一种记忆力增强蛋白的制作方法

专利名称：：一种记忆力增强蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明提供一些方法，用于增强包括人类在内的动物的记忆力。本发明还涉及一些方法，该方法通过给予有效剂量的非典型形式的蛋白激酶C来治疗脑或脊髓的损伤，其中蛋白激酶C包括蛋白激酶Mζ(PKMζ)。本发明还提供一种方法，该方法通过给予有效剂量的一种PKMζ抑制剂来引发遗忘症。大量研究这些信号传递通路的工作都开始于关于突触对高频传入刺激的反应的研究，该反应引起突触传递的长时增加，即长时程增强(LTP)(Blissetal.(1993)，同上；Blissetal.(1973)J.Physiol.232331-356；Nicolletal.(1988)197-103)。在LTP中，绝大多数信号分子只影响诱导阶段，而不是维持阶段。例外是一些能抑制蛋白激酶的催化域的制剂，具体地说，是蛋白激酶C(PKC)，它既能阻断LTP的诱导，又能逆转LTP的维持状态。(Nishizuka，Y(1988)Nature334661-665；Shwartz，J.H.(1993)同上；Schwartzetal.(1987)同上)这两个阶段可以用实验方法加以区分，方法是定时地施加抑制信号传导通路的药用制剂。当制剂是在强直性传入刺激之前施加的，并且抑制了长时改变的形成，那么这些制剂能阻断诱导阶段。如果这些制剂是在强直性传入刺激之后被施加的，并且逆转了已形成的长时程增强，那么这些制剂对维持阶段有影响。现已提出几种原理，用以鉴定维持突触传递的长时程改变的可能机制。首先，当第二信使被激活时能短暂地增强突触传递的蛋白激酶，如PKC，能通过变成不依赖第二信使的组成型活性激酶来延长其作用时间。(Schwartzetal.(1987)同上；Klannetal.(1991)J.Biol.Chem.26624253-24256)其次，尽管还未确定出引起突触增强的关键的、新合成的分子，但还是认为突触可塑性的长时程形态依赖于新蛋白的合成。Stantonetal.(1984)J.Neurosci.43080-3088；Freyetal.(1988)BrainRes.45257-65；Otanietal.(1989)Neurosci.28519-526；Abeletal.(1998)Science279338-341。现已发现长时记忆同样需要新蛋白的合成。Davisetal.(1984)PsycholBull.96518-559；Thompson，R.F.Science233941-947；Montarolaetal.(1986)Science2341249-1254。尽管通常考虑分离机制的性质，但已经确定PKC的一种同工型兼有这两种性质它作为一种组成型活性酶在LTP过程中持续增加，以及它通过新蛋白合成而产生。Sacktoretal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)908342-8346。这种新近描述的PKC形式就是PKMζ，它是PKCζ同工型的独立催化域，这种缺少PKCζ的自身抑制性调节域的PKMζ是自发活化的。Schwartz，J.H.(1993)同上；Sacktoretal.(1993)同上。通常认为通过PKC的限制性蛋白水解，使其分为调节域和催化域，从而产生PKM。这一过程可在高频强直性刺激后早期发生。但是最近的证据显示，这种长期PKMζ也可以来自一种仅编码ζ催化域的脑特异性mRNA。Andreaetal.(1995)Biochem.J.310835-843；Powelletal.(1994)CellGrowthDiffer.5143-149。PKC是一类多功能蛋白激酶家族，最早由Nishizuka于1977年发现。Takaietal.(1977)J.Biol.Chem.2527603-7609；Inoueetal.(1977)J.Biol.Chem.2527610-7616。PKC包括由铰链区所分开的两个结构域包含自身抑制性假底物序列和第二信使/脂类结合位点的氨基末端调节域，和羧基末端催化性激酶域。