用于治疗多发性硬化的新干扰素的制作方法

专利名称：用于治疗多发性硬化的新干扰素的制作方法
背景技术：
干扰素是在涉及诸如细胞增殖和免疫应答的多种生物学过程中起重要作用的胞间信号蛋白。


图1显示人干扰素-β-2的核苷酸序列，包括5′和3′序列。
图2显示人干扰素-β-2的氨基酸序列。显示了IFN-β2的可译框的翻译。信号序列以斜体字显示，而两个潜在N-糖基化位点和能够形成二硫键的半胱氨酸以下划线和粗体字显示。
图3显示I型干扰素的三维结构。所有三种IFN共享共同的人I型IFN的5-螺旋束基序特征。此外，IFN-β1b和IFN-β2在它们的潜在N-糖基化位点和被提议的二硫键的位置方面彼此类似。独特的C-末端氨基酸序列仅在IFN-β2中存在。
图4是比较人干扰素-β-2与其它干扰素类型的蛋白质序列对比。
图5是IFN-β2与人I型和II型干扰素的系统发生比较。根据半胱氨酸保守模式、潜在N-糖基化位点和系统发生分析，与其它任何干扰素相比，IFN-β2与IFN-β更加密切相关。
图6显示用于人干扰素-β-2的I型IFN依赖性ISRE-萤光素酶报道基因分析。
图7显示IFN-β2与含有抗IFN-β2多克隆抗体的人I型干扰素受体结合的抑制作用的结果。
图8(A和B)显示干扰素对细胞增殖的影响。
图9说明IFN-β2对人细胞的抗增殖活性。
图10显示干扰素对人细胞的抗病毒活性。
图11显示IFN-α2和IFN-β2之间的与I型干扰素受体结合的竞争。
图12是人IFN-β2的5′基因组核苷酸序列。
图13是编码人IFN-β2的5′区的核苷酸序列。
图14是人IFN-β2的5′多肽序列。
图15显示应答IFN-β2的人胎儿星形胶质细胞的抗增殖。(A)为无刺激的胎儿脑培养物1，(B)为EGF刺激的胎儿脑培养物1；(C)为无刺激的胎儿脑培养物2，(D)为EGF刺激的胎儿脑培养物2。

发明内容
已鉴定编码干扰素-β-2(“IFN-β2”)的新的核酸、多肽序列及它们的核酸调节剂，IFN-β2是一类发挥无数生物作用，包括例如抗肿瘤作用、抗病毒作用和免疫调节作用的胞间信号多肽。例如，参见Cirelli和Tyring，Clin.Immunother.3，27-87，1995。本发明的干扰素多肽、其片段及其衍生物具有一种或多种以下生物活性，包括但不限于IFN-β2生物活性和IFN-β2-特异性免疫原活性。
“IFN-β2生物活性”意指例如功能性作用，如改变细胞膜、抗癌基因调节、抗肿瘤活性、抗病毒活性、细胞生长抑制或抗生长活性、抗增殖、增强淋巴细胞的细胞毒性、免疫调节活性、靶细胞分化的诱导或抑制、巨噬细胞激活、癌基因减量调节等；免疫作用，如减少抗体形成、增加细胞膜组分(主要组织相容性复合物、Fc受体、β2-微球蛋白)、调节细胞介导的免疫、增加细胞因子(如白介素)产生、增加细胞毒性T细胞作用、增加巨噬细胞作用和增加天然杀伤；干扰素受体结合活性，如与干扰素I型受体，特别是它的IFNAR2c链结合，和由这种受体结合刺激的细胞作用；激活和/或缔合胞内信号分子，如Jak1、Tyk2、Stat1、Stat2、IRS-1、IRS-2、CrkL、CrkII、Vav等和其它下游效应物(如MAPK)。例如，参见Platanias和Fish，Exp.Hematology，271583-1592，1999。
短语“抗增殖活性”意指本发明的IFN-β2抑制细胞生长或诱导细胞凋亡。这在以下实施例中说明。还参见图8、9和15。例如，IFN-β2抑制脑中星形胶质细胞的增殖。例如，这种活性用于治疗多发性硬化，因为星形胶质细胞增殖可能导致作为疾病特征的神经元炎症。IFN-β2通过抑制星形胶质细胞生长而减少炎症和改善疾病。因此，本发明涉及多发性硬化的治疗方法，所述方法包括给予有效抑制星形胶质细胞增殖和/或减少炎症的量的IFN-β2。
“IFN-β2-特异性免疫原活性”意指，例如，IFN-β2多肽引起对IFN-β2具有选择性或优先性的免疫应答，例如对哺乳动物IFN-β2具有选择性的免疫应答。因此，由选自哺乳动物IFN-β2氨基酸序列，例如图2中的IFN-β2刺激抗体、T细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞等是特异性免疫原活性。这些应答可以常规测定。
IFN-β2是具有可从天然来源获得的氨基酸序列并具有一种或多种上述生物活性的全长哺乳动物多肽。它可以具有图2所示的序列，具有起始于起始密码子并终止于终止密码子的可译框。它包括天然存在的正常序列、天然存在的突变序列和天然存在的多形序列，包括单核苷酸多形(SNP)等。例如，天然来源包括活细胞，例如得自组织或整个生物、培养的细胞系(包括原代和无限增殖化细胞系)、活检组织等。
本发明还涉及哺乳动物IFN-β2的片段。所述片段优选是“生物活性的”。“生物活性的”意指多肽片段具有在活系统中或活系统成分的活性。生物活性包括已提及的活性，如IFN-β2-生物活性和IFN-β2-特异性免疫原活性。可以根据任何期望的方法制备片段，所述方法包括化学合成、基因工程、切割产物等。IFN-β2的生物活性片段包括在蛋白质的羧基-或氨基末端除去或修饰氨基酸序列的多肽。
优选排除图12和13中的核酸及其片段。优选排除图14中的多肽及其片段。但不排除含有或包含(contain或comprise)这些序列的多肽，如全长IFN-β2，具有两个或更多个这些所述片段的多肽或具有一个所述片段和其他氨基酸序列的多肽，这些多肽来自IFN-β2或其它来源。
本发明还涉及具有图2所示的推导的氨基酸序列1-208的IFN-β2。它的计算分子量为大约23000道尔顿而预期的等电点为8.1。它是一种由SDS-PAGE测得的分子量为大约26000道尔顿的酸稳定的蛋白质。在大肠杆菌产生的未糖基化的形式具有大约20500道尔顿的分子量。参见以下实施例。
如图2所示，它具有预期的氨基酸1-21位的信号序列、氨基酸74-77位和83-86位的两个潜在N-糖基化位点和32位、142位和154位的半胱氨酸残基。预期在半胱氨酸残基32位和142位之间形成二硫键。它包括在氨基酸7-24位的螺旋A、55-69位的螺旋B、83-95位的螺旋C、118-134位的螺旋D和143-158位的螺旋E。
成熟IFN-β2指图2所示的缺乏氨基酸-1至-21且长度为187个氨基酸的IFN-β2。与其它已知的干扰素类型相比，它还具有位于C-末端的独特18个氨基酸延伸。这些延伸可以用作IFN-β2的核苷酸和氨基酸水平的标记，并可以融合到异源多肽上。
例如，具有图2所示氨基酸序列的本发明的IFN-β2多肽可以通过任何适宜的方法分析，以鉴定此多肽中的其它结构和/或功能域，包括跨膜区、疏水区。例如，IFN-β2多肽可以由以下文献公开的方法分析如Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.(分子生物学)，157105，1982；EMBL Protein Predict(EMBL蛋白质预测)；Rost和Sander，Proteins(蛋白质)，1955-72，1994。
本发明的IFN-β2的其它同系物可以根据多种方法从哺乳动物和非哺乳动物来源获得。例如，与寡核苷酸(如用于扩增编码区的引物-5′-ATG ATT ATC AAG CAC TTC TTT GGA-3′和5′-CTA CCT CGGGCT TCT AAA CTC TGT-3′)杂交。用于在大肠杆菌中表达的引物-5′-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTC TAA-3′和5′-GCG CGCGCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GAT TAT-3′。全长已知序列的引物，包括5′和3′未翻译的基因组序列-5′-TTT AGG TGA CAC TATAGA AT-3′和5′-TAA AAT GGA TAG AAT ATA TAA-3′-可以用于选择同系物，如在Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，Chapter 11(11章)，1989中所述。这些同系物可以与IFN-β2具有不同量的核苷酸和氨基酸序列同一性和相似性。哺乳动物生物包括，例如啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、猴、猿、猪、母牛、马、狗、猫等。非哺乳动物生物包括，例如脊椎动物、无脊椎动物、斑马鱼、小鸡、果蝇、秀丽隐杆线虫(C.elegans)、非洲蟾蜍(Xenopus)、酵母如裂变酵母(S.pombe)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、线虫、原核生物、植物、拟南芥(Arabidopsis)、甲壳动物、卤虫属(Artemia)、病毒等。为了选择用于杂交的寡核苷酸，可以使用有效的方法。例如，可以通过比较本发明的IFN-β2和其它IFN-β2类型并选择仅在前者中出现的氨基酸序列(即非保守的或对IFN-β2“特异性的”)来鉴定IFN-β2-特异性区。例如参见图4，该图显示不同干扰素类型之间的保守区和非保守区。可以选择非保守氨基酸序列(如KSLSP)并可以根据这些序列设计简并探针。还参见Venkataraman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，963658-3663，1999。可以常规地，如通过使用BLAST计算机程序组检索基因/蛋白质数据库来发现其它特异性(即非保守)和/或保守氨基酸序列。
本发明还涉及IFN-β2-特异性氨基酸序列，例如在图2和4的特定序列中发现但在其它干扰素类型中没有发现的确定的氨基酸序列。优选的多肽为至少大约8个邻接的氨基酸，如大约9、10、12、15、20、21、22、25、30、40、50个氨基酸等。例如，这些多肽可以包含KHFFGTV、IIFQQRQV、KSLSP、FRANI、AEKLSGT、CLFFVFS和QGRPLNDMKQELTTEFRSPR和它们的片段。IFN-β2-特异性氨基酸序列或基序可以生产肽，所述肽作为抗原产生对其特异性的免疫应答。通过这种免疫获得的抗体可以用作用于诊断或研究目的的哺乳动物IFN-β2蛋白质的特异性探针，包括作为表达标记。
如上述，本发明的多肽可以包含多种IFN-β2的氨基酸序列(如全长序列，即图1所示的具有起始和终止密码子)、成熟氨基酸序列(即其中以前体形式产生IFN-β2多肽，并被加工成成熟多肽，或其片段)。有用的片段包括，例如包含或基本组成为任意上述域的片段和特异性或保守氨基酸序列，如图2和4所示的氨基酸序列可以选择具有特定生物活性的本发明的IFN-β2多肽片段，所述活性如抗病毒、免疫调节、抗生长等。这些活性的测定可如已知那样进行。参见下述。还可以如EP496162所述鉴定和制备这些肽。
本发明的多肽还可以与图2所述的氨基酸序列具有100％或更小的氨基酸序列同一性。为以下讨论的目的，序列同一性意指在比较序列的对应位置发现与在图1和2所述序列中发现的相同的核苷酸或氨基酸。与图1和2所述氨基酸序列具有小于100％序列同一性的多肽可以含有来自天然存在序列的多种置换，包括同源和非同源氨基酸置换。参见以下关于同源氨基酸置换的实施例。相同和同源残基的总和除以与IFN-β2多肽比较的序列中残基的总数等于百分序列相似性。为计算序列同一性和相似性的目的，可以对比较序列进行比对(align)，并根据任何期望的方法、算法、计算机程序等，例如FASTA、BLASTA进行计算。
与图2的氨基酸序列具有小于100％的氨基酸序列同一性的多肽可以具有大约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、88％、85％、80％、75％、70％或低至大约53％的序列同一性。
本发明还涉及IFN-β2的多肽突变体蛋白，即任何具有在氨基酸序列方面不同于可从天然来源获得的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽(哺乳动物IFN-β2的片段在氨基酸序列方面与天然存在的IFN-β2的没有不同，虽然在氨基酸数目方面不同)。因此，IFN-β2多肽突变体蛋白包含氨基酸置换、插入和缺失，包括非天然存在的氨基酸。
