宠物食物使用的新益生菌的制作方法

专利名称：宠物食物使用的新益生菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及新乳酸菌，尤其涉及已分离出的并按其益生菌效力加以挑选的乳酸杆菌、双歧杆菌属和链球菌(肠球菌)属的微生物。本发明还涉及其在改善宠物健康的宠物食物组合物制备中的应用和含该微生物的组合物。还提供了通过对宠物给食这种微生物来维持或改善宠物健康的方法。
背景技术：
家畜健康与其给食密切相关。正确给食会造就驯服和健康的宠物。除提供营养价值外，食品组成会影响肠内的微生物菌群的平衡，并可导致或免除胃肠机能紊乱。因此，对健康动物的胃肠道和消化过程知识是理解实际给食作法所必要的。作为食肉动物，猫和狗具有其消化道短和团块食物流量快的特点。
在猫和狗胃肠微生物菌群的成分中，可恢复畸形菌体种、梭状芽孢杆菌种、肠杆菌科、双歧杆菌属种、乳酸杆菌种、链球菌种、葡萄球菌种和酵母。
这种内生菌群数目和组成趋向于更稳定，不过年龄和在稍小程度上食物会使之有所变异。胃酸度、胆汁、肠内蠕动和局部免疫都被认为是调节人类和各种其它哺乳动物的小肠细菌菌群的重要因素。
通常猫科的胃肠机能紊乱是与细菌过度繁殖和通过病原菌产生的肠毒素的产量有关系的。
最近几年来，研究考查已集中一些重要乳酸菌系及其作为益生菌试剂的可能用途上。益生菌被认为是生存微生物制剂，它通过保持肠内天然微生物菌群，增进哺乳动物的健康。益生菌被认为是依附于肠粘膜，定居(colonize)于肠道，并由此防止其上有害微生物的附着。其作用前提在于它们必须以适当而有生存力的形态达到肠管的粘膜，而且尤其不会因胃内以低pH值为主的影响而被破坏。尤其，猫和狗消化道的生理学与人类的不同。例如，对狗胃内平均pH值约3.4，对猫约4.2。
尽管US 5,968,569披露了宠物食物谷类中的一种益生菌微生物的内含物，但不仅它，而且其余已有技术也都没有提供有关菌株，尤其有关为宠物健康菌株的资料。
因此，有必要提供一种尤其适宜于宠物而且按有利宠物健康的高益生菌性质而挑选的新菌株，并将这些新菌株加至宠物食物组合物中，发明综述按照本发明的第一方面，提供乳酸菌的一种新益生菌微生物，它是按其存活并定居于宠物胃肠道的能力及其对宠物健康起有利的益生菌活性作用进行选择。
该益生菌菌株可以选自乳杆菌、双岐杆菌或肠道球菌。
该益生菌菌株可以选自路氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、动物乳杆菌、瘤胃乳杆菌、约氏乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌及双歧杆菌属种、粪便肠道球菌及肠道球菌种。
在一组优选实施方案中，该益生菌菌株选自路氏乳杆菌(NCC2581；CNCM I-2448)、路氏乳杆菌(NCC2592；CNCM I-2450)、鼠李糖乳杆菌(NCC2583；CNCM I-2449)、路氏乳杆菌(NCC2603；CNCMI-2451)、路氏乳杆菌(NCC2613；CNCMI-2452)、嗜酸乳杆菌(NCC2628；CNCM 1-2453)、青春双歧杆菌属(如NCC2627)、双歧杆菌属NCC2657或屎肠球菌SF68(NCIMB 10415)。
对该新菌株可采用任何数量，由约1.0E+04-1.0E+12cfu(菌落形成单位)/动物·日，优选由1.0E+05-1.0E+11cfu/动物·日、最优选由1.0E+07-1.0E+10cfu/动物·日。
本发明一方面涉及如上所述的菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物应用，用于制备一种治疗及/或预防由病原微生物引起的与宠物胃肠道定居有关病症的组合物。除非另有清楚标明其范围之外，对“菌株”的引用都应理解为包括其培养物的上清液及/或其代谢物。
在另一方面，本发明涉及如上所述菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物的应用，用于制备一种用来调节宠物免疫反应的组合物。所谓术语“调节”免疫反应，指的是如上所述菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物具有刺激对宠物健康重要的某些免疫功能或调制可能涉及其免疫失调如炎症、过敏症等的能力。可利用如上所述菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物的不同组合，实现刺激或调制这些免疫功能。
本发明还提供一种保持或改善宠物胃肠道、皮肤及/或皮毛体系或其免疫系统健康的方法，包括对宠物给食一种含有至少一种分离出来的如上所述菌株的宠物食物组合物。
此外，本发明提供一种治疗及/或预防由病原微生物引起宠物有关胃肠道定居失调的方法，包括对宠物给食一种包括至少一种按照本发明分离出来的菌株的宠物食物组合物。
本发明还提供一种调节宠物免疫反应的方法，包括对宠物给食含有至少一种按照本发明分离出来的菌株的宠物食物组合物的步骤。
本发明还提供一种改善或减弱宠物老化作用的方法，包括对宠物给食含有至少一种按照本发明分离出来的菌株的宠物食物组合物的步骤。
所选这些微生物对宠物的胃肠道、皮肤及/或皮毛、其免疫系统及其老化作用都有特别有利的影响。
它们对肠内的病原体诸如菌株鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、志贺痢疾杆菌、或其它移生宠物的病原肠杆菌科或寄生物诸如蠕虫(弓蛔虫属种)、原生动物(隐孢子虫属种、贾第鞭毛虫属种、hominis五鞭毛虫属、痢疾内变形虫、非洲弓浆虫、...)或酵母。
与食物结合，这些微生物尤其对适口、消化及肠肚健康、免疫功能及卫生条件都起到益生菌有利影响的作用，后者有助于减少粪便体积并至少对狗粪便有部分除臭作用。因此，按照本发明第二方面，一种宠物食物组合物包括一种在宠物中有高益生菌活性并能生存及定居于宠物胃肠道的微生物。
因此，本发明涉及一种为宠物胃肠道健康而配制的与可吸收载体或药物基质有关的宠物食物组合物，其内含有至少一种如上所述分离出来的益生菌菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物。
此外，本发明也涉及一种为调节宠物免疫反应而配制的与可吸收载体或药物基质有关的宠物食物组合物，其内包含至少一种如上所述分离出来的益生菌菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物。
此外，本发明还涉及一种为改善或减少宠物老化作用而配制的与可吸收载体或药物基质有关的宠物食物组合物，其内包含至少一种如上所述分离出来的益生菌菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物。
最后，本发明涉及一种为宠物皮肤及/或皮毛健康而配制的与可吸收载体或药物基质有关的宠物食物组合物，其内包含至少一种如上所述分离出来的益生菌菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物。
在一组实施方案中，该可吸收载体包括一种宠物营养均衡的食物组合物。所述组合物优选包含足够数量的该分离出来的菌株、其培养物上清液及/或其代谢物，在将该组合物作为一种完整的膳食喂给宠物时，会有效提供所述预防作用。
发明详述在以下描述中，缩写cfu(″菌落形成单位″)表示用在琼脂平皿上微生物计数的方法显示的细菌细胞数。
此外，“NCC”指雀巢培养物收集站((Nestle CultureCollection)(Nestle Research Center，Vers-chez-les-Blanc，洛桑市，瑞士)。
至于本发明第一目的在于，按其技术及生理参数，对从猫和狗粪便分离出来的20种乳杆菌及18种双岐杆菌进行过筛和选择。
对于益生菌的可能应用进行了体外首次筛选(参见实施例1及2)生长特性，对可能存在于猫狗十二指肠中的不同pH值的胃酸度和不同胆汁盐浓度的耐受性。