在胞质溶胶中，借助调节域和催化域的相互作用使PKC保持在一种非活化状态。当脂类第二信使(或对于某些同工型为Ca2+)增加时，PKC就从胞质易位到膜(或细胞骨架)间隙中，并且其构象发生改变，调节域从催化域移开，从而产生自身抑制作用，最终使酶活化。将10种不同形式的PKC分为3组常规组(α、βI、βII、γ)、新颖组(或新型，δ、ε、η、θ)，以及非典型形式的组(ζ、ι/λ)，其中的每一种类型都由一组不同的第二信使激活。(PKD和PKCμ是具有类似钙调蛋白激酶的催化域的PKC相关分子)。常规PKCs由Ca2+和二酰基甘油(DAG)激活；新型PKCs由DAG激活，而不能被Ca2+激活；非典型形式的PKCs则既不能被DAG激活，也不能被Ca2+激活，而是由脂类第二信使激活，包括花生四烯酸、3-羟基磷酸肌醇激酶产物，以及神经酰胺。持续激活PKC的第二种机制，仍然由Nishizuka发现，是通过钙激活蛋白酶或它们的蛋白酶在PKC的铰链区将其裂解，从而使调节域与催化域永久分离。该独立的活性激酶结构域就被称为PKM。(其中“M”代表Mg2+，但已证明需要的是Mg2+-ATP中的Mg2+)。形成PKM的结果是产生一种持续活化的激酶，并且该形成过程并不通过PKC的典型激活途径。现已发现，仅一种单一同工型，ζ，可以发生稳定的PKM形成，并且发现只在脑中发生。Naiketal.(已投稿)。最近，在神经元分化细胞系中也已经有了关于PKMζ的报道。Oehrleinetal.(1998)Eur.J.Cell.Bio.77323-337。关于其他同工型，仅在病理性条件下发现稳定的PKM形式在乳腺癌肿瘤细胞中的PKMε(Baxteretal.(1992)J.Biol.Chem.2671910-1917)，心脏缺血时的PKMε(Urthaletetal.(1997)Cardiovasc.Res.3560-67)，以及在细胞凋亡过程中的PKMδ(Emotoetal.(1996)Blood971990-1996；Denningetal(1998)J.Biol.Chem.27329995-30002)。蛋白激酶Mζ(PKMζ)是蛋白激酶C中的一种形式，蛋白激酶C对记忆的形成和维持具有重要的作用。在最广泛研究的记忆及突触长时程增强(LTP)的生理学模型中，PKMζ都是一种关键的分子(Sacktor，etal.，(1993)同上；Osten，etal.，(1996)J.Neurosci.16(8)2444-2451；Hrabetova和Sacktor，(1996)J.Neurosci.16(17)4324-5333)。发明概述本发明提供一些方法和组合物，用以通过给予一种或多种治疗有效量的PKMζ或PKCι/λ等非典型形式的蛋白激酶C(PKC)而增强记忆力和治疗脑与脊髓损伤。一方面，本发明提供增强动物体内突触传递的方法，该方法包括给予一种或多种治疗有效量的PKMζ或PKCι/λ等非典型形式的PKC。另一方面，本发明提供一种维持动物记忆力的方法，该方法包括给予一种或多种治疗有效量的PKMζ或PKCι/λ等非典型形式的PKC。另一方面，本发明提供一种用以促进突触传递或维持记忆力的方法，该方法包括给予编码人(或动物)PKMζ序列的DNA。另一方面，本发明提供一种用以引发遗忘症或减弱突触传递的方法，该方法包括给予一种治疗有效量的PKMζ抑制剂。减弱突触传递的应用包括，例如，治疗急性或慢性疼痛、治疗药物或酒精成瘾，以及治疗癫痫。另一方面，本发明提供一种用以引发遗忘症或减弱突触传递的方法，该方法包括给予一种治疗有效剂量的显性失活PKMζ抑制剂、编码人(或动物)的显性失活PKMζ序列的DNA，或PKMζ的反义物。另一方面，本发明提供一种引发动物遗忘症的方法，该方法包括给予一种治疗有效量的PKMζ抑制剂或PKCι/λ抑制剂。另一方面，本发明提供一种药物组合物，该组合物包括PKMζ抑制剂和一种可药用载体。另一方面，本发明提供一种药物组合物，该组合物包括PKCι/λ抑制剂和一种可药用载体。图1B显示EPSC振幅的时间进程。图2A显示含有3nMPKMζ的CA1锥体细胞的全细胞记录。使用白屈菜红碱(1μM)可以逆转由PKMζ导入所增强的突触性诱发的AMPA/kainate反应。