还可以在基因数据库如Genbank、EMBL中进行同源性检索的基础上制备本发明的IFN-β2氨基酸序列的突变体蛋白。可以使用多种方法，包括在BLAST计算机程序组中所述的算法、Smith-Waterman算法等进行序列同源性检索。可以通过在多肽的相同和/或同源的域内鉴定和比对氨基酸，然后在此比对的基础上修饰氨基酸而将突变体蛋白引入序列。例如，本发明的IFN-β2与图4中所示的多种已知干扰素共享序列同一性。保守氨基酸残基上的这些多肽之间的比对可以鉴定预期其修饰减少、降低或消除IFN-β2生物活性，如受体结合活性等的残基。例如，当比对揭示两个或更多域之间的相同保守氨基酸时，可以预期这些氨基酸的消除或置换不利地影响其生物活性。
还可以通过用一种同源氨基酸代替另一种来进行氨基酸置换。可以在侧链的大小和极化程度的基础上确定同源氨基酸，包括小非极性半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苏氨酸；小极性丝氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺；大极性谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸；中等极性酪氨酸、组氨酸、色氨酸；大非极性苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。同源酸还可以分组如下不带电的极性R基团甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；酸性氨基酸(带负电)天冬氨酸和谷氨酸；碱性氨基酸(带正电)赖氨酸、精氨酸、组氨酸。同源氨基酸还包括Dayhoff在Atlas of Protein Sequence and Structure5，1978中和Argos在EMBOJ.，8，779-785，1989中所述的氨基酸。
可以制备对活性无影响，或与野生型相比降低或增加IFN-β2活性的突变体蛋白。可以与其它IFN-β2，如成纤维细胞干扰素(β-1)和α-干扰素类似地进行突变。例如，IFN-β2折叠成干扰素的典型的特征性五螺旋束在氨基酸7-24位的螺旋A、55-69位的螺旋B、83-95位的螺旋C、118-134位的螺旋D和143-158位的螺旋E。这些螺旋通过无规卷曲或环形区域栓在一起。参见图3。螺旋结构的突变可以与IFN-β1(成纤维细胞)类似地完成，如在Runkel等人，Biochemistry(生物化学)，392538-2551，2000中所述。例如，A螺旋的部分、AB环和E螺旋在受体结合中涉及。还参见Piehler和Schreiber，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，294223-237，1999。
本发明的IFN-β2，如成纤维细胞干扰素，具有三个位于氨基酸32位、142位和154位的半胱氨酸残基。32位和142位的半胱氨酸残基的位置与已知形成成纤维细胞干扰素内的二硫键的半胱氨酸残基相似。与成纤维细胞干扰素相似，154位的氨基酸可以缺失或被中性氨基酸置换，所述中性氨基酸如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸。优选丝氨酸和苏氨酸，因为它们与半胱氨酸具有化学相似性。除去未成对的半胱氨酸可以防止不正确的分子内和分子间二硫键的形成。例如，参见美国专利4,588,585。突变还可以根据美国专利4,914,033、5,545,723和5,580,723进行。例如，参见Fish等人，J.Interferon Res.(干扰素研究杂志)，12257-66，1992；Fish等人，J.Interferon Res.(干扰素研究杂志)，997-114，1989；DiMarco等人，J.Interferon Res.(干扰素研究杂志)，13139，1993；Mitsui等人，Pharmacol.Therap.(药理学治疗)，5893-132，1993；Wang等人，J.Immunol，152705-715，1994。
本发明涉及编码这种突变体蛋白多肽的突变体蛋白核酸。因此，本发明涉及图1的核苷酸序列，其中所述核酸编码多肽且一个或多个氨基酸位置被置换或缺失，或者同时被置换和缺失，且由该核酸编码的多肽具有生物活性，如在重组表达时增强从细菌细胞的回收，或增强生物活性。多肽突变体蛋白及其对应的核苷酸编码序列可能具有图2所述的氨基酸序列，除了其中一个或多个位置被同源氨基酸置换，如其中存在1、5、10、15或20个置换。可以根据上述、下述和本领域技术人员已知的方法测定修饰如何影响所述的活性。
已知多种测定IFN-β2活性的方法。例如，有用的测定包括抗病毒分析，如CPE(如美国专利5,545,723和4,914,033；以下实施例)；受体结合(如美国专利5,545,723和以下实施例；STAT激活(如以下实施例)；IFN-β2效应基因的激活(如干扰素刺激的效应元件(ISRE)可操纵地连接到报道基因，如萤光素酶，如以下实施例所示)；I型受体的磷酸化作用(以下实施例)；抗增殖(美国专利4,914,033，评价IFN-β2抑制细胞系复制的能力；以下实施例)；免疫调节(美国专利4,914,033，antibody-dependent cellular cytotoxicity(抗体依赖性细胞毒性)；Noronha等人，J.Neuroimmunol.(神经免疫)，46145-154，1993，inhibition of T-lymphocytes and their production of IFN-gamma(T淋巴细胞的抑制作用及它们的IFN-γ的生产)；experimental allergicencephalomyelitis(实验性变应性脑脊髓炎)(“EAE”)(如Louboutin等人，Acta Neurol.Scand.，8897-99，1993；Rott等人，Eur.J.Immunol.，231745-1751，1993；以下实施例)。
本发明的哺乳动物IFN-β2、其片段或取代的多肽还可以包含多种修饰，其中这种修饰包括脂质修饰、甲基化、磷酸化、糖基化、共价修饰(如氨基酸R基的共价修饰)、氨基酸置换、氨基酸缺失或氨基酸添加。多肽的修饰可以根据多种方法进行，包括重组、合成、化学等。
本发明的多肽(如全长、其片段、其突变)可以多种方式使用，如用于测定、作为如下所述抗体的免疫原、作为生物活性试剂(如具有一种或多种与本发明的IFN-β2相关的活性)。
编码本发明的IFN-β2的多肽、其衍生物或其片段可以与一个或多个结构域、功能域、可检测域、抗原域和/或期望的有用多肽，以自然界不存在，即不天然存在的排列组合。包含这些特征的多肽是嵌合或融合多肽。这种嵌合多肽可以根据多种方法制备，这些方法包括化学、合成、半合成和/或重组方法。编码嵌合多肽的嵌合核酸可以在可译框中包含多个域或连续(如具有多重N-末端域以稳定或增强活性)或中断的期望的多肽，如包含内含子、剪接位点、增强子等等。嵌合核酸可以根据多种方法生产。例如参见美国专利5,439,819。域或期望的多肽可以具有任何期望的性质，包括生物功能如信号、生长促进、细胞靶向(如信号序列、靶向序列，如靶向作用于内质网或核)等，结构功能如疏水、亲水、跨膜等，受体-配体功能和/或可检测的功能如与酶、荧光多肽、绿色荧光蛋白组合(Chalfie等人，Science(科学)，263802，1994；Cheng等人，Nature Biotechnology(自然生物技术)，14606，1996；Levy等人，Nature Biotechnology(自然生物技术)，14610，1996)等。域还可以是免疫球蛋白，如增强稳定性等，如免疫球蛋白重链、轻链和/或Fc区或附加表位序列。
此外，多肽或其部分在引入宿主细胞时可以用作选择性标记。例如，编码本发明的氨基酸序列的核酸可以符合读框融合成期望的编码序列并用作纯化、选择或标记目的的标记物。融合区可以编码切割位点以促进表达、分离、纯化等。
本发明的IFN-β2多肽或其片段还可以与其它细胞因子如干扰素组合，以制备嵌合或杂合IFN-β2。这种杂合IFN-β2可以是在任何种类的干扰素之间，所述干扰素包括α、ω、γ、ε、滋养层、胎儿等。可以制备与产生它们的杂合体相比具有降低或限制活性，如限制细胞生长调节活性、抗病毒活性或免疫调节活性的杂合体(和上述的突变体蛋白)。例如，参见美国专利4,758,428，用于在成纤维细胞干扰素和α-干扰素之间杂合，如使用成纤维细胞干扰素的大约氨基酸47-187、74-187、1-73等。
根据本发明，可以在表达系统，如体内、体外、无细胞、重组、细胞融合的表达系统中生产本发明的多肽。由这些系统赋予的多肽修饰包括糖基化、氨基酸置换(如通过使用不同的密码子)、多肽加工如消化、切割、内肽酶或外肽酶活性、化学部分包括脂质或磷酸酯的连接等。
可以根据常规方法，如应用于其它干扰素和其它重组蛋白的方法，从天然来源、转化的宿主细胞(培养基或细胞)中回收本发明的多肽，这些方法包括去污剂萃取(如非离子去污剂、Triton X-100、CHAPS、辛基葡糖苷、Igepal CA-630)、相萃取、正丁醇萃取、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、交联葡聚糖(Sephadex)、疏水相互作用层析、羟磷灰石层析、凝集素层析、凝胶电泳、亲合层析、SDS PAGE、可控孔度玻璃层析(CPG)、抗体亲合层析、凝胶过滤、蓝色琼脂糖、苯基琼脂糖层析、CPG和锌-螯合物层析(如Heine和Billiau，Methods in Enzymology(酶学方法)，78(A部分)448-456，1981)，Cibacron Blue F3GA-Agarose andHPLC(汽巴弄蓝F3GA-琼脂糖和HPLC)(Kenny等人，Methods inEnzymology(酶学方法)，78(A部分)435-447，1981)。还参见Innis和McCormick，Methods in Enzymology(酶学方法)，119397-403，1986；Dembinski和Sulkowski，Preparative Biochemistry(制备生物化学)，16175-186，1986；Friesen等人，Methods in Enzymology(酶学方法)，78(A部分)4330-435，1981)；Pestka等人，Annu.Rev.Biochem.，56727-77，1987。如果需要，可以使用蛋白质再折叠步骤完成成熟蛋白质的结构。
本发明还涉及核酸，如编码本发明的IFN-β2多肽及其片段的DNA和RNA。IFN-β2核酸或及片段是具有可从天然来源获得的核苷酸序列的核酸。因此，它包括天然存在的核酸、正常的核酸、天然存在的突变型和天然存在的多形等位基因(如SNP)等。例如，天然来源包括从组织或整个生物获得的活细胞、肿瘤、培养的细胞系，包括原代和无限增殖化的细胞系。
本发明的核酸序列可以包含图1所示的完全编码序列、其简并序列及其片段。本发明的核酸还可以包含与任何上述或下述的核苷酸序列100％互补如反义的核苷酸序列。
本发明的核酸，即核苷酸或多核苷酸的聚合物可以由各种不同的来源获得。它可以得自DNA或RNA，如从组织、细胞或整个生物分离的多腺苷酸化mRNA。核酸可以直接得自DNA或RNA，或来自cDNA文库。核酸可以得自特定发育期的细胞或组织(如来自胚胎或成体心肌细胞(cardiac cell)或组织)，具有期望的基因型、表型等。
如以上关于IFN-β2多肽所述，包含编码本发明的多肽的核苷酸序列的核酸可以仅包括编码序列；可以包括编码序列和其他编码序列(如编码先导肽、分泌肽、靶肽、酶肽、荧光肽或其它诊断肽的序列)；可以包括编码序列和非编码序列，如在5′或3′端或分散在编码序列中的未翻译的序列，如内含子。包含不中断地编码多肽的核苷酸序列的核酸意指该核苷酸序列包含IFN-β2氨基酸编码序列，不含中断或间插在编码序列中的非编码序列，如不存在内含子。这种核苷酸序列还可以描述为邻接的。编码人、小鼠或其它哺乳动物干扰素等的基因组DNA可以常规地获得。