此外，还清楚地证明了在4℃及20℃下两种不同冷冻保护剂中经冷冻干燥的细胞的存活很好，如快速存储试验所示。
这些菌株特征为，细胞增代时间短，在其平稳期的过程中计数高(1.0E+08cfu/ml以上)和在8和24小时接种后的高计数下稳定，对冷冻干燥随后的存储条件均稳定，耐受在十二指肠内具有的生理胆汁浓度(2％胆汁)并在胆汁高达4％中生长时其抑制作用低。此外，为选择有代表性的调查差异的细菌，还考虑了DNA分析的结果。
为猫和狗健康而提出的菌株，在胆汁盐高达2.0％下，可生长到至少1.0E+06cfu/ml。这些菌株在pH约3.4-4.2范围下约2小时之后也可生长到至少1.0E+06cfu/ml。
按照本发明的菌株可以选自路氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、动物乳酸杆菌、瘤胃乳杆菌、约氏乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、双歧杆菌属、屎肠球菌、肠球菌属。
按照布达佩斯协定，在Collection Nationale de Culture deMicro-organismes(微生物培养国家收集站)处(2000，4月19日25的rue du docteur Roux，75724 Paris，France)作为实例存放了以下菌株路氏乳杆菌NCC2581、鼠李糖乳杆菌NCC2583、路氏乳杆菌NCC2592、路氏乳杆菌NCC2603、路氏乳杆菌NCC2613和嗜酸乳杆菌NCC2628，以下分别旁注为CNCM I-2448、CNCMI-2449、CNCM I-2450、CNCM I-2451、CNCM I-2452和CNCM I-2453。在本申请或其优先权利要求的其它申请的第一次公布时，对有关提供的这些存放菌株的所有限制将被撤消。
所选菌株的生物化学特征路氏乳杆菌CNCM I-2448-格兰氏阳性微生物，非游动的，非孢子的-相当短和厚的小棒形状-微嗜氧微生物，具有异型发酵代谢作用，产生L(+)和D(-)乳酸-催化酶(-)，由葡萄糖产生二氧化碳，精氨酸水解＝产生NH3-用5％和10％ NaCl繁殖-糖的发酵L-阿糖，半乳糖，D-葡萄糖，乳糖，蔗糖，D-棉子糖鼠李糖乳杆菌CNCM I-2449-格兰氏阳性微生物，非游动的，非孢子的-相当短和厚的小棒形状-微嗜氧微生物，具有异型发酵代谢作用，产生L(+)乳酸。
-催化酶(-)，-对鼠李糖乳杆菌曲型的所有糖发酵路氏乳杆菌CNCMI-2450-格兰氏阳性微生物，非游动的，非孢子的-相当短和厚的小棒形状-微嗜氧微生物，具有异型发酵代谢作用，产生L(+)和D(-)乳酸-催化酶(-)，由葡萄糖产生二氧化碳，精氨酸水解＝产生NH3-用5％和10％ NaCl繁殖
-糖的发酵L-阿糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、乳糖、蔗糖、D-棉籽糖路氏乳杆菌CNCMI-2451-格兰氏阳性微生物，非游动的，非孢子的-相当短和厚的小棒形状-微嗜氧微生物，具有异型发酵代谢作用，产生L(+)和D(-)乳酸-催化酶(-)，由葡萄糖产生CO2，精氨酸水解＝产生NH3-用5％和10％ NaCl繁殖-对路氏乳杆菌曲型的所有糖的发酵路氏乳杆菌CNCMI-2452-格兰氏阳性微生物，非游动的，非孢子的-相当短和厚的小棒形状-微嗜氧微生物，具有异型发酵代谢作用，产生L(+)和D(-)乳酸。
-催化酶(-)，由葡萄糖产生CO2，精氨酸水解＝产生NH3-用5％和10％ NaCl繁殖-糖的发酵L-阿糖、D-葡萄糖、乳糖、蔗糖、D-棉籽糖路氏乳杆菌CNCMI-2453-格兰氏阳性微生物，非游动的，非孢子的-相当短和厚的小棒形状-微嗜氧微生物，具有同型发酵的代谢作用，产生L(+)和D(-)乳酸-催化酶(-)，-糖的发酵L-阿糖、D-葡萄糖、乳糖、蔗糖、D-棉子糖对于从猫分离出来的三种乳杆菌(NCC2581、NCC2592、NCC2583)、来自狗的三种乳杆菌(NCC2603、NCC2613、NCC2628)、来自猫的一种双岐杆菌和来自狗的一种双岐杆菌(NCC2657)都进一步检测了它们在宠物中对其益生菌的潜在活性(参见实施例3和4)。
在另一实施方案中，本发明涉及如上所述菌株的应用，用于制备能够改善或保持宠物健康的食物组合物。
可以采用它们的活的形态、非活化形态，作为培养物上清液或其分馏物，如细胞壁、肽聚糖、细胞质、提纯蛋白质、功能代谢物、生物活性分子。
优选利用它们的数量为约1.0E+04cfu/g-1.0E+11cfu/g，优选1.0E+05cfu/g-1.0E+10cfu/g，最优选1.0E+06cfu/g-1.0E+09cfu/g。
在一组优选实施方案中，可以利用它们作为膳食辅料，以改善宠物食物质量，并可以包括量为约1.0E+04cfu/g-1.0E+11cfu/g。作为膳食辅剂，可以将它们装入胶囊或以粉末型提供，并可与主膳食结合或分开包装，它们可以是湿的或干的。举例来说，可将含本发明所选微生物的一种粉末，或其培养物上清液或所选代谢物的组分或部分，按粉末或凝胶或脂质形态或其它适宜载体，包装成小袋。可按照用户要求，提供与主食一起的单独包装单元，或与主食一起使用或处理的多单元包装。在另一实施例中，可将这些益生菌菌株与第二可吸收组分一起装在多腔包装单元中，例如一种湿的或中等含水量的碎块膳食或一种定量膳食粗磨食物，呈柔软小包结构。小包第一腔含益生菌菌株，第二单独密封的腔含第二可吸收组分。
所选这些微生物对宠物胃肠道、皮肤及/或皮毛、其免疫系统、牙齿或口腔卫生及其骨骼和对老化作用都会有特别有利的影响。
此外，也发现它们可改善宠物对食物适口性、宠物的消化、免疫功能和卫生条件(粪便体积减少和对狗粪便的部分除臭作用)。
本发明还涉及一种伴有可吸收载体或药物基质的改善或保持宠物健康的宠物食物组合物，它包含至少一种有上述特征的益生菌菌株。
可以对宠物给食至少一种有上述特征的菌株及/或其培养物上清液或其分馏物及/或其代谢物，作为对其正常膳食的补充物，或作为宠物完整营养食物的一种组分。
按照本发明的营养完整的宠物食物组合物可以是干粉末型的或湿、冷或保存稳定的宠物食品。这些宠物食品可以采用本领域已知方法生产，只要其中微生物活性是所需要的，并小心保证微生物的存活。除这些菌株及/或其发酵介质外，这些宠物食品可包括任何一种或多种淀粉源、蛋白质源和脂质源。
适宜淀粉源例如是谷类和豆类，诸如玉蜀黍，稻属，小麦，大麦，燕麦，大豆，和这些东西的混合物。
适宜蛋白质源可以选自任何适宜动物或植物蛋白质源；例如肉和膳食、家禽膳食、鱼膳食、大豆蛋白质提浓物、乳蛋白质、谷蛋白等等。对稍老的动物，优选的是含有高质量蛋白质的蛋白质源。
适宜脂质源包括肉，动物脂肪和植物脂肪。
对于淀粉、蛋白质和脂质源的选择，主要按照动物的营养需要、适口性考虑和所供应的产物类型来确定。对稍老的宠物，宠物食物优选包含相应地比年轻宠物食物的油脂更低的宠物食品。此外，淀粉源可包括一种或更多种稻米、大麦、小麦和玉蜀黍。
此外，也可按照需要，将各种其它成分，例如，糖、盐、香料、调味品、维生素、矿物质，食用香料，脂肪等掺混至宠物食物中。
对于干宠物食品，适宜的方法是热压烹调，不过焙干及其他适宜的方法也可采用。在热压烹调时，一般提供粗磨型干燥宠物食物。如果采用益生素碳水化合物，在加工前可将该益生素碳水化合物与干宠物食物的另外成分混合。适宜方法描述于欧洲专利申请EP A 0850569中，引此作为参考。如果采用益生菌微生物，而且要求在最终产品中有活性，最好用该生物体包覆干燥宠物食物或充填其中。适宜方法描述于欧洲专利申请EP A 0862863中，引此作为参考。在不要求微生物存活的情况下，可按需要将其添加至预热压混合物中，如可能添加其培养物上清液或代谢物。
对于湿食品，可采用US 4,781,939和5,132,137中所描述的方法，生产仿肉制品。这些专利引此作为参考。也可以采用生产碎块型产物的其它程序；例如在蒸汽灶中烹调。另外，可乳化适宜肉料制成肉酱、添加适宜胶凝剂、并加热肉酱、然后充填进罐头盒或其它容器中，以生产肉糕型产物。在制造干燥宠物食品情况下，所选益生菌种的存活不是主要的，但在烹调或加热之前，或在生产过程任何适宜或方便的阶段，可将其加至给料混合物中。
