专利名称：纳豆芽孢杆菌及其在制备具有血栓溶解性保健食品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种纳豆芽孢杆菌及其在制备具有血栓溶解性保健食品中的应用。
背景技术：
目前，高血脂、高血压、糖尿病、癌症等现代“文明病”已经取代传染性疾病成为人类的头号杀手。世界卫生组织1998的报告指出，世界上每年有约1500万人死于血液循环系统疾病，其中720万人死于冠心病，460万人死于中风，350万人死于其他心脏病，全世界每分钟有23人死于血管疾病。据卫生部统计，我国心脑血管疾病患病人数已达2亿，其中，一半以上的患者不知道自己已经患病。到1997年底，我国高血压患者已达1.1亿，并以每年350万人的速度增加。
开发具有调节血脂功能的保健食品是预防和治疗高血脂、高血压等疾病的重要手段。近年来，保健功能食品已受到了越来越多的喜爱，据统计，国内大城市中有93％的儿童、98％的老人，和相当数量的中青年都使用过或正在使用各种保健功能食品。我国每年保健品市场销售额高达四百五十亿元人民币。在国际市场上，保健功能食品也有着同样的发展趋势。目前，我国市场上具有调节血脂功能的保健品种类繁多，鱼龙混杂，许多种都是未经卫生部批准的冒牌保健品，功能上与纳豆保健品有很大差距。
纳豆源于中国，传入日本后，已经被开发成多种保健功能食品，并被世界各国所接受，产生了巨大的经济效益。现代研究发现纳豆具有调节血压，降低血液胆固醇的功能，对高血脂、高血压、血栓病等有辅助治疗作用。因此，在日本，纳豆已经被作为保健功能食品的代表。其保健功能包括1)预防动脉硬化，防止血管老化；2)使血液清爽，血流畅通；3)溶解血栓；4)预防氧自由基的产生；5)促进新陈代谢；6)调节血压；7)预防脑梗塞；8)预防和改善痴呆症状；9)预防狭窄性心脏病及心肌梗塞；10)降低低密度脂蛋白胆固醇含量；11)减少中性脂肪含量。纳豆的“预防心脏病”的效果也已经得到美国FDA的认可。
纳豆虽然已被公认具有上述的保健功能，但是纳豆的溶栓活性很低，只有大量长期食用才能发挥溶栓效用。
发明内容
本发明的目的在于克服直接将纳豆及其制品作为保健用品的局限性，而提供一种可以在多种含氮培养基中高效合成纳豆激酶(Nattokinase)的纳豆芽孢杆菌，所产生的纳豆激酶是一种能达到“经口纤溶疗法”目的的蛋白激酶，在肠道中活性相当稳定，与其它溶栓药相比，除具有较强的溶栓作用外，还具有体内作用时间长，无毒副作用等优点；该纳豆激酶经静脉滴注直接进入血液循环，或口服后经肠道吸收进入血液循环来直接作用血栓，还可以诱导肝脏或血管内皮产生TPA(纳豆激酶本身无TPA抗原性)，使生物体自身纤溶酶系统活化，从而温和、持续地提高血液的纤溶活性，与其它纤溶酶相比，其安全性最高；本发明的另一目的是纳豆芽孢杆菌在生产保健食品中的应用。
本发明的实施方案如下本发明提供的纳豆芽孢杆菌，其特征在于该纳豆芽孢杆菌为Bacilliis nattoNLSSe，2002年3月8日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0724；菌株NLSSE为革兰氏阳性，不抗酸杆菌；好氧，有芽孢，芽孢中生、不膨大，在一个孢子囊细胞中，芽孢不多于一个，细胞壁化学组分中含有meso-DAP(内消旋二氨基庚二酸)，无特征性糖；菌株NLSSe为杆状，直或近直形，0.6-0.8×1.5-2.0um，能运动，鞭毛周生；在五种天然有机培养基上生长良好，利用黄豆饼粉培养基形成较厚菌膜，菌落乳脂色，边缘光滑。
本发明提供的纳豆芽孢杆菌NLSSe的筛选方法为精选东北小粒大豆淋洗后，加N二倍体积的水浸泡过夜，取溶胀的大豆在温度121℃，蒸汽灭菌30分钟，取稻草裹覆，温度35℃，发酵24小时；取发酵大豆进行菌种分离；分离得到的单菌落在10％豆浆中培养，以纤维蛋白平板检测其溶栓活性，筛选溶栓活性较高的菌株；进一步纯化，得到一纯种菌株，送中国科学院微生物研究所菌种保藏鉴定中心鉴定；被定名为纳豆芽孢杆菌Bacillusnatto NLSSe，2002年3月8日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0724；本发明的纳豆芽孢杆菌是从天然发酵大豆中，以纳豆激酶活性作为指标，分离纯化而得到，其生物学特征如下A.