一株纳豆芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株纳豆芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 在饲料工业中，蛋白质饲料占有重要的地位，是配合饲料生产过程中补充饲料蛋 白不足必不可少的饲料原料。蛋白质饲料的代表性饲料有植物性饼柏、动物性鱼粉、血粉和 微生物蛋白饲料等。植物性饼柏是饲料行业中最重要的植物性蛋白饲料，其中以大豆饼柏 应用最为广泛，它是一种优质的蛋白质饲料来源，是各种配合饲料中的重要成分。
[0003] 赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，在饲料中添加适量的赖氨酸有利于动物 的生长、改善氨基酸平衡、提高饲料利用率、节约蛋白质资源。在饼柏类饲料中添加限制性 氨基酸，可以替代鱼粉，降低饲料成本，改善肉的品质，添加赖氨酸能改善屠体质量，提 高瘦肉率。
[0004] 近年来，动物性蛋白在逐渐减少，大豆饼柏作为作为较理想的蛋白饲料源而被大 规模使用。大豆柏的粗蛋白含量在30%-40%之间，必需氨基酸比例组成较好，饲料配合中 需添加赖氨酸以增加饲料氨基酸营养的全面性和均衡性。随着微生物在饲料行业上的研宄 深入，微生物菌种在饲料中的应用逐步受到人们的关注。微生物发酵技术在豆柏的研宄已 在国外展开，据国外研宄表明：大豆柏经微生物发酵后，赖氨酸等限制性氨基酸含量明显曾 加，蛋白质的利用率进一步提高，同时增加饲料原料中可以利用的种类，可为幼畜、幼禽和 水产养殖提供优质蛋白来源。
[0005] 纳豆芽孢杆菌是在二十世纪中期被发现并且分离培养出来，它具有很高活性的蛋 白酶、脂肪酶和淀粉酶，能够降解植物性饲料中的某些复杂的碳水化合物，分解蛋白质。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何提高饲料用大豆柏的赖氨酸含量和/或粗蛋 白含量。
[0007] 为解决以上技术问题，本发明提供了一株纳豆芽孢杆菌。
[0008] 本发明所提供的纳豆芽孢杆菌，菌株编号为NF01-6,其在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 10535。
[0009] 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535 菌体杆状，大小 (0. 7-0. 8)umX (I. 5-1. 8)um，运动，鞭毛侧生。革兰氏阳性。内生孢子，具有较强耐热性。芽 孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，生长温度最高为45-55?，最低 为5-20°C。菌落近似圆形，边缘参差不整齐，表面微皱褶，不光滑，不透明。
[0010] 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535 的 16S rDNA序列如 SEQ ID No. 1 所示。
[0011] 为解决以上技术问题，本发明还提供了以纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto) NF01-6CGMCC No. 10535为活性成分的菌剂。
[0012] 所述菌剂具体可为用于发酵植物蛋白饲料的菌剂。
[0013] 所述菌剂具体可由所述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535 和载体组成；所述载体具体可为磷酸钙、稻壳粉、麸皮、米糠、脱脂奶粉、麦芽糊精、蔗糖、甘 油和淀粉中的至少一种。
[0014] 上述纳豆芽孢杆菌或上述菌剂在植物蛋白饲料发酵中的应用以及在制备饲料中 的应用也属于本发明的保护范围。
[0015] 本发明还提供了培养所述纳豆芽孢杆菌的方法。
[0016] 本发明所提供的培养所述纳豆芽孢杆菌的方法，包括将所述纳豆芽孢杆菌在用于 培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
[0017] 本发明还提供了上述菌剂的制备方法。
[0018] 本发明所提供的上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将所述纳豆芽孢杆菌作为 活性成分和所述载体混合，得到所述菌剂。
[0019] 上文中，所述植物蛋白饲料可为大豆柏。
[0020] 含有所述纳豆芽孢杆菌的饲料也属于本发明的保护范围。
[0021] 实验证明，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535发酵含大 豆柏培养基得到的发酵产物的赖氨酸含量和粗蛋白含量比不接菌的对照显著增加：5%豆 柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢 杆菌（Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋白含量比对照分别增加3.626%、 4. 557%和0. 191 %，赖氨酸含量比对照分别增加25. 60%、45. 60%和38. 50%。纳豆芽孢杆 菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535有效地提高了植物蛋白中的赖氨酸含量，提 高了植物性蛋白饲料可利用性，具有较高的实用性和可推广性。本发明在植物性蛋白饲料 应用领域具有广阔的前景。
[0022] 保藏说明
[0023] 菌种名称：纳豆芽孢杆菌
[0024] 拉丁名：Bacillus natto
[0025] 菌株编号：NF01-6
[0026] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0027] 保藏机构简称：CGMCC
[0028] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0029] 保藏日期：2015年2月6日
[0030] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 10535
【具体实施方式】
[0031] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535液体培养基的配制方 法：蛋白胨 5g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，MnSO4 · H2O 5mg，用水定容至 lOOOmL，pH 值为 6. 8-7. 2。
[0033] 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535固体培养基的配制方 法：蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，MnS04.H20 5mg，琼脂22g，用水定容至1000mL，pH值为 6. 8_7. 2〇
[0034] 实施例1、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535的保藏及培养
[0035] 1、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的分离、鉴定和保藏
[0036] 取自然发酵的大豆柏，用平板（蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂22g，用水定 容至100〇1111^口!1值为6.8-7.2)划线分离方法得到纳豆芽孢杆菌（1^(3；[11118 1^1:1:0)即01-6。 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6已于2015年02月06日保藏于中国普通微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10535。
[0037] 2、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535 的斜面培养
[0038] 挑取该菌种，对其用上述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6 CGMCC No. 10535固体培养基进行斜面培养，在32°C下培养40h。
[0039] 3、菌种的液体培养
[0040] 挑取步骤2斜面培养的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535， 将其接种于500mL上述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535液体培养 基中，32 °C恒温摇床220r/min培养30h。
[0041] 4、菌株的鉴定
[0042] 4. 1、形态学鉴定
[0043] 将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的纳豆芽孢杆 菌（Bacillus natto)NF01-6进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿 润度、菌落表面状态（是否平坦、突起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放 射状等）。另一方面，对处于对数生长期的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6,经涂片 染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
[0044] 结果表明纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535菌体杆状，大 小（0. 7-0. 8) μ mX (1. 5-1. 8) μ m，运动，鞭毛侧生。革兰氏阳性。内生孢子，具有较强耐热 性。芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，生长温度最高为45-55?， 最低为5-20°C。菌落近似圆形，边缘参差不整齐，表面微皱褶，不光滑，不透明。
[0045] 4. 2、16S rDNA 序列分析
[0046] 采用菌落PCR方法扩增纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的16S rDNA片段 并克隆测序。结果表明纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6具有SEQ ID No. 1的16S rDNA片段序列。
[0047] 4. 3、生理生化特征鉴定
[0048] 参考《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京： 科学出版社，2011.)和《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Second Edition Volume Three》测定纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的生理生化特征。
[0049] 结果表明纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6好氧生长；接触酶阳性；V-P反 应阳性；利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖和木糖；水解淀粉、酪素；明胶液化；利用柠檬 酸盐；可还原硝酸盐；不利用尿素。
[0050] 鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列分析结果，将纳豆芽孢杆菌 (Bacillus natto)NF01_