专利名称：双价Vero细胞肾综合征出血热纯化灭活疫苗的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于预防用新生物制品新型疫苗领域，涉及一种入用双价Vero细胞肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome，HFRS)纯化灭活疫苗的制备方法及其制品在预防HFRS中的应用。
HFRS是危害我国人民身体健康最严重的病毒性传染病之一，它由HFRS病毒引起。目前，该病在世界广泛流行，在我国的发病数占全世界的90％以上，建国以来，我国每年发病病例为4-11万人，病死率为3-10％。迄今为止，疫区已遍及全国29个省、市、自治区，严重威胁广大人民群众的生命与健康。50年代以来，我国共发生138万多例HFRS病例，死亡人数达5万之多，遭受HFRS病毒威胁的人高达数亿，因此，控制和消灭该病毒，预防该病的流行是我们发明本项目的主要目的。
由于HFRS病毒是以啮齿动物为宿主，主要通过气溶胶传播到人，不容易通过控制传染源和切断传播途径进行预防。但是HFRS病毒具有很好免疫原性，可以进行疫苗接种，通过提高人群免疫力进行预防。我国目前已研制出几种动物原代细胞和乳鼠脑灭活疫苗，经实践证明均获得了一定的防病效果。但是这三种灭活疫苗均是采用动物原代细胞或脑组织作为基质的传统工艺生产的产品，这些疫苗尚存在一些先天的不易克服的缺欠①由于上述疫苗使用动物器官、动物细胞作为生产基质很难控制疫苗的质量，例如动物携带的病毒污染问题等；②上述疫苗的基质均来源于啮齿动物的器官和细胞，细胞异质成份较多，易引起接种副反应；③由于这些疫苗每针的抗原量有限，全程免疫反应后的抗体反应水平和阳转率相对较低。④需要繁殖和饲养大批动物，生产过程复杂，操作麻烦，产量有限。随着改革开放发展，人民文化生活水平的提高和国际交流的日益频繁，极其需要更安全，更有效更可靠，质量更高的疫苗以充分满足国内外防病需要。因此，原工艺生产的疫苗需要用其他较先进工艺生产的疫苗替代，本发明双价Vero细胞肾综合征出血热纯化灭活疫苗的研究就提到日程上来。迄今为止，国内外尚未见到类似的疫苗进入临床试验或上市报导。
本发明的目的通过以下生产工艺达到1、Vero细胞制备a.从工作细胞库液氮罐中取出工作细胞库细胞进行细胞复苏；b.T150培养瓶培养扩增长成单层的细胞瓶倾去培养液，加入混合消化液(0.5％胰酶1份加verson3份)溶液，待细胞面呈毛玻璃状，中间有裂隙时，倒去消化液，加入新配制的细胞生长液，反复振摇细胞培养瓶至细胞脱落，然后以1∶3比例将细胞分种到新的T150培养方瓶中，每瓶加入30ml新配制的细胞生长液，于37℃条件下培养。
c.3L转瓶扩增培养细胞传够量时，改成3L转瓶传代培养。用4-5个T150 Vero细胞瓶，以混合消化液消化后传1个转瓶，每瓶加入适量的细胞生长液，置37℃培养。细胞长成单层后，倾去培养液，每瓶加入100ml混合消化液，待细胞面呈毛玻璃状时，倒去消化液，加入100ml细胞生长液，稍用力振荡使细胞脱落，然后以1∶3的比例将细胞分种到新的培养瓶中，每瓶加入含10％小牛血清的MEM细胞生长液500ml，于37℃条件下旋转培养。
2、病毒混合接种细胞在3L转瓶中生长成单层时，用混合消化液消化细胞做1∶3分种，生长液为10％小牛血清MEM培养液，在培养液中加入姬鼠型(或家鼠型)毒种，并使其终浓度为10-4。每瓶加入含病毒的培养液500ml。此为混合接种法。混合接种后置37℃旋转培养。
3、浸泡、洗换和收液a.浸泡感染病毒后第4天，弃去转瓶中的培养液，每瓶加入含0.1％人血白蛋白的MEM培养液，33℃旋转培养。浸泡过液。