形态学特征于30℃培养2-4天，菌株NLSSe为杆状，不成链，无孢囊；直或近直形，0.6-0.8×1.5-2.0um，周生鞭毛，能运动，有芽孢，芽孢中生、不膨大，在一个孢子囊细胞中，芽孢不多于一个(见图1，2)，革兰氏阳性，不抗酸；B.培养特征本菌株NLSSe在以下五种培养基中30℃培养2-4天的培养特征见表1，表1菌株NLSSe在5种培养基上的培养特征培养基菌落颜色及形状蛋白胨查氏琼脂菌落污白色，菌膜厚，边缘光滑桑塔斯琼脂菌落杏仁白色，菌膜厚，边缘光滑牛肉浸汁琼脂 菌落乳白色，菌膜中度，边缘光滑黄豆粉琼脂菌落微黄色，菌膜厚，边缘峭状葡萄糖酵母精琼脂 菌落微黄白色，菌膜薄，边缘粗糙C.化学组分按Hasegawa T.等的快速薄层层析法(Thin Layer Chromography，TLC)对本菌株NLSSe进行全细胞水解液糖型及氨基酸分析，确认该菌含有meso-DAP(内消旋二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)和甘氨酸，无特征性糖(糖型C)；D.生理生化特征参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》的方法，菌株NLSSe的生理生化特征如表2所示。
表2菌株NLSSe的生理生化特征
本发明的纳豆芽孢杆菌NLSSe菌株，在pH4-9均能良好地生长，生长温度25-45℃，好氧；毒力实验证明菌株NLSSe对小鼠无明显毒性。
本发明提供的纳豆芽孢杆菌在制备具有血栓溶解性保健食品中的应用本发明提供的纳豆芽孢杆菌在含有氮源的培养基中培养得到含有血栓溶解性物质的培养物，并可对培养物提取液体状或粉未状物质，用作制备具有血栓溶解性保健食品；所述氮源为大豆、黑豆等豆类，及其蛋白提取物。
本发明提供的纳豆芽孢杆菌所产生的纳豆激酶(Nattokinase)是一种能达到“经口纤溶疗法”目的的蛋白激酶。纳豆激酶在肠道中活性相当稳定，与其它溶栓药相比，除具有较强的溶栓作用外，还具有体内作用时间长，无毒副作用等优点。纳豆激酶经静脉滴注直接进入血液循环，或口服后经肠道吸收进入血液循环来直接作用血栓，还可以诱导肝脏或血管内皮产生TPA(纳豆激酶本身无TPA抗原性)，使生物体自身纤溶酶系统活化，从而温和、持续地提高血液的纤溶活性，与其它纤溶酶相比，其安全性最高；本发明的纳豆芽孢杆菌菌株是从天然发酵大豆分离得到的菌种，可以在大豆、黑豆等固体培养及豆乳等液体培养，调pH为6-8，温度20-45℃，这种菌能产生一种高活性的血栓溶解酶，可以直接利用，也可做成菌液或粉未状添加于食品中，制做具有溶解血栓功能的保健食品，其应用前景广阔。
附图1菌株NLSSe菌体及芽孢形态的电镜照片(750X)附图2菌株LSSe J-1的芽孢表面特征电镜照片(20000X)
具体实施例方式
本实施例的胶囊保健食品的主要功能成分及含量为
实施例2用本发明提供的纳豆芽孢杆菌菌株NLSSe发酵大豆生产纳豆保健食品纳豆芽孢杆菌菌种斜面制备培养基成分大豆粉2％、氯化钠1％、大豆蛋白胨0.2％、琼脂1.5％，PH7.0，121℃，灭菌30分钟；每个试管加培养基10毫升，制成试管斜面。接入纳豆芽孢杆菌菌株NLSSe，30℃，培养24小时，得到斜面菌种；斜面菌种用无菌生理盐水冲洗，倒入摇瓶液体培养基中，30℃，150转/分钟摇床上培养24小时，得到液体菌种；取东北产大豆1公斤，17℃浸泡20小时，沥水后121℃，高温高压蒸煮30分钟。加菌株NLSSe液体菌种20毫升，40℃保温，相对温度90％，发酵48小时。降温至20℃，继续发酵24小时；发酵大豆在40℃真空干燥，然后，无菌条件下粉碎，加入1.5倍体积纯净色拉油，维生素E，胶体磨研磨、混均，装入胶囊，得到本实施例的胶囊保健食品；本实施例的胶囊保健食品的主要功能成分及含量为
实施例3用本发明提供的纳豆芽孢杆菌菌株NLSSe发酵大豆生产纳豆保健食品纳豆芽孢杆菌菌种斜面制备培养基成分大豆粉2％、氯化钠1％、大豆蛋白胨0.2％、琼脂1.5％，PH7.0，121℃，灭菌30分钟；每个试管加培养基10毫升，制成试管斜面。接入纳豆芽孢杆菌菌株NLSSe，30℃，培养24小时，得到斜面菌种；斜面菌种用无菌生理盐水冲洗，倒入摇瓶液体培养基中，30℃，150转/分钟摇床上培养24小时，得到液体菌种；取东北产大豆1公斤，20℃浸泡8小时，沥水后121℃，高温高压蒸煮20分钟。加菌株NLSSe液体菌种50毫升，40℃保温，相对温度90％，发酵24小时。降温至10℃，继续发酵48小时；发酵大豆在40℃真空干燥，然后，无菌条件下粉碎，加入1.5倍体积纯净色拉油，维生素E，胶体磨研磨、混均，装入胶囊，得到本实施例的胶囊保健食品；本实施例的胶囊保健食品的主要功能成分及含量为
