非核苷反录酶抑制剂的制作方法

专利名称：非核苷反录酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明关于一种新颖化合物及其药物上允许的盐，以及其单独或与其他治疗剂组合而在治疗或预防HIV感染上的用途，以及关于包含该化合物的药物组合物。
发明的背景被称为后天免疫缺陷综合症(爱滋病)的疾病由人类免疫缺陷病毒(HIV)，尤其是被称为HIV-1的菌株所引起。若要使HIV被宿主细胞复制，则病毒基因的信息必须被整合进宿主细胞的DNA中。但是，HIV为反录病毒，此表示基因信息为RNA的形式。所以HIV复制周期需要病毒基因(RNA)的转录步骤，这与复制的正常步骤相反。病毒RNA转录成DNA是通过通称为反录酶(RT)的酶完成。HIV病毒粒体包括RT以及病毒RNA一起的拷贝。
反录酶具有三项已知的酶促功能其充当RNA-依赖性DNA聚合酶、核糖核酸酶及DNA-依赖性DNA聚合酶。基于作为RNA-依赖性DNA聚合酶，RT将病毒RNA转录为单股DNA拷贝。基于作为核糖核酸酶，RT破坏原先病毒RNA以及从原始病毒RNA释放出刚产生的DNA。最后基于作为DNA-依赖性DNA聚合酶，RT以第一DNA股作为模板制造第二互补的DNA股。该二股形成双股DNA，其通过称为整合酶的另一酶而整合进宿主细胞的基因中。
抑制HIV-1反录酶的酶促功能的化合物可抑制感染细胞中的HIV-1的复制。这种化合物，如已知的RT抑制剂诸如3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷(AZT)、2′，3′-二脱氧肌苷(ddI)、2′，3′-二脱氧胞苷(ddC)、d4T、3TC、萘弗拉平(Nevirapine)、德拉佛汀(Delavirdine)、爱法佛兰兹(Efavirenz)及阿巴卡佛(Abacavir)(为目前允许用于治疗爱滋病的主要药物)所表示的，在预防或治疗人体HIV-1感染上有用。
如同其他任何抗病毒治疗一样，将RT抑制剂用于治疗爱滋病最终将导致病毒使其对给予的药物更不敏感。对这种药物的抗性(敏感性减低)是由于pol基因的反录酶片段产生突变的结果。曾鉴定HIV的多个突变菌株，其对于已知治疗剂的抗性是由于在RT基因产生突变。在临床上一些最常常观察到的突变菌株为Y181C突变株，其中在密码子181处的酪氨酸(Y)被突变为半胱氨酸(C)残基；而K103N，其中在位置103的赖氨酸(K)被天冬酰胺(N)取代。用已知抗病毒剂治疗期间，其他出现频率增加的突变株包括单突变株V106A、G190A、Y188C及P236L；以及双突变株K103N/Y181C、K103N/P225H、K103N/V108I及K103N/L100I。
由于持续使用抗病毒剂治疗及预防HIV感染，可预期新颖抗性菌株的出现将增加。因此不断需要在对抗各种突变株上具有不同效力模式的新颖RT抑制剂。
为HIV-1抑制剂的具有三环结构的化合物描述于美国专利5,366,972中。HIV-1反录酶的其他抑制剂描述于Hargave等人，J.Med.Chem.，34，2231(1991)中。
美国专利5,705,499提出作为RT抑制剂的8-芳烷基-及8-芳基杂烷基-5，11-二氢-6H-二吡啶并[3，2-B2′，3′-E][1，4]二氮杂。例举的化合物表明对野生型及突变型HIV-1 RT，尤其是Y181C及其他单突变株诸如K103N具有一些活性，但效力较差。
更具体而言，本发明的化合物在抑制Y181C及K103N突变株以及广范围的其他单突变株及某些常见的双突变株诸如K103N/Y181C及K103N/P225H上有效。
发明的概要本发明通过提供对HIV-1 RT的单及双突变株的有力抑制剂的新颖化合物而减少现有技术的困难及缺点。
在本发明的第一方面，提供一种通式I的化合物或其药物上允许的盐 式中R2选自H、F、Cl、C1-4烷基、C3-4环烷基及CF3的基团；R4为H或Me；R5为H、Me或Et，其条件为如R4及R5不同时为Me时，以及如R4为Me，则R5不可能是Et；R11为Me、Et、环丙基、丙基、异丙基或异丁基；Q选自下列基团 和 在第二方面中，本发明提供一种具通式I的HIV复制抑制剂或其药物上允许的盐。
在第三方面中，本发明提供一种具通式I的HIV反录酶的抑制剂或其药物上允许的盐。
在第四方面中，本发明提供一种治疗或预防HIV感染的方法，其包含给与病人HIV抑制量的式I化合物或其药物上允许的盐。
在第五方面中，本发明提供一种治疗或预防HIV感染的药物组合物，其包含式I的化合物或其药物上允许的盐以及药物上允许的载体。
在第六方面中，本发明提供一种制备式I化合物或其药物上允许的盐的方法。
