专利名称：白藜芦醇的免疫增强用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及白藜芦醇的用途，尤其涉及白藜芦醇在增强机体免疫功能中的用途。
已知该化合物具有抗炎、抗肿瘤、心血管保护等作用。白藜芦醇对花生四烯酸代谢过程中的两个关键的酶脂氧化酶(lipoxygenase)和环氧化酶(cyclooxygenase)有较强的抑制活性(Jang M.等，Science 1997，275218-220)，从而抑制PGE2、白三烯(LTs)等的生成。白藜芦醇还能抑制巨噬细胞、中性粒细胞活性氧自由基及一氧化氮的生成(Jang D.S.等，Biochem.Pharmacol.1999，57(6)705-712)，抑制TNF-α的产生(Kawada N.等，Hepatology 1998，27(5)1265-1274)，从而起到抗炎作用。在抗肿瘤方面，白藜芦醇能竞争性抑制诱癌剂二恶英(Dioxin)、多环芳香烃与受体结合，选择性抑制细胞色素P4501A1活性，从而抑制致癌剂的代谢活化(Casper R.F.等，Mol.Pharmacol.1999，56(4)784-790；Ciolino H.P.等，Mol.Pharmacol.1999，56(4)760-767)；同时能抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡(Damianaki A.等，J.Cell Biochem.2000，78(3)429-441；Delmas D.等，Oncol.Rep.2000，7(4)847-852)。白藜芦醇对心血管的保护作用表现为抑制血管收缩性，抑制内皮细胞增殖(NaderaliE.K.等，Clin.Sci.(Colch)2000，98(5)537-543)；抑制血小板聚集(DobrydnevaY.等，Br.J.Pharmacol.1999，128(1)149-157)；抑制低密度脂蛋白的氧化修饰从而抑制冠心病的诱导(Fremont L.等，Life Sci.1999，64(26)2511-2521)；防止心肌缺血再灌注损伤(Salo M.等，Free Radic.Res.2000，32(2)135-144)。
本发明研究发现白藜芦醇能通过增强抗原提呈细胞和T细胞的免疫反应功能，促进机体免疫系统产生细胞介导免疫反应，对免疫反应异常低下或抑制的机体作用尤为显著。
在机体免疫系统中，T淋巴细胞是重要的免疫效应细胞，主要包括T辅助性淋巴细胞(TH)和T杀伤性淋巴细胞(CTL)两大类，负责清除入侵体内的病毒、细菌等微生物及肿瘤；但T淋巴细胞的激活，取决于抗原提呈细胞(包括树突状细胞、单核-巨噬细胞等)的抗原提呈和辅助作用；抗原提呈细胞和T细胞活化时，产生分泌的细胞因子可根据引起的免疫效应的不同分为Th1型(IL-12，IFN-γ，IL-2等)和Th2型(IL-10等)。Th1型细胞因子可促进机体免疫系统产生细胞介导免疫反应，而Th2型细胞因子则抑制细胞介导免疫反应，产生体液免疫反应。巨噬细胞等分泌的IL-12可促进T细胞IFN-γ的产生也可归为Th1型细胞因子。
迟发型超敏(DTH)模型是经典的反映T细胞介导免疫反应的实验动物模型，巨噬细胞是其主要的效应细胞之一。
多量的乙醇摄入可导致机体免疫反应功能的下降和低下，主要表现在对巨噬细胞功能的抑制；肿瘤病人晚期出现免疫功能反应低下，容易并发各种感染，主要是T淋巴细胞数目减少，淋巴细胞反应能力降低，同时伴随巨噬细胞抗原提呈功能的下降。
本发明采用淋巴细胞增殖、细胞因子产生、整体DTH动物模型，以及肿瘤小鼠免疫反应、效应细胞功能分子表达，来科学有效地评价药物对机体免疫系统的影响作用。
下面通过白藜芦醇对小鼠T淋巴细胞增殖，细胞因子产生，DTH反应，对乙醇诱导的DTH免疫反应功能低下型小鼠和免疫反应抑制型荷瘤小鼠中作用的药理实验来说明该化合物在增强机体免疫功能中的作用。
整体实验白藜芦醇采用灌胃给药，用无菌0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)-生理盐水配制成均匀悬液，对照以0.5％CMC代替，每只小鼠给药量0.2毫升。
ELISA检测细胞因子产生及流式细胞仪检测细胞表面功能分子表达所用抗体均为Pharmegen公司产品，刀豆蛋白(Conannavalin A，ConA)及细菌脂多糖(Lipopolysacchride，LPS)为Sigma公司产品，金黄色葡萄球菌菌体Sac(Staphylococcus aureus Cowan strain 1)为Biosciences公司产品，RPMI-1640培养液及小牛血清为GIBCOL公司产品，[3H]-胸腺嘧啶核苷为上海原子能研究所产品，其余试剂均为国产分析纯。实施例1白藜芦醇对正常小鼠免疫细胞功能的影响1、淋巴细胞增殖实验；(1)无菌取小鼠脾脏，常规制成单细胞悬液，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液调细胞浓度为4×106/毫升。
