专利名称：参与细胞衰老的核酸序列和蛋白质的制作方法
背景技术：
另外，衰老已经在细胞水平即细胞衰老得到了研究。根据研究，衰老细胞的特征是(a)细胞周期停滞在G1期，(b)生理功能降低(Goldstein，科学，2491129-1133(1990)；Campisi J.，细胞，84497-500(1996))，和(c)对细胞程序性死亡的抗性(Wang E.，癌症研究，552284-2292(1995))。
由于认为细胞反映了个体水平的衰老现象，因此对细胞衰老的各种研究已经用人成纤维细胞来进行(Campisi J.，细胞，84497-500(1996))。
同时，本申请书涉及WO99/52929和WO01/23615中公开的与老龄化过程相关的核酸和蛋白质。
如上所述，尽管各种理论已经提出，但仍然需要更多的证据来阐明细胞的衰老，需要特定的生物标记来鉴定衰老的细胞，以及需要生物分子来调节细胞衰老。
特别是在某些与衰老相关的疾病如Werner综合症和Hutchinson-Gilford综合症中，返老还童和恢复正常的生理功能的前景是重要的。
通过这一申请，可参考各种专利和出版物，并在括号中提供了引证。这些专利和出版物的公开以它们的全文引入本申请作为参考，以便更全面地叙述本发明和本发明涉及的本领域的状态。
在本发明的另一个方面，提供了检测衰老细胞的方法，其包括测定编码参与细胞衰老的蛋白质的多核苷酸的量，其中该蛋白质是选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白中的一个或两个。
仍然在本发明的另一个方面，提供了调节细胞衰老的组合物，其含有有效量的参与细胞衰老的蛋白质，其中该蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
在本发明的其他方面，提供了调节细胞衰老的组合物，其含有有效量的编码参与细胞衰老的蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
仍然在本发明的其他方面，提供了调节细胞衰老的组合物，其含有有效量的与编码参与细胞衰老的蛋白质的多核苷酸杂交的反义寡核苷酸，从而抑制多核苷酸表达该蛋白质，其中该蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
在本发明的另一个方面，提供调节细胞衰老的组合物，其含有有效量的甲基化试剂或脱甲基化试剂，其中该试剂使编码小窝蛋白的多核苷酸的碱基甲基化或脱甲基化。
仍然在本发明的另一方面，提供了调节细胞衰老的组合物，其含有有效量的显性负两栖生理素-1基因。
在本发明的其他方面，提供了调节需要的患者中细胞衰老的方法，其包括给患者施用有效量的参与细胞衰老的蛋白质，其中蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
仍然在本发明的其他方面，提供了调节需要的患者中细胞衰老的方法，其包括给患者施用有效量的编码参与细胞衰老的蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
在本发明的另一方面，提供了调节需要的患者中细胞衰老的方法，其包括给患者施用有效量的与编码参与细胞衰老的蛋白质的多核苷酸杂交的反义寡核苷酸，从而抑制多核苷酸表达蛋白质，其中该蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
仍然在本发明的另一方面，提供了调节需要的患者中细胞衰老的方法，其包括给患者施用有效量的甲基化试剂或脱甲基化试剂，其中该试剂使编码小窝蛋白质的多核苷酸的碱基甲基化或脱甲基化。
在本发明的其他方面，提供了鉴定影响细胞衰老的物质的方法，其包括(a)在待测物质存在下培养细胞；(b)从细胞分离蛋白质；(c)将分离的蛋白质与特异于参与细胞衰老的蛋白质的抗体接触，其中该蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白；和(d)确定与抗体结合的分离的蛋白质的量。
仍然在本发明的其他方面，提供了鉴定影响细胞衰老的物质的方法，其包括(a)在待测物质存在下培养细胞；(b)从细胞中分离RNA；(c)将分离的RNA与编码参与细胞衰老的蛋白质的多核苷酸接触，其中该蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白；和(d)确定与编码参与胞吞作用的蛋白质的多核苷酸杂交的分离的RNA的量。
在本发明的另一方面，提供了检测衰老细胞的试剂盒，其包括源自编码参与细胞衰老的蛋白质的多核苷酸的探针，其中蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
仍然在本发明的另一方面，提供了鉴定细胞衰老的生物标记，其包括参与细胞衰老的蛋白质，其中该蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
仍然在本发明的另一方面，提供了鉴定细胞衰老的含有参与细胞衰老的蛋白质的生物标记，其中蛋白质选自两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
在本发明的其他方面，提供了鉴定细胞衰老的生物标记，其含有编码参与细胞衰老的蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质包括两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
因此，本发明的一个目的是提供检测衰老细胞的方法。
本发明的另一目的是提供调节细胞衰老的组合物。
本发明的另一目的是提供调节需要的患者中细胞衰老的方法。
本发明的其他目的是提供鉴定影响细胞的衰老的物质的方法。
仍然是本发明的其他目的是提供检测衰老细胞的试剂盒。
仍然是本发明的另一目的是提供鉴定细胞衰老的生物标记。
本发明的其他目的和优点从下列详细描述结合附加的权利要求和附图将变得明了。
图11代表携带显性负两栖生理素-1基因的表达载体的基因图谱；图12代表的聚焦纤维照片证实用显性负两栖生理素-1基因处理的幼龄细胞的胞吞作用受到抑制；图13a所示的照片代表蛋白质印迹对幼龄和中龄细胞中Erk-1/2激酶的激活(磷酸化)进行分析的结果；图13b所示的照片代表蛋白质印迹对老龄细胞中Erk-1/2激酶的激活(磷酸化)进行分析的结果；图14所示的照片代表蛋白质印迹对小窝蛋白亚型，即小窝蛋白-1、小窝蛋白-2和小窝蛋白-3，在幼龄、中龄和老龄细胞中的表达进行分析的结果；图15所示的照片代表免疫沉淀的结果，其证明在幼龄和老龄细胞中表皮生长因子受体(EGFR)和小窝蛋白-1之间的相互作用；图16的电子显微照片显示幼龄和老龄细胞中的小窝结构；图17代表携带实施例XV中构建的小窝蛋白-1cDNA的表达载体的基因图谱；图18代表的照片显示对用小窝蛋白-1cDNA转化的幼龄细胞进行蛋白质印迹分析的结果；图19代表的聚焦纤维照片表示小窝蛋白-1的表达被反义寡核苷酸急剧降低；图20的照片表示对反义寡核苷酸转染到小窝蛋白-1后的Erk-1/2激活进行蛋白质印迹分析的结果；图21的聚焦纤维照片代表在幼龄和老龄细胞中用表皮生长因子(EGF)刺激后Erk-1/2的激活和定位；图22的聚焦纤维照片显示在小窝蛋白-1下调后，即在将反义寡核苷酸转染到小窝蛋白-1之后，在幼龄和老龄细胞中用EGF刺激后Erk-1/2的激活和定位；图23a的照片代表对用脱甲基化试剂5-杂氮-脱氧胞苷处理的幼龄细胞进行与衰老相关的β-半乳糖苷活性染色的结果；以及图23b所示的照片代表对用脱甲基化试剂5-杂氮-脱氧胞苷处理的幼龄细胞进行蛋白质印迹分析的结果。
发明详述本发明主要涉及调节细胞衰老的核酸和蛋白质。正如实施例中所证明，本发明人已经发现两栖生理素和小窝蛋白以各自不同的方式对细胞衰老负责。
通过网格蛋白包被的小泡进行受体介导的胞吞作用的过程是由几个步骤组成的，其包括补充网格蛋白包被和有被芽的分裂(Schmid，S.L.生物化学年评，66511-548(1997))。在配体和受体结合之后，如表皮生长因子(下文中称为“EGF”)，受体酪氨酸激酶磷酸化网格蛋白，依次可以提供两栖生理素的Src-同源性-3(SH3)区的结合位点(Slepnev，V.I.等，科学，281821-824(1998)；Wang，L.H.等，生物化学杂志，27010079-10083(1995)；和Ramjaun，A.R.等，神经化学杂志，702369-2376(1998))。虽然它的准确的作用机制还不清楚，但人们认为两栖生理素-1参与了胞吞的芽的颈部的补充和寡聚(Schmid，S.L.生物化学年评，66511-548(1997)；和Takei，K.等，自然细胞生物学，133-139(1999))。两栖生理素-1桥接了AP2/网格蛋白包衣和发动蛋白-1，从而产生了内体小泡(Slepnev，V.I.等，科学，281821-824(1998)；Shupliakov，O.等，科学，276259-263(1997)；McMahon，H.T.等，FEBSLett.，413319-322(1997)；David，C.等，美国国家科学院院刊，93331-335(1996)；和Urrutia，R.等，美国国家科学院院刊，94377-384(1997))。两栖生理素的羧基末端区补充了GTPase发动蛋白，拧下了有被芽(David，C.等，美国国家科学院院刊，93331-335(1996)；和Urrutia，R.等，美国国家科学院院刊，94377-384(1997)。破坏两栖生理素与发动蛋白或网格蛋白和AP-2的相互作用抑制了网格蛋白介导的胞吞作用(Slepnev，V.I.等，科学，281821-824(1998)；Shupliakov，O.等，科学，276259-263(1997)；和Wigge，P.等，现代生物学，7554-560(1997))。这些发现表明，两栖生理素可以作为将胞吞小泡的网格蛋白介导的芽和发动蛋白介导的小泡分裂相偶联的已调节的衬垫蛋白质(linerprotein)。另外，已经有报道，两栖生理素有几个亚型，两栖生理素-2也有SH3区，并如两栖生理素-1一样与发动蛋白具有结合亲和力。