图2B显示EPSC振幅的时间进程。图3显示纯化的重组表达的PKMζ的银染图。图4显示，与其他蛋白激酶相比，白屈菜红碱对PKMζ的抑制特异性。PKCA是髓鞘碱性蛋白(MBP)发生α磷酸化的蛋白激酶。PKCE是MBP发生ε磷酸化的蛋白激酶。PKM是MBP发生磷酸化的PKMζ。CKII是Syntide(Calbiochem，SanDiego，CA)肽底物发生磷酸化的Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II。图5显示，豆蔻酰化的ζ抑制性假底物肽(1μM)使LTP的维持发生逆转。图6显示编码人PKMζ的DNA序列(来自cDNA)。图7显示，突触后暴露于显性失活抑制剂PKMζ-K281W(20nM)，从而阻断LTP。(A)银染法以示置于全细胞记录管中的由杆状病毒/Sf9表达的PKMζ-K281W蛋白，PKMζ-K281W表现为一种二联体。(B)分别在PKMζ-K281W扩散后一分钟和十分钟去极化至-40mV，其结果显示对由AMPA和NMDA受体介导的突触反应没有显著影响。(C)上一行图，强直性刺激前和强直性刺激后的全细胞EPSCs，其结果显示在暴露于PKMζ-K281W后没有持续性增强。下一行图，同时记录的场电位以显示LTP。(D)用PKMζ-K281W进行的全细胞记录的时间进程。强直性刺激只显示PTP。插入图，同时进行的场记录的时间进程以显示LTP。发明详述本发明提供一些方法和组合物，用以通过给予一种或多种治疗有效量的非典型形式的PKC而增强记忆力和治疗脑与脊髓的损伤。在一项优选实施方案中，该非典型形式的PKC是PKCι/λ。根据本发明，已经确定PKMζ是维持长时程LTP的必要和充分条件。此外，根据本发明，已经确定PKMζ的功能是在脑中贮存和巩固记忆。根据本发明，在脊椎动物中，发现蛋白激酶Mζ(PKMζ)和PKCι/λ等被称为非典型形式PKC的化合物家族成员能维持或巩固突触强度的长时改变，这就是长时记忆的机制。通过对长时程增强(LTP)的研究，本发明阐明了PKMζ在维持增强的突触传递中的作用。反之，抑制PKMζ可能引发遗忘症，这一作用可有效地用于治疗创伤性应激疾病、恐怖症，以及急性或慢性疼痛。已提出的可增强记忆力的其他制剂基本上是刺激(如咖啡)或被设计用于促进诱导类长时程增强(LTP)过程的制剂(例如，用于增加cAMP的药物)。PKMζ是在脊椎动物中发现的第一个具有维持记忆功能的分子。根据本发明，当PKMζ被注射到神经元中时，它能持续地增强突触传递。在一项实施方案中，本发明考虑一种用于治疗动物脑损伤的方法，该方法包括给予一种或多种治疗有效量的PKMζ等非典型形式的PKC或编码PKMζ的DNA。治疗有效量是指，在合理的医学判断范围内，非典型形式的PKC的用量足以显著地改善所需治疗的状况，而又不会引起严重的副作用(以一种合理的获益/风险比)。例如，随着所要治疗的特定损伤、所需治疗病人的年龄和生理状况、损伤的严重性、治疗的持续时间、联合疗法的性质以及所用的特定PKMζ的不同，PKMζ的治疗有效量也有所改变。在另一个实施方案中，本发明考虑一种用于治疗动物脊髓损伤的方法，该方法包括给予一种或多种治疗有效量的非典型形式的PKC，如PKMζ。在另一个实施方案中，本发明考虑一种用于增强动物突触传递的方法，该方法包括给予一种或多种治疗有效量的非典型形式的PKC，如PKMζ。本发明还考虑一种用于引发动物遗忘症的方法，该方法包括给予一种治疗有效量的PKMζ抑制剂。在一些优选实施方案中，PKMζ抑制剂是白屈菜红碱、豆蔻酰化的ζ抑制性假底物(MZIP)肽(Myr-Ser-Ile-Tyr-Arg-Arg-Gly-Ala-Arg-Arg-Trp-Arg-Lys-Leu-OH)，或诸如PKMζ-K281W等PKMζ的显性失活型，或PKMζ的mRNA的反义核酸。MZIP对PKMζ的IC50为10-100nM，对PKCγ的IC50为10,000nM，因此它是一种比白屈菜红碱更为特异的抑制剂(见图5)。本发明考虑的接受诱发选择性遗忘症的优选候选者是患有外伤后应激疾病和恐怖症等的人。本发明还考虑一种方法，用以减少脑或脊髓的选择性区域中的突触传递，其方法是给予治疗有效量的PKMζ抑制剂。