发明的详细说明定义在本文中，术语“C1-4烷基”意指含有1至4个碳原子的直链或支链烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基及叔丁基。
在本文中，术语“C3-4环烷基”意指含3至4个碳原子的饱和环状烃基，包括环丙基及环丁基。
优选实施方案的详细说明按照优选实施方案，本发明化合物为式1定义的，其中R2优选为Cl、F或H。R2更优选为Cl或H，最佳R2为H。
按照优选实施方案，本发明化合物按式I定义，其中R4优选为H。
按照另一实施方案，本发明化合物为式I定义，其中R5优选为甲基。
优选地，本发明化合物为式I定义，其中R11为乙基或环丙基。R11更佳为乙基。
按照优选实施方案，本发明化合物为式I定义，其中Q为选自下列基团 和 Q优选为 另外，本发明的优选实施方案包括选自下列中的化合物 和 本发明化合物为野生型反录酶的有效抑制剂，以及可抑制例如单突变酶Y181C、K103N、V106A、G190A、Y188C及P236L。这种化合物也抑制双突变酶K103N/Y181C、K103N/P225H、K103N/V108I及K103N/L100I。
式I化合物具有抗HIV-1反录酶的抑制活性。当以适当剂型给药时，其在治疗爱滋病、ARC及与HIV-1感染相关的紊乱上有用。所以本发明的另一方面为治疗HIV-1感染的方法，其包括将治疗有效量的上述新颖式I化合物给药被HIV-1感染的人类。不论是被称作治疗或预防，该化合物也可通过在出生之前投药母亲，而防止出生期间HIV-1从母亲传染至婴儿。
式I化合物可通过口服或肠道外途径，以单剂量或分为多个剂量给药。式I化合物的适当口服剂量为每日0.5毫克至1克。式I化合物的优选口服剂量，对体重70公斤的病人而言，为每日约100毫克至800毫克。在肠道外制剂中，适当剂量单位可含有0.1至250毫克化合物，优选含有1毫克至200毫克。但是，应了解剂量因病人而异，以及对于任何特定病人的剂量视临床医师的判断而定，临床医师将考量病人的体型及状况以及病人对药物的反应而确定适当的剂量。
当本发明化合物通过口服途径给药时，可以将含有该化合物及相容性药物载体物质的药物制剂形式的药剂给药。其中该载体物质可为适于口服的惰性有机或无机载体物质。这些载体物质的实例有水、明胶、滑石、淀粉、硬脂酸镁、阿拉伯胶、植物油、聚乙二醇、石油凝胶及类似物。
药物制剂可以以习用方式制备以及制成的剂型可为固体剂型，例如片剂、糖衣片、胶囊剂及类似物；或液体剂型，例如溶液、悬浮液、乳液及类似物。药物制剂可经受一般的药剂处理诸如灭菌。再者，药物制剂可含有通常的助剂诸如防腐剂、稳定剂、乳剂、增味剂、润湿剂、缓冲剂、改变渗透压的盐以及类似物。可使用的固体载剂物质包括，例如，淀粉、乳糖、甘露醇、甲基纤维素、微晶纤维素、滑石、二氧化硅、磷酸氢钙及高分子聚合物(诸如聚乙二醇)。
供肠道外使用的式I化合物可以水性或非水性溶液、在药物允许的油或液体混合物中的悬浮液或乳液给药，这种制剂可含有抑菌剂、抗氧化剂、防腐剂、缓冲剂或使溶液与血液等渗的其他溶质、增稠剂、助悬剂或其他药物允许的添加剂。这种类型的添加剂包括，例如，酒石酸盐、柠檬酸盐及乙酸盐缓冲剂，乙醇、丙二醇及聚乙二醇，络合物形成体(诸如EDTA)，抗氧化剂(诸如亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠及抗坏血酸)，供调节粘度的高分子聚合物(诸如液体聚环氧乙烷)以及山梨醇酐的聚乙烯衍生物。如需要，也可加入防腐剂诸如苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、氯苄烷铵及其他季铵化合物。
本发明化合物也可以供鼻用的溶液给药，并在水性溶剂中，除了含有本发明的化合物外，还可含有适当的缓冲剂、张力调节剂、微生物防腐剂、抗氧化剂及增粘剂。用于增粘的物质的实例有聚乙烯醇、纤维素衍生物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚山梨酸酯或甘油。微生物防腐剂包括氯苄烷铵、硫柳汞、氯丁醇或苯乙醇。
此外，本发明提供的化合物可通过栓剂给药。
本发明化合物可用有机化学合成技术制造。示例性反应流程图示于流程

图1至6中。
流程图1中间物(其中R4为甲基)的制备 流程图2中间物(其中R5为甲基)的制备 流程图2的顺序与J.M.Klunder等人；J.Med.Chem.1998，41，2960-71以及C.L.Cywin等人.；J.Med.Chem.1998，41，2972-84所述类似。