b.感染病毒后第5天弃去培养液，用Hank’s液喷洗，加新鲜的含0.2％人血白蛋白的MEM培养液，于33℃继续旋转培养。
c.单次病毒液收获感染病毒后第8天开始收获单次病毒液，以后每3天收获1次，连续收获3次，每次收获的病毒液采用Millipore公司0.45μmPellicon-2膜包澄清。并抽样做无菌试验、分别测定病毒滴度和病毒抗原量。
4、单价病毒液在严格无菌的条件下，合并合格的3次的病毒液为单价病毒液。同时取培养相同时间未感染病毒的对照细胞做外源因子检查。
5、单价病毒液灭活取单价病毒液加入适量β-丙内脂，灭活病毒。
6、单价病毒液浓缩灭活后单价病毒液用截留分子量为100kd的Mi1liporePellicon-2膜包进行浓缩。
7、柱层析纯化使用Phamarcia公司生产的Sepharose 4FF进行纯化。用280nm波长检测柱后分离情况，记录结果。根据出峰情况收集第一个蛋白峰样品为单价原苗。抽样做蛋白含量测定，用0.45μm滤膜过滤后为单价原液。
8、双价原液a.将无菌试验、病毒滴度和灭活试验合格的姬鼠型和家鼠型单价灭活原液，等量混合即为双价疫苗原液。
b.抽样进行细胞DNA、残余牛血清蛋白。灭活安全试验和蛋白含量测定。
9.半成品配制双价原液中加入终浓度为0.2％人血白蛋白作为保护剂。加入终浓度≤0.10mg/ml硫柳汞为防腐剂。加入氢氧化铝作为佐剂，使含量为0.5mg/ml，即为半成品。
10、检定合格后分装安瓶，每支1.0ml，冻干、包装、入库。上述双价Vero细胞HFRS纯化灭活疫苗的工艺方法具有以下特征。
a、一种制备双价Vero细胞肾综合征出血热(Hemorrhagic FeverwithRenal Syndrome，HFRS)纯化灭活疫苗的方法，该方法包括用于制备该疫苗的两株毒种为我们自行分离的毒株；将该两株病毒在来自于非洲绿猴肾Vero细胞上增殖，获得了高滴度病毒；收获上述病毒液进行β-丙内酯、甲醛灭活或CO60辐射灭活；经切向流超滤浓缩和柱层析纯化以及加入稳定剂、防腐剂、佐剂。
b、用于双价Vero细胞HFRS纯化灭活疫苗的毒株为姬鼠型H8207和家鼠型Y86013株，为本专利发明人1982年和1986年用Vero-E6细胞分别从牡丹江地区采集的早期HFRS病人全血和辽宁省锦西葫芦岛地区捕获的褐家鼠鼠肺标本中分离。这两株病毒历史清楚、传代明确，通过传代适应，病毒在Vero细胞上增殖快、滴度高，可诱导动物产生高滴度中和抗体。在传代细胞上用交叉中和试验、单克隆抗体反应谱等选出了这两株抗原性强、免疫原性好的不同血清型的疫苗毒株，进行了基因分析，证明它们能代表国内外HFRS的主要流行株。
c、将上述b项的两株病毒，经传代适应于Vero细胞上，首次采用混合接种技术，获得了高滴度病毒液，从感染后第8天开始，每隔1-2天收获一次病毒液，共收获3-4次。
d、收获的病毒经β-丙内酯或甲醛灭活，经灭活安全试验证明该两种灭活方法，均取得了良好的效果。
e、采用Millipor Pollicon-2膜包切向流超滤浓缩和Sepharose 4FF柱层析纯化等完整的疫苗生产工艺和稳定的浓缩纯化工艺。
f、建立了Vero细胞规模化培养技术，比较了各种转瓶培养的最佳条件，选择了简便经济质量易于控制的3L转瓶培养技术用于本疫苗生产。
g、建立了本疫苗的质量控制标准特别是抗原量的检定，用ELISA法检测，应不低于1∶64，比国内生产的其他疫苗高4倍以上。
h、效力测定按规定用兔子进行免疫，全程两针，滴度均大于1∶20，比国内其他同类疫苗高一个滴度。