本发明考虑的接受减少突触传递的优选候选者是患有疼痛、药物或酒精成瘾，以及类似癫痫中的神经元过度兴奋等疾病的人。本发明的另一个实施方案考虑了药用组合物，该药用组合物包含一种或多种非典型形式的PKC，如PKMζ-K281W。包含PKMζ或PKMζ的编码核酸的药用组合物的活性成分应该表现出有效的治疗活性，例如，在增强记忆力方面，以及在治疗脑与脊髓损伤方面。因此，依据特定疾病，将包含PKMζ的治疗组合物的活性成分以治疗有效量给药。例如，通过给药使PKMζ在脑或脊髓中的终浓度约为1nM。调整用药方案以提供最适宜的治疗反应。例如，可将一日剂量分几次给药，或根据治疗状况的紧急程度成比例的减少剂量。可以经颅内或经鞘内方式即，使用鞘内泵或鞘内容器将一种或多种诸如PKMζ等非典型形式的PKC给药至脑或脊髓中。依据给药途径，包含PKMζ的活性成分可能需要被包于一种物质中，以保护上述成分免遭酸的作用以及免受其他可能使上述成分失活的天然条件的作用。例如，可将PKMζ与佐剂或脂质体混合给药。在此考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子型表面活性剂，如聚氧乙烯油酸酯和n-十六烷基聚乙烯酯。脂质体包括水包油包水P40乳剂以及传统的脂质体。在常规的贮存和使用条件下，本发明的制剂含有一种防腐剂以抑制微生物的生长。适合注射用的药用形式包括无菌的水性溶液(可水溶)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在任何情况下，这些形式都必须是无菌的，并且必须是流体，其流动性还要达到易于用针筒进行注射的程度。这些形式在生产和贮存条件下必须是稳定的，并且必须防止细菌和真菌等微生物的污染。载体可以是一种溶剂或分散体介质，其中包含，例如，水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、上述溶剂和分散体的适当混合物，以及植物油。保持合适的流动性的方法有，例如，通过使用卵磷酯等包被，在分散体情况下通过保持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂。借助于多种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等可以预防微生物的作用。在许多情况下，优选的是添加等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用可延缓吸收的制剂，例如，单硬脂酸铝和明胶，可以使可注射组合物的吸收延长。制备无菌的可注射溶液，其方法是将所需量的活性化合物掺入到适当溶剂中，该溶剂可根据需要含有多种以上列举的其他成分，然后过滤除菌。一般来说，制备分散体的方法是将各种已灭菌的活性成分掺入到一种无菌载体中，该载体包含基本的分散介质和必需的选自以上列举的其他成分。制备用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，其优选的方法是真空干燥技术和冷冻干燥技术，利用这些技术可以得到含有活性成分和任何添加的必需成分的粉末，其中的必需成分来自此前过滤除菌的溶液。将组合物以剂量单位的形式配制是尤为有利的，可以使给药更容易，并且剂量更一致。在此使用的剂量单位形式是指一些物理上不连续的单位，其单元剂量适于进行治疗的哺乳类受试者；每个单位都含有经过估计能产生预期疗效的预定量的活性物质以及所需的药用载体。本发明新颖的剂量单位形式的规格决定于并且直接依赖于(a)活性物质的独特性质和预期得到的特定疗效，以及(b)复合领域中固有的局限性，例如将本文详细公开的用于治疗患有身体健康受损状况的活受试者损伤的活性物质进行复合的局限性。将有效剂量的主要活性成分与适当的可药用载体以上文公开的剂量单位形式混合，以方便和有效地给药。单位剂量形式可以，例如，使PKMζ在脑或脊髓中的浓度最终达到，例如约0.1-10nM。在此使用的“可药用载体”包括任何以及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延缓剂，等等。