专利名称：一种用于骨组织转化生长因子载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及医学骨移植技术领域，特别是涉及到一种用于骨组织转化生因子载体的制备方法。
目前应用的骨形成蛋白等载体有两种物理形态1.胶体载体，如胶原、纤维蛋白凝块(FC)、聚吡咯烷酮等；2.固态载体，常见如羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乙烯二醇(polyethyleneglycol，PEG)、聚乙醇酸(polygiycolic acid，PGA)及它们的共聚物；烧结骨、同种异体脱钙骨或脱矿骨基质、冻干骨、脱蛋白骨、重组合异种骨和珊瑚骨等；3.另外是由两种形态载体混合应用。
胶体载体与骨形成蛋白等的复合方式为直接将骨形成蛋白等与载体混匀；固态载体与骨形成蛋白等的复合方式为将载体浸于含骨形成蛋白等的溶液中，通过负压抽吸使骨形成蛋白等到载体中；混合性载体与骨形成蛋白的复合方式则是先将骨形成蛋白等与胶体载体混合，再将此液通过负压抽吸而吸附到固态载体中。
这几种承载方式有几点不利一、骨形成蛋白等分布不均，载体外部含骨形成蛋白等多而内部少。导致骨形成蛋白等的释放不平衡，早期释放多，被组织蛋白酶过快降解，而后期释放少，达不到骨诱导的有效浓度。二、由于骨形成蛋白等的分布不均导致成骨主要在载体的表面，内部成骨少，从而成骨不完全和缓慢。三、设备条件要求高、生产过程复杂。
本发明的具体技术方案是；一种用于骨组织转化生因子载体的制备方法，其特点是将各类固体载体加工成中空的圆柱体，骨形成蛋白等和胶体样载体按特定比例充分混匀后，置入固体载体中孔中，干燥成型。
具体步骤为1.将异体骨制成直径6-10mm，长度3-6mm，中空，内径2-4mm的圆柱体。
2.将制备好的圆柱体用甲醇/氯仿(1∶1)超声洗涤6h，0.6当量盐酸，15分钟脱钙，3％双氧水6h脱蛋白，制备去抗原骨。
3.将胶原与明胶以1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16比例分别混合加入适量蒸馏水，涡旋震荡器震荡24h充分混匀，调节PH值7.0，冻干，制备胶原明胶混合物。
4.去抗原异体骨与胶原明胶复合物分别用环氧乙烷消毒备用。
5.无菌操作下，将定量胶原明胶复合物与骨形成蛋白混合，加少量无菌蒸馏水混匀成胶状，置于去抗原骨中孔中，干燥。
当此种复合物植入体内后，因为有外层固体载体的阻挡，体液中的生物酶不能立刻接触到骨形成蛋白，从而有效的保存了骨形成蛋白；随着体液渗入到中孔，骨形成蛋白逐渐由中心缓慢向载体周围释放，在固体载体内形成从中孔到外周由高到低的骨形成蛋白梯度浓度，进而使成骨过程由中心向周围进行。
本实施例以异体骨(固体载体)，胶原和明胶(胶体载体)与骨形成蛋白的复合工艺为例具体的说明中心释放载体与骨形成蛋白复合的加工程序。
具体步骤为1.将异体骨制成直径8mm，长度5mm，中空，内径3mm的圆柱体。
2.将制备好的圆柱体用甲醇/氯仿(1∶1)超声洗涤6h，0.6当量盐酸，15分钟脱钙，3％双氧水6h脱蛋白，制备去抗原骨。
3.将胶原与明胶以1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16比例分别混合加入适量蒸馏水，涡旋震荡器震荡24h充分混匀，调节PH值7.0，冻干，制备胶原明胶混合物。
4.去抗原异体骨与胶原明胶复合物分别用环氧乙烷消毒备用。
5.无菌操作下，将定量胶原明胶复合物与骨形成蛋白混合，加少量无菌蒸馏水混匀成胶状，置于去抗原骨中孔中，干燥。
以上步骤参见附
图1，图中1为空隙性固体载体；2为含有药物的胶体纤维复合物。
本方法在体外细胞培养实验中，发现中空骨释放骨形成蛋白较实心骨慢，说明本发明设计的中空结构有利于骨形成蛋白的保留。
在动物实验中，将制备好的骨形成蛋白/胶原明胶复合物/异体骨复合物，将异体骨无中空结构其他含同样成分的复合物作为对照以异体骨(固体载体)，胶原和明胶(胶体载体)与骨形成蛋白各5个，一起植入兔脊柱两侧，分别于2、4周处死，2周4个样本，4周6个样本。结果2周时实心结构释放骨形成蛋白较空心快，ALP活性高，但是到4周时，空心结构仍缓慢释放骨形成蛋白，ALP的活性高于实心结构，ALP的活性下降比较平缓，说明骨形成蛋白的释放是缓慢而持续的。不象实心结构释放骨形成蛋白，早期太过，而后期则欠缺。
HE切片检查2周时可见实心结构植入物中无细胞长入，而空心结构植入物内有少量软骨、骨细胞生长。
权利要求
1.一种用于骨组织转化生因子载体的制备方法，其特征是将各类固体载体加工成中空的圆柱体，骨形成蛋白等和胶体样载体按特定比例充分混匀后，置入固体载体中孔中，干燥成型。具体步骤为(1)将异体骨制成直径6-10mm，长度3-6mm，中空，内径2-4mm的圆柱体。(2)将制备好的圆柱体用甲醇/氯仿(1∶1)超声洗涤6h，0.6当量盐，15分钟脱钙，3％双氧水6h脱蛋白，制备去抗原骨。(3)将胶原与明胶以1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16比例分别混合加入蒸馏水，涡旋震荡器震荡24h充分混匀，调节PH值7.0，冻干，制备胶原明胶混合物。(4)去抗原异体骨与胶原明胶复合物分别用环氧乙烷消毒备用。(5)无菌操作下，将定量胶原明胶复合物与骨形成蛋白混合，加少量无菌蒸馏水混匀成胶状，置于去抗原骨中孔中，干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在与于所述各类载体包括羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乙烯二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚乙醇酸(polygiycolic acid，PGA)及它们的共聚物；烧结骨、同种异体脱钙骨或脱矿骨基质、冻干骨、脱蛋白骨、重组合异种骨和珊瑚骨等。
全文摘要
本发明公开了一种用于骨组织转化生长因子载体的制备方法，将各类固体载体加工成中空的圆柱体，骨形成蛋白等和胶体样载体按特定比例充分混匀后，置入固体载体中孔中，干燥成型。该方法的特点在于1.骨形成蛋白等从载体中心向周围释放，成骨由中心开始，避免了骨形成蛋白等大量释放到组织中而被降解，在载体及周边形成一个持续的骨形成蛋白等浓度梯度有利于成骨。载体内外成骨完全，进而有利于载体的降解。2.设备要求简单，简便易行。
文档编号A61L27/00GK1463755SQ0212096
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月6日 优先权日2002年6月6日
发明者孙磊, 田伟, 尹大庆, 王戈平, 黄啸原, 陈磊, 高新生, 杰永生, 陶剑峰, 禇黎, 刘竟成 申请人:北京市创伤骨科研究所