本发明的核酸还可以包含可操纵地连接到上述核酸上的表达调控序列。术语“表达调控序列”意指调节一种多肽表达的核酸序列，该多肽由与该核酸序列可操纵地连接其上的核酸编码。可以在mRNA或多肽水平调节表达。因此，表达调控序列包括mRNA相关元件和蛋白质相关元件。这些元件包括启动子、增强子(病毒的或细胞的)、核糖体结合序列、转录终止子等。当表达调控序列以这种方式定位以进行或完成编码序列的表达时，表达调控序列可操纵地连接于核苷酸编码序列。例如，当启动子可操纵地连接5′至编码序列时，启动子驱动编码序列的表达。表达调控序列可以与正常基因是异源的或内源的。
可以在核酸杂交的基础上选择本发明的核酸。两种单链核酸制剂杂交在一起的能力衡量它们的核苷酸序列的互补性，例如核苷酸如A-T、G-C等之间的碱基配对。因此本发明还涉及核酸和它们的互补链，它们与包含图1所述的核苷酸序列的核酸杂交。与后一序列杂交的核苷酸序列具有互补核酸链，或在聚合酶(即适宜的核酸合成酶)存在下用作一条链的模板。本发明包括核酸的两条链，如有义链和反义链。
可以选择杂交条件以选择具有期望量的与图1所述的核苷酸序列互补性的核苷酸的核酸。能够与这种序列杂交的核酸优选在序列之间具有大约85％，更优选90％、92％，甚至更优选95％、97％或100％的互补性。本发明特别涉及在低或高严格条件下与图1所述的核苷酸序列杂交的核酸序列。
可以多种方式选择与IFN-β2序列杂交的核酸。例如，印迹(即包含核酸的基质)、芯片阵列和其它包含有用核酸的基质，可以在30℃下在预杂交溶液(6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml变性的鲑精子DNA，5×Denhardt溶液和50％甲酰胺)中温育过夜，然后根据已知的方法在42℃下在杂交溶液(如6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml变性的鲑精子DNA和50％甲酰胺)中与可检测的寡核苷酸探针(见下述)杂交过夜。可以在允许少于5％bp错配的高严格条件下洗涤印迹(如在65℃下在0.1×SSC和0.1％SDS中洗涤两次，持续30分钟)，即选择具有95％或更大序列同一性的序列。高严格条件的其它非限制性实例包括在65℃下在包含30mM NaCl和0.5％SDS的缓冲水溶液中的最后洗涤。高严格条件的另一实例是在50℃下在7％SDS、0.5M NaPO4、pH7、1mM EDTA中杂交过夜，然后在42℃下用1％SDS溶液洗涤一次或多次。
高严格洗涤可以允许少于5％错配，而宽松的或低严格洗涤条件(如在37℃下在0.2×SSC和0.5％SDS中洗涤30分钟)可以允许多至20％错配。低严格条件的另一个非限制性实例包括在42℃下在包含30mM NaCl和0.5％SDS的缓冲液中的最后洗涤。还可以如在Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，1989，第9章中所述完成洗涤和杂交。
杂交还可以基于在探针和它的靶之间形成的杂合体的解链温度(Tm)，如在Sambrook等人中所述。一般地，短寡核苷酸(包含18个核苷酸或更少)从其靶序列中解链的温度Tm由以下等式得到Tm＝(A和T的数目)×2℃+(C和G的数目)×4℃。对于更长的分子，Tm＝81.5+16.6log10[Na+]+0.41(％GC)-600/N，其中[Na+]是钠离子的摩尔浓度，％GC是探针中GC碱基对的百分比，而N是长度。杂交可以在低于此温度几度下进行以确保探针和靶可以杂交。通过更进一步降低温度可以允许错配。
可以选择严格条件以分离序列和它们的互补链，它们在探针(如IFN-β2的寡核苷酸)和靶核酸之间具有至少大约95％、97％、98％、99％的核苷酸互补性。
根据本发明，核酸或多肽在图1或2所示的核苷酸或氨基酸序列中可以包含一个或多个差别。核苷酸和/或氨基酸序列的改变或修饰可以通过任何可获得的方法，包括定向或无规诱变而完成。
编码本发明的哺乳动物IFN-β2，如人IFN-β2的核酸可以包含在天然存在的基因如天然存在的多形、正常或突变型等位基因(核苷酸或氨基酸)中存在的核苷酸，在天然哺乳动物如人、猴、猪、小鼠、大鼠或兔的种群中发现的突变。术语“天然存在的”意指该核酸可从天然来源如动物组织和细胞、体液、组织培养细胞、法医样品中获得。天然存在的突变可以包括核苷酸序列的缺失(如截短的氨基或羧基末端)、置换、倒位或添加。这些基因可以根据本领域技术人员已知的方法通过核酸杂交而被检测和分离。编码本发明的哺乳动物IFN-β2的核苷酸序列可以包含在天然存在的基因中发现的密码子、转录物或cDNA，例如图1所示，或者它可以包含编码相同氨基酸序列的简并密码子。例如，可以期望改变序列中的密码子以使序列在期望的宿主内的表达最优化。
本发明的核酸可以包含例如DNA、RNA、合成核酸、肽核酸、修饰的核苷酸或混合物。DNA可以是双链或单链。包含核苷酸的核酸可以通过多种已知的连接，如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等连接，这取决于期望的目的，如耐核酸酶，例如耐RNA酶H，改善体内稳定性等。例如参见美国专利5,378,825。
可以对核酸进行多种修饰，如连接可检测的标记(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素)、连接改善杂交、检测或稳定性的部分。根据期望的方法，核酸还可以连接到固体载体上，如硝酸纤维素、磁性或顺磁性微球体(如在美国专利5,411,863、美国专利5,543,289中所述；例如包含铁磁体、超磁体、顺磁体、超顺磁体、氧化铁和多糖)、尼龙、琼脂糖、重氮化纤维素、胶乳固体微球体、聚丙烯酰胺等。例如，参见美国专利5,470,967、5,476,925、5,478,893。
本发明的另一方面涉及寡核苷酸或核酸探针。这些寡核苷酸或核酸探针可以用于例如检测、定量或分离试验样品中哺乳动物IFN-β2核酸，或者用于鉴定IFN-β2同系物。在一个优选的实施方案中，核酸可以用作寡核苷酸探针，如用于PCR、示差显示、基因芯片(如Affymetrix GeneChips(Affymetrix基因芯片)；美国专利5,143,854、美国专利5,424,186、美国专利5,874,219、PCT WO 92/10092、PCT WO90/15070)，和其它可用的方法。检测可以预期用于多种不同的目的，包括研究、诊断和法医学。对于诊断目的，可能期望鉴定样品中核酸序列的存在或量，其中样品从组织、细胞、体液等中获得。在一个优选的方法中，本发明涉及一种检测核酸的方法，所述方法在有效地实现靶和寡核苷酸之间的杂交的条件下使试验样品中的靶核酸与寡核苷酸接触，和检测杂交。本发明的寡核苷酸还可以用于合成核酸扩增如PCR(如Saiki等人，Science(科学)，24153，1988；美国专利4,683,202；PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(PCR方案方法和应用指南)，Innis等人，eds.，Academic Press(学院出版社)，New York，1990)；示差显示(例如参见Liang等人，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)，213269-3275，1993；美国专利5,599,672；WO97/18454)；线性PCR；或其它扩增方法。
可以结合其它基因，如在信号转导、生长、癌、细胞凋亡或任何上述或下述基因的寡核苷酸等进行检测。寡核苷酸还可以用于测试突变，如使用在美国专利5,683,877；美国专利5,656,430；Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，898779-8783，1992中所述的错配DNA修复技术。
本发明的寡核苷酸可以包含任何图1的连续的核苷酸序列或其互补链，或任意的这些序列或上述的其互补链。本发明的这些寡核苷酸(核酸)可以是任何期望的大小，如大约10-200个核苷酸、12-100、12-50、12-25、14-16，至少大约15，至少大约20，至少大约25，至少大约30个核苷酸等。寡核苷酸可以具有非天然存在的核苷酸，如肌苷、AZT、3TC等。寡核苷酸可以与图1的序列具有100％同一性或互补性，或者它可以具有错配或核苷酸置换，如1、2、3、4或5个置换。根据本发明，寡核苷酸可以包含试剂盒，其中该试剂盒包括期望的缓冲液(如磷酸盐、Tris等)、检测组合物等等。寡核苷酸可以被本领域中已知的放射性或非放射性标记标记或未被标记。
本发明的另一方面是哺乳动物IFN-β2的独特核苷酸序列。IFN-β2的独特序列意指在IFN-β2中存在的确定的核苷酸顺序，例如它在图1的核苷酸序列中存在，但在其它核酸中很少或不常存在，尤其是不存在于动物核酸，优选哺乳动物，如人、大鼠、小鼠等。独特核苷酸序列包括编码图1所示的氨基酸KHFFGTV、IIFQQRQV、KSLSP、FRANI、AEKLSGT、CLFFVFS和QGRPLNDMKQELTTEFRSPR及其片段的序列或者它们的互补链。这些序列可以在本文所述的或引用作为参考的任何方法中用作探针。包括有义和反义核苷酸序列。本发明的独特核酸可以常规地检测。包含这些独特序列的核酸可以用作杂交探针，用于在包含核酸混合物的样品中，如在RNA印迹上鉴定人或小鼠IFN-β2的存在。杂交可以在高严格条件(参见上述)下进行以选择与探针具有至少95％同一性(即互补性)的核酸(和它们的可以包含编码序列的互补链)，但也可以使用较低的严格条件。独特的IFN-β2核苷酸序列还可以在其5′或3′端符合读框融合成本专利通篇所述的多种核苷酸序列，包括用于IFN-β2其它部分、酶、GFP等的编码序列、表达调控序列等。
如已讨论的，可以在不同条件下，根据期望的选择性完成杂交，例如Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，1989中所述。例如，为了特异性地检测本发明的IFN-β2，可以在以下条件下将寡核苷酸与靶核酸杂交其中，仅寡核苷酸与它杂交，例如其中寡核苷酸与靶100％互补。如果期望选择具有小于100％的核苷酸互补性，例如至少大约为99％、97％、95％、90％、86.4％、85％、70％、67％的核苷酸互补性的靶核酸，则可以使用不同的条件。
还可以由本发明的核酸制备反义核酸，优选图1的序列的反义核酸。反义核酸可以多种方式使用，如用于调控或调节(regulate或modulate)IFN-β2的表达，如抑制它，用于检测它的表达，或者用于原位杂交。这些寡核苷酸可以与美国专利5,576,208类似地使用。为了调控或调节IFN-β2的表达，反义寡核苷酸可以可操纵地连接到表达调控序列。
为了抑制IFN-β2，可以将寡核苷酸设计成沿cDNA的对应的有义位置。例如参见J.Milligan等人，Current Concepts in Antisense DrugDesign(目前反义药物设计的概念)，J.Med.Chem.(药物化学杂志)，36(14)1923-1937，1993；Helene和Toulme，Biochim.Biophys.Acta，104999-125，1990；Cohen，J.S.，Ed.，Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression(寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂)，CRC PressBoca Raton，Fla.，1987；Crooke，S.，Basic Principles of Antisense Therapeutics(反义治疗的基本原理)，Springer-Verlag Berlin，Heidelberg，New York，Jul.1998。这些寡核苷酸可以是耐核酸酶的，例如使用在美国专利6,040,296或上述参考资料中所公开的多种化学连接。可以在细胞培养物中使用大约35bp的总长度和阳离子脂质体以促进细胞摄入，但对于体内使用，优选给予较短的寡核苷酸，如25个核苷酸。