小窝是质膜的囊状内陷，直径在50-100nm，参与了胞吞作用如转胞吞作用和ptocytosis和信号转导(Engelman，J.A.等，FEBS Lett.，428205(1998))。小窝蛋白为21-24kDa整合的膜蛋白，是体内小窝蛋白膜的主要结构成分。小窝蛋白-1或-3基因在没有小窝蛋白的哺乳动物细胞中的稳定表达诱导了小窝结构的形成(Lipardi，C.等，细胞生物学杂志，140617(1998))。已经发现了小窝蛋白在体内有几个亚型。小窝蛋白-1是小窝结构的关键成分。小窝蛋白-2在大多数细胞类型中普遍表达，假设性在基底外侧定位的小窝中形成杂合寡聚体(Scheiffele，P.等，细胞生物学杂志，140795(1998))。已经有报道，小窝蛋白-3的表达限制于横纹肌肉细胞中(Tang，Z.等，生物化学杂志，2712255(1996))。I.检测衰老细胞的方法和鉴定影响细胞衰老的物质的方法本方法利用了参与胞吞作用的蛋白质，如两栖生理素蛋白质和小窝蛋白。
在本方法中，指示细胞衰老的信号是通过测量细胞中两栖生理素蛋白质水平的下降或通过测量细胞中小窝蛋白水平的提高来检测的。
术语“衰老”用于本文中与“老龄化”有相同的意思。术语“老龄细胞”用于本文中与“衰老细胞”有相同的意思。除非另有定义，用于本文的所有技术和科学术语的意思与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同。例如，用于本文的术语可以在下面的文献中找到，Benjamin Lewin，Genes VII，牛津大学出版社(2000)出版；和Kendrew等，分子生物学百科全书，Blackwell科学有限公司出版(1994)。
根据优选的实施方案，细胞起源于哺乳动物细胞如人细胞。
用于本发明的两栖生理素可以选自如上所述的两栖生理素亚型。优选地，两栖生理素蛋白质是两栖生理素-1，已知是如上提到的主要亚型。另外，利用的小窝蛋白可以选自小窝蛋白-1、小窝蛋白-2和小窝蛋白-3。优选地，利用的小窝蛋白是小窝蛋白-1，也已知是如上所述的主要亚型。
在利用针对两栖生理素或小窝蛋白的抗体的本发明方法中，如本领域的技术人员已知的方法可以得到该抗体(抗体实验室手册，冷泉港实验室(1988))。该抗体可以是多克隆或单克隆抗体。单克隆抗体可以利用熟知的技术容易地制备，如美国专利号4,196,265中举例的那些技术。确定与抗体结合的分离蛋白质的量可以根据本领域技术人员已知的方法进行，如放射免疫测定和酶联免疫吸附测定。这些方法通常基于标记或标志的检测，如放射性、荧光、生物学或酶标志或标记。
在这一方法的优选实施方案中，该方法是通过蛋白质印迹方法来进行的。蛋白质印迹方法的一般程序公开在Peter B.Kaufma等，生物学和医学，分子和细胞学方法，108-121，CRC出版社中。本发明的蛋白质印迹优选地包括(a)溶解待测的细胞样品；(b)从溶解的细胞中制备蛋白质；(c)在含有SDS和2-巯基乙醇的溶液中变性制备的蛋白质；(d)进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；(e)将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素(下文称为“NC”)膜上；(f)将NC膜上的蛋白质与针对两栖生理素或小窝蛋白、优先是两栖生理素-1或小窝蛋白-1的初级抗体反应；(g)将初级抗体与酶催化比色反应结合的次级抗体反应；(h)通过加入(g)中的酶的底物诱导比色反应；和(i)测量酶(g)的显色的强度。
优选的比色反应的酶包括但不限于碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶。如果利用碱性磷酸酶，则溴氯吲哚磷酸(BCIP)、氮蓝四唑(NBT)和ECF可以用作底物，在利用辣根过氧化物酶的情况中，氯萘酚、氨乙基咔唑、二氨基联苯胺和鲁米诺可以用作底物。
正如实施例中所述，本发明人已经发现，细胞中的两栖生理素的水平在衰老阶段剧烈下降，但对于小窝蛋白则是相反的情况。所以，本方法可以定性地进行。例如，可发现检测两栖生理素的蛋白质印迹带的强度和厚度剧烈地降低到肉眼能够检测的程度；在蛋白质印迹检测小窝蛋白的情况中，可发现得到的带的强度和厚度剧烈地增加。结果，比较来自衰老细胞和来自幼龄细胞的蛋白质印迹带，可以容易地检测衰老。
另外，本方法可以定量的方式进行。例如，采用密度计可把从蛋白质印迹得到的带转化成定量的数据。在分析40μg蛋白质的特定的实施例中，如果在测试细胞中两栖生理素-1的表达水平比幼龄细胞少45倍，则可以认为被测细胞是衰老的。
本方法利用编码参与胞吞作用的蛋白质如两栖生理素蛋白质和小窝蛋白的多核苷酸。
在这一方法中，通过测量细胞中编码两栖生理素蛋白质的多核苷酸的水平的下降或测量细胞中编码小窝蛋白的多核苷酸的水平的增加来检测指示细胞衰老的信号。
根据优选的实施方案，细胞起源于哺乳动物的细胞如人的细胞。优选地，该多核苷酸是一种编码两栖生理素-1或小窝蛋白-1的多核苷酸。优选地，用于本方法的多核苷酸是gDNA(基因组DNA)、cDNA和mRNA。
在这一方法优选的实施方案中，该方法可通过RNA印迹方法进行。RNA印迹方法的一般程序公开在Peter B.Kaufma等，生物学和医学，分子和细胞方法，102-108，CRC出版社中。本发明的RNA印迹优选地包括如下步骤(a)从待测细胞中制备RNA；(b)用已制备的RNA进行电泳；(c)将RNA转移到尼龙或NC膜上；(f)将已转移的RNA与互补于两栖生理素mRNA或小窝蛋白mRNA，优先与互补于两栖生理素-1mRNA或小窝蛋白-1mRNA的放射性标记的寡核苷酸探针杂交；和(g)测量得到的带的强度。
正如实施例中所述，本发明人已经发现，细胞中的两栖生理素RNA的水平在衰老期剧烈地下降，而对于小窝蛋白则相反。所以，本方法可以定性地进行。例如，可以发现，用于检测两栖生理素RNA的RNA印迹带的强度和厚度剧烈地下降到肉眼能够观察的程度；在用于检测小窝蛋白RNA的RNA印迹的情况中，可以发现，得到的带的强度和厚度剧烈地增加。结果，比较来自衰老细胞和来自幼龄细胞的RNA印迹的带，可以方便地检测衰老。
另外，本发明可以定量的方式进行。例如从RNA印迹得到的带采用密度计可转化成定量的数据。在分析50μg两栖生理素-1RNA的特定的实施例中，如果被测细胞的带的强度比幼龄细胞小15倍，则可以认为被测细胞是衰老了。II.调节细胞衰老的组合物本发明调节细胞衰老的组合物包括能够调节细胞衰老的生物分子。生物分子包括(a)蛋白质，如两栖生理素蛋白质和小窝蛋白；和(b)多核苷酸，如一种编码两栖生理素蛋白质或小窝蛋白的多核苷酸。另外，生物分子包括能够与编码两栖生理素蛋白质或小窝蛋白的多核苷酸杂交的反义寡核苷酸。同时，本发明的组合物包括甲基化试剂或脱甲基化试剂，以便使编码小窝蛋白的多核苷酸的碱基甲基化或脱甲基化。
如上所述，可以想象，蛋白质是可以直接送递的，优选的实施方案包括提供编码两栖生理素或小窝蛋白的多核苷酸。
根据优选的实施方案，细胞起源于哺乳动物的细胞如人细胞。优选地，参与胞吞作用的蛋白质是两栖生理素-1或小窝蛋白-1。
在含有多核苷酸的组合物中，优选地，多核苷酸是gDNA或cDNA，并且通过真核细胞的表达载体携带。编码两栖生理素-1的多核苷酸优选地包括，编码SEQ ID NO2代表的氨基酸序列的核苷酸序列，并且更优选包括对应于SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的第111-2195位核苷酸的核苷酸序列。编码小窝蛋白-1的多核苷酸优选包括编码SEQ ID NO4代表的氨基酸序列的核苷酸序列，更优选包括对应于SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的第26-559位核苷酸的核苷酸序列。
用于本发明的表达载体在真核宿主，优选地在哺乳动物细胞，更优选地在人细胞中表达外源基因。表达载体中的启动子可以来自哺乳动物细胞的基因组(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒后启动子、牛痘病毒7.5k启动子)。另外，还有可能并且理想的是利用通常与所需基因序列相关的启动子或控制序列，条件是这样的控制序列与宿主细胞系统是兼容的。可以利用许多以病毒为基础的表达系统，例如通常利用的启动子来源于多形瘤、腺病毒2和最常见的猿猴病毒40(SV40)。在转录单位中掺入适当的聚腺苷酸化位点是需要的。用于本发明的市售载体的例子包括pcDNA3(Invitrogen；含有巨细胞病毒启动子和聚腺苷酸化信号)、pSI(Promega；含有SV40启动子和聚腺苷酸化信号)、pCI(Promega；含有巨细胞病毒启动子和聚腺苷酸化信号)和pREP7(Invitrogen；RSV启动子和SV40聚腺苷酸化信号)。
另外，在含有编码两栖生理素或小窝蛋白的多核苷酸的组合物中，可以利用为基因治疗而设计的病毒载体送递该多核苷酸。例如，送递系统包括但不限于(a)腺病毒载体(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，人基因的转移，Cohen-Haguenauer和Boiron，Editions JohnLibbey Eurotest，France，51-61(1991))；和Stratford-Perricaudet等，Hum.Gene Ther.，1241-256(1991))；(b)腺伴随病毒载体(LaFace等，病毒学，162483-486(1998)；Zhou等，实验血液学，21928-933(1993)；和Walsh等，临床研究杂志，941440-1448(1994)；和(c)逆转录病毒载体，如莫络尼鼠白血病病毒的改造变体(Kasahara等，科学，2661373-1376(1994))。
在含有反义寡核苷酸的本发明组合物中，反义寡核苷酸可以在细胞内的条件下与靶DNA或RNA杂交。用反义寡核苷酸靶击双链DNA导致三链螺旋的形成；靶击RNA导致双链螺旋的形成。可以设计反义寡核苷酸结合靶基因的启动子和其他控制区、外显子和内含子。用于本发明的反义寡核苷酸可以基本上与靶多核苷酸互补。即，反义构建体可以与靶基因有一些碱基错配。更优选地，反义寡核苷酸与编码小窝蛋白质，优先与编码小窝蛋白-1的多核苷酸杂交。最优选地，反义寡核苷酸与小窝蛋白-1mRNA的翻译起始区杂交。
在本发明中含有甲基化试剂或脱甲基化试剂，该试剂调节小窝蛋白基因的碱基的甲基化水平。正如实施例中所述，具有较少甲基化水平的小窝蛋白基因展示了更大的表达水平。在一个优选的实施方案中，待甲基化或脱甲基化的小窝蛋白基因是小窝蛋白-1基因。更优选地，修饰的区域是小窝蛋白-1基因的启动子，以及最优选地，修饰的区域是来自小窝蛋白-1基因的启动子的CpG岛。用于本发明的甲基化试剂的例子包括但不限于甲基氧化偶氮甲醇乙酸酯(methylazoxymethanol acetate)，temozolomide和N-甲基-N-亚硝基脲。用于本发明的脱甲基化试剂的非限制性例子包括5-氮杂-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和8-氮杂鸟嘌呤。
