6 鉴定为纳豆芽抱杆菌（Bacillus natto)。
[0051] 实施例2、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6的固体发酵培养
[0052] 1.发酵菌种活化：
[0053] 将冷冻干燥保藏的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6菌种在培养基（蛋白 胨 5g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，MnSO4^H2O 5mg，蒸馏水 1000ml，pH 值为 6. 8-7. 2,琼脂粉 22g， 121°〇灭菌3〇11^11)固体斜面划线转接，32°〇培养4011。
[0054] 2.种子液制备：
[0055] 将活化的一支斜面上的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6全部接种于装有 100mL液体种子培养基（蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，MnS04，H20 5mg，121°C灭菌30min) 的500ml三角瓶中，置220rpm摇床，32°C，培养30h，种子液制备完毕。
[0056] 3.配制固体发酵培养基：
[0057] 配制如下四种固体发酵培养基：100%麦麸固体发酵培养基、5%豆柏固体发酵培 养基、10 % S柏固体发酵培养基、15 % S柏固体发酵培养基。
[0058] 100%麦麸固体发酵培养基的配制方法如下：1000g小麦麦麸、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg (NH4)2SO4,用石灰水调pH值为7. 0,使含水量为35% (质量百分含量）， 装入可灭菌的袋子，121°C灭菌40min。灭菌结束后冷却，得到100%麦麸固体发酵培养基。
[0059] 5%豆柏固体发酵培养基的配制方法如下：950g小麦麦麸、50g大豆柏、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg(NH4)2SO4,用石灰水调pH值为7.0,使含水量为35% (质量百分含 量），装入可灭菌的袋子，121°0灭菌4〇11^11。灭菌结束后冷却，得到5%豆柏固体发酵培养 基。
[0060] 10%豆柏固体发酵培养基的配制方法如下：900g小麦麦麸、100g大豆柏、2g K 2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg (NH4)2SO4,用石灰水调 pH 值为 7.0,使含水量为 35% (质量 百分含量），装入可灭菌的袋子，121°C灭菌40min。灭菌结束后冷却，得到10%豆柏固体发 酵培养基。
[0061] 15%豆柏固体发酵培养基的配制方法如下：850g小麦麦麸、150g大豆柏、2g K 2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg (NH4)2SO4,用石灰水调 pH 值为 7.0,使含水量为 35% (质量 百分含量），装入可灭菌的袋子，121 °C灭菌40min。灭菌结束后冷却，得到15%豆柏固体发 酵培养基。
[0062] 上述四种固体发酵培养基的配制方法中，除石灰水外，其它物料均以干重计。
[0063] 4.固体发酵培养：
[0064] 取步骤2的种子液，分别接入步骤3的100%麦麸固体发酵培养基、5%豆柏固体 发酵培养基、柏固体发酵培养基和柏固体发酵培养基中，接种比例均为10% (体积百分含量），搅拌均匀进行固体发酵培养，在32°C培养72h，得到纳豆芽孢杆菌固体发 酵培养物。实验重复三次，每次重复每种固体培养基设3个菌袋，每个菌袋所装的固体培 养基以干基计为200g。将纳豆芽孢杆菌固体发酵培养物进行菌落计数，换算为以干基计每 g固体培养基所形成的菌落形成单位（有效活菌数）cfu/g，得到纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6产量（简称为NF01-6产量）。其中，以平板稀释计数法进行计数：称取IOg(精 确到〇. Olg)固体发酵产物，放入内装100mL无菌水的三角瓶中，置摇床振荡30min，转速 200r/min。振荡后静置20min制成1 :10的均勾稀释液。采用10倍稀释法稀释。用灭菌吸 管吸取1 :10稀释液5ml，注入含有45ml无菌水的三角瓶中，制成I :100的稀释液，依次制 成10倍递增稀释液。选取三个合适稀释度悬液各取0. lml，加至直径为90mm的培养基平板 上，将菌液均匀涂布。每个稀释度重复三次。放置30°C温度下培养。
[0065] 结果如表1所示，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6接种不同固体发酵培养 基进行发酵后，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6产量比不添加大豆柏的100%麦麸 固体发酵培养基分别平均增长118. 26%、206. 40%和141. 34%，其中10%豆柏固体发酵培 养基的NF01-6产量可达2. 92X 109cfu/g，比对照增加206. 40%，表明本发明的纳豆芽孢杆 菌（Bacillus natto)NF01-6在10%豆柏固体发酵培养基中的产量与100%麦麸固体发酵 培养基相比，显著增加。纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6在各种固体发酵培养基的 芽孢形成率为90%。
[0066] 表1.四种固体发酵培养基的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6产量
[0067]
[0068] 实施例3、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的发酵产物养分测定
[0069] 1.发酵菌种活化：
[0070] 同实施例2步骤1。