可以根据任何期望的方法将本发明的核酸标记。就某些常用的示踪剂而言，可以使用放射性示踪剂如32P、35S、125I、3H或14C标记核酸。放射性标记的进行可以根据任何方法，如使用放射标记的核苷酸、多核苷酸激酶(进行或不进行磷酸酶脱磷酸)或连接酶(取决于欲标记的末端)在3′或5′端进行末端标记。还可以使用非放射性标记，组合本发明的核酸和具有免疫性质(抗原、半抗原)、对某些反应物(配体)的特殊亲合力、使可检测的酶反应能够完成的性质(酶或辅酶、酶底物或其它在酶反应中涉及的物质)或特征性物理性质如荧光或者发射或吸收期望波长的光等的残基。
可以采用多种技术，包括RNA印迹、PCR、原位杂交、示差显示、核酸阵列(如“基因芯片”)、斑点印迹等，使用本发明的核酸，包括寡核苷酸、反义核酸等，检测整个器官、组织、细胞等中IFN-β2的表达。这些核酸可以特别地用于检测扰乱的表达，如IFN-β2的细胞特异性和/或亚细胞改变。可以单独或结合其它基因产物，特别是在细胞因子生产中涉及的其它基因产物来测定IFN-β2的水平。
可以根据期望的目的，在多种不同的系统中体外和体内表达本发明的核酸。例如，可以将核酸插入表达载体、导入期望的宿主，并在有效地实现该核酸编码的多肽表达的条件下进行培养。有效条件包括任何适于实现由宿主细胞生产多肽的培养条件，包括有效的温度、pH、培养基、培养宿主细胞的培养基添加剂(如扩增或诱导表达的添加剂如丁酸盐，或者如果该编码核酸与dhff基因相邻则为甲氨蝶呤)、放线菌酮、细胞密度、培养皿等。可以通过任何有效的方法将核酸导入细胞，这些方法包括例如裸DNA、磷酸钙沉淀、电穿孔、注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体融合、与增强其细胞摄入的试剂缔合、病毒转染。已导入本发明的核酸的细胞是转化的宿主细胞。核酸可以是染色体外的或整合到宿主细胞的染色体内。它可以是稳定或瞬时的。选择与宿主细胞相容的表达载体。宿主细胞包括哺乳动物细胞，如COS、CV1、BHK、CHO、HeLa、LTK、NIH 3T3、293、PAE、人、人成纤维细胞、人原发肿瘤细胞、睾丸、神经胶质、神经元、少突神经胶质细胞、星形胶质细胞、成神经细胞瘤、神经胶质瘤等；昆虫细胞，如Sf9(S.frugipeda)和果蝇、细菌如大肠杆菌、链球菌、杆菌、酵母如酵母属(Sacharomyces)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、真菌细胞、植物细胞、胚胎干细胞(例如哺乳动物，如小鼠或人)、神经元干细胞、成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞和T细胞。
类似地选择和宿主相容的表达调控序列用于期望目的，如高拷贝数、高量、诱导、扩增、受控的表达。其它可以使用的序列包括诸如来自SV40、CMV、RSV的增强子、可诱导的启动子、细胞类型特异性元件或允许选择性或特异性细胞表达的序列。可以用于驱动其表达的启动子包括例如细菌宿主的内源性启动子、其它细胞信号转导途径中的基因的启动子、MMTV、SV40、trp、lac、tac或T7启动子；或者酵母的α-因子、醇氧化酶或PGH启动子。RNA启动子可以用于产生RNA转录物，如T7或SP6。例如参见Melton等人，Nucleic AcidsRes.(核酸研究)，12(18)7035-7056，1984；Dunn和Studier，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，166477-435，1984；美国专利5,891,636；Studier等人，Gene Expression Technology(基因表达技术)，Methods inEnzymology(酶学方法)，8560-89，1987。
本发明的核酸或多肽可以用作核酸或蛋白质电泳、层析等中的大小标记。可以通过扫描序列的限制位点、计算其大小和进行相应的限制酶切消化而测定确定的限制片段。
本发明的IFN-B2多肽和核酸可以是“分离的”。术语“分离的”意指它处于在其原始环境中或自然界未发现的形式，如更为浓缩、更为纯化、从组分中分离、在其中表达异源IFN-β2基因的细胞的溶胞产物中存在。当IFN-β2作为异源核酸在转染的细胞系中表达时，在核酸表达的条件下将本发明的核酸导入上述的细胞中。术语“异源的”意指已“手工”将核酸导入细胞系。以上讨论了细胞系内核酸的导入。表达IFN-β2核酸的转染的(或转化的)细胞可以如实施例所述溶解，并在所述方法中用作溶胞产物(即“分离的”)或者可以使用完整的细胞系。
一般地，术语“有效条件”意指诸如实现期望效果的环境。这种环境包括例如缓冲剂、氧化剂、还原剂、pH、辅因子、温度、离子浓度、细胞正被使用时的适宜年龄和/或储藏的细胞(例如在细胞周期的特定部分或在特定基因正在表达的特定时期)、培养条件(包括底物、氧、二氧化碳等)。
本发明还涉及一种调节、优选抑制编码本发明的IFN-β2的核酸的表达的方法，所述方法包括使表达本发明的IFN-β2的细胞与一定量的试剂，如IFN-β2的反义寡核苷酸或反义RNA接触，这些试剂有效的序列特异性地抑制所述核酸的表达。
可以使用反义核酸如反义寡核苷酸或RNA常规地实现核酸的序列特异性抑制作用。例如，反义寡核苷酸，如磷酸二酯或硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸可以设计于IFN-β2 RNA的特定区域，如翻译起始位点，然后可以抑制它们表达的量给予表达这些基因的细胞。一般地，反义核酸是与给定核酸的有义或编码链互补的核酸，因此它们也与所述核酸的mRNA转录物互补丙因此能与其特异性杂交。优选的反义寡核苷酸包含靶基因的5′区，特别是包含起始密码子的区域。
为了增强稳定性，可以将给予的核酸修饰，如使其耐细胞酶、氧化、还原、核酸酶等，或增强它的细胞摄入。可以使用任何适宜的修饰，包括例如硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、与吖啶嵌入试剂和/或疏水尾连接的磷酸二酯寡核苷酸、补骨脂素衍生物、2′-核糖修饰、戊糖衍生物、氮碱衍生物等等。例如参见用于反义寡核苷酸修饰的美国专利5,576,208、5,744,362、6,040,296和6,046,319等，这些修饰可以用于本发明。一般地，本发明的反义核酸可以包含天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸的单体和它们的组合，以增强细胞摄入和/或稳定性。
给予的反义可以是裸核酸、和其它试剂或任何适宜的给药工具，或被所述试剂或给药工具复合或包封，所述试剂促进其摄入细胞、注入细胞。
本发明还涉及使用本发明的IFN-β2，如人IFN-β2的方法，用于治疗任何期望IFN-β2生物活性的病症、障碍、疾病等。这些方法包括给予需要治疗的宿主有效量的本发明的IFN-β2，用于一种或多种以下目的抗癌基因调节、抗肿瘤活性、抗病毒活性、细胞生长抑制或抗生长活性、抗增殖(如有效抑制星形胶质细胞增殖的IFN-β2的量)、增强淋巴细胞的细胞毒性、免疫调节活性、诱导或抑制靶细胞分化、巨噬细胞激活、减量调节癌基因等；免疫作用，如减少抗体形成、增加细胞膜组分(主要组织相容性复合物、Fc受体、β2-微球蛋白)、调节细胞介导的免疫、增加细胞因子(如细胞间介素)产生、增加细胞毒性T细胞作用、增加巨噬细胞作用和增加天然杀伤。IFN-β2可以给药用于治疗癌、自体免疫疾病和病毒感染。例如，参见Cirelli和Tyring，Clin Immunbother.(临床免疫干扰).327-87，1995，关于可用本发明的IFN-β2治疗的各种疾病；具体参见α-和β-干扰素的用途。
IFN-β2可以作为多肽给药，或者它可以作为核酸给药，如在基因治疗中给药。当作为核酸给药时，它可以任何有效实现表达的形式提供，如作为裸DNA、作为载体(如病毒载体，如腺病毒)、与脂质体或其它载体试剂复合、微泡等。参见以上关于核酸给药，它们在宿主中的表达等等的更多信息。
可以根据本发明治疗任何癌，如宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌(例如参见DePalo等人，Int.J.Tissue React.，6523-527，1984，关于剂量、给药途径、方案等)、黑素瘤和转移性黑素瘤(例如参见Beiteke等人，Hautarzt，44365-371，1994，关于剂量、给药途径、方案等)、毛细胞白血病、卡波西肉瘤、基细胞癌、扁平细胞癌、肾细胞癌、良性肿瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(关于其它癌，还参见Dorr，Drugs，45(2)177-211，1993)。
还可以根据本发明治疗自体免疫疾病，如多发性硬化(例如参见Yong等人，Neurology(神经学)，51682-689，1998，关于剂量、给药途径、方案等)、类风湿性关节炎等。多发性硬化(“MS”)是一种自体免疫疾病，其病理学特征在于导致脱髓鞘、轴突破坏和随后的神经胶质增生的血管周和室周炎症。慢性MS损伤的特点是由局部星形胶质细胞肥大和增生导致形成的脱髓鞘神经胶质增生斑。这些星形胶质细胞斑干扰正常轴突传导并产生再髓鞘化的物理屏障。因此，抑制星形胶质细胞增生的因子具有有益的治疗意义，特别是在疾病的后期。因此，IFN-β2抑制星形胶质细胞的能力对于治疗MS特别有用。
还可以根据本发明治疗病毒性疾病和感染，如人乳头状瘤病毒(如Puligheddu等人，Eur.J.Gynaecol.Oncol.(欧洲妇科肿瘤学杂志)，9161-162，1988；Costa等人，Cervix(子宫颈)，6203-212，1988，关于剂量、给药途径、方案等)、尖锐湿疣(Schonfeld等人，Lancet，11038-1042，1984，关于剂量、给药途径、方案等)、乙、丙、丁型肝炎、HIV等。
术语“给药”意指将IFN-β2或其它活性试剂转运到靶，如肿瘤、免疫系统、脑损伤(如脑炎症部位，如在多发性硬化或其它脑炎症中观察到的部位)等。可以采用实现上述效果的有效途径对任何靶进行IFN-β2给药(如体内、体外或原位)，包括培养物中的细胞和具有欲治疗的损伤、病症或疾病的宿主，例如可以通过直接注射到靶部位或接近靶部位而将IFN-β2配方给药。还可以进行局部、肠、肠胃外、静脉内、肌肉、皮下、口、鼻、大脑内、心室内给药等，这取决于欲治疗的靶部位的位置。IFN-β2还可以作为被细胞摄入的核酸给药。核酸给药的方法包括上述的给药和其它常规给药技术。
将有效量的IFN-β2给予靶。有效量是用于实现期望效果，优选是有益或治疗效果的量，如有效抑制星形胶质细胞增殖的量。这种量可以常规确定，如通过进行剂量反应试验，其中将不同的剂量给予靶细胞以确定实现期望目的，如产生抗病毒效果、产生免疫调节效果的有效量。可以根据多种因素选择用量，包括IFN-β2给药的环境(如患有多发生性硬化的患者、动物模型、组织培养细胞等)、欲治疗的细胞的部位、欲治疗的患者或动物的年龄、健康、性别和体重等。有用的量包括，例如1.6MIU(根据国际参考标准的百万国际单位)和8MIU交替日皮下给药。术语“治疗”意指任何导致症状、疾病、障碍等改善的效果。
有效量的IFN-β2可以与其它有效的试剂，如用于治疗癌、病毒、MS、肝炎和任何可以用IFN-β2治疗的病症的试剂一起给药。这些试剂可以是细胞毒性试剂、抗病毒剂、化学治疗试剂等。