在宠物食物中益生素的量优选约20％重量以下，更优选约10％重量以下。例如，该益生素可包含约宠物食物的0.1％-5％重量。对于采用菊苣作为益生素的宠物食品，可包含菊苣，构成给食混合物约0.5％-10重量％；更优选约1％-5％重量。
宠物食品可含其它活化剂，诸如长链脂肪酸。适宜长链脂肪酸包含α-亚油酸，γ-亚油酸，亚油酸，二十碳戊酸，和二十二碳己酸。鱼油是二十碳戊酸和二十二碳己酸的一种适宜源。琉璃苣籽油，黑茶籽油，晚樱油是γ-亚油酸的适宜来源。红花油类、向日葵油类、玉蜀黍油类和黄豆油类是亚油酸的适宜来源。
如有必要，用矿物质和维生素增补宠物食品，使之营养完全。
此外，如果需要，可将细菌菌株包于胶囊中；例如包囊于糖基质、油脂基质或多糖基质中。也可按EP 862 863所述对其涂覆。
优选采用新益生菌菌株，使宠物食物每克优选含约1.0E+04-1.0E+10细胞的益生菌微生物；更优选每克宠物食物含约1.0E+06-1.0E+08细胞的益生菌微生物。宠物食物可含约0.005％-10％重量的益生菌微生物的混合物。优选它含约0.02-6％重量和最优选约1-6％重量。
为获得有利效果，宠物食用宠物食物量取决于宠物的大小、类型和年龄。但是，提供宠物食物量，通常应当以每日食用至少一种乳酸菌菌株及/或当量发酵介质的量约1.0E+03-1.0E+14cfu是适当的。优选对狗给食约1.0E+09-1.0E+11cfu/日，或对猫给食1.0E+07-1.0E+10cfu/日。
按照本发明的组合物的益生菌活性高，及/或被发现是对改善及/或保持宠物健康的消化功能和改善和保持宠物的胃肠道、皮肤及/或皮毛及/或免疫系统和健康是特别有效的。这种组合物也对猫和狗的老化产生有利的影响。
本发明并不局限于这里所述具体实施方案的范围。现在先简要描述图，后再描述实施例。
1在用促细胞分裂剂或佛波酯刺激时，狗的外周血单核细胞(PMBC)的淋巴细胞增生。用图示剂量(μg/ml)的不同促细胞分裂剂，对成年狗给食有(黑色条)或无(白色条)的嗜酸杆菌NCC2628四周，刺激成年狗的PMBC。促细胞分裂剂是PHA(植物凝集素)、ConA(伴刀豆凝集素A)、PWM(商陆有丝分裂原)及佛波酯是PMA/iono(乙酸肉豆蔻佛波醇和离子霉素)。*＝P＜0.05、斯氏-t检验。
图2用不同益生菌菌株刺激狗的白血球形成的细胞因子。用不同宠物分离出来的乳杆菌菌株，刺激正常成年狗白血球18小时。对照培养物含单独介质(阴性对照)或人体乳杆菌分离物ST11(阳性对照)。用RT-PCR(室温聚合酶链反应)鉴定细胞因子。用对菲啶溴红变形琼脂糖凝胶进行扫描，和用NIH成象软件对各带条相对象素进行确定的方法，完成对它们的量化。这些结果均按两独立实验的平均值以任意单位表示。(A)IL-12、(B)IL-10、(C)IFNγ、(D)TGFβ。
实施例实施例1菌株及培养条件按其对猫和狗潜伏益生菌用途对许多菌株(来自雀巢培养物收集站＝NCC)进行筛选。尤其，按照表1中所列从猫及狗粪便中分离出来的20种乳杆菌及18种双岐杆菌，评定了其繁殖能力、对随后存储冷冻干燥的耐受性、对猫和狗胃肠道中的胃酸度及不同浓度胆汁盐的耐受度。
表1测定所选细菌的代码及特征乳酸杆菌
双岐杆菌
所有20种乳酸杆菌及18种双岐杆菌是从保持不同膳食的猫和狗中分离出来的，如表1所示。是通过形态和生理特征判断的初始鉴别而确定的。对乳杆菌及双岐杆菌分别采用API-50CH及快速-ID32A体系(BioMerieux)。纯菌株是冻结及储存于-80℃下的雀巢培养物收集站(Nestec Culture Collection)(NCC)。
所有细菌都是在用于分析的肉汤介质中被培养的。各现活化菌株的样品被存放在-80℃的1毫升防冻介质中(40％甘油+60％ LL)。在10毫升生长培养基和37℃厌氧培育中，用1％接种液每周一次对培养物维持传代培养。
使乳杆菌在MRS中生长18小时。使双岐杆菌在MRS+0.05％(重量/体积)L-盐酸半胱氨酸(MRS-C)中生长32小时，或在BHI+0.05％L-盐酸半胱氨酸(BHI-C)中生长48小时，开始时用5％接种液。
将所有培养物在不同转移中均存储在+4℃。利用氢-二氧化碳厌氧体系(GasPak，Becton Dickinson，USA)一般获得厌氧生活。在其存储期间总是保持双岐杆菌在这些瓶罐中。
实施例2菌株选择这种体外过筛是基于对活细胞工业应用及其对抑制或有害胃肠条件的存活能力和其基因组差异的生产特征。运用RAPD及核糖分型(ribotyping)，考虑这些非特征菌株的菌株差异或基因组相似性。
材料及方法细菌繁殖必须鉴别能迅速形成大量细胞的菌株。其细菌繁殖周期可表征为短停滞期、短增代时间、高的最大计数值及长稳定期。因此，对菌株进行比较，考虑三个变量其停滞期长度、细胞增代时间(小时)及最大计数，这些相当于最重要的特征。
对乳杆菌属用1％的一种新鲜传代培养物在37℃下接种预培育过的200毫升MRS发酵液。按接种后每小时收集1毫升样品，历时八小时。24小时之后取最后一个样品。取各样品一毫升，在TS中连续稀释10倍，用于计数。使培养物在MRS琼脂(倾注-平板培养技术)中37℃下厌氧生长48小时。以每毫升培养物的菌落形成单位(cfu)，记录菌落数在30-350的所有平板，并由此认可其计数。
对在(MRS-C)中的双岐杆菌属在初步检测中，在MRS-C和TPYG发酵液中繁殖24小时之后，计数所有菌株。用cfu/ml表示结果。测定在MRS-C中生长0、4、12、24、32和48小时之后的细胞数，按照对乳酸杆菌所述方案，确定繁殖曲线。为了确定传代培养基和对繁殖培养基脱气最佳化的影响，对以下传代培养物实行这种检测●来自在BHI-C中4℃存储48小时并在MRS-C中接种的传代培养物；
●来自在BHI-C中4℃存储48小时并在脱气(通过热压处理该介质两次及将其直接存储于厌氧瓶中已使脱氧最佳化)过的MRS-C孔中接种的传代培养物；●来自在MRS中一种新鲜传代培养物，并在脱气过的MRS-C孔中接种，并在实验前存储于厌氧条件下。
表2细菌繁殖检验介质
用添加Difco Bacto琼脂(15g·l-1)的方法获得固体培养基。在121℃热压处理培养基15分钟。使双岐杆菌的液体培养基存储在厌氧状态下，或使用之前使之脱气。
对胃的pH值及胆汁耐受性在吸收时，该微生物在胃及十二指肠条件下必须成活，能在动物胃肠道中起到有利的活性作用。胃的pH值及胆汁盐是控制细菌群落的主要组分。因此，必须测定这些菌株对酸性及胆汁的耐受性。
猫和狗的消化道生理机能与人类的不同。狗及猫平均pH值分别为pH3.4及4.2。建议了一种用于检测的重组宠物胆汁(表4)。在消化食物时小肠中胆汁浓度变化在0.5-2％的范围。
按照在猫和狗体内存在的最大pH值，在pH2.6下10分钟之后及在pH3.4(从狗分离出来的菌株)或pH4.2(从猫分离出来的菌株)2小时之后的活菌计数不应低于1.0E+06cfu/ml。
对胃pH值耐受性对所有乳杆菌在MRS发酵液接种1％，并在37℃下厌氧生长过夜。对双岐杆菌使在BHI-C中接种5％，并在37℃厌氧条件下生长48小时。将该培养物分配在2毫升的反应管(Eppendorf管)中，并在3500xg/10min/20℃下离心。对细胞用林格-溶液洗涤三次。用HCl(Merck)调节三种模拟胃液pH值水平至2.6、3.4和4.2，检测对胃酸性条件的耐受性。所有滤器消毒均采用一次性过滤器产品(Nalgene除菌滤器)。添加1毫升至一系列5毫升模拟胃液(pH不同)中并补加1.5毫升0.5 ％NaCl溶液，研究各细菌悬液的存活率。
在37℃下培育样品，按以下计数活生物体●用pH2.6的胃液在0、1、5、10分钟下；●当胃液pH为3.4(对于从狗分离出来的菌株)或4.2(对于从猫分离出来的菌株)时，在0、1、30、60、120、180分钟下。
用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释样品，将稀释样品涂至MRS-琼脂上，并进行计数。
表3模拟胃液
●对胆汁盐耐受性在各种浓度的重组宠物胆汁存在下测定乳酸杆菌生长18小时活菌计数的演变。