作为调节细胞衰老的组合物，本发明提供含有有效量的显性负两栖生理素-1基因的组合物。已知显性负两栖生理素-1基因封闭了两栖生理素-1的功能(Shupliakov，O.等，科学，276259(1997)；和Wigge P.，现代生物学，7554(1997))。用显性负两栖生理素-1基因处理导致了如实施例中所述的细胞衰老。根据优选的实施方案中，显性负两栖生理素-1基因是编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括SEQ ID NO2代表第250-588位的氨基酸序列。III.调节细胞衰老的方法在本发明的方法中，有效量的涉及两栖生理素或小窝蛋白的生物分子通常是给细胞施用的。具体而言，根据下面的方法，可以在体内或体外导入编码两栖生理素或小窝蛋白或其反义寡核苷酸的多核苷酸(a)显微注射(Capecchi，M.R.，细胞，22479(1980))；(b)磷酸钙共沉淀(Graham，F.L.等，病毒学，52456(1973))；(c)电穿孔(Neumann，E.等，EMBO J.，1841(1982))；(d)脂质体介导的转染(Wong，T.K.等，基因，1087(1980))；(e)DEAE葡聚糖处理(Gopal，分子细胞生物学，51188-1190(1985))；和(f)颗粒炸弹(Yang等，美国国家科学院院刊，879568-9572(1990))。
根据优选的实施方案，利用的细胞来自于哺乳动物细胞，更优选的是人细胞。优选地，施用的蛋白质、多核苷酸和反义寡核苷酸涉及两栖生理素-1或小窝蛋白-1。优选地，施用的多核苷酸是gDNA或cDNA。更优选地，在真核细胞的表达载体上携带施用的多核苷酸。在利用反义构建体的方法的优选实施方案中，反义寡核苷酸基本上是与编码小窝蛋白、更优选的是与编码小窝蛋白-1的基因互补。最优选的实施方案包括，反义寡核苷酸与小窝蛋白-1mRNA的翻译起始区杂交。
在本方法中，利用甲基化试剂或脱甲基化试剂，该试剂调节小窝蛋白基因的碱基的甲基化水平。在优选的实施方案中，待甲基化或脱甲基化的小窝蛋白基因是小窝蛋白-1基因。更优选地，修饰的区域是小窝蛋白-1基因的启动子，最优选地，修饰的区域是来自小窝蛋白-1基因的启动子的CpG岛。用于本发明的甲基化试剂的例子包括但不限于甲基氧化偶氮甲醇乙酸酯、temozolomide和N-甲基-N-亚硝基脲。用于本发明的脱甲基化试剂的非限制性例子包括5-氮杂-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和8-氮杂鸟嘌呤。
在I、II和III之间共同叙述简写了，以便避免这一说明书的复杂性，导致不适当的重复。IV.试剂盒和生物标记如上所述，本发明提供了检测衰老细胞的试剂盒。检测衰老细胞需要的所有必需材料和试剂可以一起组装成试剂盒。利用的探针可以用于与从待测细胞中分离的DNA或RNA杂交。另外，利用的探针可以是在本领域技术人员已知的任何分子生物学分析如PCR和RT-PCR中所用的引物。还可包括的是适于扩增核酸的酶，如Taq聚合酶，dNTP混合物和缓冲液，以提供扩增所必需的反应混合物。
在优选的实施方案中，探针起源于编码两栖生理素-1蛋白质或小窝蛋白的多核苷酸。优选地，该探针固定于固相支持物上。在本发明的试剂盒中适于利用的固相支持物是本领域的技术人员已知的，包括玻璃、塑料、多聚体、金属、准金属、陶瓷和有机物。根据更优选的实施方案，本发明提供了包括一批来源于编码两栖生理素-1蛋白质或小窝蛋白-1的多核苷酸的探针的试剂盒。含有固相支持物的微阵的常用技术已经公开在许多出版物中，如WO89/10977、美国专利号5,202,231、5,002,867和5,143,854。
根据本发明的优选的实施方案，该试剂盒另外包括检测探针是否在的标记。该标记允许检测探针和从待测样品中分离的核苷酸之间的杂交。最常见的标记是放射性物质，如3H、14C和32P。
本发明提供了用于鉴定细胞衰老的生物标记。在优选的实施方案中，适于这一发明的蛋白质或多核苷酸起源于两栖生理素-1或小窝蛋白-1。
下面的特异的实施例旨在用来说明本发明，不应看成限制如附加的权利要求书所限定的本发明的范围。
用400μM H2O2处理停滞在G1期的成纤维细胞，然后温育3小时。接着用10ml PBS洗涤。然后，以1∶4的比例和在细胞培养的正常条件下(37℃、5％CO2和加湿)传代培养细胞，连续地进行细胞培养。在处理7天后，利用如实施例III中所述的与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性染色，确定细胞的衰老。II-2.用羟基脲诱导细胞的衰老在实施例I-1中传代培养的成纤维细胞PDL是16，将其放置于含有DMEM的培养平板上，并在培养箱中(37℃、5％CO2和加湿)培养14小时。然后，用400μM羟基脲处理成纤维细胞，然后连续温育。每3天加入新鲜的400μM的羟基脲更新培养基。在处理后14天，利用实施例III中所述的与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性染色确定细胞的衰老。实施例III衰老相关的β-半乳糖苷酶活性染色根据Dimri等的方法(Dimri GP等，美国国家科学院院刊，929363(1995))进行与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性染色(下文中称为“SAβ-gal活性染色”)用10ml的PBS洗涤半汇合的成纤维细胞两次，并用2％低聚甲醛的PBS在室温下固定5分钟。PBS洗涤后，用SAβ-gal活性染色溶液(1mg/ml X-gal，40mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液、pH6.0，5mM亚铁氰化钾/高铁氰化钾，150mM NaCl和2mM MgCl2)在37℃温育细胞4小时。用相差显微镜观察幼龄和老龄的人成纤维细胞。观察的结果是，人成纤维细胞显示PDL50、PDL65的IMR90、用H2O2处理后10天的细胞以及用羟基脲处理后14-20天的细胞的β-半乳糖苷酶活性，这证明进入了细胞衰老。实施例IV评估胞吞作用的变化IV-1在衰老细胞中观察胞吞作用的降低为了研究衰老细胞中受体介导的胞吞作用的功能变化，观察了运铁蛋白的内化。在盖玻片上铺成纤维细胞，并在培养箱中温育(37℃、5％CO2和加湿)，接着用25μg/ml的四甲基罗丹明-结合的人运铁蛋白(分子探针)处理5分钟。在用10毫升PBS洗涤后，细胞用4％低聚甲醛的PBS室温下固定，然后，用DAPI(Sigma Aldrich)染色细胞核。用聚焦显微镜(Biorad，#MRC1024)检测荧光运铁蛋白的内化，表示在图1中。在图1中，A组代表幼龄(PDL20)成纤维细胞和衰老的成纤维细胞(PDL54)和B组代表IMR细胞(分别为PDL32和PDL68)。正如图1中证明，幼龄成纤维细胞和IMR细胞容易吸收荧光运铁蛋白，并在核周区，内化的运铁蛋白观察为典型的标点式新月型形状。相反，衰老细胞如早衰细胞一样不能有效吸收运铁蛋白。IV-2随处理时间增加观察运铁蛋白的内化如前所述，用25μg/ml四甲基罗丹明-结合的人运铁蛋白处理成纤维细胞10、20、40或60分钟；并把实验结果表示在图2中。在图2中，组Y、M和O分别代表幼龄成纤维细胞(PDL24)、中龄成纤维细胞(PDL28)和老龄成纤维细胞(PDL54)。正如图2所示，具有PDL24和PDL38的细胞有效地吸收荧光运铁蛋白，并且在核周区，10分钟处理中观察到了内化的运铁蛋白，其随着处理时间的增加而增加，从而得到更大的荧光强度。与此相反，老龄成纤维细胞甚至在60分钟处理后也不吸收运铁蛋白。IV-3脉冲追踪运铁蛋白吸收在IMR90细胞上脉冲25μg/ml的罗丹明-结合的运铁蛋白5分钟，然后，追踪0、5和10分钟。在如上所述的固定后，用聚焦显微镜检测荧光运铁蛋白的内化(参见图3)。在图3中，组Y、M和O分别代表幼龄(PDL26)、中龄(PDL48)和老龄细胞(PDL72)。正如图3中所示，幼龄细胞有效地吸收运铁蛋白，并仅在5分钟内就定位于核周区，然后在追踪10分钟后，快速降解运铁蛋白。在追踪10分钟后发现，PDL48细胞推迟和限制了运铁蛋白的吸收。PDL72细胞随着追踪时间流逝几乎不能吸收运铁蛋白。IV-4在人工诱导的衰老细胞中观察降低的胞吞作用用如上所述的25μg/ml的罗丹明结合的运铁蛋白处理实施例II中人工诱导的衰老细胞，用聚焦显微镜检测荧光运铁蛋白的内化(参见图4)。如图4所示，不仅通过连续传代的天然存在的衰老细胞而且由H2O2或羟基脲(标记“+”)人工诱导的衰老细胞显示了受体介导的胞吞作用的功能降低。
总而言之，本发明人已经发现，衰老的成纤维细胞显示了胞吞作用的功能显著降低，所以不能吸收各种配体如运铁蛋白。实施例V对参与受体介导的胞吞作用的蛋白质的表达进行分析为了鉴定衰老细胞中受体介导的胞吞作用如此变化的分子机制，参与受体介导的胞吞作用的几个蛋白质的表达水平是通过蛋白质印迹实验来检查的。
首先，总的细胞溶解物是利用溶解缓冲液(1％Triton X-100，0.5％NP-40，50mM Tris、pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM PMSF，5μg/ml抑酶肽，5μg/ml亮抑酶肽，1mM NaVO4和1mM NaF)从亚汇合的早、中和晚传代的细胞中提取的，并用超声波短暂破碎，然后，以14000xg离心10分钟，收集上清液。采用如Bradford方法对上清液进行蛋白质定量(Bradford，M.，Anal.Biochem.72248-254(1976))，并在5×SDS的样品缓冲液(60mM Tris-Cl、pH6.8，25％甘油，2％SDS，14.4mM 2-巯基乙醇和0.1％溴酚兰)中将40μg的蛋白等同物煮沸5分钟。在8％的聚丙烯酰胺凝胶上，利用电泳试剂盒(Biorad)电泳细胞溶解物(10-15μg蛋白质等同物)，然后利用转移试剂盒转移到硝酸纤维素膜上。在室温下用含有5％的无脂奶粉(Difco)的TTBS(带有Tween 20的Tris缓冲盐)封闭印迹1小时。室温下用含5％的无脂奶粉的TTBS中的各个初级抗体免疫印迹斑点(blot)1小时，以TTBS洗涤3次，再用辣根过氧化物酶结合的抗小鼠次级抗体(Jackson免疫研究实验室)温育。在初级抗体中，从Transduction Laboratories购买抗发动蛋白抗体，抗-α-衔接蛋白，抗-β-衔接蛋白和抗网格蛋白重链抗体，针对两栖生理素-1的单克隆抗体由Chungbuk国立大学(Chungbuk NationalUniversity)的Kim博士制备(Jin，Y.，Kim等(待出版)，抗两栖生理素的单克隆抗体的生产和鉴定，Exp.Mol.Med.)，以及抗磷酸酪氨酸(phosphotyrosin)抗体和抗运铁蛋白受体抗体是Santa Cruz生物技术公司的。由增强的化学发光系统可最后观察到信号(ECL试剂盒，Amersham Pharmacia Biotech)，它们在图5中找到。