流程图3中间物(其中R2为C1-3烷基)的制备 流程图4中间物(其中R2为CF3)的制备 流程图5喹啉核的引入 流程图6R4为甲基的化合物的另一制备方法 如上述，本发明提供的化合物抑制HIV-1RT的酶促活性。根据下述这些化合物的测试，已知其抑制HIV-1 RT的RNA-依赖性DNA聚合物酶活性。已知(但未显示数据)其也会抑制HIV-1 RT的DNA-依赖性DNA聚合物酶活性。利用下述反录酶(RT)测定，可以测试化合物抑制HIV-1 RT的RNA-依赖性DNA聚合物酶活性的能力。对下文实施例中所述的某些特异性化合物进行测试。该测试结果示于表2以[IC50(nM)]表示及表3以[EC50(nM)]表示。
实施例本发明通过下列非限制性实施例更详细地说明。所有反应都在氮气或氩气气氛中进行。温度以摄氏度数表示。溶液的浓度百分率或比率，除非另有陈述，都以体积对体积的关系表示。
本文所用的简写或符号包括DEAD 偶氮二羧酸二乙酯；EIAD 偶氮二羧酸二异丙酯；DIEA 二异丙基乙胺；DMAP 4-(二甲氨基)吡啶；DMSO 二甲基亚砜；DMF 二甲基甲酰胺ES MS: 电喷雾质谱；Et乙基；EtOAc: 乙酸乙酯；Et2O乙醚；HPLC高效液相色谱；iPr异丙基；Me甲基；MeOH甲醇；MeCN乙腈；NBSN-溴琥珀酰亚胺；Ph苯基；TBEtris-硼酸盐-EDTA；TBTU2-(1H-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基尿鎓四氟硼酸盐；TFA三氟乙酸；THF四氢呋喃；MS(ES)电喷雾质谱；MS(FAB)或FAB/MS快原子轰击质谱；HRMS高分辨质谱；PFU成斑单位；DEPC焦碳酸二乙酯；DMSO二甲亚砜；DTT二硫苏糖醇；
EDTA乙二氨四乙酸盐；UMP尿苷5′-单磷酸；UTP尿苷5′-三磷酸；合成下列实施例说明本发明化合物的制法。
实施例I(编号24，表1)5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-{2-(4-喹啉氧)乙基}-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮a)2-(乙氨基)-3-硝基吡啶在2-氯-3-硝基吡啶(51克，325毫摩尔)溶于THF(650毫升)的溶液中，加入乙胺溶于THF的2M溶液(365毫升，731毫摩尔)。将反应物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物倒入水(～1.5升)中且将生成的固体过滤并于减压下干燥，得到标题化合物(52克)。b)3-氨基-2-(乙氨基)吡啶将2-(乙氨基)-3-硝基吡啶(52克)溶于MeOH(600毫升)的溶液，于室温、氢气(1atm)下及在有20％的Pd(OH)2/C(10.4克)下搅拌过夜。催化剂通过硅藻土过滤而除去。将滤液在减压下浓缩，得到黑色固体的标题化合物(39克，步骤a)以及b)的总产率为88％)。c)2-氯-N-{2-(乙氨基)-3-吡啶基}-5-溴-3-吡啶羧酰胺在3-氨基-2(乙氨基)吡啶(30.6克，223毫摩尔)溶于MeCN(740毫升)的冷却溶液中，加入固体NaHCO3(56.3克，669毫摩尔)。5分钟后，加入粗制的5-溴-2-氯-3-吡啶羰基氯(1当量，223毫摩尔)(从5溴-2-羟基-3-吡啶羧酸及SOCl2制备[如同T.W.Gero等人.in Synth.Commun.1989，19，553-559(纳入本文以供参考)，但删去水处理部分]。2小时后，将反应混合物倒入冰/H2O(1.5升)且将生成的固体过滤，用水及己烷依次清洗。在减压下干燥过夜，即可获得黑色固体的标题化合物(54.9克，产率69％)。d)8-溴-5，11-二氢-11-乙基-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮在2-氯-N-{2-(乙氨基)-3-吡啶基}-5-溴-3-吡啶羧酰胺(54.9克，154.4毫摩尔)溶于吡啶(308毫升)的溶液中，于50℃逐滴加入NaHMDS(六甲基二硅氮化钠)溶于THF(355毫升，355毫摩尔)的1M溶液。10分钟后，将反应物冷却至室温，然后倒在冰水(2升)上。将生成的固体过滤，用水及己烷依次清洗。将固体于减压下干燥，即可获得墨绿色固体的标题化合物(36克，产率75％)。e)8-溴-5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮在8-溴-5，11-二氢-11-乙基-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(36.7克，115毫摩尔)溶于DMF(380毫升)的溶液中，加入NaH(3.5克，138毫摩尔)，且将此混合物加热至50℃历30分钟。