本发明还涉及特异性识别本发明的IFN-β2的抗体。对IFN-β2具有特异性的抗体意指该抗体识别IFN-β2内或包括IFN-β2的确定的氨基酸序列，如图2的序列。因此，一般而言，特异性抗体与图2中发现的氨基酸序列，即表位的结合比其与其他表位结合的亲合力更大，例如所述亲和力通过免疫印迹测定或其它常规免疫测定来检测和/或测定。因此，对人IFN-β2的表位具有特异性的抗体用于检测样品中该表位的存在，这些样品如包含人IFN-β2基因产物的组织样品，从而将其与其中不存在该表位的样品区分开。有用的抗体是对独特的IFN-β2的C-末端而言的，如QGRPLNDMKQELTTEFRSPR或其片段。这些抗体的有用性如在Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz生物技术公司)，Research Product Catalog中所述，可以根据其进行配方。
抗体，如多克隆、单克隆、重组、嵌合、人源化抗体可以根据任何期望的方法制备。还参见筛选重组免疫球蛋白文库(如Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，863833-3837，1989；Huse等人，Science(科学)，2561275-1281，1989)；体外刺激淋巴细胞群；Winter和Milstein，Nature(自然)，349293-299，1991。例如，为了生产单克隆抗体，可以将图2的多肽，皮下和/或腹膜内，与佐剂一起或不与佐剂一起，以足以引起免疫应答的量给予小鼠、山羊或兔。抗体还可以是单链或Fab片段。这些抗体可以是IgM、IgG、亚型、IgG2a、IgG1等。还可以通过裸DNA给药产生抗体和免疫应答。例如，参见美国专利5,703,055、5,589,466、5,580,859。
用于诱导抗体的干扰素或其片段不需要具有生物活性；但是它们必须单独或与载体组合而具有免疫原活性。用于诱导IFN-β2-特异性抗体的肽可以具有由至少5个氨基酸，优选至少10个氨基酸组成的氨基酸序列。短的一段氨基酸序列，如5个氨基酸可以与其它蛋白质如钥孔血蓝蛋白的氨基酸或其它有用的载体和用于抗体生产的嵌合分子融合。用于制备抗体的IFN-β2的区域可以凭经验选择，或者可以分析由cDNA推导的IFN-β2的氨基酸序列以确定高免疫原性区域。Ausubel，F.M.等人(1989，Current Protocols in Molecular Biology(目前分子生物学的方案)，第2卷，John Wiley & Sons)描述了选择适宜表位的分析。
特定的IFN-β2抗体用于诊断前病理学症状和以IFN-β2的量或分布的差别为特征的慢性或急性疾病。IFN-β2的诊断试验包括使用抗体和标记检测人(或小鼠等，如果使用小鼠等的话)的体液、组织或这种组织的提取物中的IFN-β2的方法。抗体可以被中和或用于测定IFN-β2活性，如作为中和干扰素活性的对照。
本发明的多肽和抗体可以在修饰和不修饰的情况下使用。通常，通过将多肽和抗体与提供可检测信号的物质共价或非共价连接在一起而将它们标记。大量的标记和缀合技术是已知的，并广泛报道在科学和专利文献中。适宜的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光试剂、磁性颗粒等等。教导这些标记的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。
结合IFN-β2的抗体和其它配体可以多种方式使用，包括作为治疗、诊断和商业研究工具，如在蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、RIA等中，用于定量测定动物、组织、细胞等中的干扰素多肽水平，用于鉴定细胞位置和/或其分布，用于纯化其或包含其部分的多肽，用于调节其功能。本发明涉及这些分析、和进行分析的组合物试剂盒等。使用这些和其它方法，可以将本发明的抗体用于检测多种样品包括组织、细胞、体液、血、尿、脑脊液中的IFN-β2多肽或其片段。
此外，与本发明的IFN-β2多肽结合的配体或其衍生物也可以使用例如合成肽文库或类似方法制备(如Pitrung等人，美国专利5,143,854；Geysen等人，J.Immunol.Methods(免疫方法杂志)，102259-274，1987；Scott等人，Science(科学)，249386，1990；Blackwell等人，Science(科学)，2501104，1990；Tuerk等人，1990，Science(科学)，249505)。
本发明还涉及根据期望的方法制备的IFN-β2多肽，例如在美国专利5,434,050中公开的。标记的多肽可以用于例如结合分析，如鉴定结合或连接到IFN-β2上的物质，从而在体外、体内或在原位系统中示踪IFN-β2在细胞中的运动等。
核酸、多肽、抗体、IFN-β2等可以是分离的。“分离的”意指物质处于在其原始环境中或自然界未发现的形式，如更为浓缩、更为纯化、从组分中分离等。例如，分离的核酸包括具有从活动物中发现的染色体DNA分离的IFN-β2序列的核酸，例如作为完全基因、转录物或cDNA。此核酸可以是载体的部分或插入到染色体(通过特异性基因靶向或在除了其正常位置之外的位置进行无规整合)，且其仍是分离的原因在于它不处于在其天然环境中发现的形式。本发明的核酸或多肽还可以是基本上纯化的。基本上纯化的意指核酸或多肽是分离的，且基本上不含其它核酸或多肽，即核酸或多肽是主要和活性组分。
本发明还涉及一种转基因动物，例如非人哺乳动物，如小鼠，所述动物包含IFN-β2。转基因动物可以根据已知方法制造，例如这些方法包括将重组基因前核注射到1-细胞胚胎的前核中、将人工酵母染色体导入胚胎干细胞中、基因靶向法、胚胎干细胞方法。例如，参见美国专利4,736,866、4,873,191、4,873,316、5,082,779、5,304,489、5,174,986、5,175,384、5,175,385、5,221,778；Gordon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，777380-7384，1980；Palmiter等人，Cell(细胞)，41343-345，1985；Palmiter等人，Annu.Rev.Genet.，20465-499，1986；Askew等人，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)，134115-4124，1993；Games等人，Nature(自然)，373523-527，1995；Valancius和Smithies，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)，111402-1408，1991；Stacey等人，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)，141009-1016，1994；Hasty等人，Nature(自然)，350243-246，1995；Rubinstein等人，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，212613-2617，1993。可以将本发明的核酸引入任何非人哺乳动物，包括小鼠(Hogan等人，Manipulating theMouse Embryo(操控小鼠胚胎)A Laboratory Manual(实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约，1986)、猪(Hammer等人，Nature(自然)，315343-345，1985)、羊(Hammer等人，Nature(自然)，315343-345，1985)、牛、大鼠或灵长类。还参见例如Church，Trends in Biotech.(生物技术趋势)，513-19，1987；Clark等人，Trends in Biotech.(生物技术趋势)，520-24，1987)；和DePamphilis等人，BioTechniques(生物技术)，6662-680，1988)。此外，定制的转基因大鼠和小鼠生产是可商购的。这些转基因动物是有用的动物模型，用于测试IFN-β2功能，作为蛇的食物，作为检测菌株来源的基因标记(即其中已插入IFN-β2或其片段)等。这些转基因动物还可以包含其它转基因。转基因动物可以根据任何适宜的方法制备和使用。
本发明还涉及一种哺乳动物细胞，其中编码IFN-β2的基因的表达已被剔除(knock out)或破坏。这种基因破坏可以通过一种有效的方法实现，如包括反义，或通过向其中插入有效抑制基因表达的核苷酸序列而实现。在此意义上术语“基因”意指IFN-β2编码序列，它存在于染色体上，且包括它的启动子序列和其它调节区。
本发明特别涉及包含一种或多种细胞的哺乳动物，其中基因的表达被功能性失活或破坏。功能性失活或破坏指部分或完全降低至少一部分由哺乳动物的单细胞、选择的细胞或所有细胞的内源IFN-β2基因编码的多肽的表达。术语“剔除”是基因功能性失活的同义语。
在一个实施方案中，使用基因靶向策略促进将期望的核苷酸序列导入IFN-β2基因。基因靶向策略优选使用双交互重组和正选择标记以帮助将核苷酸序列插入靶核酸内。靶核酸优选是基因，更优选在其特定染色体基因座上的基因。以如下方式将期望的核苷酸序列插入基因基因被功能性破坏，即它的表达被部分或完全降低。
在本发明的一方面，使用靶向载体以将选择性标记插入IFN-β2基因的预定位置。选择此位置以在插入选择性标记后立即实现基因的功能性破坏。为此目的，一个优选的实施方案是包含以下的重组核酸分子(1)在哺乳动物IFN-β2基因的第一预定位置有效地实现同源性重组的5′核苷酸序列，该序列可操纵地连接到(2)赋予其存在的细胞第一选择特征的第一选择性核苷酸序列的5′端，和(3)在哺乳动物IFN-β2基因的第二预定位置，如IFN-β2基因有效地实现同源性重组的3′核苷酸序列，其可操纵地连接到第一选择性核苷酸序列的3′端。重组核酸分子有效地实现在哺乳动物染色体的预定位置的同源性重组。靶向载体的片段也在本发明的范围内，如包含元件(1)和(2)，或包含元件(2)和(3)的重组核酸分子等。
术语重组指已被手工修饰的核酸分子，如包含来自不同来源的核酸片段或来自己改造的一种来源的核酸分子。因此，核酸分子是重组的，因为它包含来自哺乳动物IFN-β2基因的核苷酸序列和选择性标记基因。当分子包含来自相同基因的序列，但以自然界不存在的方式排列，即非天然存在的排列时，其也是重组的。
同源性重组指这样的方法，其中具有类似基因信息的核酸分子并排地排列并交换核苷酸链。因此有效地在靶核酸的预定位置实现同源性重组的重组核酸的核苷酸序列指促进重组核酸分子之间在靶基因，如小鼠IFN-β2基因的预定位置的核苷酸链交换的核苷酸序列。有效的核苷酸序列一般包括与期望的靶核酸分子(如欲被修饰的基因座)互补，促进核苷酸碱基配对的核苷酸序列。可以使用任何核苷酸序列，只要它促进在靶核酸分子的特定和选定位置进行同源性重组。一般地，靶向效率指数依赖于靶向载体和靶基因座之间的同源性的范围和长度。在诸如以下的文献中描述了对同源性重组有效的序列的选择和使用Deng和Capecchi，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)，123365-3371，1992；Bollag等人，Annu.Rev.Genet.，23199-225，1989；Waldman和Liskay，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)，85350-5357，1988。
本发明的一方面是抑制或功能性破坏IFN-β2基因的表达。短语“基因的破坏”、“基因破坏”、“抑制表达”、“基因抑制”、“基因的功能性失活”或“功能性基因失活”指以降低或阻止该基因的表达和/或它在细胞中的产生的方式进行的基因修饰。基因产物的表达可以完全或仅部分被抑制，如降低70％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。功能性破坏的基因，如功能性破坏的IFN-β2基因包括表达短于野生型基因的整个编码序列的截短的多肽的修饰基因。这种基因如图1所示。还可以通过影响基因的mRNA结构以创造不可翻译的信息，如移码、降低稳定性等，从而功能性破坏基因。