正如图5中证明的，只有两栖生理素-1，而不是其他测试的胞吞蛋白质在衰老细胞中显著降低。在包皮成纤维细胞和IMR90细胞中均观察到两栖生理素-1蛋白质表达的独特降低。另外，由H2O2或羟基脲(标记“+”)诱导的衰老细胞给出了如图5中所示的相同结果(参见图6)。
这些结果表明，细胞衰老过程伴随着两栖生理素-1的下调。实施例VINorthern分析编码参与受体介导的胞吞作用的蛋白的mRNA实施例V中的分析表明在衰老细胞中两栖生理素-1的水平降低，为了研究该现象的准确机理，使用了RNA印迹方法。具体方法如下使用酸性硫氰酸胍—苯酚—氯仿，从实施例I的人成纤维细胞中提取RNA，与甲醛样品缓冲液(5×MOPS、17.5％甲醛和50％甲酰胺)混合，然后使用电泳试剂盒(Hoefer)在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳后，将RNA转移到硝酸纤维素膜上，并使用全自动紫外交联仪(Stratagen)使RNA交联于膜上。然后，使用p32标记的探针(包含两栖生理素-1cDNA的第111-1116位碱基)进行杂交，结果获得放射自显影(参见图7)。在图7中，组Y、M和O分别代表了PDL27、PDL36和PDL60成纤维细胞。图7阐明了两栖生理素mRNA的水平随着衰老的进程而降低。
这些结果表明细胞的衰老过程伴随着两栖生理素-1在转录水平的下调。实施例VII两栖生理素-1基因的克隆编码全长人两栖生理素-1的cDNA，具有SEQ ID NO1表示的核苷酸序列，携带该cDNA的载体得自韩国Chungbuk国立大学。在构建此载体时，将该cDNA插入到pGEX-2T载体(Pharmacia)的BamHI和EcoRI限制性位点之间，因此两栖生理素-1和谷胱甘肽-S-转移酶以融合的形式表达。图8显示了携带编码人两栖生理素-1的cDNA的最终载体的遗传图谱。使用PCR方法扩增了全长cDNA，所用引物为5’-AACTGTCCACCATGGCCGACATCAAGACGGGC-3’和5’-GGATCCCTAATCTAAGCGTCGGGT-3’。PCR扩增使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara)，共进行30个循环，每个循环的温度设置为55℃、30秒(退火)，72℃、1.5分钟(延伸)以及92℃、30秒(变性)。将扩增的cDNA克隆到pT7 blue载体(Novagen)中，并测定其碱基序列。在用HindIII和BamHI消化后，把该cDNA亚克隆到pcDNA3载体(Invitrogen含有巨细胞病毒的启动子和多聚腺苷化信号)中，以便通过显微注射将扩增的两栖生理素-1的cDNA引入成纤维细胞。图9显示了含有两栖生理素-1cDNA的pcDNA3的遗传图谱。实施例VIII在衰老细胞中使用两栖生理素-1基因恢复胞吞功能VIII-1两栖生理素-1基因的显微注射将实施例I中的衰老成纤维细胞(PDL58)置于盖玻片上，加入含有FBS的DMEM，于培养箱中(37℃、5％CO2和加湿)温育24小时。然后将10-14升实施例VII中克隆在pcDNA3中的两栖生理素-1基因(10ng/ml)和10-14升兔IgG(Sigma，5mg/ml)，通过显微注射注入衰老成纤维细胞的核内。载体用显微注射缓冲液(50mM HEPES、pH7.2，100mM KCl，50mM NaPO4)稀释到10ng/ml。使用transjector 5426(Eppendorf)和显微操作仪(micromanipulator)(Eppendorf)将稀释的载体显微注射到细胞核内。VIII-2两栖生理素-1在显微注射细胞中的表达分析使用双免疫荧光染色法对两栖生理素-1在显微注射细胞中的表达进行分析。显微注射后，细胞在不含FBS的DMEM中培养24小时，再用含3.7％低聚甲醛的磷酸缓冲液固定10分钟，然后用0.3％TritonX-100的磷酸缓冲液于室温处理10分钟以增加通透性。细胞与抗两栖生理素-1抗体和FITC结合的抗大鼠IgG抗体(Jackson实验室，稀释100倍)于37℃按序温育1小时，然后再与若丹明(rhodamine)结合的抗兔IgG抗体(Jackson Laboratories，稀释100倍)于37℃温育1小时。使用荧光显微镜(Zeiss，Axiovert25，CFL451210)观察图象(参见图10)。如图10所示，抗兔IgG给出了由若丹明发出的红色荧光，而两栖生理素-1则由次级抗体中的FITC发出的绿色荧光所确定。在细胞质中发现了证明两栖生理素-1存在的绿色荧光。
所以，这些结果表明在实施例VIII-1的显微注射细胞中，两栖生理素-1蛋白得到了表达。VIII-3在衰老细胞中恢复胞吞功能的分析显微注射细胞在不含FBS的DMEM中于培养箱(37℃、5％CO2和加湿)中培养24小时。然后，细胞用125ng/ml四甲基若丹明结合的运铁蛋白处理30分钟，用10ml磷酸缓冲液清洗，再用10ml含4％甲醛的磷酸缓冲液固定10分钟。参照实施例VIII-2中所述的方法进行免疫荧光染色。利用荧光显微镜(Zeiss，Axiovert 100)分析显微注射细胞和摄入的运铁蛋白。结果概括于表1中。
表1
1)被显微注射的DNA；2)用于分析显微注射细胞的抗体；3)运铁蛋白；4)总细胞数；5)平均值；以及6)两栖生理素-1。
从表1可以看出，与用pcDNA3显微注射的对照细胞相比，用携带两栖生理素-1基因的pcDNA3显微注射的细胞表现出高得多的运铁蛋白摄取活性。也就是说，通过引入两栖生理素-1cDNA，衰老细胞的胞吞活性急剧增加。这些结果成功地证明了两栖生理素-1对于衰老细胞功能性胞吞作用的恢复是必需的，因而对调节细胞的衰老也是必需的。实施例IX显性负两栖生理素-1基因的克隆已知显性负两栖生理素-1基因能够阻断两栖生理素-1的功能(Shupliakov，O.等，Science，276259(1997)；和Wigge，P.，Curr.Biol.，7554(1997))。使用PCR方法扩增了显性负两栖生理素-1基因，以两栖生理素-1cDNA为模板，使用特异引物扩增了编码两栖生理素-1蛋白中间部分(第250-588位氨基酸)的部分核苷酸序列。所用的正向和反向引物的序列分别为5’-AACTGTCCACCATGAGTGATTCGGGTCCTCTCCGC-3’和5’-GGATCCCTACTGCTCCGTAGCCAGCTCCGG-3’。进行PCR扩增以及使用pcDNA3(Invitrogen)以实施例VII中描述的相同方法对扩增产物进行亚克隆。最终载体的遗传图谱示于图11中。实施例X在幼龄细胞中使用显性负两栖生理素-1基因抑制胞吞功能使用实施例IX中构建的载体，对幼龄成纤维细胞(PDL16)进行了转化，方法如下将2μg实施例IX中构建的载体和0.5μgpEGFP-N1载体(Clontech)与DMEM和8μl的Plus试剂混合，混合液于室温放置15分钟。然后与脂转染胺试剂(Gibco-BRL)和DMEM充分混匀，于室温再放置15分钟。接着再加入2ml DMEM，最终的混合物加入幼龄成纤维细胞中，37℃温育3小时。过3小时后，加入2.5ml含有20％FBS的DMEM，继续温育40小时。温育后的细胞用25μg/ml若丹明结合的运铁蛋白处理10分钟，使用聚焦显微镜(Biorad，#MRC1024)观察图象，由此阐述运铁蛋白在转化后的细胞(发出EGFP衍生的绿色荧光)或非转化的细胞中的内化(参见图12)。如图12所示，用携带显性负两栖生理素-1基因的载体和pEGFP-N1载体共转化的细胞(左组)没有显示出若丹明结合的运铁蛋白的红色荧光，这表明若丹明结合的运铁蛋白的内化没有发生，但是非转化的细胞(右组)显示出了红色荧光。
这些结果证明两栖生理素-1的功能不全能够抑制受体介导的胞吞作用，并最终诱导细胞衰老。实施例XI通过蛋白质印迹分析Erk-1/2的激活人成纤维细胞或IMR-90细胞的幼龄细胞(PDL30以下)、中龄细胞(PDL35-45)和老龄细胞(PDL60以上)分别用100ng/mlEGF(Gibco-BRL，人源重组产品)进行刺激。刺激后，采用实施例V中描述的方法进行蛋白质印迹。抗磷酸-Erk-1/2单克隆抗体、抗Erk-1/2多克隆抗体和抗EGFR多克隆抗体购自Santa Cruz生物技术公司。从图13a中可以发现，在幼龄和中龄细胞中，Erk-1/2激酶在5分钟内就被磷酸化了(激活)，产生的激活作用在EGF刺激后持续了15分钟。然而，在老龄细胞中，直到过了15分钟仍未能检测到Erk-1/2激酶的磷酸化。尽管EGF对Erk-1/2激酶有下调作用，但在蛋白质印迹中Erk激酶和EGFR的表达水平并未由于群体倍增的增加而改变(参见图13b)。
因此，老龄细胞对生长因子反应性的降低是由于Erk-1/2磷酸化的减少，即Erk-1/2活化的减少。实施例XII-通过蛋白质印迹分析小窝蛋白的表达对人成纤维细胞或IMR-90细胞的幼龄细胞(PDL30以下)、中龄细胞(PDL35-45)和老龄细胞(PDL60以上)中小窝蛋白的表达进行分析，采用实施例V中描述的方法进行蛋白质印迹。抗小窝蛋白-1单克隆抗体、抗小窝蛋白-2单克隆抗体和抗小窝蛋白-3单克隆抗体购自Transduction Laboratories。如图14所示，在人成纤维细胞和IMR-90细胞中，随着细胞衰老，小窝蛋白-1、小窝蛋白-2和小窝蛋白-3的表达都增加了。实施例XIII通过免疫沉淀分析EGFR与小窝蛋白-1的相互作用幼龄(PDL30以下)或老龄(PDL60以上)成纤维细胞在IP裂解缓冲液(10mM磷酸缓冲液、pH7.4，150mM NaCl，1％NP-40，2mMEDTA，1mM苯甲基磺酰氟，2μg/ml抑肽酶，2μg/ml亮抑酶肽，50mMNaF和0.2mM Na3Vo4)中裂解并经短暂超声破碎。裂解液于9000rpm离心5分钟，将上清液与正常的小鼠血清、抗EGFR抗体或抗小窝蛋白-1抗体共同温育。免疫复合物用蛋白A-琼脂糖珠(AmershamPharmacia Biotech)沉淀，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用实施例V中描述的蛋白质印迹方法进行分析(参见图15)。