当其log10偏差在0.25以上时，有两种活菌计数被认为是显著不同。各菌株以二个变量表征●发现了与对照物无明显差异的所测最大胆汁盐浓度●当生长培养基中胆汁浓度增加时成活力的降低速率。
以胆汁浓度上升1％其损失超过log10活菌计数为特征的菌株，均被认为对胆汁是敏感的。在0-2％胆汁存在下生长细胞之间，减少超过一个log10的，和每另加百分之几胆汁(2％以上)的减少超过一个log10的，被认为是合格的。此外，在高达2％胆汁盐存在下生长时，应该选择只产生1.0E+06cfu/ml以上的菌株，以使在胃肠道中产生效应。
按表4中指示，制备猫或狗的重组宠物胆汁，并在使用前经过滤器杀菌。在第一组测定中，乳杆菌在37℃下在MRS发酵液中厌氧生长24小时，然后转送入新鲜MRS发酵液中，另加0、0.1、0.3、0.5、1、2、4％无菌重组宠物胆汁，培养另外18小时。在试验装置(TS)中10倍连续稀释样品计数。用WASP(Whitley AutomaticSpiral Plater；Don Whitley Scientific Limited，England)，将稀释物1.0E-03和1.0E-05涂抹于MRS琼脂上。干燥时，将该平板倒置并在厌氧瓶中37℃培育48小时。Floch等(1972)定义与对照管生长相比测试中减少至少2个log数时的抑制才为显著的。根据这个定义，在0、1、1.5、2、2.5、3、4％胆汁存在下，同样测试了在第一检测中对胆汁浓度敏感的所有乳杆菌和两种耐受4％胆汁的乳杆菌。第二测定目的在于重复性和确认活细菌数是否随胆汁浓度增加而剧烈降低。
另一方面，它表明在18小时的期间这些菌株是耐受胆汁的。生长曲线是在胆汁盐存在下建立的，以断定停滞期和繁殖速率是否受到影响。按照早先繁殖测定所描述的方案，利用在补加1％重组宠物胆汁的MRS发酵液中生长的乳杆菌进行测定。
用含0、1、2、3和4％重组宠物胆汁的MRS-C发酵液，使双岐杆菌传代培养和繁殖32小时/37℃/厌氧。采用了对乳杆菌在稀释物1.0E-03、1.0E-04和1.0E-05下相同的计数方法。
表4重组宠物胆汁
●乳酸杆菌菌株对冷冻干燥和随后存储的存活率评价了存活率的演变。不及10E+05CFU/ml的活菌计数被认为是太低。
对各菌株，用新鲜传代培养物对200ml MRS发酵液接种3％。在37℃下使该培养物生长16小时。不充气条件(密闭容器)被认为是基本上厌氧的。采用先前描述的倾注-平板培养法计数活细胞。
经3500xg/+7℃/20分钟离心(RC3C Sorvall Instrument公司的离心机)，采集培养物，并将其再悬浮于10毫升两种不同防冻培养基中。各菌株被再悬浮于两种不同防冻剂中。对提浓细菌悬液(倾注平板培养法)计数，并将其分配进小瓶(0.5毫升每安瓿)中。用液氮-196℃下冷冻该样品，并对其真空干燥18小时。冷冻干燥之后，通过冷冻干燥器的空气进入阀引入氮气，并密封所有安瓿。将所有小瓶存储于+4℃和+20℃下六个月。每月确定每安瓿中活细胞数(对各种细菌和悬浮物培养基)。
结果按对猫和狗潜伏益生菌选择的构架，根据其生长潜力、对冷冻干燥随后存储的耐受性、对猫和狗胃肠道中胃液pH和胆汁浓度的耐受性，表5列出了体外过筛20种乳杆菌和18种双岐杆菌的结果。
按满足目前研究的判据，对这20种乳杆菌进行了分类。在有关其生长特征、胃(液)pH耐受性、胆汁耐受性和对冷冻干燥之后储存期间存活率方面，所列四种菌株结果良好路氏乳杆菌NCC2581(CNCMI-2448)、路氏乳杆菌NCC2592(CNCMI-2450)、路氏乳杆菌NCC2603(CNCMI-2451)和路氏乳杆菌NCC2613(CNCM1-2452)。汇集特征如下在MRS中生长时，细胞增代时间小于1小时；●停滞期短(小于2小时)；●在生长周期的稳定期过程中细菌计数高(1.0E+08CFU/ml以上)，在接种后8和24小时稳定；●通过冷冻干燥和随后4℃和20℃下存储六个月，这些菌株是稳定的；●这些菌株耐受最大胆汁浓度可能就是猫和狗胃肠道中存在的浓度(2％)；●在最多4％胆汁存在下，培养基中抑制不明显；●表明这些菌株耐受pH 2.6至少10分钟，并可保持在高于1.0E+08CFU/ml的水平；●这些菌株耐受胃平均pH至少两小时。
因此，选择了两种从猫分离出来的乳杆菌(路氏乳杆菌NCC2581和路氏乳杆菌NCC2592)和两种从狗分离出来的乳杆菌(路氏乳杆菌NCC2603和路氏乳杆菌NCC2613)进行潜伏益生菌活性研究。用API50CH鉴定菌株NCC2581、NCC2592、NCC2603和NCC2613为路氏乳杆菌。但是，核糖分型显示，除NCC2603和NCC2613以外，NCC2581和NCC2592也具有非常接近的型，因此，显示了一种可能接近的关系。菌株NCC2581具有很好的生长特性，NCC2603具有比NCC2613更好的对胆汁耐受性。
有关从猫粪便分离出来的八种双岐杆菌的结果，允许按其生长特性、对胃pH耐受性和对胆汁敏感性的功能对其加以选择。菌株NCC2623没有理想特性，因此不推荐其进一步研究。另一方面，菌株NCC2627满足所有判据在MRS-C中生长时，其增代时间在1小时以下；●其停滞期同乳酸杆菌的一样短；●在生长周期稳定期间计数高而稳定；●该菌株耐受最大胆汁浓度可能是猫和狗胃肠道中存在的浓度(2％)；●在培养基中最多4％胆汁存在下没有明显抑制；●表明该菌株对pH2.6耐受至少10分钟，并可保持在比1.0E+06CFU/ml更高的水平；
●该菌株耐受平均胃pH至少两小时。
菌株NCC2627比NCC2623和NCC2635更耐受得多，而通过核糖分型这三菌株具有接近结构，因此显示一种可能接近的关系(两种限制酶EcoRI和EcoRV的消化作用)。
当用核糖分型表征时，从狗分离出来的10种双岐杆菌显示仅两种不同结构。因此，仅用四种(每组各两种)菌株进行胆汁耐受性检测NCC2657、NCC2660、NCC2671和NCC2677。这四种菌株全耐受体内可能存在的最大胆汁浓度(2％胆汁)，菌株NCC2660和NCC2657在遭遇最大值4％的胆汁时活菌计数不降低。因此，所有从狗粪便分离出来的双岐杆菌是更耐受高浓度胆汁的。
有关生长特性，这10种细菌可能因此被分成两组●耐受胆汁菌株和生长特性良好的菌株NCC2657、NCC2651、NCC2663和NCC2667；●耐受胆汁，但其生长特性必须按工业生产被最佳化后的菌株NCC2660、NCC2671、NCC2677、NCC2647、NCC2654和NCC2674。
根据耐受在猫和狗消化过程中存在的最大胃pH值的全部结果，应对所选进一步研究的菌株提供较好测定。仅菌株NCC2651没有满足对pH值耐受性选择的判据。
表5综述
就当前结果而言，可选择从猫分离出来的一种双岐杆菌和从狗分离出来的三种双岐杆菌(分别为NCC2627、NCC2657、NCC2663和NCC2667)。
表6稀释物培养基
将9ml份分配在管内，并在121℃下热压处理15分钟。
最后，选择38种菌株中的8种用于进一步研究(参见实施例3)三种从猫分离出来的乳杆菌(NCC2581、NCC2592、NCC2583)、三种来自狗乳杆菌(NCC2603NCC2613NCC2628)一种来自猫的双岐杆菌(NCC2627)和一种来自狗的双岐杆菌NCC2657)。
这些菌株特征在于细胞增代时间短，在其平稳期的过程中计数高(1.0E+08cfu/毫升以上)和接种后8和24小时稳定在高数字下，对冷冻干燥随后两种存储条件均稳定，耐受在十二指肠中存在的最大胆汁浓度(2％胆汁)和其在最多4％胆汁存在下生长时其抑制低。此外，为选择有代表性的调查差异细菌，考虑了DNA分析的结果。
实施例3猫体内定居效力在给食试验中对路氏乳杆菌NCC2581、路氏乳杆菌NCC2592、鼠李糖乳杆菌NCC2583和双歧杆菌属种NCC2627均进行了测试，以评价其成活于猫胃肠道通道的能力。
使16只公和母猫尽可能同样地经历3天时间适应Friskies Grand牛肉菜谱。给食方案包括7天“Friskies Grand菜谱”和7天用包含上述菌株之一的“Friskies Grand菜谱”的测定，上述菌株包括路氏乳杆菌NCC2581(食谱A)、路氏乳杆菌NCC2592(食谱B)、鼠李糖乳杆菌NCC2583(食谱C)和双歧杆菌属种NCC2627(食谱D)。该食谱安排如下