本领域已非常了解用于药用活性物质的这种介质制剂的使用。除了不能与活性成分相容的传统介质或制剂外，它们都可以用于药用组合物中。补充的活性成分也可以掺入到组合物中。诸如PKMζ等非典型形式的PKC的给药，也可以加入PKMζ的修饰型及其衍生物，或能增强其活性、稳定性及神经系统对其吸收性的药物。可以容易地检验或筛选可应用的PKMζ促进药物，方法是通过在体外检测药物的作用或PKMζ的磷酸化作用(如图4中所测定)，或者当PKMζ被注射到神经元中时，检测PKMζ的作用对突触传递的影响，如图2所示。也可以使用基因转移技术将PKMζ的DNA给药至脑或脊髓中。该技术包括，但不局限于，病毒、脂质体，以及DNA或RNA的修饰型及其衍生物。PKMζ活性抑制剂的给药包括给予通过显性失活效应来抑制内源性PKMζ的活性或有效性的药物如白屈菜红碱、豆蔻酰化的ζ抑制性假底物肽，以及PKMζ的修饰型。这种显性失活剂包括失活型的PKMζ及其部分，但不局限于此。抑制PKMζ的功能还包括通过给予PKMζ序列的反义序列来降低内源性PKMζ的水平。以下实施例用以进一步说明本发明，在任何情况下本发明都不受其限制。实施例1PKMζ的增加对突触传递的影响。PKMζ的细胞内灌注由杆状病毒/Sf9表达系统纯化出基本纯净的PKMζ，使用全细胞记录移液管将其灌注到CA1锥体细胞中(图1A-1B)。PKMζ的浓度约为0.8nM，其活性为0.03pmol/min/μl。为分离出AMPA/kainate反应，在IPSC反相电位(～-70)的条件下，对记录其胞体的细胞进行电压钳制，并且使用铯-葡糖酸基电极液(以阻断GABAB的作用)。每10秒对辐射层进行一次刺激，并且在整个试验过程中，始终对输入阻抗进行监控，并保持其不发生改变。5-10分钟期间，AMPA/kainateEPSCs增加了约60％，然后变得稳定。不同的是，失活的PKMζ没有这种作用。使用类似的全细胞技术，与引起CA1锥体细胞中的突触反应增强的硫代磷酸化的自发活化型钙调蛋白激酶II的浓度比较，关于AMPA/kainate电流增强的比较结果显示PKMζ比钙调蛋白激酶II更为有效200-1000倍。电生理记录按照实例2所述来制备Sprague-Dawley鼠的海马切片。在NarishigePP-83型垂直拉制器上采用15mmO.D.硼硅酸盐玻璃(WorldPrecisionInstruments，Sarasota，FL)来拉制膜片电极(两步法)。记录吸管的尖端电阻为2-5MΩ，并且包含130mM葡糖酸铯或葡糖酸钾；2mMMgCl2；2mMCaCl2；10mMEGTA；10mMHEPES；2mMNa-ATP；用CsOH或KOH调节pH至7.25。该混合物已被证明能减少GABAA受体介导的反应的下降。铯用以阻断钾电流，包括慢GABABIPSCs。电极液中含有能阻断Na+电流的QX-314(10mM)以防止在去极化维持电位下细胞棘波发放的干扰。利用盲膜片(blindpatch)技术来获得来自CA1锥体细胞的全细胞记录。该记录管穿过组织缓慢地前进，同时施加短暂的电压阶(step)(-10mV，10ms)来监测电极的电阻。一旦检测到电极电流反应发生偏转，就说明记录管已接触到靶细胞的胞体，轻微施加负压使细胞与电极紧密接触从而在二者间形成大于1GΩ的阻抗。使用外加吸力或电流脉冲来完成破膜过程。膜破裂后，在正式记录前预留两分钟的静息时间。施加电压阶(-10mV)来监测接触阻抗和输入电容。应用电压钳以及Axoclamp2A放大器(AxonInstruments，FosterCity，CA)来记录信号。在从维持电位(通常是静息膜电位，在细胞内液条件下为60mV)到-10mV的电压阶的电流反应过程中都要对静息输入阻抗进行测量。只要观测到细胞具有大于100MΩ的静息输入阻抗和小于20MΩ的接触阻抗，这些细胞就可以用于研究。如果在记录过程中，细胞的接触阻抗发生显著增加(大于20％)，那么就应废弃所收集的数据。经由一种14位的PCM界面(VR-10BDigitalDataRecorder，InstrutechCorp.，Element，NY)将数据信号以94kHz数字化，并贮存在VHS录像带上以便于以后在IBM-兼容的Pentium-II微机上用pCLAMP软件(AxonInstruments)进行分析。