图15的结果表明，老龄成纤维细胞的EGFR免疫复合物含有小窝蛋白-1，而幼龄成纤维细胞则未显示出可比较量的小窝蛋白-1以及与EGFR的相互作用。
据此推断，随着细胞的衰老，小窝蛋白-1的表达增加，从而有更多的小窝蛋白-1与EGFR相互作用，进而抑制了EGFR激活Erk-1/2激酶。实施例XIV小窝蛋白-1的电子显微镜分析离心(1000rpm)收集亚汇合的幼龄(PDL20)和老龄(PDL65)成纤维细胞，并用3％戊二醛/pH7.4磷酸盐缓冲液固定。在用0.2M pH7.4的二甲胂酸钠缓冲液洗涤后，细胞沉淀再用1％四氧化锇的二甲胂酸钠缓冲液处理1小时。然后细胞使用环氧丙烷在分级的乙醇步骤中脱水，并包埋于Embed812(Electron Microscope Sciences)中。使用切片机(Leichert-JUNG)将包埋好的细胞切成200nm的大小，用亚甲蓝和苯胺蓝II将切片染色，然后用光学显微镜观察以选择适用于电子显微镜观察的区域。随后，用切片机(Leichert-JUNG)将选定区域超薄切成60nm的大小，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。切片用透射电子显微镜(H-600，Hitachi)进行观察。图16表明，与幼龄细胞相比，老龄成纤维细胞含有多得多的类似小窝的结构。实施例XV携带小窝蛋白-1cDNA的质粒的构建使用TRIzol(Gibco-BRL，#15596-026)从人老龄成纤维细胞中分离出总RNA，再使用分离到的RNA通过RT-PCR的方法获得小窝蛋白-1cDNA。使用的引物是正向引物5’-atccaagcttccaccatgtctgggggcaaatacgt-3’和反向引物5’-gcaggatccctatatttctttctgcaagttgat-3’。使用的反转录酶和Taq聚合酶分别是Promega公司的AMT反转录酶和TaKaRa公司的Ex Taq。温度设置为60℃、30秒(退火)，72℃、50秒(延伸)以及92℃、30秒(变性)。扩增得到的cDNA通过DNA测序进行确证，测序方法参照链终止法(Sanger，F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，745463(1977))。小窝蛋白-1cDNA的核苷酸序列见SEQ ID NO3。利用HindIII和BamHI限制性位点将扩增的cDNA亚克隆在pcDNA3(Invitrogen)中。最终构建的载体的遗传图谱示于图17中。实施例XVI使用小窝蛋白-1cDNA转化人成纤维细胞使用实施例XV中构建的载体转化幼龄人成纤维细胞(PDL25)。将细胞铺于平皿中温育18小时达到70-80％汇合。2μg实施例XV中构建的载体与8μl Plus试剂混合，所得混合物再与12μl脂转染胺试剂(Gibco-BRL)和238μl DMEM混合，接着将混合物室温放置15分钟。另加入2ml DEME后，将最终混合物加入幼龄成纤维细胞中，于37℃温育3小时。过3小时后，加入2.5ml含20％FBS的DMEM，继续温育24小时。30小时后，用100μg/ml EGF刺激转染的细胞。最后按照实施例V中描述的方法进行蛋白质印迹以便能够检测Erk-1/2的活化。在图18中，组A的1道代表用pcDNA3转化的样品，2道代表用携带小窝蛋白-1cDNA的pcDNA3转化的样品。图18的结果证实，用携带小窝蛋白-1cDNA的pcDNA3转化的细胞表达了小窝蛋白-1蛋白。在图18中，组B的1-3道分别代表了用pcDNA3转化并随后用EGF刺激0、5和20分钟的样品，以及组B的4-6道分别代表了用携带小窝蛋白-1cDNA的pcDNA3转化并随后用EGF刺激0、5和20分钟的样品。
如图18所示，在细胞过量表达小窝蛋白-1蛋白时，Erk-1/2激酶的表达没有改变，与对照的转化细胞相比，Erk-1/2的磷酸化反而被显著地抑制了。
这些数据证实当把小窝蛋白-1DNA导入细胞中时Erk-1/2激酶的活化受到阻断，从而对刺激的反应也降低，由此导致细胞衰老。结果表明Erk-1/2激酶活化的降低是由于小窝蛋白-1表达水平降低造成的。实施例XVII小窝蛋白-1反义寡核苷酸的转染XVII-1小窝蛋白-1反义寡核苷酸的合成为了制备反义寡核苷酸以抑制小窝蛋白-1的表达，在小窝蛋白-1的mRNA上选择了一个适当区域与反义寡核苷酸相互作用。因此，设计并合成了能够结合在小窝蛋白-1mRNA的翻译起始区的反义寡核苷酸，以阻断翻译的起始。合成的寡核苷酸在5’端区结合了荧光素(Genotech)，并用硫代磷酸修饰以增加其稳定性。例如，合成的反义寡核苷酸具有的核苷酸序列为5’-tttgcccccaga-3’。同时与上述区域结合的有义寡核苷酸也被合成，序列为5’-atgtctgggggc-3’。XVII-2小窝蛋白-1反义寡核苷酸的转染人老龄成纤维细胞(PDL64)置于24孔板或平皿中，加入不含FBS的DMEM，并在培养箱(37℃、5％CO2)中温育12小时。其后，将1-5μl100μM的合成反义寡核苷酸和Plus试剂(Gibco-BRL)与50μlDMEM混合，并随后于室温反应15分钟，所得混合物与500μl含有12μl脂转染胺试剂(Gibco-BRL)和DMEM的混合液充分混匀，再于室温放置15分钟以形成脂质体复合物。温育后的细胞用DMEM(无血清)洗涤两次，并用1ml脂质体复合物处理，接着37℃温育3小时。向转染后的细胞中加入1-5ml含10％FBS的DMEM，并继续温育24小时，然后用含10％FBS的DMEM替换培养基。在温育一定时间后，按照下述方法进行免疫染色和蛋白质印迹。XVII-3免疫染色经反义寡核苷酸处理过的细胞用0.5ml 4％低聚甲醛在室温固定20分钟，然后用0.5ml含0.5％Triton X-100的磷酸缓冲液处理10分钟以增加通透性，再用含2％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液封闭。接着将细胞与抗小窝蛋白-1抗体(Transduction Laboratory)在4℃温育过夜，然后与若丹明结合的次级抗体(Santa Cruz)室温下温育1小时。为了能够看见细胞核，也加入了DAPI(分子探针)。使用聚焦显微镜(Biorad，#MRC1024)观察。如图19所示，在用反义寡核苷酸处理一段时间以后，细胞中小窝蛋白-1的表达急剧降低，而在用有义寡核苷酸处理的细胞中小窝蛋白-1的表达没有变化。有趣的是，用反义寡核苷酸处理的老龄细胞在形态上发生了改变，从较大、伸展的形态变为较小的纺锤形。与之相反，用有义寡核苷酸处理的老龄细胞的形态没有发生如此的变化。XVII-4蛋白质印迹以实施例XII相同的方法对用寡核苷酸处理过的细胞进行蛋白质印迹。用反义寡核苷酸处理过的细胞，在对应于小窝蛋白-1的位置给出了一条较弱的带，这表明在用反义寡核苷酸处理过的细胞中，小窝蛋白-1的表达降低了。
基于免疫染色和蛋白质印迹的结果，可以说明小窝蛋白-1直接参与了细胞衰老过程，抑制小窝蛋白-1的表达不仅可以防止细胞衰老，而且可以将老龄细胞转化为幼龄细胞。实施例XVIII对小窝蛋白-1反义寡核苷酸转染后的Erk-1/2活化进行分析按实施例XVII中描述的方法用反义寡核苷酸处理老龄和幼龄成纤维细胞。按照实施例XI中描述的方法进行EGF刺激和蛋白质印迹。本实施例的结果见图20。如图20所示，幼龄细胞中的Erk-1/2激酶被强烈磷酸化(激活)。但是与幼龄细胞相比，未处理的老龄细胞和用有义寡核苷酸处理的老龄细胞则表现出较高的Erk-1/2基础活性，并且用EGF刺激后，细胞的Ekr-1/2活性没有变化。有趣的是，在用反义寡核苷酸处理的老龄细胞中，EGF刺激的Erk-1/2活化作用极大地增强了，正如在幼龄细胞中发生的情况一样。
这些观察证明，由于用反义寡核苷酸处理抑制小窝蛋白-1的表达，能够使老龄细胞恢复由Erk介导的信号级联，而这样的信号级联通常是存在于幼龄细胞中的。实施例XIX观察小窝蛋白-1反义寡核苷酸转染后对P-Erk-1/2向细胞核内转运的影响为了证实在实施例XVIII中激活的Erk-1/2激酶被转运到细胞核内并随后调节其它基因的表达，使用了如下的免疫染色的方法参照实施例XIII用反义寡核苷酸和EGF处理幼龄和老龄成纤维细胞。然后将处理过的细胞与抗P-Erk(磷酸化ErK)抗体(New EnglandBiotech)在4℃温育过夜，然后与FITC结合的次级抗体(Santa Cruz)室温下温育1小时。为了能够看见细胞核，加入了DAPI(分子探针)。使用聚焦显微镜(Biorad，#MRC1024)观察P-Erk-1/2定位的图象，见图21和图22。在图21和22中，箭头标明了P-Erk-1/2激酶向细胞核中的转运。
如图21所示，在幼龄细胞中，处理后5分钟时，在细胞质中可观察到很强的P-Erk-1/2，处理后30分钟时，可观察到P-Erk-1/2被转运到细胞核内以及处理后60分钟时，仅在细胞质中观察到较弱的P-Erk-1/2。这些结果表明，在处理后5分钟内，Erk-1/2即被激活(磷酸化)，产生的P-Erk-1/2在30分钟时被转运到细胞核内以调节了几个基因的转录，以及在60分钟时最终失活。与幼龄细胞相反，在老龄细胞中不论是否用EGF处理，在细胞质中都观察到了很强的P-Erk-1/2，在蛋白质印迹的结果中也得到了同样的发现。有趣的是，老龄细胞中没有观察到P-Erk-1/2向细胞核内的转运。
此外，如图22所示，用有义寡核苷酸处理的老龄细胞的细胞核内未观察到P-Erk-1/2，用反义寡核苷酸处理的老龄细胞中也一样。
这些结果证明，用反义寡核苷酸抑制小窝蛋白-1的表达，导致了Erk介导的信号级联的恢复。此外，这些结果也表明小窝蛋白-1还参与了向细胞核内转运的恢复，这样的转运在老龄细胞中通常是被阻断的。实施例XX小窝蛋白-1基因CpG岛的甲基化众所周知，当衰老后，随着位于启动子中的CpG岛的甲基化水平的降低，p16/Ink4a的表达增加(Jarrard DF.，Cancer Res.，15；59(12)2957-2964(1999))。此外，已发现在癌细胞中小窝蛋白-1也有相似的甲基化模式(Cui J.，Prostate，15；46(3)249-256(2001))。因此，本发明人研究了小窝蛋白-1表达的降低是否是由这样的甲基化引起的。