i、一种双价Vero细胞HFRS纯化灭活疫苗在预防HFRS中予以应用，其特征是全程免疫只需两针，在0、14天皮下接种，能产生良好的免疫力。
附图为双价Vero细胞HFRS纯化灭活疫苗的生产工艺流程图。
权利要求
1.一种制备双价Vero细胞肾综合征出血热(Hemorrhagic FeverwithRenal Syndrome，HFRS)纯化灭活疫苗的方法，该方法包括用于制备该疫苗的两株毒种为我们自行分离的毒株；将该两株病毒在来自于非洲绿猴肾Vero细胞上增殖，获得了高滴度病毒；收获上述病毒液进行β-丙内酯、甲醛灭活或CO60辐射灭活；经切向流超滤浓缩和柱层析纯化以及加入稳定剂、防腐剂、佐剂。
2.根据专利要求中1项所述的方法，其特征主要包括以下步骤a.用于双价Vero细胞HFRS纯化灭活疫苗的毒株为姬鼠型HF8401和家鼠型Y86013株，为本专利发明人1984年和1986年用VeroE6细胞分别从辽宁省黑线姬鼠和褐家鼠鼠肺标本分离。这两株病毒历史清楚、传代明确，通过传代适应，病毒在Vero细胞上增殖快、滴度高，可诱导动物产生高滴度中和抗体。在传代细胞上用交叉中和试验、单克隆抗体反应谱等选取以上这两株抗原性强、免疫原性好的不同血清型的疫苗毒株，进行了基因分析，证明它们是代表国内HFRS的主要流行株。b.将专利要求2中a项本专利发明人分离的这两株病毒，经多次传代适应于Vero细胞上，并首次采用混合接种技术，获得了高滴度病毒液，从感染后第8天开始，每隔1-2天收获一次病毒液，共收获3-4次；采用简便、高效的Millipore pellicon-2切向流过膜技术进行杂质去除，省去费时费力的离心澄清操作步骤。c.收获的病毒经β-丙内酯、甲醛或CO60辐射灭活，经灭活安全试验证明该三种灭活方法，均取得了良好的效果。d.采用Millipor Pollicon-2膜包切向流超滤浓缩技术，Sepharose4FF柱层析纯化技术等完整的疫苗生产工艺和稳定的浓缩纯化工艺。e.建立Vero细胞规模化培养技术，比较了各种转瓶培养的最佳条件，选择了简便经济质量易于控制的3L转瓶培养技术用于本疫苗生产。f.建立了本疫苗的质量控制标准特别是抗原量的检定用ELISA法检测，不得低于1∶64，比国内生产的其他疫苗动物原代细胞苗和鼠脑苗高4倍以上；.效力测定按规定用兔子进行免疫，全程两针，滴度均大于1∶20，比国内其他疫苗动物原代细胞苗和鼠脑苗高一个滴度。g.一种双价Vero细胞HFRS纯化灭活疫苗在预防HFRS中予以应用，其特征是全程免疫只需两针，在0、14天皮下接种，能产生良好的免疫效力。
全文摘要
本发明属于预防用新生物制品新型疫苗领域，涉及一种人用双价Vero细胞肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome，HFRS)纯化灭活疫苗的制备方法及其制品在预防HFRS中的应用。本发明的双价Vero细胞HFRS纯化灭活疫苗的方法是在来源于非洲绿猴肾传代细胞Vero细胞上分别增殖HF8401和Y86013肾综合征出血热病毒，收集上述两型病毒合并，经切向流过滤澄清、β－丙内酯或甲醛灭活、切向流超滤浓缩、Sepharose 4FF柱层析纯化，加入稳定剂人血白蛋白，防腐剂硫柳汞，佐剂氢氧化铝。本发明的双价Vero细胞HFRS纯化灭活疫苗抗原含量高、副反应小、质量易于控制、成本低，便于人们使用，全程免疫只需接种疫苗两次。
文档编号A61P31/00GK1404874SQ0212101
公开日2003年3月26日 申请日期2002年5月29日 优先权日2002年5月29日
发明者刘江秋, 李忠义 申请人:辽宁卫星生物制品研究所(有限公司), 刘江秋, 李忠义