用双极镀钨电极所产生的细胞外刺激来诱发突触事件，该电极置于记录电极侧面的辐射层上。通过使用一种数控的刺激隔离设备(WorldPrecisionInstruments)以低频率(0.1Hz)向阴极传送电刺激(2-10V；200μs的持续时间)。除非特别指出，都是以溶液的形式递送药物。实施例2方法海马切片的制备。将3-4周龄Sprague-Dawley鼠用氟烷麻醉后，用McIlwain组织切片机制备450μM的横切片。在解剖过程中，用4℃的解剖盐水(125mMNaCl，2.5mMKCl，1.25mMNaH2PO4，26mMNaHCO3，11mM葡萄糖，10mMMgCl2以及0.5mMCaCl2，pH7.4，经95％的O2和5％的CO2平衡)多次清洗海马，以使其保持低温。将这些切片转移至一种交界室中(FineScienceTools)，于32℃的解剖盐水中孵育一小时。然后将二价离子的浓度改变为1.2mMMgCl2和01.7mMCaCl2(生理盐水)。PKMζ的细胞内灌注PKMζ对CA1锥体神经元中诱发的EPSCs的作用以及白屈菜红碱的作用的研究评定细胞内注射PKMζ对兴奋性突触电流的影响，其方法是往全细胞吸管中加入激酶，并且测量这期间EPSC的振幅。在海马CA1锥体细胞体中，使用含有不同浓度PKMζ(0.1、1、10nM)的铯-葡糖酸基电极液来记录突触事件。使用处于IPSC反相电位(EIPSC～-70mV)条件下的被电压钳制了的细胞，通过施加于辐射层的低频(0.1Hz)电刺激引发分离的集合EPSCs。将刺激强度设定在中等水平(-5V)以选择性地诱发快速EPSCs(即AMPA/kainate介导的)，并且在整个试验过程中，刺激强度始终保持恒定。对照数据包括紧接全细胞记录建立后(即在PKMζ扩散到靶细胞中之前)的EPSC振幅和持续时间的测量结果，以及将激酶经煮沸变性或反复冻融失活来进行的平行试验。在每次实验中，可以用磷酸化测试方法在体外对灌注的PKMζ的活性进行测定。持续监测EPSCs以评定细胞内PKMζ对EPSC最大强度和持续时间的影响。定时地记录电流-电压以核查EPSC(EEPSC)反相电位的恒定性，并且在整个试验过程中，始终对细胞的输入阻抗进行监测。在切片上使用非NMDA受体拮抗剂CNQX(10μM)，以证明中等刺激强度EIPSC引发的EPSCs仅由非NMDA受体介导。一旦发现某种作用，并且该作用表现出稳定性，就往溶液中加入PKC催化域的竞争性抑制剂，白屈菜红碱，以通过阻止PKMζ的磷酸化来逆转该作用。然后再将药物洗去。图2A-2B中显示了白屈菜红碱的实验示例，其中使用了3nMPKMζ。实施例3丛Sf9细胞中纯化由杆状病毒表达的PKMζ在含有5μg/ml庆大霉素的SF-900IISFM昆虫细胞培养基(Gibco)中培养草地夜蛾(Sf9)细胞。为了表达PKMζ，将含有10×108个细胞的正常的对数期Sf-9培养物离心，并重悬在125ml培养基中，然后用25ml杆状病毒-ζ的病毒原液(SylviaStable惠赠)进行感染。室温培养0.5小时后，另添加额外的培养基，然后以1×106细胞/ml的密度进行接种。3天后，将细胞离心，PBS清洗，然后在65ml匀浆缓冲液中匀浆。用DEAEFastFlowSepharose柱和Superdex75柱(制备级，Pharmacia)进行2步纯化，以提纯由杆状病毒表达的PKMζ。在每次全细胞实验的同一天测定PKMζ的活性。杆状病毒重组表达的PKMζ的银染结果表明了制备物的纯度(见图3)。实施例4白屈菜红碱作为PKMζ抑制剂的特异性用白屈菜红碱抑制多种蛋白激酶对外源性底物的磷酸化作用，其结果说明白屈菜红碱作为PKMζ活性的抑制剂，选择性高10倍以上(见图4)。实施例5人PKMζ的有义序列、反义序列及氨基酸序列通过与确定含有PKMζ可读框的大鼠序列(Ono，etal.，1988)类比，由公布的已表达序列标记来获得人类序列。将PKMζ序列用于基因转移技术，以提高神经系统中PKMζ的水平。获得PKMζ显性失活抑制剂的方法是改变或去除ATP-结合位点中的序列，或将该蛋白的选定区域，如羧基末端结构域给药。