制备足够数量并为稳定冻干型的所述菌株，按照所测试动物的胃肠道中菌株存活率，施加这八种不同的细菌。将所有菌株都与4克海藻糖混合，以便添加足够体积的载体，用于混合所制备的菌株和动物食物基质。在各个塑料管中调配细菌菌株(1.0E+09cfu/day)，每日加入部分食物，以保证吃去总数的细菌。
获得新鲜粪便样品，分析细菌种群数目，并与基线(不添加细菌的)相比。
收集粪便按7及8日(基线)，14及1521及22(基线)28及29。
用一种无菌直肠探针，获取至少0.1克粪便样品。精确地称重该样品，用0.1克与10毫升含10％甘油的生理溶液(林格溶液)混合。然后，将此溶液转移到1毫升低温管中，并在液氮中加以冷冻。然后将所有样品存储于-80℃下直至分析。
计数乳杆菌属、拟杆菌属、肠杆菌属、肠杆菌属、双岐杆菌属及产气荚膜梭菌的内生群种。在选择性或半选择性培养基上检测细菌。用含0.5％半胱氨酸的林格溶液，按稀释-2至-8的范围，进行百倍系列稀释。接种及培育各种选择性培养基的皮氏培养皿(见表以下)。
*Wadsworth厌氧细菌学手册，V.Suter，D.Citron and S.Finegold第三版。
**磷霉菌素(Phosphomycine)(79.5mg/1)+磺胺甲基异恶唑(0.93mg/1)+甲氧苄啶(5mg/1)
***NN琼脂，来自Lowbury and Lilly，1995。
结果以10为底的对数表示细菌计数并列于表7中。
表7猫粪便细菌计数(平均值±标准偏差(Stdev)，n＝8)
在处理过程中，我们观察到乳杆菌属的粪便计数增加，因为吸收了所引用的益生菌细菌。我们观察到，肠杆菌属计数没有急剧增大，反映了对利用所选益生菌相关的肠内生态系统没有损害。
实施例4狗体内定居效力对乳杆菌NCC2603、乳杆菌NCC2613、嗜酸乳杆菌NCC2628和双歧杆菌属NCC2657均进行了给食试验测试，以评价其在狗胃肠道通道中的成活能力。
对10只狗(5公和5母，4-7岁)进行了这种专门试验。给食方案包括5天给食“Friskies Vitality”w/o菊苣适应和5天给食“Friskies Vitality”w/o菊苣进行测定，和3天适应，5天给食“Friskies Vitality”w/o菊苣+细菌路氏乳杆菌NCC2603(食谱E)、路氏乳杆菌NCC2613(食谱F)、嗜酸乳杆菌NCC2628(食谱G)和双歧杆菌属种NCC2657(食谱H)进行测定。
该食谱安排如下
调配足够数量并稳定冻干型的所述菌株，按照所测试动物在胃肠道中的菌株存活率，施加这八种不同细菌。将所有菌株与4克海藻糖混合，以便添加足够体积的担体，用于使所调配的菌株与动物的食物基质混合。将细菌菌株调配在单个塑料管中(5.0E+09cfu/日)，每日加入部分此食物，保证吃去总数的细菌。
获得新鲜粪便样品，分析细菌种群数目，并与基线(不添加细菌的)相比。
收集粪便按7及8日(基线)，14及1521和22(基线)28和29。
利用一种无菌直肠探针，获取至少0.1克粪便样品。精确称重样品，用0.1克与10毫升含10％甘油的生理溶液(林格溶液)混合。然后将此溶液转移到1毫升低温管中，用液氮加以冷冻。然后将所有样品存储于-80℃下直至分析。在与实施例3中所述相同培养基上计数细菌。
结果此细菌计数，用以10为底的对数表示，列于表8中。
表8狗粪便细菌计数((平均值±标准偏差，n＝5)
在处理过程中，我们观察到，由于吸收所选益生菌细菌，粪便乳杆菌计数没有较大变化，但菌株嗜酸乳杆菌NCC2628情况除外。在测试条件下，对产气荚膜梭菌抑制效果不明显，因为对产气荚膜梭菌基础水平极低。我们观察到，肠杆菌属计数没有急剧增大，反映了使用所选益生菌没有扰乱肠内的生态系统。
实施例5乳杆菌和其代谢物对肠贾第虫成活力的影响我们研究了从猫和狗分离出来的乳杆菌菌株培养物滤液上清液的影响。
材料与方法细菌菌株和培养物属于乳杆菌属的微生物是来自雀巢培养物收集站的。细菌在MTYI培养基中生长。中和含乳杆菌代谢物的上清液至pH6，并过滤器杀菌。
对照物是通过用乳酸酸化MTYI培养基，达到与其细菌培养物之一相同的pH而完成的。然后，用0.1N NaOH调节pH至pH值为6。研究中菌株源和上清液及对照物的pH值示于表9中。
表9
寄生物肠贾第虫菌株WB(ATCC 30957)是向American TypeCulture Collection(美国模式培养物收集站)(Rockville，美国)购买的。滋养体是在Keister改进TYI-S-33培养基中繁殖的，其内每升含酪蛋白消化液(casein digest)(Difco)，20g；酵母抽提物(BBL)，log；右旋糖(Merck)，10g；牛胆汁(Difco)，0.75g；NaCl(Merck)，2g；L-半胱氨酸.HCl(Sigma)，2g；抗坏血酸钠盐(Fluka)，0.2g；K2HPO4(Merck)，0.6g；柠檬酸铁铵(Sigma)，22.8mg；成年牛血清(Sigma)，100ml；青霉素/链霉素(Gibco，1000IU(国际单位)/ml，1000μg/ml)，15ml。在过滤器灭菌(0.22μm孔径)之前，用5N NaOH调节pH值至6.9。
在其内装有40毫升培养基的聚苯乙烯组织培养烧瓶中(LUX，MilesLaboratories，Inc.Naperville IL 60540)培养寄生物。放出无附着寄生物的上清液，添加5毫升冰冷培养基，在冰浴中培育10分钟脱除粘着的滋养体，并接种0.2毫升所得悬浮物到新鲜培养基中，进行传代培养。培育在37℃黑暗中进行。
增生检测将两百微升的滋养体悬浮物(1.4×105寄生物/毫升)与100μl上清液或对照物混合，并加入1μCi的3H胸腺嘧啶脱氧核苷。在37℃下在96孔组织培养平板(Nunc Brand Products)中培育样品24小时。然后，采集寄生物，并评价胸腺嘧啶脱氧核苷结合(thymidine incorporation)。
结果胸腺嘧啶脱氧核苷结合示于表10。从狗分离出来的菌株NCC 2628产生一种对WB菌株(91％)增生的强抑制作用。所研究的其它菌株不抑制滋养体的繁殖。
表10培养物滤液上清液对肠贾第虫菌株增生的影响
此试验可以证明的是，在嗜酸乳杆菌NCC 2628生长过程中所产生的功能代谢物，对肠贾第虫菌的繁殖具有非常强的抑制作用。
实施例6-8按照本发明乳杆菌菌株对肠内病原菌的抑制作用为鉴别菌株对小肠内病原体的强拮抗性，在模拟狗小肠条件(pH、胆汁组成及浓度、粘蛋白、胰酶)的模型系统中进行了共培养试验。所模拟的狗小肠汁含有重组狗胆汁(0.345g/l牛磺鹅去氧胆酸盐，Sigma，德国；0.7g/l牛磺去氧胆酸盐，Sigma，德国；3.04克/l牛磺胆酸盐，Sigma，德国；0.006克/l胆酸盐，Fluka，瑞士)、猪粘蛋白(1.9g/l，Sigma，德国)、猪胰酶(2.42g/l，Sigma，德国)及电解质溶液(5g/l NaCl，0.6克/l KCl，0.25克/升CaCl2，所有均来自Merck，德国)。用0.1N Na0H调节该汁pH值至pH值6.5±0.5。
菌株及培养条件小肠病原体选择了四种潜病原菌株鼠伤寒沙门氏菌SL1344，大肠杆菌ETEC 08H9及大肠杆菌0149K88(狗病原分离物)及一种痢疾志贺氏菌的临床分离物(人体源，由Centre Hospitalier UniversitaireVaudoise-CHUV Lausanne，瑞士友善提供)。除繁殖在Luria Bertani(卢里亚贝尔塔尼)发酵液(Difco，USA)中的鼠伤寒沙门氏菌SL1344外，所有肠杆菌科都是在脑心浸液发酵液(Brain Heart Infusion broth(Difco，USA))中在37℃振荡(240rpm)下生长的。