再将反应混合物冷却至室温，且以MeI(14.3毫升，230毫摩尔)处理。1.5小时后，将反应混合物倒在冰水上。将固体过滤，用水及己烷依次清洗，干燥后获得为深灰色固体的标题化合物(37.9克，产率99％)。f)5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-(2-丙烯基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮将烯丙基三丁基锡(30.7毫升，99.0毫摩尔)及Pd(Ph3P)4(5.20克，4.50毫摩尔)于室温下加至8-溴-5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(30.0克，90.0毫摩尔)溶于DMF(450毫升)的除气(将N2通入溶液历30分钟)溶液中。将该混合物于90℃搅拌1.5小时，然后冷却至室温以及于减压下浓缩。残余物通过急骤色谱纯化(己烷∶EtOAc，8∶2至7∶3)，得到标题化合物(22.19克，产率84％)。g)5，11-二氢-11-乙基-8-(2-羟乙基)-5-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮将臭氧化的氧流鼓泡通入5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-(2-丙烯基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(22.19克，75.4毫摩尔)溶于CH2Cl2(150毫升)及MeOH(150毫升)的冰冷(-78℃)溶液中历2.5小时。继而将氮气流鼓泡通入溶液中历15分钟，然后将NaBH4固体(4.99克，132毫摩尔)加到溶液中。让反应混合物温热至室温。1小时后，加入NH4Cl饱和水溶液(200毫升)并将该混合物于室温搅拌2小时。于减压下除去有机溶剂。将水(300毫升)及CHCl3(300毫升)加至残余物中。将各相分离并将水层用CHCl3(3×300毫升)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，过滤及于减压下浓缩。残余物通过急骤色谱法纯化(EtOAc∶CHCl3，4∶1)，得到为白色固体的标题化合物(1 6.1克，产率72％)。h)5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-{2-(4-喹啉氧基)乙基}-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮将偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)(12.8毫升，81.0毫摩尔)于室温逐滴加至5，11-二氢-11-乙基-8-(2-羟乙基)-5-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(16.1克，54.0毫摩尔)，4-羟基喹啉(11.6克，81.0毫摩尔)及Ph3P(21.3克，81.0毫摩尔)溶于THF(270毫升)的溶液。将该混合物于室温搅拌1小时，然后于减压下浓缩。残余物通过急骤色谱法(EtOAc∶MeOH；95∶5)纯化，得到白色固体的标题化合物(17.7克，产率77％)。MS(ESI)m/z 426(MH)+。
将固体mCPBA(46.9毫克，0.22毫摩尔)于室温加至2-氯-5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-{2-(4-喹啉氧)乙基}-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(50.0毫克，0.11毫摩尔)溶于CH2Cl2(2.2毫升)的溶液。将该混合物于室温搅拌1小时，然后于减压下浓缩。将残余物溶于EtOAc(50毫升)。将该溶液用10％Na2S2O3水溶液(3×10毫升)，NaHCO3饱和水溶液(3×10毫升)及盐水(10毫升)依次冲洗，干燥(MgSO4)，过滤及于减压下浓缩。残余物通过反相HPLC(CombiPrep ADS-AQ 50×20mm，5μ，120A，5-100％MeCN+0.10％TFA/水+0.10％TFA，25分钟)进一步纯化。将纯化部分用饱和NaHCO3水溶液处理，用EtOAc萃取，以及将溶液干燥(MgSO4)，过滤及于减压下浓缩，得到白色固体的标题化合物(32.5毫克，产率63％)；MS(ESI)m/z 488/490(MH)+。