用1μM脱甲基化试剂5-氮杂-脱氧胞苷(Sigma)的DMSO处理幼龄成纤维细胞(PDL20)，并在随后的2-3周内随着定期替换培养基同时用该试剂处理。采用实施例III中描述的SAβ-gal活性染色的方法证实细胞衰老的诱导。为研究相关蛋白的表达，收集处理不同天的处理细胞，按照以前描述的方法进行蛋白质印迹。蛋白质印迹中所用的抗p53抗体、抗p16抗体、抗小窝蛋白-1抗体和抗肌动蛋白抗体购自Santa Cruz生物技术公司。
图23a显示了SAβ-gal活性染色的结果，处理2周的幼龄细胞表现出了类似衰老细胞的现象。图23b显示了蛋白质印迹的结果，随着脱甲基化过程，p16和小窝蛋白-1的表达增加，但p53的表达没有变化。有趣的是，p16水平的增加出现于细胞衰老的早期阶段，而小窝蛋白-1水平的增加比p16还早出现。这些结果说明，在衰老细胞中小窝蛋白-1水平的增加，既不是由细胞衰老也不是由p16水平的增加所直接引起的，而是由小窝蛋白-1基因启动子中CpG岛的脱甲基化引起的。
结果显示，细胞衰老能够由小窝蛋白-1基因启动子、特别是CpG岛的甲基化水平所调节。
在描述了本发明的优选实施方案后，应理解的是，对于本领域那些专业技术的人来说很显然本发明的变体和修饰落入了本发明的实质范围内，本发明的范围将由附加的权利要求及其等同物所确定。
序列表<110>代谢工程实验室有限公司(Metabolic Engineering Laboratories Co.，Ltd.)<120>参与细胞衰老的核酸序列和蛋白质(Nucleic Acid Sequences and Proteins Involved in CellularSenescence)<130>SCT030540-47<150>KR2000-53341<151>2000-09-08<150>KR2000-53342<151>2000-09-08<160>4<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>2377<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(111)..(2195)<223>两栖生理素-1cDNA(amphiphysin-1cDNA)<400>1cggctctcag ctgcactcct gtacatccac ctgtcttcag gagagcactg tttgtgtgtg 60cccagccccg ctgcgcgctc tgctcttcgc agctccccgg acccgcagcc atg gcc gac119Met Ala Asp1atc aag acg ggc atc ttc gcc aag aac atc cag aag cga ctc aac cgc 167Ile Lys Thr Gly Ile Phe Ala Lys Asn Ile Gln Lys Arg Leu Asn Arg5 10 15gcg cag gaa aag gtc ctc caa aag ctg ggg aaa gct gat gag aca aaa 215Ala Gln Glu Lys Val Leu Gln Lys Leu Gly Lys Ala Asp Glu Thr Lys20 25 30 35gac gaa cag ttc gaa gaa tat gtc cag aac ttc aaa cgg caa gaa gca263Asp Glu Gln Phe Glu Glu Tyr Val Gln Asn Phe Lys Arg Gln Glu Ala40 45 50gag ggt acc aga ctt cag cga gaa ctc cga gga tat tta gca gca atc311Glu Gly Thr Arg Leu Gln Arg Glu Leu Arg Gly Tyr Leu Ala Ala Ile55 60 65aaa ggc atg cag gag gcc tcc atg aag ctc aca gag tcg ctg cat gaa359Lys Gly Met Gln Glu Ala Ser Met Lys Leu Thr Glu Ser Leu His Glu70 75 80gtc tat gag cct gac tgg tat ggg cgg gaa gat gtg aaa atg gtt ggt407Val Tyr Glu Pro Asp Trp Tyr Gly Arg Glu Asp Val Lys Met Val Gly85 90 95gag aaa tgt gat gtg ctg tgg gaa gac ttc cat caa aaa ctc gtg gat455Glu Lys Cys Asp Val Leu Trp Glu Asp Phe His Gln Lys Leu Val Asp100 105 110 115ggg tcc ttg cta aca ctg gat acc tac ctg ggg caa ttt cct gac ata503Gly Ser Leu Leu Thr Leu Asp Thr Tyr Leu Gly Gln Phe Pro Asp Ile120 125 130aag aat cgc atc gcc aag cgc agc agg aag cta gtg gac tat gac agt551Lys Asn Arg Ile Ala Lys Arg Ser Arg Lys Leu Val Asp Tyr Asp Ser135 140 145gcc cgc cac cat ctg gaa gct ctg cag agc tcc aag agg aag gat gag599Ala Arg His His Leu Glu Ala Leu Gln Ser Ser Lys Arg Lys Asp Glu150 155 160agt cga atc tct aag gca gaa gaa gaa ttt cag aaa gca cag aaa gtg647Ser Arg Ile Ser Lys Ala Glu Glu Glu Phe Gln Lys Ala Gln Lys Val165 170 175ttt gaa gag ttt aac gtt gac tta caa gaa gag tta cca tca tta tgg695Phe Glu Glu Phe Asn Val Asp Leu Gln Glu Glu Leu Pro Ser Leu Trp180 185 190 195tca aga cga gtt gga ttt tat gtt aat act ttc aaa aac gtc tcc agc743Ser Arg Arg Val Gly Phe Tyr Val Asn Thr Phe Lys Asn Val Ser Ser
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375 380 385agc act gat ttg gta cag ccg gct tct ggt ggt tca ttt aat gga ttc1319Ser Thr Asp Leu Val Gln Pro Ala Ser Gly Gly Ser Phe Asn Gly Phe390 395 400aca cag ccc cag gat act tca tta ttc aca atg cag aca gac cag agt1367Thr Gln Pro Gln Asp Thr Ser Leu Phe Thr Met Gln Thr Asp Gln Ser405 410 415atg atc tgc aac ttg gct gaa tct gaa cag gct cca ccc aca gag cca1415Met Ile Cys Asn Leu Ala Glu Ser Glu Gln Ala Pro Pro Thr Glu Pro420 425 430 435aaa gca gag gag cct ctg gct gct gtc aca cct gcc gtt ggt ctg gac1463Lys Ala Glu Glu Pro Leu Ala Ala Val Thr Pro Ala Val Gly Leu Asp440 445 450ctt gga atg gac act cgg gct gag gag cca gtg gag gag gca gtg atc1511Leu Gly Met Asp Thr Arg Ala Glu Glu Pro Val Glu Glu Ala Val Ile455 460 465ata cct gga gct gat gct gat gca gct gtt gga acc ttg gtg tca gca1559Ile Pro Gly Ala Asp Ala Asp Ala Ala Val Gly Thr Leu Val Ser Ala470 475 480gct gag ggg gcc cca gga gag gaa gca gag gcg gag aag gcc act gtc1607Ala Glu Gly Ala Pro Gly Glu Glu Ala Glu Ala Glu Lys Ala Thr Val485 490 495cct gcc ggg gaa gga gta agt tta gag gag gcc aaa att gga act gaa1655Pro Ala Gly Glu Gly Val Ser Leu Glu Glu Ala Lys Ile Gly Thr Glu500 505 510 515acc act gag ggt gca gag agt gcc caa cct gaa gca gag gag ctc gaa1703Thr Thr Glu Gly Ala Glu Ser Ala Gln Pro Glu Ala Glu Glu Leu Glu520 525 530gca aca gtg cct cag gag aag gtc att cct tcg gtg gtc ata gag cct1751Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Val Ile Pro Ser Val Val Ile Glu Pro535 540 545gcc tcc aac cat gaa gag gaa gga gaa aac gaa ata act ata ggt gca1799Ala Ser Asn His Glu Glu Glu Gly Glu Asn Glu Ile Thr Ile Gly Ala