乳酸菌一种狗及猫科源的宽范围的乳杆菌包括嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM I-2453)，鼠李糖乳杆菌NCC2583(CNCM I-2449)、路氏乳杆菌NCC2581(CNCM I-2448)、路氏乳杆菌NCC2592(CNCM I-2450)，均选自雀巢培养物收集站(NCC、Nestec、瑞士)。并对其按上述狗小肠模型中小肠病原体存活率、生理活动性及抑制作用加以筛选。在37℃下在Man Rogosa Sharp发酵液(Difco，USA)中厌氧(anaerocult、oxoid、英国)培养乳杆菌。
活细胞计数的测定用无菌磷酸盐缓冲液(NaH2PO4，pH7，0.2M)稀释样品，并表面涂抹10倍稀释物于琼脂平板上对乳杆菌用MRS琼脂(Difco，USA)，对鼠伤寒沙门氏菌及痢疾志贺菌用沙门-志贺氏琼脂(Oxoid，England)，而对大肠杆菌用山梨糖醇Mac Conkey琼脂(Oxoid，英国)。在37℃下对乳杆菌的琼脂平板厌氧培育48小时，和在37℃对肠杆菌科培养24小时。
对共培养试验，添加多粘菌素(Oxoid，英国)抑制肠杆菌科在MRS琼脂上的生长。
乳酸菌(LAB)和病原体之间共培养试验在37℃下20毫升(Falcon管)模拟富集了不同碳源(糖、宠物食物)的狗小肠汁中。进行潜伏益生菌LAB与病原菌株的共培养试验，以促进培养物的代谢活性。在10E+08cfu/ml下接种LAB，在10E+02cfu/ml、10E+04cfu/ml和10E+06cfu/ml下接种病原体。在达到各8小时点取样品，按各10倍稀释物表面涂抹，确定在各自培养基上的活细胞计数。
共培养试验在不同条件下进行，包括用右旋糖(5g/l)富集的模拟狗小肠汁和不同浓度的市场供应的挤压干宠物食物(5、25或100g/l；Friskies ALPO Complete，USA)。后者是在电解质溶液中被均质化(Stomacher Lab拌合机)并是被悬浮的。所有试验均重复完成二次。
实施例6对在四种乳杆菌和四种潜伏病原菌株大肠杆菌ETEC 08H9、大肠杆菌0149K88、鼠伤寒沙门氏菌SL1344和志贺痢疾杆菌之间的共培养试验，是在富集5g/l右旋糖(Difco)的模拟狗十二指肠汁中完成的。乳杆菌接种10E+08cfu/ml，革兰氏阴性指示菌株系接种10E+02cfu/ml。结果汇集于表11中。
表11在富集右旋糖的模拟狗小肠汁中LAB和潜伏病原菌之间的共培养
+ 抑制生长++ 抑制生长和部分失活+++抑制生长和完全失活所有四种被研究的乳杆菌证明了抗菌活性，但仅有嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM I-2453)和鼠李糖乳杆菌NCC2583 CNCM I-2449)证明对所有测试的病原体活性高。两种菌株不仅能抑制生长、而且也能完全钝化试验体系中所含病原体(没有残留活细胞)。
实施例7乳杆菌[(嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM 1-2453)、鼠李糖乳杆菌NCC2583(CNCM I-2449)]和鼠伤寒沙门氏菌SL1344之间的共培养试验是在富集了市售挤压干宠物食物(5、25或100g/l；Friskies ALPOComplete，USA)的模拟狗十二指肠汁中的完成的。乳杆菌接种10E+08cfu/ml，革兰氏阴性指示菌株系接种10E+02cfu/ml。结果汇集于表12中。
表12在富集右旋糖的模拟狗小肠汁中LAB和潜伏病原菌之间的共培养
+ 抑制生长++ 抑制生长和部分失活+++抑制生长和完全失活结果证明，在非常实际的条件下，诸如在模拟小肠汁与宠物食物的混合物中，尤其嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM I-2453)抑制生长并甚至完全失活小肠病原体的潜力高。嗜酸乳杆菌NCC2628的抗菌活性非常高，甚至在工业宠物食物富集物含量低时，起到一种对生物体可发酵糖源的作用。与对嗜酸乳杆菌NCC2628的观测结果相反，鼠李糖乳杆菌NCC2583(CNCM I-2449)的有效性却取决于宠物食物富集水平，因此，观察到了抗菌活性随测试系中所加宠物食物数量的增加而增加。
实施例8用嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM I-2453)与不同接种水平的鼠伤寒沙门氏菌SL1344的共培养试验，是在富集右旋糖(5g/l，Difco)的模拟狗十二指肠汁中完成的。对嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM I-2453)接种10E+08cfu/ml，对鼠伤寒沙门氏菌SL1344接种10E+02cfu/ml、10E+04cfu/ml与10E+06cfu/ml。结果汇集于表13中。
表13嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM I-2453)与不同接种水平的鼠伤寒沙门氏菌SL1344的共培养
+ 抑制生长++ 抑制生长和部分失活+++抑制生长和完全失活嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM 1-2453)的抗菌活性高，足以甚至完全失活高初始浓度的鼠伤寒沙门氏菌SL1344。
实施例9对狗体内免疫刺激在临床试验中，用嗜酸乳杆菌NCC 2628菌株测试益生菌对宠物分离菌株的免疫刺激潜力。
方法用不同促细胞分裂剂刺激后，狗外周血单核细胞(PBMC)的增生对20只4-7岁的狗进行试验。给食方案包括一周用“FriskiesVitality”w/o菊苣适应和四周用“Friskies Vitality”w/o菊苣+嗜酸乳杆菌NCC2628细菌进行测定。
根据测试动物胃肠道中的菌株存活率，制备足够量和稳定冻干型的嗜酸乳杆菌NCC2628。将细菌与4克海藻糖混合，以便添加足够体积的担体，用于使所制备的细菌与动物食物的基质混合。将细菌调配在各塑料管中(5.0E+09cfu/日)，每日加入部分该食物，以保证吃去总数的细菌。
给食益生菌四周之后采集狗血液。将血液通过VaccutainerTM柱(Becton Dickinson，Mountain View，CA)分馏。按照该厂家的建议采出PBMC。
用不同促细胞分裂剂或佛波酯刺激细胞，引起T细胞(刀豆素A(conA)、植物血细胞凝集素(Phytohemaglutinin(PHA))、B细胞(商陆促分裂原(PWM))和所有细胞(佛波醇-豆蔻酸酯-醋酸盐/离子霉素(PMA/Iono)的强增生。在最终容积200μl的RPMI-1640培养基和在96孔平底的培养平板中(Nunc)补加10％胎牛血清和抗生素中，用促细胞分裂剂或佛波酯(各自剂量标明于

图1中)对每容器培育105个细胞。
在37℃下维持细胞在湿润的5％CO2气氛中48小时。用1μCi的[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷(Amersham Pharmacia Biotech，Switzerland)脉冲标记这些细胞再18小时。然后在硝化纤维素滤器(Packard)上采集细胞，并通过闪烁计数(TopCount；Packard，Switzerland)测定被结合的[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷。按三次重复的平均值(每分钟计数(c.p.m)(±SD))计算细胞增生。
结果图1在给食嗜酸乳杆菌NCC2628的狗组对所有促细胞分裂剂的响应中，细胞增生比对照组的明显增大。在用佛波酯PMA+离子霉素刺激的培养物中这种增加明显。此数据表明，在体外活化后来自给食益生菌的狗的淋巴样细胞更有活性，说明给食益生菌的狗的免疫系统已受到刺激。