根据本发明，将IFN-β2基因修饰以使其有效地破坏相应的基因产物的表达。因此，例如功能性破坏的重组IFN-β2基因不表达功能性IFN-β2多肽或以小于IFN-β2的野生型水平的水平表达功能性IFN-β2多肽，例如表达水平降低70％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。“非功能性”或“功能性失活”IFN-β2多肽意指例如IFN-β2缺乏一种或多种其生物活性。该基因的修饰可以在任何有效的位置，如增强子、启动子、调节区、非编码序列、编码序列、内含子、外显子等，以降低或阻止该基因在细胞中的表达。插入IFN-β2基因，如鼠IFN-β2基因的某一区域可以通过同源性重组完成。将包含基因同源性区域和编码选择性标记基因的核苷酸序列的重组核酸分子插入到IFN-β2的启动子和/或编码区和/或非编码区，从而功能性破坏基因的表达。当然后将这种剔除的构建物(knockout construct)插入细胞时，可以将此构建物整合入基因组DNA。因此，该细胞的子代将只表达该基因的仅有的一个功能性拷贝；其它拷贝将不再表达基因产物，或将低水平表达其，因为此基因的内源性核苷酸序列被插入的核苷酸序列破坏。如果需要的话，可以在另一个类似的步骤中激活该功能基因。
对同源性重组有效的核苷酸序列可以可操纵地连接到核苷酸序列，优选选择性标记核苷酸序列或基因上，所述序列将插入期望的靶核酸中。
重组核酸优选插入含染色体DNA的细胞中，所述DNA包含欲被剔除的内源性基因。在细胞中，重组核酸分子可以通过同源性重组和细胞的DNA整合，整合的位置为阻止或中断欲被剔除的基因的转录的位置。这种插入通常通过同源性重组而发生(即与内源性DNA序列同源或互补的靶向载体的区域在细胞中插入靶向载体时彼此杂交；然后这些区域重组以使部分靶向载体导入内DNA的相应位置。
如所讨论的，可以将一个或多个核苷酸序列插入基因中以抑制它的表达。期望确定此基因中插入的核苷酸序列的存在。这可以多种方式实现，包括通过核酸杂交、抗体结合到由插入的核酸编码的表位，或通过选择插入序列的表型。因此，这种插入的核苷酸序列可以称为第一选择性核苷酸序列。第一选择性核苷酸序列优选赋予其存在的细胞第一选择特征。短语“选择特征”意指例如在细胞中表达且可以优先于另一个或其它特征被选择的特征。选择性核苷酸序列，也称为选择性标记基因，可以是任何在其被导入哺乳动物基因组DNA后可被检测和/或分析的核酸分子。选择特征可以是正特征，即细胞表达或获得的，且其存在使这种细胞的选择成为可能的特征。正选择特征可以使细胞或生物的存活，如抗生素耐药性、耐乌本苷(一种耐乌本苷钠/钾ATP酶蛋白的基因)成为可能。正选择特征的实例和相应的选择试剂包括Neo和G418或卡那霉素；Hyg和潮霉素、hisD和组氨醇；Gpt和黄嘌呤；Ble和博莱霉素；Hprt和次黄嘌呤。例如参见美国专利5,464,764和Capecchi，Science(科学)，2441288-1292，1989。还可以使用识别可选择基因的产物的结合配体鉴定靶序列中选择性基因的存在，例如可以使用抗体鉴定由该选择性基因编码的多肽产物，可以使用适宜的配体鉴定由该选择性基因编码的受体多肽，或通过分析由该选择性基因编码的酶的表达而鉴定靶序列中选择性基因的存在。优选地，该选择性基因编码不天然存在于哺乳动物的多肽。
该选择性标记基因可以可操纵地连接到它本身的启动子或来自任何具有活性或可在其插入的细胞中被容易地激活的其它来源的另一种启动子。但是，选择性标记基因不需要连接其本身的启动子，而使用其插入的基因的启动子可以将其转录。选择性标记基因可以包含一种或多种用于驱动和/或帮助其表达的序列，包括例如核糖体识别序列、增强子序列、赋予多肽或RNA稳定性的序列和/或连接在3′端以终止基因转录的序列。
正选择性标记促进重组体的选择，所述重组体中正选择性标记已通过同源性重组整合到靶核酸中。本发明的基因靶向载体还可以进一步包含由第二选择性基因编码的第二选择特征以进一步帮助正确选择靶向重组体。负选择标记不允许选择其中只发生非同源性重组的细胞。在一个优选的实施方案中，第二选择性标记基因赋予其已导入的细胞负选择特征。这些负选择特征可以安排在靶向载体上以使它可被用于区分无规整合事件和同源性重组。术语负选择意指这样的选择特征当细胞获得这种选择特征时，导致细胞存活能力的丧失(即它对细胞而言是致死的)。核苷类似物，更昔洛韦(gancyclovir)，对表达HSV tk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)的细胞具有优先毒性，它可以用作负选择试剂，因为它选择不具有整合的HSV tk选择性标记的细胞。FIAU(1，2-脱氧-2-氟-α-d-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶)也可以用作选择试剂，用以选择缺乏HSV tk的细胞。其它负选择性标记可以类似地使用。负选择特征的实例是相应的胸苷激酶(HSV tk)和阿昔洛韦、更昔洛韦或FIAU；Hprt和6-硫鸟嘌呤或6-硫黄嘌呤；白喉毒素；蓖麻毒蛋白毒素；胞嘧啶脱氨基酶和5-氟胞嘧啶。
负选择性标记一般排列在基因靶向载体5′或3′至重组基因同源区，从而使同源区的双交换置换重组将正选择性标记转移到靶核酸的预定位置，但不转移负选择性标记。例如，tk盒可以位于鼠基因的3′端，从3′终止密码子数大约150个碱基对。还可以在靶向载体中使用多于一个负选择性标记。例如两种负选择载体在靶向载体的5′和3′端的定位进一步增强不选择具有无规整合载体的靶细胞。无规整合有时导致载体的重排，造成无规整合之前的全部或部分负选择性标记的切除。当这种情况发生时，负选择不能用于消除已通过无规整合而不是同源性重组导入靶向载体的细胞。多于一种负选择性标记的使用基本上增大了无规整合导致插入至少一种负选择性标记的可能性。为此目的，负选择性标记可以相同或不同。
正-负选择方案的使用减少了具有不正确整合的靶向构建物序列的细胞的背景。正-负选择一般包括使用两种活性选择性标记(1)可以在无规整合或同源靶向之后稳定表达的正选择性标记(如neo)，和(2)仅可以在无规整合之后稳定表达的负选择性标记(如tk)。通过组合正和负选择，可以有效地获得具有正确靶向同源性重组事件的宿主细胞。正-负选择方案描述于例如美国专利5,464,764、WO 94/06908。但是应认识到，对于实施本发明，如生产其中IFN-β2基因被功能性失活或破坏的转基因动物来说，不需要一种或多种负选择性标记。
本发明的重组核酸分子还可以包含整个载体或其部分。载体是，例如可以在宿主细胞中自主复制，如包含复制区的核酸分子。载体可以用于进行操控，以在期望的宿主中增殖和/或获得大量重组分子。本领域技术人员可以根据期望的目的选择载体，例如为了在细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞中增殖重组分子。例如以下举例提供的载体。细菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、Phagescript、φX174、pBKPhagemid、pNH8A、pNH16a、pNH18Z、pNH46A(Stratagene)；Bluescript KS+II(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核生物的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、PBPV、PMSG、pSVL(Pharmacia)。但是，可以使用任何其它载体，例如质粒、病毒或它们的部分，只要它们在期望的宿主中可复制和可存活。载体还可以包含能够在其基因组要被修饰的宿主中复制的序列。这种载体的使用可以延长重组能够发生的相互作用时间，增大靶向效率。在Molecular Biology(分子生物学)，Ausubel，F.M.等人编，Unit9.16，图9.16.1(pNTK)中描述了可以根据本发明使用的基因靶向载体的实例。
根据本发明的一方面，可以通过在IFN-β2基因中插入外源或异源序列，中断其功能，从而破坏或剔除IFN-β2基因的功能。例如，可以将外源或异源序列插入IFN-β2基因的第一起始密码子之前的区域。可以通过同源性重组将编码选择性特征的核苷酸序列插入IFN-β2基因，从而使其可操纵地连接于IFN-β2基因的内源启动子。在将选择性标记基因整合入IFN-β2基因的期望的预定位置后，立即由内源IFN-β2基因启动子驱动选择性特征的表达，从而允许对其整合入的细胞进行检测。
还可以将选择性标记基因整合到IFN-β2基因的第一起始密码子的3′下游位置。可以使IFN-β2基因在读框外或读框内整合IFN-β2多肽以制备融合多肽，其中融合多肽的活性小于正常产物的活性。通过仅检测表达这些特征的细胞便可以选择在期望的位置含有整合的序列的细胞。进行这种选择的一种方便的方法是利用抗生素耐药性。以下实施例中，利用新霉素耐药性作为选择性特征。通常，在毒性浓度的新霉素存在下的细胞生长将死亡。通过同源性重组而获得新霉素耐药性拯救细胞免受致死影响，从而促进它们的选择。
通过整合事件将IFN-β2基因剔除或功能性中断。在IFN-β2编码序列之前插入选择性基因有效地将它与启动子序列分离，使其不能表达。如果选择性基因含有转录终止子，则使用IFN-β2启动子的基因转录将在其后立即终止，且很少导致IFN-β2编码序列的转录。还可以通过无置换的缺失，如基因的部分的定向缺失而将IFN-β2基因剔除。缺失的区域可以是该基因的调节区的编码区。
可以在任何期望的位置修饰IFN-β2基因。可以修饰其从而产生具有完整IFN-β2多肽的一种或多种活性的截短的IFN-β2多肽。
如果期望，可以将插入从重组基因中除去。在实施例中，新霉素盒置换小鼠IFN-β2基因的外显子，从而将其功能性失活。随后可以从IFN-β2基因中除去该新霉素盒，如使用重组酶系统。Cre-lox位点特异性重组系统对于从重组基因中除去序列而言特别有用。为了使用Cre-lox系统，将重组酶识别位点和选择性基因一起整合入染色体，以方便其后将其除去。关于重组酶切割系统的指导，例如参见美国专利5,626,159、5,527,695和5,434,066。还参见Orban，P.C.等人，“Tissue-and Site-Specific DNA Recombination in Transgenic Mice(转基因动物中的组织和位点特异性DNA重组)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896861-6865，1992；O′Gorman，S.等人，“Recombinase-Mediated Gene Activation and Site-Specific Integration in MammalianCells(重组酶介导的哺乳动物细胞的基因激活和位点特异性整合)”，Science(科学)，2511351-1355，1991；Sauer，B.等人，“Cre-stimulatedrecombination at loxP-Containing DNA Sequences placed into themammalian genome(在置于哺乳动物基因组内的含loxP的DNA序列中进行Cre刺激的重组)”，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，17(1)147-161，1989。