550555 560gag ccc aag gag acc acc gag gac gcg gct cct ccg ggc ccc acc agc 1847Glu Pro Lys Glu Thr Thr Glu Asp Ala Ala Pro Pro Gly Pro Thr Ser565 570 575gag aca ccg gag ctg gct acg gag cag aag cct atc cag gac cct cag 1895Glu Thr Pro Glu Leu Ala Thr Glu Gln Lys Pro Ile Gln Asp Pro Gln580 585 590 595ccc acg cct tct gca cca gcc atg ggg gct gct gac cag cta gca tct 1943Pro Thr Pro Ser Ala Pro Ala Met Gly Ala Ala Asp Gln Leu Ala Ser600 605 610gca agg gag gcc tct cag gaa ttg cct cct ggc ttt ctc tac aag gtg 1991Ala Arg Glu Ala Ser Gln Glu Leu Pro Pro Gly Phe Leu Tyr Lys Val615 620 625gaa aca ctg cat gat ttt gag gca gca aat tct gat gaa ctt acc tta 2039Glu Thr Leu His Asp Phe Glu Ala Ala Asn Ser Asp Glu Leu Thr Leu630 635 640caa agg ggt gat gtg gtg ctg gtg gtc ccc tca gat tca gaa gct gat 2087Gln Arg Gly Asp Val Val Leu Val Val Pro Ser Asp Ser Glu Ala Asp645 650 655cag gat gca ggc tgg ctg gtg gga gtg aag gaa tca gac tgg ctt cag 2135Gln Asp Ala Gly Trp Leu Val Gly Val Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gln660 665 670 675tac aga gac ctt gcc acc tac aaa ggc ctc ttt cca gag aac ttc acc 2183Tyr Arg Asp Leu Ala Thr Tyr Lys Gly Leu Phe Pro Glu Asn Phe Thr680 685 690cga cgc tta gat taggg caacaagtac tgcaagaagg agctcagtta cggggttttt2240Arg Arg Leu Asp695aaaccttcat gaaaacctga agagttcact tttgttatta tgctcttaat gatttacaga2300ctgatgccag acaaaccttg ggaagatgta tcaatggagc atgtgtgcaa aaaaatgtaa2360gaggaaaaaa aaaaccg 2377<210>2<211>695<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ala Asp Ile Lys Thr Gly Ile Phe Ala Lys Asn Ile Gln Lys Arg1 5 10 15Leu Asn Arg Ala Gln Glu Lys Val Leu Gln Lys Leu Gly Lys Ala Asp20 25 30Glu Thr Lys Asp Glu Gln Phe Glu Glu Tyr Val Gln Asn Phe Lys Arg35 40 45Gln Glu Ala Glu Gly Thr Arg Leu Gln Arg Glu Leu Arg Gly Tyr Leu50 55 60Ala Ala Ile Lys Gly Met Gln Glu Ala Ser Met Lys Leu Thr Glu Ser65 70 75 80Leu His Glu Val Tyr Glu Pro Asp Trp Tyr Gly Arg Glu Asp Val Lys85 90 95Met Val Gly Glu Lys Cys Asp Val Leu Trp Glu Asp Phe His Gln Lys100 105 110Leu Val Asp Gly Ser Leu Leu Thr Leu Asp Thr Tyr Leu Gly Gln Phe115 120 125Pro Asp Ile Lys Asn Arg Ile Ala Lys Arg Ser Arg Lys Leu Val Asp130 135 140Tyr Asp Ser Ala Arg His His Leu Glu Ala Leu Gln Ser Ser Lys Arg145 150 155 160Lys Asp Glu Ser Arg Ile Ser Lys Ala Glu Glu Glu Phe Gln Lys Ala165 170 175Gln Lys Val Phe Glu Glu Phe Asn Val Asp Leu Gln Glu Glu Leu Pro180 185 190Ser Leu Trp Ser Arg Arg Val Gly Phe Tyr Val Asn Thr Phe Lys Asn195 200 205Val Ser Ser Leu Glu Ala Lys Phe His Lys Glu Ile Ala Val Leu Cys210 215 220His Lys Leu Tyr Glu Val Met Thr Lys Leu Gly Asp Gln His Ala Asp225 230 235 240Lys Ala Phe Thr Ile Gln Gly Ala Pro Ser Asp Ser Gly Pro Leu Arg245 250 255Ile Ala Lys Thr Pro Ser Pro Pro Glu Glu Pro Ser Pro Leu Pro Ser260 265 270Pro Thr Ala Ser Pro Asn His Thr Leu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro275 280 285Ala Arg Pro Arg Ser Pro Ser Gln Thr Arg Lys Gly Pro Pro Val Pro290 295 300Pro Leu Pro Lys Val Thr Pro Thr Lys Glu Leu Gln Gln Glu Asn Ile305 310 315 320Ile Ser Phe Phe Glu Asp Asn Phe Val Pro Glu Ile Ser Val Thr Thr325 330 335Pro Ser Gln Asn Glu Val Pro Glu Val Lys Lys Glu Glu Thr Leu Leu340 345 350Asp Leu Asp Phe Asp Pro Phe Lys Pro Glu Val Thr Pro Ala Gly Ser355 360 365Ala Gly Val Thr His Ser Pro Met Ser Gln Thr Leu Pro Trp Asp Leu370 375 380Trp Thr Thr Ser Thr Asp Leu Val Gln Pro Ala Ser Gly Gly Ser Phe385 390 395 400Asn Gly Phe Thr Gln Pro Gln Asp Thr Ser Leu Phe Thr Met Gln Thr405 410 415Asp Gln Ser Met Ile Cys Asn Leu Ala Glu Ser Glu Gln Ala Pro Pro420 425 430Thr Glu Pro Lys Ala Glu Glu Pro Leu Ala Ala Val Thr Pro Ala Val435 440 445Gly Leu Asp Leu Gly Met Asp Thr Arg Ala Glu Glu Pro Val Glu Glu450 455 460Ala Val Ile Ile Pro Gly Ala Asp Ala Asp Ala Ala Val Gly Thr Leu465 470 475 480Val Ser Ala Ala Glu Gly Ala Pro Gly Glu Glu Ala Glu Ala Glu Lys485 490 495Ala Thr Val Pro Ala Gly Glu Gly Val Ser Leu Glu Glu Ala Lys Ile500 505 510Gly Thr Glu Thr Thr Glu Gly Ala Glu Ser Ala Gln Pro Glu Ala Glu515 520 525Glu Leu Glu Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Val Ile Pro Ser Val Val530 535 540Ile Glu Pro Ala Ser Asn His Glu Glu Glu Gly Glu Asn Glu Ile Thr545 550 555 560Ile Gly Ala Glu Pro Lys Glu Thr Thr Glu Asp Ala Ala Pro Pro Gly565 570 575Pro Thr Ser Glu Thr Pro Glu Leu Ala Thr Glu Gln Lys Pro Ile Gln580 585 590Asp Pro Gln Pro Thr Pro Ser Ala Pro Ala Met Gly Ala Ala Asp Gln595 600 605Leu Ala Ser Ala Arg Glu Ala Ser Gln Glu Leu Pro Pro Gly Phe Leu610 615 620Tyr Lys Val Glu Thr Leu His Asp Phe Glu Ala Ala Asn Ser Asp Glu625 630 635 640Leu Thr Leu Gln Arg Gly Asp Val Val Leu Val Val Pro Ser Asp Ser645 650 655Glu Ala Asp Gln Asp Ala Gly Trp Leu Val Gly Val Lys Glu Ser Asp