在3-硝基-6-(三氟甲基)-2(1H)-吡啶酮(2.4克，11.5毫摩尔)溶于DMF(69毫升)的溶液中，加入氢化钠(350毫克，13.8毫摩尔)。将反应混合物于45℃搅拌30分钟，冷却至室温以及加入N-苯基三氟甲烷磺酰亚胺(4.9克，13.8毫摩尔)。1小时后，加入乙胺溶于THF(13毫升，25毫摩尔)的2M溶液。将反应混合物于室温搅拌过夜。将反应混合物倒入水(100毫升)中并用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用水及盐水依次冲洗，干燥(MgSO4)，过滤并于减压下浓缩。残余物通过急骤色谱法纯化(己烷∶EtOAc，9∶1)，得到黄色油状的期望化合物(1.1克，产率41％)。b)3-氨基-2-(乙氨基)-6-(三氟甲基)吡啶将2-(乙氨基)-3-硝基-6-(三氟甲基)吡啶(1.1克，4.9毫摩尔)溶于MeOH(40毫升)的溶液，在有20％Pd(OH)2/C(100毫克)存在下，于室温及氢气(1大气压)下搅拌过夜。催化剂通过硅藻土过滤而除去。将滤液于减压下浓缩，得到橙色油状的标题化合物(1克)。c)2-氯-N-{2-(乙氨基)-6-(三氟甲基)-3-吡啶基}-5-溴-3-吡啶甲酰胺在3-氨基-2-(乙氨基)-6-(三氟甲基)吡啶(1克，4.9毫摩尔)溶于MeCN(24毫升)的冷却溶液中，加入固体NaHCO3(906克，11毫摩尔)。5分钟后，加入粗制5-溴-2-氯-3-吡啶羰基氯(1当量，4.9毫摩尔)(从5-溴-2-羟基-3-吡啶羧酸及SOCl2制备)[如T.W.Gero等人.在Synth.Commun.1989，19，553-559中所述(列入本文以供参考)，但删去水处理步骤]。2小时后，将反应混合物倒在冰/H2O(1.5升)上，并将所得的固体过滤，用水及己烷冲洗。于减压下干燥过夜后，得到淡褐色固体的标题化合物(1.6克，产率77％)。d)8-溴-5，11-二氢-11-乙基-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮在2-氯-N-{2-(乙氨基)-6-(三氟甲基)-3-吡啶基}-5-溴-3-吡啶羧酰胺(766毫克，1.8毫摩尔)溶于DMF(18毫升)的溶液中，加入NaH(137毫升，5.4毫摩尔)。将反应混合物于80℃搅拌。1小、时后，让反应混合物冷却至室温，然后倒入水(20毫升)中。将所得混合物用EtOAc(3×)萃取。将合并有机层用水及盐水依次冲洗，干燥(MgSO4)，过滤及于减压下浓缩。残余物通过急骤色谱法纯化(己烷∶EtOAc，7∶3)，得到为黄色固体的所要化合物(200毫克，产率28％)。e)8-溴-5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮在8-溴-5，11-二氢-11-乙基-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(200毫克，0.52毫摩尔)溶于DMF(2.6毫升)的溶液中，加入NaH(20毫克，0.78毫摩尔)，并将该混合物加热至50℃历30分钟。将反应混合物冷却至室温并用MeI(97微升，1.56毫摩尔)处理。16小时后，将反应混合物用水稀释。将所得混合物用EtOAc(3×)萃取。将合并的有机层用水及盐水依次冲洗，干燥(MgSO4)，过滤及于减压下干浓缩。残余物通过急骤色谱法纯化(己烷∶EtOAc，8.5∶1.5)，得到白色泡沫体的标题化合物(110毫克，产率53％)。f)5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-(2-丙烯基)-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮将烯丙基三丁基锡(98微升，0.32毫摩尔)及Pd(Ph3P)4(16毫克，0.02毫摩尔)于室温加至8-溴-5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(11毫克，0.27毫摩尔)溶于DMF(1.4毫升)的除气(将N2通入溶液中历30分钟)溶液中。将该混合物于90℃搅拌1.5小时，然后冷却至室温并于减压下浓缩。残余物通过急骤色谱法(己烷∶EtOAc，8∶2至7∶3)纯化，得到标题化合物(101毫克，产率99％)。g)5，11-二氢-11-乙基-8-(2-羟乙基)-5-甲基-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮将臭氧化的氧气流鼓泡通入5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-(2-丙烯基)-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(100毫克，0.27毫摩尔)溶于CH2Cl2(2.7毫升)及MeOH(2.7毫升)的冰冷(-78℃)溶液中历2.5小时。