实施例4、菌株NLSSe发酵大豆生产纳豆保健功能食品纳豆芽孢杆菌菌种斜面制备培养基成分大豆粉2％、氯化钠1％、大豆蛋白胨0.2％、琼脂1.5％，pH7.0，121℃，灭菌30分钟；每个试管加培养基10毫升，制成试管斜面；接入菌株NLSSe，30℃，培养24小时，得到斜面菌种；斜面菌种用无菌生理盐水冲洗，倒入摇瓶液体培养基中，30℃，150转/分钟摇床上培养24小时，得到液体菌种；取东北产大豆1公斤，20℃浸泡8小时，沥水后121℃，高温高压蒸煮20分钟；加菌株NLSSe液体菌种50毫升，40℃保温，相对温度90％，发酵24小时；降温至10℃，继续发酵48小时；发酵大豆在40℃真空干燥，然后，无菌条件下粉碎，加入1.5倍体积纯净色拉油，维生素E，胶体磨研磨、混均，装入胶囊，得到胶囊保健食品。
该保健功能食品的主要功能成分及含量为
实施例5纳豆保健功能食品临床试验每天给治疗组分两次服用6粒纳豆保健功能食品胶囊，给对照组服用6粒空胶囊。定期采血，分别测定优球蛋白溶解时间(ELT)、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)和组织型纤溶酶原激活因子(TPA)，以此表征血浆的纤溶活性。实验结果表明试验组在服胶囊后，血中ELT明显延长，FDP和TPA明显增加，说明该纳豆保健功能食品可以提高血浆的纤溶活性。纳豆保健功能食品中的纳豆激酶与血栓具有特殊的亲和力，能够专一溶解血栓，对纤维蛋白原没有降解活性，大量使用不会引起出血，可以预防和辅助治疗以下病症脑血栓、脑梗塞，心肌梗塞，血栓后遗症，血栓静脉炎，脉管炎等。
权利要求
1.一株纳豆芽孢杆菌，其特征在于该纳豆芽孢杆菌为Bacilliis natto NLSSe，2002年3月8日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0724。
2.按权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌，其特征在于该纳豆芽孢杆菌的革兰氏染色阳性，不抗酸杆菌，直或近直形，0.6-0.8×1.5-2.0um；好氧，有芽孢，芽孢中生、不膨大，在一个孢子囊细胞中，芽孢不多于一个；鞭毛周生，能运动。
3.按权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌，其特征在于该纳豆芽孢杆菌细胞壁化学组分中含有内消旋二氨基庚二酸和甘氨酸，无特征性糖。
4.按权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌，其特征在于该纳豆芽孢杆菌在蛋自胨查氏琼脂、桑塔斯琼脂、牛肉浸汁琼脂、黄豆粉琼脂或葡萄糖酵母精琼脂五种天然有机培养基上生长良好，利用黄豆饼粉培养基形成较厚菌膜，菌落乳脂色，边缘光滑。
5.权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌在制备具有血栓溶解性保健食品中的应用。
全文摘要
本发明涉及的纳豆芽孢杆菌为Bacilliis nattoNLSSe，2002年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNO.0724；其革兰氏染色阳性，不抗酸杆菌，直或近直形，0.6－0.8×1.5－2.0um；好氧，有芽孢，芽孢中生、不膨大，在一个孢子囊细胞中，芽孢不多于一个，细胞壁化学组分中含有内消旋二氨基庚二酸和甘氨酸；无特征性糖；能运动，鞭毛周生；在蛋自胨查氏琼脂、桑塔斯琼脂、牛肉浸汁琼脂、黄豆粉琼脂或葡萄糖酵母精琼脂五种天然有机培养基上生长良好，利用黄豆饼粉培养基形成较厚菌膜，菌落乳脂色，边缘光滑；可在含有氮源的培养剂中培养得到含有血栓溶解性物质纳豆激酶的培养物，并可对培养物提取粉未状物质，可用来在制备具有血栓溶解性保健食品或保健食品添加剂。
文档编号A61P9/00GK1464046SQ0212135
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月14日 优先权日2002年6月14日
发明者邢建民, 栾晓弟, 刘会洲 申请人:中国科学院过程工程研究所