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权利要求
1.一种检测衰老细胞的方法，其包括测定参与细胞衰老的蛋白的量，其中蛋白是选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中细胞衍生自哺乳动物细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中两栖生理素蛋白为两栖生理素-1蛋白以及小窝蛋白为小窝蛋白-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中方法是蛋白质印迹法。
5.一种检测衰老细胞的方法，其包括测定编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸的量，其中蛋白是选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白中的一种或两种。
6.根据权利要求5所述的方法，其中细胞衍生自哺乳动物细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其中多核苷酸编码两栖生理素-1或小窝蛋白-1。
8.根据权利要求5所述的方法，其中多核苷酸选自gDNA、cDNA和mRNA。
9.一种调节细胞衰老的组合物，其包括有效量的参与细胞衰老的细胞蛋白，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白。
10.一种调节细胞衰老的组合物，其包括有效量的编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白。
11.一种调节细胞衰老的组合物，其包括有效量的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸与编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸杂交，并由此抑制多核苷酸表达蛋白，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白。
12.一种调节细胞衰老的组合物，其包括有效量的甲基化试剂或脱甲基化试剂，其中试剂使编码小窝蛋白的多核苷酸的碱基甲基化或脱碱基化。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中细胞衍生自哺乳动物细胞。
14.根据权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中参与细胞衰老的蛋白为两栖生理素-1蛋白或小窝蛋白-1。
15.根据权利要求10所述的组合物，其中多核苷酸是gDNA或cDNA。
16.根据权利要求10所述的组合物，其中编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸包含在真核生物细胞的表达载体中。
17.根据权利要求11所述的组合物，其中参与细胞衰老的蛋白为小窝蛋白。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中反义寡核苷酸与小窝蛋白mRNA的翻译起始区杂交。
19.根据权利要求12所述的组合物，其中甲基化试剂选自甲基氧化偶氮甲醇乙酸酯、Temozolomide和N-甲基-N-亚硝基脲。
20.根据权利要求12所述的组合物，其中脱甲基化试剂选自5-氮杂-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和8-氮鸟嘌呤。
21.根据权利要求19或20所述的组合物，其中试剂使来自编码小窝蛋白-1的多核苷酸的启动子的CpG岛甲基化或脱甲基化。
22.一种调节细胞衰老的组合物，其包括有效量的显性负两栖生理素-1基因。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中显性负两栖生理素-1基因为编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括由SEQ ID NO2表示的第250-588位氨基酸序列。
24.一种调节需要的患者中细胞衰老的方法，其包括给患者施用有效量的参与细胞衰老的蛋白，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白。
25.一种调节需要的患者中细胞衰老的方法，其包括给患者施用有效量的编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸，其中蛋白选自两栖生理素和小窝蛋白。
26.一种调节需要的患者中细胞衰老的方法，其包括给患者施用有效量的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸与编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸杂交，并由此抑制多核苷酸表达蛋白，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白。
27.一种调节需要的患者中细胞衰老的方法，其包括给患者施用有效量的甲基化试剂或脱甲基化试剂，其中试剂使编码小窝蛋白的多核苷酸的碱基甲基化或脱甲基化。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中细胞衍生自哺乳动物细胞。
29.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中参与细胞衰老的蛋白为两栖生理素-1蛋白或小窝蛋白-1。
30.根据权利要求25所述的方法，其中多核苷酸是gDNA或cDNA。
31.根据权利要求25所述的方法，其中编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸包含在真核生物细胞的表达载体中。
32.根据权利要求26所述的方法，其中参与细胞衰老的蛋白为小窝蛋白。
33.根据权利要求32所述的方法，其中反义寡核苷酸与小窝蛋白mRNA的翻译起始区杂交。
34.根据权利要求27所述的方法，其中甲基化试剂选自甲基氧化偶氮甲醇乙酸酯、Temozolomide和N-甲基-N-亚硝基脲。
35.根据权利要求27所述的方法，其中脱甲基化试剂选自5-氮杂-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和8-氮鸟嘌呤。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中试剂使来自编码小窝蛋白-1的多核苷酸的启动子的CpG岛甲基化或脱甲基化。
37.一种鉴别影响细胞衰老的物质的方法，其包括下列步骤(a)在待测物质存在下培养细胞；(b)自细胞中分离蛋白；(c)将分离蛋白与特异于参与细胞衰老的蛋白的抗体接触，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白；以及(d)测定分离蛋白与抗体结合的量。
38.一种鉴别影响细胞衰老的物质的方法，其包括下列步骤(a)在待测物质存在下培养细胞；(b)自细胞中分离RNA；(c)将分离RNA与衍生自编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸的探针接触，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白；以及(d)测定分离RNA与编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸杂交的量。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中细胞衍生自哺乳动物细胞。
40.根据权利要求37或38所述的方法，其中蛋白为两栖生理素-1蛋白或小窝蛋白。
41.一种检测衰老细胞的试剂盒，其包括衍生自编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸的探针，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中细胞衍生自哺乳动物细胞。
43.根据权利要求41所述的试剂盒，其中蛋白为两栖生理素-1蛋白或小窝蛋白-1。
44.根据权利要求41所述的试剂盒，其中探针固定于固相支持物上。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的试剂盒，其进一步包括检测探针是否存在的标记。
46.一种鉴别细胞衰老的生物标记，其包括参与细胞衰老的蛋白，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白。
47.一种鉴别细胞衰老的生物标记，其包括编码参与细胞衰老的蛋白的多核苷酸，其中蛋白选自两栖生理素蛋白和小窝蛋白。
48.根据权利要求46或47所述的生物标记，其中蛋白为两栖生理素-1或小窝蛋白-1。
全文摘要
本发明涉及参与衰老的核酸序列和蛋白质，特别是涉及包括参与细胞衰老的两栖生理素和小窝蛋白的核酸序列和蛋白质和它们的用途。
文档编号A61K48/00GK1460181SQ01815293
公开日2003年12月3日 申请日期2001年7月6日 优先权日2000年9月8日
发明者朴相哲, 朴熊洋, 朴静水, 赵京娥, 金德仁 申请人:汉城国立大学工业基金会