继而将氮气流鼓泡通入溶液中历15分钟，然后将NaBH4固体(52毫克，1.4毫摩尔)加到溶液中。使反应混合物温热至室温。1小时后，加入NH4Cl饱和水溶液(5毫升)并将该混合物于室温搅拌2小时。将反应混合物用CH2Cl2稀释并用CH2Cl2再萃取水层。将合并的有机层用水及盐水依次冲洗，干燥(MgSO4)，过滤并于减压下浓缩。残余物通过急骤色谱法纯化(EtOAc∶己烷，75∶25至EtOAc 100％)，得到白色固体的标题化合物(60毫克，产率59％)。h)5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-{2-(4-喹啉氧)乙基}-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮将偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)(38微升，0.24毫摩尔)于室温逐滴加至5，11-二氢-11-乙基-8-(2-羟乙基)-5-甲基-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(58毫克，0.16毫摩尔)，4-羟基喹啉(35毫克，0.24毫摩尔)及Ph3P(62克，0.24毫摩尔)溶于THF(1.6毫升)的溶液。将该混合物于室温搅拌1小时，然后于减压下浓缩。残余物通过急骤色谱法(EtOAc∶MeOH；95∶5)纯化，得到白色固体的标题化合物(24毫克，产率31％)。MS(ESI)m/z494，495(MH)+。i)5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-{2-(1-氧桥-4-喹啉基)氧}乙基}-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮将固体mCPBA(80-85％，间-氯过苯甲酸)(16毫克，0.08毫摩尔)于室温加至5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-{2-(4-喹啉氧)乙基}-2-(三氟甲基)-6H-二吡啶并[3，2-b2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮(22毫克，0.44毫摩尔)溶于CH2Cl2(0.5毫升)的溶液中。将该混合物于室温搅拌2.5小时。然后用CH2Cl2稀释。将生成的溶液用10％Na2S2O3溶液，NaHCO3饱和水溶液及盐水依次冲洗，干燥(MgSO4)，过滤及于减压下浓缩。残余物通过急骤色谱法纯化(MeOH∶CHCl3，5％至10％)，得到白色固体的标题化合物(11毫克，产率52％)；MS(ESI)m/z 511(MH)+。表1式1的化合物 反录酶(RT)的测定测定理论在人类免疫缺陷病毒(HIV-1)编码的酶中为反录酶(I)，其所以如此命名，是因为它从RNA模板转录DNA拷贝。该活性可在无细胞酶测定中进行定量，基于以下观察，即反录酶能使用事先以生物素化的寡d(G)为引子的合成模板聚r(C)，而用3H-dGTP作为基质，转录放射性-标记的DNA股的能力。下述测定是使用野生型酶(它是在感染HIV-1病人中最常观察到的形式)，并在类似的测定条件下使用突变RT酶(例如，Y181C，通过定向位点的突变而制备，其中在密码181处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基所取代)。该测定可以评估化合物在抑制突变酶上的效力。材料a)酶的制备一些HIV-1 IIIB克隆BH10 RT突变体由Dr.C.-K.Shih(BoehringerIngelheim Pharmaceuticals Inc.，U.S.A.)以载体pKK233-2(Pharmacia)的形式提供。简言之，只含有通过由lac操纵子/trc启动子调节的RT p66基因的HIVRT克隆pKRT2得自Dr.W.Summers(耶鲁大学)(2)。各种特异性氨基酸取代是通过定向位点的突变而引入野生型RT基因中。将RT克隆亚克隆入pKK233-2细菌表达载体中。提供的克隆包括野生型、Vall06Ala、Tyr81Cys、Tyr1 88Cys、Tyr188Leu、Gly190Ala及Pro236Leu。