实施例10用宠物分离乳杆菌菌株体外调节免疫功能对如上所述不同宠物分离乳杆菌菌株进行体外筛选，以确定它们的免疫调节潜力。为此目的，我们测定了它们对引起促炎细胞因子(IL-12，IFNγ)及/或抗炎细胞因子(IL-10，TGF-β)(Anand A.C.，Adya C.M.1999，Trop.Gastroenterol.；20(3)97-106；SpellbergB.，Edwards J.E.Jr 2001，Clin.Infect.Dis.；32(1)76-102.)的能力。其目的在于，按照强抗病原或抗癌症免疫功能，以及抗狗肠病害如过敏症及炎症(炎性肠疾病)的功能，选择可能待选的菌株。确定了加入单独培养基(阴性对照)的，加入粪便肠道球菌菌株SF68(NCIMB 10415，Cerbios-Pharma，Switzerland)及一种人体乳杆菌分离物ST11(NCC2461，CNCM I-2116)(阳性对照)的另外几种培养物。
方法狗白血球中不同益生菌菌株引起的细胞因子分布在室温下用ACK赖氨酸缓冲液(在H20中150mM NH4Cl、1mM KHCO3及0.1mM Na2EDTA，pH＝7.4)对正常成年狗的血液处理5分钟。用RPMI培养基(无抗生素)洗涤该白血球两次，并种植(seeded)2×106细胞/毫升到24孔组织培养平皿中。将1ml含106CFU的细菌悬液(描述于下)加至各孔中。
对于对照处理，将培养基单独加至白血球中。在37℃及5％CO2中培育样品18小时。随后采集白血球，用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤，并加以离心。用500μl的Trizol试剂(Gibco BRL)溶化细胞球。采用Nucleospin RNA(核糖核酸)试剂盒(Macherey-Nagel)从细胞溶解产物中萃取RNA。用AB基因试剂盒(Merck公司)进行对狗细胞因子放大的RT-PCR(室温-聚合酶链反应)。主要参照物(所有的都由Microsynth生产)指示于下。用NIH成象软件，对在菲啶溴红污染的琼脂糖(agarsose)凝胶中显示的PCR-带进行了光密度分析。所有带均用由各样品(内部对照)获得的各自β-肌动朊PCR-产物带进行归一，并将结果表示为任意单位，反映各细胞因子PCR-产物带的像素密度(图2)。
-细菌的制备在MRS培养基中使乳杆菌的不同菌株生长约8小时直至达到相同密度。在无抗生素的RPMI培养基中稀释该细菌至最后浓度106CFU/ml。
-用于细胞因子-RT-PCR的主要部分
结果图2数据表明由乳杆菌诱发的细胞因子分布是与菌株相关的。例如，该菌株NCC2628诱发高水平的IL10及TGFβ，使该具体菌株对诸如过敏症及肠炎疾病的炎性病症的免疫调节潜力显著。相反，菌株NCC2583诱发强水平的IFNγ及IL-12，这使该菌株成为抗病原或抗癌症活性的一种好待选物。
实施例11研究中采用了三种干宠物食物。这些被标记为“A”、“B”及“C”。宠物食物“A”是一种营养完整的干宠物食物，商标名称ALPO(ALPO是SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A.of Switzerland的一种注册商标)。
宠物食物B是与宠物食品A同样的营养完整干宠物食物，但补加有一小袋所选益生菌微生物的粉末混合物。这种混合物包括基本等量的嗜酸乳杆菌NCC2628及双歧杆菌属NCC2657。每餐在食物上少量泼洒，该剂量提供大约1.0E8cfu/日。
宠物食物C是一种营养完整的干宠物食物，它基本相同于宠物食物A，但含有1.2％重量的屎肠球菌SF68(NCIMB 10415)培养物干燥后的上清液。
研究中用30只狗。用宠物食物A，对狗预给食8周。然后将狗分成3组，各组10只狗，标明A、B及C组，相应给食命名膳食8周这些狗均可自由饮水，而给食一天一次。由30位成员的鉴定专家小组确定其在开始和在7周后皮毛中皮屑普遍的程度。
在鉴定之前，由专家小组洗刷狗，鉴定过程中专家小组各成员间互不交换意见。
在鉴定中，使狗按20种不同配对出现在专家小各组成员面前。要求专家小组成员现场配对的狗的得分表上标记(1)皮屑较少(2)皮毛光泽较高及(3)皮毛气味较小。
从视觉及触觉上看，所有狗的皮毛综合条件良好，如同对正常、健康狗可预料到的一样。但是，对于给食膳食C的狗，其皮屑比给食膳食A对照组狗的显著地少。对于给食膳食B的狗，其皮毛光泽显著，而且其皮毛气味比给食膳食A的狗的显著更小。与B组狗相比时，这些特征显著差异不是从统计上得出来的。
实施例12一种给食混合物由约58％重量玉蜀黍、约6％重量谷类谷蛋白、约23％重量肉及膳食、盐类、维生素及其余为矿物质组成。
将此给食混合物注入预调节器中，并加以增湿。将一种含以下乳杆菌菌株的混合物加至该混合物中鼠李糖乳杆菌NCC2583(CNCMI-2449)、嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM I-2453)及屎肠球菌SF68(NCIMB10415)。将这种粉末基本均匀地分散于整个该混合物中。然后将此增湿食物混合物注入热压锅，并使之胶凝化。强使离开热压锅的胶凝化基质通过一个模具并进行压条。将压条切成适用于喂狗的片状物，在约110℃下干燥约20分钟，然后使之冷却形成颗粒。检验对压条片所加菌株的细菌活性。检测结果为没有。
实施例13研究中用24只狗。包括年轻狗及老狗，较老的狗年龄为8-12岁。所选老狗均有与其年龄相称的关节炎症的外部病兆，看起来移动常有困难。对某些运动仿佛痛苦。在较老狗中常见这些症状，被认为与关节炎条件相关。
研究中采用三种干燥宠物食物，标明为A、B及C。宠物食物A是一种营养完整的干燥宠物食物(ALPO Beefy Dinner)。这是对照食物。
对所选所有24只狗均用宠物食物A预给食8周。然后将狗分成3组，A、B及C，每组各有8只，其内年轻与较老狗的比例相同。然后对各组各自给食以下膳食8周
宠物食物B是一种营养完整的干燥宠物食物，基本相同于宠物食物A，但它包含补加重量2％的包衣，这种包衣包含微生物屎肠球菌SF68(NCIMB 10415)。对各狗每日给食物量都按各自体重计算，使其剂量为1.0E+09cfu/日。
膳食C包括以上实施例12中所生产的压条粗磨食物。对各狗每日给食物量都按照各自体重计算，使微生物剂量达1.0E+11cfu/日。
这些狗都可自由饮水并给食一天一次。将活性仪安装在各狗领圈上，每日采测量值。也通过狗舍标尺，视觉评价对狗活性。
从视觉及触觉上看，所有狗的条件均良好，如同对正常健康狗可预料的一样。但是，接受宠物食物膳食B及C组的狗，比用膳食A的配对的狗显著更活泼。仪表读数也支持了这些观测。
此外，对于在B及C组中较老的狗，在试验期间给食膳食B及C之后，看起来呈现关节炎位点外部病症减轻。另外，看起来这些狗对机械运动感受疼痛水平减轻，运动比以前更任意。可以结论的是，膳食B及C看起来解除了老化的某些病征，提高了较老宠物的活动性。
实施例14给猫的干燥食物一种食物混合物是由约58％重量玉蜀黍、约6％重量玉蜀黍谷蛋白，约23％重量鸡膳食、盐类、维生素及其余为矿物质组成。
将此食物混合物注入预调节器中，并使之增湿。然后将此增湿食物注入热压锅中，并加以胶凝化。强制将离开热压锅的胶凝化基质通过一种模具，加以热压。将压条物切成适用于喂猫的片状物，在约110℃下干燥约20分钟，然后加以冷却，形成颗粒。此刻对一种或多种以下乳杆菌种的冻干粉末加到该颗粒中鼠李糖乳杆菌NCC2583(CNCM I-2449)、嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM I-2453)或屎肠球菌SF68(NCIMB 10415)。从而提供足够粉末以使对猫的相应饮食摄入量达到约1.0E+07-1.0E+9cfu/日。将部分粉末混合到第一颗粒堆中，并装入袋内。称量第二份量的该粉末，使之与脂质担体混合，然后将其喷至第二堆颗粒质体上。在50-60℃下充分干燥包衣若干分钟之后，将颗粒装入袋内。
实施例15罐装宠物食物及添加物。