获得显性失活PKMζ的方法是去除或改变ATP-结合区(标记处)，以及给予羧基末端结构域(标记处)。实现反义作用的方法是给予全部或部分PKMζ的反义序列。(见图6)实施例6为了确证LTP过程中，PKMζ能介导突触传递的增强作用，经突触后将PKMζ的一种显性失活抑制型(PKMζ-K281W)导入到CA1锥体细胞中，以检测其对LTP的影响。PKMζ-K281W催化域的第281位氨基酸由赖氨酸突变为色氨酸，这一突变干扰了ATP结合作用，从而使PKMζ-K281W失去了激酶活性。在全细胞记录管中加入20nM的显性失活抑制剂(图7A)，并且让其扩散10分钟以进入CA1锥体细胞中，在-75mV条件下将细胞电压钳制以分离出突触的AMPA反应。在-40mV条件下，分别在1分钟和10分钟取样检测，PKMζ-K281W对由AMPA和NMDA受体介导的突触传递没有显著的影响(图7B)。PKMζ-K281W完全消除了细胞中的持续性突触增强，但是对强直后增强(PTP)没有此作用(图7C，上一行，D中的大图)。强直刺激后20分钟，EPSCs为基线反应的101.6±1.9％(n＝4)。同时，在切片的场反应中发现了同时出现的LTP(图7C，下一行，D中的插入图)。使用MaxBac2.0杆状病毒/Sf9系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)表达PKMζ-K281W。包含PKMζ的158-592位的氨基酸序列(Drier，etal.(2000)第30届神经科学协会年会，NewOrleans，LA，由JerryYin惠赠，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)的插入部分被亚克隆至杆状病毒转移载体pBlueBacHis2B的EcoRI和SalI位点之间。经测序确认该构建体，然后与线性化的杆状病毒基因组共转染到Sf9细胞中。在Sf9细胞中表达重组蛋白，并使用Ni2+柱(Invitrogen，XpressTM纯化试剂盒，Carlsbad，CA)来纯化该蛋白，再用银染(图7A)和蛋白印迹法(未给出结果)进行分析。权利要求1.一种用于增强动物记忆力的方法，该方法包括给予一种治疗有效量的非典型形式的PKC。2.权利要求1的方法，其中，所述非典型形式的PKC的给药量使得该非典型形式的PKC在脑中的终浓度为约0.1-10nM。3.一种用于增强动物体内突触传递的方法，该方法包括给予一种治疗有效量的非典型形式的PKC。4.一种用于维持动物记忆力的方法，该方法包括给予一种治疗有效量的非典型形式的PKC。5.一种用于治疗动物脑损伤的方法，该方法包括给予一种治疗有效量的非典型形式的PKC。6.一种用于治疗动物脊髓损伤的方法，该方法包括给予一种治疗有效量的非典型形式的PKC。7.权利要求1、3、4、5或6的任一项的方法，其中，所述非典型形式的PKC为PKMζ。8.权利要求1、3、4、5或6的任一项的方法，其中，所述非典型形式的PKC为PKCι/λ。9.一种药物组合物，该组合物含有一种非典型形式的PKC和一种可药用载体。10.权利要求9的组合物，其中，所述非典型形式的PKC为PKMζ或PKCι/λ。11.一种方法，用于引起患有创伤性应激疾病、恐怖症、疼痛综合征或癫痫的动物的遗忘症或减少其突触传递，该方法包括给予一种治疗有效量的PKMζ抑制剂给药。12.权利要求11的方法，其中，所述PKMζ抑制剂为白屈菜红碱。13.权利要求8的方法，其中，所述PKMζ抑制剂为豆蔻酰化的ζ抑制性假底物肽。14.权利要求12的方法，其中，所述抑制剂为PKMζ的显性失活形式或修饰形式，或PKMζ的反义形式。15.权利要求1、3-6和11的任一项的方法，其中，所述动物为人。全文摘要本发明提供一些方法和组合物，用于通过给予一种有效剂量的非典型形式的蛋白激酶C增强包括人类在内的动物的记忆力，该蛋白激酶C包括蛋白激酶Mζ(PKMζ)或蛋白激酶Cι/λ。文档编号A61P25/28GK1437477SQ01811376公开日2003年8月20日申请日期2001年4月20日优先权日2000年4月20日发明者托德C·萨克托申请人:托德C·萨克托