其他通过pKK233-2 RT克隆的定向位点的突变而在机构内制得的包括Lys103Asn、Lys103Asn/Tyr181Cys、Lys103Asn/Leu100Ile、Lys103Asn/Pro225His以及Lys103Asn/Val108Ile。b)酶的纯化重组反录酶的纯化用前述方法的组合进行(3)。使用来自转化JM109细胞的新鲜平板的单一菌落以在37℃预培养过夜，以开始培养。将2升生长培养基与该预培养物一起接种。于OD600～1.5(于37℃5～6小时)下，用IPTG(终浓度为1mM)引发RT基因表达以及于37℃继续发酵数小时。离心后，弃去上清液，同时收集细胞沉淀并贮存于-80℃，直至纯化。将细胞于4℃熔化过夜并悬浮于溶解的缓冲液(MES 50 mM pH6，EDTA 1 mM，10％v/v甘油，0.02％w/v正-辛基-β-D-糖苷，0.02％w/v叠氮化钠)中。加入溶菌酶并将混合物在冰上培育40分钟。在有溶菌酶存在下用Dounce均质化并用超音波处理后，将细胞离心30分钟。保留上清液(S1)并贮存于4℃。将离心得到的沉淀再悬浮于萃取缓冲液(MES 50mM pH6，KPO450 mM pH6，KCl100mM，10％v/v甘油，0.02％w/v正-辛基-β-D-糖苷，0.02％w/v叠氮化钠)中并于4℃搅拌30分钟。将该第二混合物再次离心并保留上清液(S2)。重复上述步骤2次以上，保存上清液S3及S4以及最后一次萃取进行过夜(S5)。将Polymin P(终浓度为0.005％)加至合并的上清液中，以除去核酸。将该溶液于4℃搅拌75分钟并离心1小时。在冰上用20％w/v硫酸铵沉淀上清液(SS1)并于4℃搅拌1小时。然后将该混合物离心并将所得的上清液(SS3)用另外的40％w/v硫酸铵(全部的60％)沉淀，搅拌1小时并再次离心。将最终得到的沉淀(P1)贮存于4℃过夜，然后于次日进行纯化。除非另有陈述，所有纯化步骤于4℃进行。
将沉淀(P1)再悬浮于缓冲液(MES 50 mM pH6，KPO410 mM pH6，KCl100mM，10％v/v甘油，0.02％w/v正-辛基-β-D-糖苷，0.02％w/v叠氮化钠)。使用12-14kD MWCO透析管将悬浮液对相同的缓冲液进行透析过夜。将所得的透析离心并将上清液经由Millex-PF 0.8微米过滤单元过滤。将滤出的样品载在羟基磷灰石柱(床体积30毫升)上并用相同缓冲液冲洗。结合的酶用约220毫升的含10至300 mM KPO4的线性梯度的上述缓冲液洗脱。将含p66/p51杂二聚物的部分(由SDS-PAGE 8％及Western 印迹法测定)汇集以供下一个柱层析。将含有RT的部分用缓冲液(Bis-Tris丙烷50 mM pH 7.0，(NH4)2SO41M、0.02％w/v OBG，10％v/v甘油，0.02％NaN3)稀释2倍。然后加载在Hi-Trap肝素琼脂糖柱(床体积为5毫升)上并用相同缓冲液冲洗。结合型RT然后用75毫升含0至1M硫酸铵的在相同缓冲液的线性梯度液洗脱。根据SDS-PAGE及Western印迹法分析汇集含RT的部分。该汇集物的蛋白质浓度通过Bradford方法测定，其中使用BSA作为标准。最终酶制剂在含MES 50 mM pH6，KPO4300 mM pH6，KCl 175mM，10％v/v甘油，0.02％w/v叠氮化物的缓冲液中透析，分成等份并于-80℃冷冻。测定步骤放射性酶测定采用96-孔微量滴定皿格式并使用链霉抗生物素闪烁亲近珠。该测定简单说明于下。将HIV-1 RT酶融化以及用含NaCl 60 mM，MgCl2·6H2O 2mM，DTT 6mM，还原的谷胱苷肽2mM及0.02％w/v Chaps的Tris/HCl 50mMpH 7.8进行稀释，得到约3nM酶。在30微升的该酶溶液中，加入10微升抑制剂溶液(50μM至2.5nM抑制剂，在含有15％v/v DMSO的上述缓冲液中)。在进行下一步骤前，将该平皿于室温预培育15分钟。在该预培育步骤中，最高及最低抑制剂浓度分别为12.5μM及0.62nM，以及DMSO浓度为3.75％v/v。该酶促反应通过添加10微升基质溶液而启动。最终反应混合物含有Tris/HCl 50 mM pH 7.8，NaCl 60 mM，MgCl2·6H2O 2mM，DTT 6 mM，GSH 2 mM，Chaps 0.02％w/v，DMSO 3％v/v，Poly rC 179nM，生物素dG1518nM，dGTP 288 nM及3H-dGTP 71 nM。
在该培育步骤中，最高及最低抑制剂浓度分别为10μM及0.5nM。添加基质后，将平皿用塑料密封物覆盖并在干燥培育器中于37℃培育1小时。反应然后通过添加75微升含5毫克/毫升链霉抗生物素闪烁亲近珠的EDTA0.5M而终止。