(2)取96孔板，每孔加入上述细胞悬液100μL，以及不同浓度的白藜芦醇及T细胞刺激剂ConA(终浓度5μg/mL)，对照组以培养液代替，培养总体积200μL。
(3)在含5％二氧化碳，37℃的培养箱中培养36小时。
(4)每孔加入1.9×1010Bq的[3H]-胸腺嘧啶核苷，继续培养12小时后，培养板冻存于-20℃冰箱。
(5)用细胞收集仪(HARVESTER96，TOMTEC)收集细胞于玻璃纤维膜上，用液闪记数仪(MicroBeta Trilux，PerkinElmer)检测[3H]-胸腺嘧啶核苷掺入量，反映细胞增殖情况。2、淋巴细胞因子诱导及检测(1)脾细胞悬液的制备如上，将细胞浓度调为2×106/毫升，加入24孔板，每孔1mL。
(2)白藜芦醇及ConA(终浓度5μg/mL，IL-2诱导)或Sac(终浓度0.01％，II-12，IFN-γ，IL-10诱导)加入24孔板，终体积2mL。
(3)在含5％二氧化碳，37℃的培养箱中培养24或48小时后，收集无菌培养上清冻存于-20℃冰箱，待测细胞因子。
(4)常规ELISA法检测细胞因子的产生，用TMB作为酶反应底物，OD450nm检测吸光度，根据标准品所做标准曲线换算细胞因子生成量。
如下表1所示，白藜芦醇能明显促进T淋巴细胞的增殖，同时促进Th1型细胞因子(2，IFN-γ，IL-12)的产生，抑制Th2型细胞因子(II-10)的产生；表明白藜芦醇有增强机体产生细胞介导免疫反应的作用。
表1 白藜芦醇对正常小鼠免疫细胞功能的影响(X±S)分组剂量 T淋巴细胞增殖 细胞因子产生(24小时)(μM) (CPM×10-3) (pg/mL)无刺激 CONA IL-2 IFN-γ IL-12 IL-10对照组 - 2.08±0.35 18.96±0.374020±14 3153±621145±159534±448RES 0.752.52±0.39 23.75±0.29c 4102±4 3327±124 1416±747750±1611.5 2.39±0.46 30.78±0.89c4216±1b3462±36b1654±8c7313±510b3 2.12±0.52 31.45±0.43c4841±5c3600±15b1723±32c6478±188b6 1.99±0.56 32.74±0.21c5074±11c3752±14b1903±37c4371±644b与对照组比较bP＜0.05，cP＜0.01实施例2白藜芦醇在小鼠DTH反应中对乙醇诱导的免疫抑制作用的影响1、DTH反应动物模型用2，4-二硝基氟苯诱导小鼠DHT反应，具体为雌性Balb/c小鼠随机分组，每组8只用以丙酮-橄榄油(4∶1)配制的0.5％的2，4-二硝基氟苯20μL涂于小鼠两后足致敏，第二天以同样剂量加强致敏。
白藜芦醇(4，16mg/kg)用0.5％CMC制成悬浊液后从致敏第一天开始给小鼠灌胃，直至实验结束。同时，乙醇(16％w/v)加于小鼠饮用水瓶中，让小鼠自由饮用。阴性对照，模型对照及乙醇对照组每天以0.5％CMC灌胃。第一次致敏5天后，用10μL 0.2％2，4-二硝基氟苯-丙酮-橄榄油(4∶1)涂于小鼠左耳片两侧攻击；右耳片则涂以丙酮-橄榄油(4∶1)溶剂作为自身对照。24小时后，脱颈臼处死小鼠，用特制的8mm打孔器沿耳片外沿相同部位打下耳片，称重，以左右耳片重量差作为小鼠DTH反应的指标。2、淋巴细胞亚群的改变及抗原提呈功能分子表达检测(1)小鼠脾淋巴细胞1.0×106用冰冷的染色缓冲液(staining buffer)(PBS，含0.1％NaN3，1％FBS，pH7.2)洗后，重悬于staining buffer中。
(2)2.4G2单抗封闭Fc受体后，加入适宜浓度荧光标记的抗体并于4℃冰箱中孵育30分钟。
(3)细胞用2.0mL染色缓冲液洗两次后，重悬于0.5mLPBS(pH7.2)中，流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析，数据用CellQuestTM软件(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行分析。
(4)进行Mac-1+细胞抗原提呈功能分子分析采用FITC-Mac-1与PE-H-2KdPE-I-Ad/I-EdPE-CD80，PE-anti-mouse-CD86双染，其余操作同上。