[0071] 2.种子液制备：
[0072] 同实施例2步骤2。
[0073] 3.配制固体发酵培养基：
[0074] 按照实施例2步骤三的方法配制5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发酵培 养基和15 % 柏固体发酵培养基。
[0075] 4.固体发酵培养：
[0076] 取步骤2的种子液，分别接入步骤3的5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发 酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基中，接种比例均为10% (体积百分含量），搅拌均匀进 行固体发酵培养，在35°C培养72h，分别得到名称为5%豆柏接菌、10%豆柏接菌和15%豆 柏接菌的纳豆芽孢杆菌固体发酵培养物。同时设置5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固 体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基不接菌的对照，即将5%豆柏固体发酵培养基、 10%豆柏固体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基均在35°C培养72h，分别得到名称为 5 %豆柏CKUO %豆柏CK和15 %豆柏CK的对照发酵产物。实验重复三次，每次重复每种固 体培养基设3个菌袋，每个菌袋所装的固体培养基以干基计为200g。
[0077] 发酵产物依据饲料中粗蛋白测定方法（GB/T 6432-1994)和饲料中氨基酸的测定 方法（GB/T 18246-2000)进行粗蛋白和全谱氨基酸的测定。结果如表2和表3所示，5% 豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢 杆菌（Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋白含量比对照分别增加3.626%、 4. 557%和0· 191 %，赖氨酸含量比对照分别增加25. 60%、45· 60%和38. 50%。其中，10% 豆柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋 白含量为43. 59%，比对照增加4. 557%，赖氨酸含量为2. 65%，比对照增加45. 60%。表明 本发明的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6发酵含有大豆柏的物料，发酵后粗蛋白和 赖氨酸的含量都有提高，特别是赖氨酸含量有显著的增加。
[0078] 表2.不同培养基固体发酵产物粗蛋白含量的测定
[0079]
_〇] 表3.不同培养基固体发酵产物全谱氨基酸的测定
[0081]
[0082]
[0083] 表2中，发酵产物粗蛋白含量是粗蛋白占发酵产物干基（干重）的质量百分含量。 表3中，每种氨基酸的含量是每种氨基酸占发酵产物干基（干重）的质量百分含量。
【主权项】
1. 纳豆芽孢杆菌，其特征在于：所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6,其在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo. 10535。2. -种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌。3. 根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为用于发酵植物蛋白饲料的菌 剂。4. 根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于：所述植物蛋白饲料为大豆柏。5. 权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌、或权利要求2或3或4所述的菌剂在植物蛋白饲 料发酵中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物蛋白饲料为大豆柏。7. 权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌、或权利要求2或3或4所述的菌剂在制备饲料中 的应用。8. 培养权利要求1所述纳豆芽孢杆菌的方法，包括将所述纳豆芽孢杆菌在用于培养芽 孢杆菌的培养基中培养的步骤。9. 权利要求2或3或4所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述纳豆 芽孢杆菌作为活性成分和载体混合，得到所述菌剂。10. 含有权利要求1所述纳豆芽孢杆菌的饲料。
【专利摘要】本发明公开了一株纳豆芽孢杆菌及其应用。该纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.10535。纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NF01-6发酵含大豆粕培养基得到的发酵产物的赖氨酸含量和粗蛋白含量比不接菌的对照显著增加：5％豆粕固体发酵培养基、10％豆粕固体发酵培养基和15％豆粕固体发酵培养基培养纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋白含量比对照分别增加3.626％、4.557％和0.191％，赖氨酸含量比对照分别增加25.60％、45.60％和38.50％。CGMCC No.1053520150206
【IPC分类】C12R1/07, C12N1/20, A23K1/14
【公开号】CN104894027
【申请号】CN201510337233
【发明人】马晓彤, 张晓霞, 顾金刚, 李世贵, 李静梅, 吕运
【申请人】中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月17日