将平皿以中等速度振摇2分钟并在室温培育1小时。然后加入75微升氯化铯7M溶液，将平皿以中等速度振摇2分钟并于室温再次培育1小时。然后将平皿用塑料密封物覆盖以及用TopCount-NXTTM微量平皿闪烁和冷光计数器(Packard)计数。各孔计数60秒。各列在其两端含有空白及对照孔。
抑制％的计算如下 使用上述测定，测试本发明化合物对于RT野生型(WT)及突变酶的抑制。结果列于表2，以IC50(nM)表示。
为了确证这些化合物对抑制HIV复制的能力，它也在下述人类T-细胞培养物(Syncytia)中进行测试。评估细胞培养物中活性的ELISA测定在96-孔平皿测定中，测试本发明化合物在细胞培养物中抑制HIV复制的能力。使用由RPMI1640+10％牛胎血清，10微克/毫升庆大霉素及10μMβ-巯基乙醇构成的完全RPMI 1640稀释化合物并作为细胞生长培养基。将T淋巴细胞用编码野生型及突变型反录酶的病毒，以0.001感染倍数进行感染。然后在有本发明化合物存在下的系列稀释液下，培育细胞3日。将上清液从8个复制孔中汇集并用市售HIV-1 p24抗原测定套组(Beckman-Coulter)测定胞外p24的浓度。抑制度(抑制百分率)以下列方程式计算
结果列于表3，以EC50(nM)表示。特异性测定为了评估本发明化合物的酶抑制活性的特异性，用已知方法测试少数化合物的抑制其他病毒聚合酶(诸如肝炎C病毒及呼吸道合胞病毒RNA-依赖性RNA聚合酶)以及哺乳动物聚合酶(诸如小牛胸腺RNA-依赖性DNA聚合酶及人类端粒酶)的能力。观察到被测试化合物中没有一个对这些酶具有明显的抑制活性。这些结果显示本发明化合物的酶抑制活性是特异性地对准HIV-1RT。
参考资料(列入本文作为参考)1.Benn，S.，等人.科学230949，1985.2.D’Aquila，R.T.and Summers，W.C.J.Acq.Imm.Def.Svn.2579，1989.3.a)Warren，T.C.等人.蛋白表达及纯化3479，1992；b)Kohlstaedt，L.A.科学256(5065)1783，1992.
表2式I化合物对于野生型及突变菌株RT的抑制

表3式I 化合物对于细胞培养物中野生型及突变型HIV的抑制

权利要求
1.一种具有通式I的化合物或其药物上允许的盐 式中R2选自H、F、Cl、C1-4烷基、C3-4环烷基及CF3的基团；R4为H或Me；R5为H、Me或Et，其条件为R4及R5不同时为Me，以及如R4为Me时，则R5不可能是Et；R11为甲基、乙基、环丙基、丙基、异丙基或环丁基；以及Q选自下列中的基 和
2.按权利要求1的化合物或其药物上允许的盐，其中R11为乙基或环丙基。
3.按权利要求1的化合物或其药物上允许的盐，其中Q选自下列的基 和
4.按权利要求1的化合物或其药物上允许的盐，其中Q为
5.按权利要求1的化合物或其药物上允许的盐，其中R5为甲基。
6.按权利要求1的化合物或其药物上允许的盐，其中R11为乙基。
7.一种化合物或其药物上允许的盐，它具有下列结构式
8.一种化合物或其药物上允许的盐，它具有下列结构式
9.一种化合物或其药物上允许的盐，它具有下列结构式
10.一种具有通式I的HIV复制的抑制剂 式中R2选自H、F、Cl、C1-4烷基、C3-4环烷基及CF3中的基团；R4为H或Me；R5为H、Me或Et，其条件为R4及R5不同时为Me时，以及如R4为Me，R5则不可能是Et；R11为甲基、乙基、环丙基、丙基、异丙基或异丁基；以及Q选自下列基团 和 或其药物上允许的盐。
11.按权利要求10的HIV复制的抑制剂，其中R11为乙基或环丙基或其药物上允许的盐。
12.按权利要求10的HIV复制的抑制剂，其中Q选自下列的基 和 或其药物上允许的盐。
13.按权利要求10的HIV复制的抑制剂，其中Q为 或其药物上允许的盐。
14.按权利要求10的HIV复制的抑制剂，其中R5为甲基。
15.按权利要求10的HIV复制的抑制剂，其中R11为乙基。
16.一种具有下式的HIV复制抑制剂 或其药物上允许的盐。
17.一种具有下式的HIV复制抑制剂 或其药物上允许的盐。
18.一种具有下式的HIV复制抑制剂 或其药物上允许的盐。
19.一种治疗或预防HIV感染的方法，其包含给药病人HIV抑制量的权利要求1的式I化合物或其药物上允许的盐。
20.一种治疗或预防HIV感染的药物组合物，其包含权利要求1的式I化合物或其药物上允许的盐，以及药物允许的载体。
全文摘要
本发明提供一种通式I的化合物式中R
文档编号A61P43/00GK1436189SQ01811269
公开日2003年8月13日 申请日期2001年6月14日 优先权日2000年6月16日
发明者布鲁诺·西莫尼厄 申请人:贝林格尔·英格海姆加拿大有限公司