关于核酸的其它方面，参见分子生物学的标准教科书。例如，参见Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学中的基本方法)，Elsevir Sciences Publishing，Inc.，New York，1986；Hames等人，Nucleic acid Hybridization(核酸杂交)，IL Press，1985；Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，CSH Press，1989；Howe，Gene Cloning and Manipulation(基因克隆和操控)，CambridgeUniversity Press，1995。
实施例IFN-β2的表达和纯化。通过SDS-PAGE比较纯化的IFN-β2和IFN-β1b。IFN-β2的表观分子量为26kDa，所述分子量由SDS-PAGE测定，而IFN-β1b的表观分子量为大约20.5kDa。方法设计PCR引物(5′-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTCTAA-3′和5′-GCG CGC GCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GATTAT-3′)以扩增来自人基因组DNA制剂的去掉信号序列的IFN-β2的编码区，用于随后连接到IPTG可诱导的pet5a表达载体(Promega公司)。在诱导之后，从大肠杆菌包含体分离IFN-β2并使用Zwittergent3-14(Russell-Harde等人，J.interferon Cytokine Res.(干扰素细胞因子研究杂志)，15，31-37，1995)将其溶解。使用离子交换层析，然后使用大小排阻层析，进行从溶解的包含体纯化IFN-β2。从SDS-PAGE凝胶洗脱26kDa条带，对应于IFN-β2，并通过N-末端蛋白测序进行分析。最初的10个氨基酸对应于预期的IFN-β2的氨基酸。而且，进行溴化氰消化，得到几个片段，将所述片段测序，发现它们具有预期的蛋白质序列，表明已成功地表达和纯化完整蛋白。
IFN-β2激活干扰素依赖性ISRE-萤光素酶报道基因.用含有ISRE-萤光素酶构建物的质粒转染T98G细胞，并分离表达该构建物的稳定克隆。将3×104个细胞放置过夜，并加入指定浓度的纯化的IFN-β2。4小时后，如在试剂盒方案(Promega Cat.#E1501)中所述，使用萤光素酶测定试剂盒测定细胞的萤光素酶活性。IFN-β2特异性地激活干扰素依赖性ISRE报道基因。参见图6。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的性质。
用抗IFN-β2小鼠多克隆抗体抑制IFN-β2与人I型干扰素受体结合。合成对应于IFN-β2独特的C末端区的肽(KLSKQGRPLNDMKQELTTEFR)，将其偶联于KLH并用于免疫Swiss-Webster小鼠，两个月内总共进行四次免疫。免疫后，收集血清，证明它含有特异性结合IFN-β2的抗体。而且，抗IFN-β2血清阻断由IFN-β2导致的IFN依赖性ISRE-萤光素酶报道基因的诱导。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的功能性质。方法将3×104个细胞放置过夜，并在抗IFN-β2血清或正常小鼠血清的存在下，于4小时内加入20ng IFN-β2，然后使用萤光素酶测定试剂盒和Promega公司的标准方案测定诱导的萤光素酶的存在。参见图7。
IFN-β1b和IFN-β2对人HT1080细胞增殖的影响。IFN-β1b和IFN-β2对HT1080细胞和HT1080IFNAR2c细胞均有抗增殖作用。这由Alamar Blue测定组(图8A和B)和目视检查证明。抗增殖作用与受体数目增加有关，这由HT1080IFNAR2c细胞的作用增加证明，与HT1080细胞相比，HT1080IFNAR2c细胞具有5倍的IFN结合位点数目。采用这种测定，IFN-β2表现出类似于IFN-β1b的功能性质。方法HT1080IFNAR2c细胞为过度表达IFNAR2c的HT1080细胞。这些细胞与亲本HT1080细胞相比具有5倍的IFN结合位点。将2-5×104细胞/ml放置过夜，未接受刺激或接受1μg/ml、500ng/ml、200ng/ml或50ng/ml IFN-β2的刺激。但是，HT1080接受1μg/ml、500ng/ml或200ng/ml IFN-β2刺激，而HT1080IFNAR2c细胞接受500ng/ml、200ng/ml或50ng/ml IFN-β2的刺激。采用标准方案，使用Alamar Blue(美国专利5,501,959)测定细胞增殖，并在代表范围内的每个时间点拍照。每天更换含干扰素的培养基。所有的处理均进行三份。参见图8。
由短期3[H]胸苷结合测定的IFN-β2对人HT1080细胞的抗增殖活性。在加入IFN-β2(反萃取柱)或缓冲对照(填充柱)后48小时测定3[H]胸苷结合。3[H]胸苷结合表示为结合的CPM/106细胞。数据(图9)代表n＝3的平均值，而平行样品之间的变分小于15％。IFN-β2显著降低胸苷结合，如降低大约86％。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的功能性质。方法在24孔细胞培养平板中接种(2×104细胞/孔)细胞，温育过夜，然后用IFN-β2(1μg/ml)刺激24小时。然后在含有3[H]胸苷([甲基-3H]胸苷，比活性＝40-60Ci/mmol，Amersham Life Science)的完全培养基中培养细胞，并在在24小时后收集细胞。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，然后用10％三氯乙酸(TCA)和100％乙醇洗涤。在测定放射性结合之前，将细胞溶解于1M氢氧化钾并与Ecolume闪烁流体混合。
由IFN-β2激活I型IFN受体。IFN-β2诱导人I型IFN受体的IFNAR2c受体链的酪氨酸磷酸化。不刺激(unstim.)细胞或用人IFN-α2、IFN-β1b或IFN-β2刺激细胞(1000-2000相对单位/106细胞，15分钟)。在存在而不是不存在干扰素下观测到磷酸化作用。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的功能性质。方法将表达IFNAR2c的Daudi细胞(5×107细胞)溶解于溶胞缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，含有1％Nonidet-40(v/v)(NP-40)，150mM氯化钠，1mM EDTA，2.5％甘油(v/v)，1.0mM氟化钠，1.0mM原钒酸钠，1.0mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.5μg/ml亮抑酶肽(leupeptin)和5.0μg/ml胰蛋白酶抑制剂)，4℃下持续30分钟，并离心除去不溶物质。为了进行免疫沉淀，将IFNAR2c抗血清(+)或阴性对照抗血清(-)加到各样品中，温育过夜，与蛋白-G琼脂糖(Boehringer-Mannheim)混合，并通过SDS-PAGE(10％Novex凝胶)分离。将蛋白质转移入聚偏二氟乙烯滤器(Pro-Blot)，并在4℃下在封闭缓冲液(20mMTris-HCl，pH7.5，含有0.1％Tween20(v/v)、150mM氯化钠、1mMEDTA、1.0mM氟化钠、1.0mM原矾酸钠、1.0mM PMSF、0.5μg/ml亮抑酶肽和5.0μg/ml胰蛋白酶抑制剂)中温育过夜，与抗磷酸酪氨酸抗体(ab PY99，Santa Cruz Biotechnology，Inc.Santa Cruz，CA)一起温育并在封闭缓冲液中洗涤。洗涤后，将膜与偶联于辣根过氧化物酶(HRP)的特异性第二抗体(1∶1000稀释)一起温育1小时，在封闭缓冲液中洗涤3次，并使用化学发光检测法显色(Pierce)。
通过用IFN-β2刺激进行Daudi细胞中的STAT1和STAT2激活。用IFN-β1b或IFN-β2(1000-2000相对单位/106细胞)刺激Daudi细胞15分钟，将其溶解于溶胞缓冲液中并免疫沉淀STAT1和STAT2。免疫沉淀之后，使用磷酸酪氨酸特异性抗体检测两种IFN类型的STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化作用。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的功能性质。方法将Daudi细胞(1×107细胞)溶解于溶胞缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，含有1％Nonidet-40(v/v)(NP-40)、150mM氯化钠、1mMEDTA、2.5％甘油(v/v)、1.0mM氟化钠、1.0mM原矾酸钠、1.0mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.5μg/ml亮抑酶肽和5.0μg/ml胰蛋白酶抑制剂)，4℃下持续30分钟，并离心除去不溶物质。为了进行免疫沉淀，将STAT1和2抗体(分别为Stat1 p91和Stat 2(C-20)，Santa CruzBiotechnology，Inc.Santa Cruz，CA)加入各样品中，温育过夜，与蛋白质-G琼脂糖(Boehringer-Mannheim)混合，并通过SDS-PAGE(10％Novex凝胶)分离。将蛋白质转移入聚偏二氟乙烯滤器(Pro-Blot)，并在4℃下在封闭缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，含有0.1％Tween20(v/v)、150mM氯化钠、1mM EDTA、1.0mM氟化钠、1.0mM原矾酸钠、1.0mM PMSF、0.5μg/ml亮抑酶肽和5.0μg/ml胰蛋白酶抑制剂)中温育过夜，与抗磷酸酪氨酸抗体(PY99，Santa CruzBiotechnology，Inc.Santa Cruz，CA)一起温育并在封闭缓冲液中洗涤。洗涤后，将膜与偶联于辣根过氧化物酶(HRP)的特异性第二抗体(1∶1000稀释)一起温育1小时，在封闭缓冲液中洗涤3次，并使用化学发光检测法显色(Pierce)。
IFN-β2和IFN-β1b的抗病毒活性。用IFN-β1b或IFN-β2刺激人WISH细胞，然后用疱疹性口炎病毒(VSV)感染。用氧化还原染料Alamar Blue测定病毒性细胞病变作用(CPE)。与IFN-β1b对应的抗病毒活性单元沿X轴绘制。测定IFN-β2的特异性抗病毒为每mg4.0-8.0×106国际单位(“IU”)。参见图10。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的功能性质。方法将WISH细胞(30000细胞/孔)置于96孔Falcon微滴板上并使其吸附过夜。用IFN-β1b(1000IU，在第一孔中；比活性＝2.5×107IU/ml)或IFN-β2(1μg，在第一孔中)刺激细胞，通过平板稀释1∶1，进行6小时，然后在18小时内加入VSV(7×103空斑形成单位/孔，(PFU))。温育后，除去培养基，将100μl Alamar Blue(BiosourceInternational)(生产商提供的贮备液在培养基中1∶10稀释)加入各孔中。在37℃下温育30-60分钟后，通过测定600nm处的吸光度来测定CPE。
IFN-β2与IFN-α2竞争与HT1080细胞上的I型IFN受体结合。将1×106HT1080细胞与15ng/ml32P-标记的IFN-α2(PestkaBiomedical#51100)在全细胞培养基(10％FBS，DMEM)中一起温育。温育后，用细胞培养基洗涤细胞两次，将其溶解于1％SDS中，与闪烁流体混合并计数。15μg/ml IFN-β2竞争大于90％的结合于HT1080细胞的标记的IFN-β2。测定进行三份，标准偏差小于10％。参见图11。