如下表2所示白藜芦醇单独使用能促进小鼠DTH免疫反应；乙醇能导致小鼠DTH反应的显著抑制，白藜芦醇能显著地对抗乙醇的抑制作用。白藜芦醇对小鼠淋巴细胞亚群无明显的影响作用，但它能明显地促进脾脏巨噬细胞的抗原提呈重要功能分子MHC-II的表达，并且明显对抗乙醇引起的MHC-II表达的抑制。
表2 白藜芦醇对正常及乙醇抑制小鼠迟发型超敏反应(DTH)功能的影响(X±S)分组淋巴细胞亚群(％) 抗原提呈分子表达DTH耳肿乙醇 白藜芦醇Mac-1+-I-Ad/I-Ed胀(mg) CD4+CD8+B Mac-1+(16w/v) (mg/kg) (MHC-II)-- 14.3±0.824.5 14.0 46.8 12.6 2185-4 15.4±1.524.7 13.4 49.0 11.1 269016 16.5±1.3b23.3 12.8 48.1 13.1+- 11.9±1.1b25.0 15.1 49.4 9.11841+4 15.2±2.3e24.7 14.2 49.6 10.6 2558+16 18.9±5.1e23.8 14.8 44.6 10.0与对照组比较，bP＜0.05，与乙醇对照组比较，eP＜0.05实施例3白藜芦醇对晚期荷瘤小鼠免疫细胞功能的影响1、CAS1M免疫抑制型荷瘤小鼠模型CAS1M纤维肉瘤细胞最初是在一雄性Balb/c小鼠上用Schmidt-Ruppin品系的鲁斯氏肉瘤病毒诱导而来。取传代第三天的生长良好的细胞，胰蛋白酶消化后用不含血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为3×106/毫升。于雄性Balb/c小鼠背部皮内注射，每鼠0.1mL(3×105)。取同批接种五周且瘤径相当的动物随机分组，每组8-10只。白藜芦醇给药剂量参照前期在DTH模型中的结果采用4mg/kg剂量，对照组则以0.5％CMC代替；每天灌胃给药，持续2-3周，到第8周左右进行实验，作为晚期荷瘤组。正常对照组采用与晚期组同批次但未接种肿瘤的小鼠。2、实验时取各组小鼠(＞3只)脾细胞混合悬液，分别调至适宜细胞浓度，进行细胞增殖实验，或培养48小时取上清液，用ELISA法检测细胞因子，或用流式细胞仪检测脾脏巨噬细胞抗原提呈功能分子(MHC-II，CD80)的表达。
如下表3所示白藜芦醇口服给药两周后，能显著提高晚期荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应功能，解除功能抑制的现象。明显提高晚期肿瘤鼠淋巴细胞IL-2，IFN-γ，IL-12的产生，同时降低免疫抑制型淋巴因子IL-10的产生。白藜芦醇明显改善晚期肿瘤所表现的机体免疫功能低下。
表3白藜芦醇对荷瘤小鼠淋巴细胞增殖，细胞因子产生及抗原提呈功能分子表达的影响(X±S)淋巴细胞增殖反应 抗原提呈功能分子表分组 细胞因子产生(mg/ml)(CPMx10-3) 达(平均荧光强度)T淋巴细胞 B淋巴细胞 IL-2IFN-γ IL-12 IL-10 MHC-II CD80正常组38.74±4.1932.29±1.80 2.60±0.06 29.04±0.65 3.48±0.05 29.18±1.26 1116554晚期肿瘤1.44±0.25c0.04±0.01c2.41±0.01a7.67±0.02b2.13±0.03b23.71±1.32b541 509组白藜芦醇42.67±3.90af14.95±3.01c，a3.39±0.07c，e14.92±0.86b，e3.82±0.15a，e23.49±0.54a，d870 660治疗组与正常对照组比较，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；与晚期肿瘤组比较，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01有益效果本发明发掘了已知化合物白藜芦醇在增强机体免疫功能中的新用途，开拓了新的应用领域。
权利要求
1.一种具有如下结构 具有抗炎、抗肿瘤和心血管保护作用的白藜芦醇其特征在于在增强抗原提呈细胞和T细胞免疫反应功能，促进机体产生细胞介导免疫反应中的作用。
2.根据权利要求1所述的作用，其特征在于增强机体产生细胞介导免疫反应，提高机体抗病能力和免疫反应机能，在药物治疗或预防肿瘤、艾滋病、免疫缺陷症、衰老等所致的免疫系统功能降低和衰退中的应用。
全文摘要
本发明涉及白藜芦醇的新用途。该化合物具有增强抗原提呈细胞和T细胞的免疫反应功能，促进机体免疫系统产生细胞介导免疫反应的作用，对免疫反应异常低下或抑制的机体作用尤为显著。
文档编号A61K31/045GK1459280SQ02111769
公开日2003年12月3日 申请日期2002年5月21日 优先权日2002年5月21日
发明者左建平, 冯泉红, 李晓玉, 赵维民 申请人:中国科学院上海药物研究所