由73％家禽畜体、猪肺及牛肝(碾磨)、16％小麦粉、2％染料、维生素及无机盐调配一种混合物。在12℃下使该混合物乳化，并压成为布丁型，然后将其在90℃温度下烹调。将其冷却至30℃，并切成为碎块。将45％的这种碎块与55％的由98％水、1％染料及1％的瓜尔胶配制的调味料混合一起。充填入马口铁罐头盒，并在125℃下消毒40分钟。作为在使用前与宠物食物混合的益生菌添加物，提供具有以下乳杆菌物种菌株的小袋型附加包装鼠李糖乳杆菌NCC2583(CNCMI-2449)、嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM I-2453)或屎肠球菌SF68(NCIMB10415)。根据是否猫或狗和对诸如体重等物理因素，宠物给食相应量为约106-1012cfu/日。将其作为一种添加物以可取下的附在罐头盒上提供，并附有给食说明书。
权利要求
1.一种新分离的在宠物中有高益生菌活性的乳酸菌菌株，它是按对宠物胃肠道成活和定居能力加以挑选的。
2.按照权利要求1的分离菌株，它具有在最高2.0％的胆汁盐存在下的生长能力，产生至少1.0E+06cfu/ml。
3.按照权利要求1或2的分离菌株，它具有在pH约3.4-4.2范围下2小时之后产生至少1.0E+06cfu/ml的能力。
4.权利要求1至3任一项的分离菌株，它选自乳杆菌、双歧杆菌或肠球菌属。
5.按照权利要求1-4任一项的分离菌株，它选自路氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、动物乳杆菌、瘤胃乳杆菌、约氏乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、双歧杆菌属、屎肠球菌、肠球菌属。
6.按照权利要求5的分离菌株，它是路氏乳杆菌NCC2581(CNCM I-2448)、路氏乳杆菌NCC2592(CNCM I 2450)、鼠李糖乳杆菌NCC2583(CNCM 1-2449)、路氏乳杆菌NCC2603(CNCM I-2451)、路氏乳杆菌NCC2613(CNCM I-2452)、嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM1-2453)。
7.乳酸菌及/或其培养物上清液及/或其代谢物的一种分离菌株的应用，它在宠物中具有高益生菌活性，用于制备一种维持或提高宠物健康而配制的组合物。
8.按照权利要求7的应用，其中该菌株具有在最高2.0％胆汁盐存在下生长产生至少1.0E+06cfu/ml的能力，或具有在pH值约3.4-4.2范围约2小时之后产生至少1.0E+06cfu/ml的能力。
9.按照权利要求7或8的应用，其中该乳酸菌选自乳杆菌、双歧杆菌或肠球菌属。
10.按照权利要求7-9任一项的应用，其中该菌株选自路氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、动物乳酸杆菌、瘤胃乳杆菌、约氏乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、双歧杆菌属、屎肠球菌、肠球菌属。
11.按照权利要求7-10任一项的应用，其中该菌株是路氏乳杆菌NCC2 581(CNCM I-2448)、路氏乳杆菌NCC2592(CNCM I 2450)、鼠李糖乳杆菌NCC2583(CNCM 1-2449)、路氏乳杆菌NCC2603(CNCMI-2451)、路氏乳杆菌NCC2613(CNCM I-2452)、嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM 1-2453)、屎肠球菌SF 68(NCIMB 10415)。
12.按照权利要求7-11任一项的应用，其中包含在组合物中的该菌株的量为约1.0E+04cfu/动物·日-1.0E+12cfu/动物·日。
13.按照权利要求7-12任一项的应用，包括制备一种组合物，用于治疗及/或预防由病原微生物诱发的与宠物胃肠道内定居有关的失调。
14.按照权利要求7-12任一项的应用，包括制备一种组合物，用于调节宠物免疫系统。
15.按照权利要求7-12任一项的应用，包括制备一种组合物，用于保持或提高宠物皮肤及/或皮毛体系的健康。
16.按照权利要求7-12任一项的应用，包括制备一种组合物，用于改善或减缓宠物老化作用。
17.一种宠物食物组合物，其中包含按照权利要求1-6任一项的至少一种乳酸菌的分离菌株及/或其培养物的上清液及/或其代谢物，它们与可吸收载体或药物基质相伴。
18.一种宠物食物组合物，它是为宠物胃肠道健康而配制的，包含至少一种按照权利要求1-6任一项的分离菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物，它们与可吸收载体或药物基质相伴。
19.一种宠物食物组合物，它是为宠物皮肤及/或皮毛健康而配制的，包含至少一种按照权利要求1-6任一项的分离菌株及/或其培养物的上清液及/或其代谢物，它们与可吸收载体或药物基质相伴。
20.一种宠物食物组合物，它是为调节宠物免疫系统而配制的，包含至少一种按照权利要求1-6任一项的分离菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物，它们与可吸收载体或药物基质相伴。
21.一种宠物食物组合物，它是为改善或延缓宠物老化作用而配制的，包含至少一种按照权利要求1-6任一项的分离菌株及/或其培养物的上清液及/或其代谢物，它们与可吸收载体或药物基质相伴。
22.按照权利要求17-21的任一项的一种组合物，其中该分离菌株数量为约1.0E+04cfu/动物·日-约1.0E+12cfu/动物·日。
23.按照权利要求17-22任一项的一种组合物，它另外包含一种益生素。
24.按照权利要求17-23任一项的一种组合物，它的形式是i)一种营养完整的宠物食物，呈粉末状、干燥或湿状、冷却的或贮存稳定型，或，ii)呈膳食添加剂或补充物型。
25.按照权利要求24的一种膳食添加剂或补充物，它是以另外的诸如小袋包装与宠物食物一起提供的。
26.一种维持或提高宠物胃肠道健康的方法，包括对宠物给食一种包含至少一种按照权利要求1-6任一项的分离菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物的宠物食物组合物的步骤。
27.一种维持或提高宠物皮肤及/或皮毛体系健康的方法，包括对宠物给食一种包含至少一种按照权利要求1-6任一项的分离菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物的宠物食物组合物的步骤。
28.一种调节宠物免疫系统的方法，包括对宠物给食一种包含至少一种按照权利要求1-6任一项的分离菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物的宠物食物组合物的步骤。
29.一种改善或减缓宠物老化作用的方法，包括对宠物给食一种包含至少一种按照权利要求1-6任一项的分离菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物的宠物食物组合物的步骤。
30.一种治疗及/或预防由病原微生物引起有的与宠物胃肠道内定居有关的失调的方法，包括对宠物给食包括至少一种按照权利要求1-6任一项的分离菌株及/或其培养物上清液及/或其代谢物的宠物食物组合物步骤。
31.按照权利要求30的方法，其中病原微生物是菌株鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、痢疾志贺杆菌或其它定居宠物的病原肠杆菌属或寄生物，诸如蠕虫(弓蛔虫属)，原生动物(隐孢子虫属种、贾第鞭毛虫属、hominis五鞭毛虫属、痢疾内变形虫、弓型属gondii...)，或酵母。
全文摘要
本发明涉及按益生菌潜力及用途已分离和挑选的新乳酸菌微生物，用于配制宠物食品组合物以改善宠物健康，还涉及包含该微生物的组合物。
文档编号A61P31/12GK1444647SQ0181326
公开日2003年9月24日 申请日期2001年5月22日 优先权日2000年5月25日
发明者R·津克, R·雷尼尔奥, F·罗查特, C·卡瓦蒂尼, T·冯德维德, E·施弗里恩, J·本亚考, V·鲁塞奥, P·佩滋 申请人:雀巢制品公司