IFN-β2竞争性结合Daudi细胞上的I型IFN受体。用磷酸化形式的IFN-α2进行竞争性配体结合测定。将配体磷酸化(比活性为60-62μCi/μg)，如在Croze，E.，等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，27133165-33168，1996中所述。分析结合数据，如在Scatchard，G.，Ann.N.Y Acad.Sci.，51，660-672，1965中所述。在100倍过量的未标记的IFN存在下测定非特异性结合。通过温育增加量的未标记的IFN-α2、IFN-β1b或IFN-β2和恒定量的磷酸化的IFN-α2测定不同IFN的竞争性结合。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的功能性质。
I型IFN受体的IFN-β特异性组配。IFN-β1b以不同于IFN-α2的方式与I型IFN受体相互作用。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的功能性质。方法在37℃下在CO2恒温箱中用浓度为200IU/106细胞的IFN刺激细胞(1×108)15分钟。处理后，在4℃下通过离心(3000×g，3分钟)快速收集细胞，并立即溶解于冰冷的溶胞缓冲液(100mM Tris，pH8.0，含有150mM NaCl、10％甘油(v/v)、1％NP-40(v/v)、1mM原矾酸盐、1mM焦磷酸钠、1mM氟化钠、1mM EDTA、1mM苯甲基磺酰氟、5μg/ml亮抑酶肽和5μg/ml胰蛋白酶抑制剂)。4℃下将溶胞产物离心(16000×g，30分钟)，并收集上清液。使用如在Croze，E.，等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，271，33165-33168，1996中所述的抗IFNAR1抗体或IFNAR2.2兔多克隆抗血清(10μl抗血清/108细胞)免疫沉淀细胞溶胞产物，然后使用Novex8％ Tris-甘氨酸凝胶进行SDS-PAGE分析。电泳后，将蛋白质转移入聚偏二氟乙烯(PVDF)滤器(Pro-Blot)，在室温下用以下物质封闭过夜20mM Tris，pH8.0，含有150mM NaCl、1mM原矾酸盐、1mM焦磷酸钠、1mM氟化钠、1mM PMSF和0.1％Tween20。然后在室温下将滤器与针对抗IFNAR1的抗体(40H2，0.1μg/ml，如在Croze，E.，等人，J Biol.Chem.(分子生物学)，271，33165-33168，1996中所述)或针对IFNAR2的抗体(10μl抗血清/10ml封闭缓冲液)一起温育2-3小时，随后用封闭缓冲液洗涤10分钟。然后在室温下将洗涤的滤器与相应的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的第二抗体一起温育2-3小时，洗涤并用化学发光法显色(增强的化学发光检测试剂盒，Pierce)。
不同种类的干扰素优先诱导基因。干扰素诱导培养细胞中的基因的重叠(overlapping)、不种组(distinct set)。用人IFN-α2(1000IU/106细胞)、IFN-β1b(1000IU/106细胞)、IFN-γ(1000IU/106细胞)或IFN-β2(1000IU/106细胞)刺激Daudi或HT1080细胞17小时，并收集和处理全部细胞粒状沉淀用于TaqMan分析，如在TaqManGold RT-PCR Protocol Manual(TaqMan黄金RT-PCR方案手册)，AppliedBiosystems(应用生物系统)，Perkin-Elmer Corporation P/N402876Rev.A1997中所述。为了进行基因表达的核糖核酸酶保护测定，如在Sandhya，R.等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，271，22878-22884，1996中所述，刺激并收集细胞。将由IFN-β1b优先诱导的基因归一化为ISG6-16，由IFN-α和IFN-β等同诱导的基因的表达。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的功能性质。
应答IFN-β2的人胎儿星形胶质细胞的抗增殖。星形胶质细胞引起MS损伤的产生，而在这里我们证明IFN-β2在体外抑制人胎儿星形胶质细胞的增殖。这种观测结果提示IFN-β2可以用作星形胶质细胞增殖的生长调节剂，从而防止MS中反应性胶质损伤的形成。采用这种测定，IFN-β2表现出与IFN-β1b类似的功能性质。方法(A)星形神经胶质细胞培养物的制备由2个不同的17-22周妊娠的胎儿脑制备来自人胎儿脑的富含星形胶质细胞的培养物。从Advanced Bioscience Resource Inc.，在合法治疗性流产之后获得组织。除去脑脊膜之后，将脑解剖并通过温和移液而分离成单细胞悬浮液，然后使它们过筛。在含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素混合剂的存在下将细胞再悬浮在含10％FCS的Iscove培养基中，并在一周内每天通过示差吸附技术除去小胶质细胞。然后使星形胶质细胞生长至少8-10周，并每周进料(feed)两次。污染的小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞祖细胞不能存在活在这些长期培养条件中。在此段时期结束时，用GFAP、O4和巢蛋白(nestin)抗体将培养物染色，证实含大于95％的纯星形胶质细胞。将培养物在液N2中冷冻，然后将它们用于增殖测定。(B)增殖测定星形胶质细胞起始于冷冻的贮备液，并在用于增殖测定之前在上述培养基中生长至少两个传代。以2×104细胞/ml将细胞与或不与10ng/ml EGF(R & D System)一起置于96孔平板中。在低血清培养基(2％FCS)中进行测定。用指定稀释的IFN-β2(1mg/ml贮备液)或缓冲对照处理培养物。温育4天后，将培养物与3H-胸苷一起温育过夜，并在收集前将平板冷冻。
IFN-β2在多发性硬化的啮齿动物模型中的活性。实验性变应性脑脊髓炎(EAE)广泛用作多发性硬化的动物模型(Swanborg，G.，Clin.Immunol.Immunopathol.(临床免疫学和免疫病理学)，77，4-13，1995；Martin，R.和McFarland，H.，Sprircgeroge Semin.Immurzopathol.，18，1-24，1996)。IFN-β1b在这些相关的MS模型中显示体内功效。采用这些模型，IFN-β2表现出与IFN-β31b类似的功能性质。方法(A)SJL小鼠中的被动转移实验性变应性脑脊髓炎动物和材料8周龄雌性SJL小鼠(Jackson Laboratories)；RPMI1640，含L-谷氨酰胺和25mM HERPES、1X，0.1微米过滤(LifeTechnologies，Cat#22400-089)；FBS，确定的(Hyclone，热失活，Cat#SH30070.01)；MEM非必需氨基酸溶液，10mM，100X(LifeTechnologies，Cat#11140-050)；2-巯基乙醇，1000X，5.5×10-2M，在D-PBS中(Life Technologies，Cat#21985-023)；青霉素/链霉素，10000U/μg/ml(Bio-Whiftaker，Cat#17-602E)；Hank′s Balanced SaltSolution(Hank’s平衡盐溶液)，1X，0.1微米过滤(Life Technologies；Cat#24020-117)；实验皮下(分开在尾基部和上背面)注射0.1ml在完全弗氏佐剂(“CFA”)中的150μg蛋白脂质蛋白(“PLP”)和200μg结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Ra(研磨)对8周龄雌性SJL小鼠进行免疫。11天后，切除小鼠的轴突(axial)淋巴结、肱淋巴结和腹股沟淋巴结细胞，并在以下培养基(向450ml RPMI 1640(含L-谷氨酰胺和HEPES)中加入50ml FBS、0.455ml 2-巯基乙醇、5.0ml Pen/Strep和5.0ml非必需氨基酸)以6×106细胞/ml进行培养。将PLP加入细胞以获得最终50μg/ml的浓度。将细胞在37℃下在7％CO2中温育72小时。收集细胞，并用HBSS洗涤两次。通过台盼蓝排阻评价淋巴结细胞的存活能力。将淋巴结细胞的浓度调节到4×107细胞/ml的浓度。给年幼8周龄的雌性SJL小鼠腹膜内注射2×107淋巴结细胞/小鼠(剂量体积＝0.5ml)。将小鼠称重并每日打分。如果需要，给予IFN-β2和IFN-β1b治疗。临床评价(EAE打分/症状)0/正常；1/跛行尾；2/难以直立；3/一只或两只后肢不完全麻痹；4/一只或两只后肢完全麻痹；5/不动、濒死或死亡。(B)Lewis大鼠中的急性实验性变应性脑脊髓炎动物和材料雌性Lewis大鼠(Charles River)，在8周龄时免疫；脊髓均浆制剂(来自雄性Hartley豚鼠，Simonsen Labs，Gilroy)用CO2将500-700克的豚鼠处死。使用锋利的骨剪刀切开椎骨取出脊髓，用盐水洗涤、吸干一次，并在-80℃下贮藏直到使用。然后将脊髓称重，并用1g/ml盐水均化；抗原乳液将豚鼠脊髓均浆与含1mg/ml结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)(用研钵和杵研磨)的CFA(Difco，底特律，密歇根州)1∶1混合。将0.05ml注射入每只后肢的脚掌，每只大鼠总共注射0.1ml。
实验在第1天用一次推注对大鼠进行免疫。每天将大鼠称重并打分。如果需要，给予IFN-β2和IFN-β1b治疗。临床评价(EAE打分/症状)0/正常；1/跛行尾；2/一只或两只后肢不完全麻痹；3/一只后肢完全麻痹或两只后肢可以移动但不能有助于身体的运动；4/两只后肢完全麻痹；5/后肢完全麻痹和一只或两只前肢虚弱或濒死，或死亡。
前面的描述最大范围地使用本发明。因此，前述优选的具体实施方案应理解为只是一种例示，而不是以任何方式限制说明书的其它部分。以上和图中所引用的所有申请、专利和出版物均引入作为参考。
权利要求
1.一种用于治疗哺乳动物的多发性硬化的药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的图2的人IFN-β2多肽、其生物活性片段或其生物活性衍生物。
2.权利要求1的药物组合物，其中需要其的哺乳动物是人。
3.一种将用于哺乳动物的多发性硬化的药物组合物给予需要其的哺乳动物的方法，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的图2的人IFN-β2多肽、其生物活性片段或其生物活性衍生物。
4.权利要求3的方法，其中需要其的哺乳动物是人。
5.一种用于治疗哺乳动物的多发性硬化的药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的人IFN-β2多肽、其生物活性片段或其生物活性衍生物。
6.一种将用于哺乳动物的多发性硬化的药物组合物给予需要其的哺乳动物的方法，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的人IFN-β2多肽、其生物活性片段或其生物活性衍生物。
全文摘要
本发明涉及新的核酸和多肽序列，它们编码干扰素－β－2(“IFN－β2”)。一种包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的人IFN－β2多肽，其生物活性片段或其生物活性衍生物的组合物用于治疗人的多发性硬化。
文档编号A61P25/28GK1436086SQ01811184
公开日2003年8月13日 申请日期2001年6月18日 优先权日2000年6月16日
发明者爱德华·M·克罗兹, 达里亚尔·福尔兹, T·查尔斯·瓦格纳 申请人:舍林股份公司