专利名称：微生物、微生物抗病毒产品及其应用的制作方法
发明所属领域本发明属于微生物领域，具体地说，本发明涉及新的微生物，由其获得的抗病毒产品，培养方法及其在抗病毒中的应用。
芽孢杆菌类细菌有11个属100多种，是一类具有众多生物用途的微生物群落，目前在对芽孢杆菌的研究主要集中在用芽孢杆菌生产酶制剂、冶炼金属，以及用芽孢杆菌作杀虫剂、作食品保鲜剂和用于外源基因的表达系统。某些类别的芽孢杆菌抗细菌性疾病的研究已有报道。
发明技术内容本发明的一个目的是提供一种新的微生物，该微生物及其提取物具有抗病毒作用。
本发明的另一个目的是提供一种培养该微生物的方法。
本发明的再一个目的是提供新的微生物及其提取物在抗病毒中的应用。
一种新的微生物，该微生物或其提取物对人体及动物无害，具有广谱抗病毒作用。该微生物为地衣芽孢杆菌类，经菌种鉴定是地衣芽孢杆菌变种(Bacilluslickeniformis)。该微生物从畜禽粪便中分离，通过紫外线诱变，再通过亚硝基胍处理筛选得到，并优选生长稳定，抗病毒力强的菌种命名为CX990C2。
地衣芽孢杆菌CX990C2是一个经长期筛选获得新菌株，生长培养条件为培养基组成以1000毫升体积计，含牛肉膏3～7克，蛋白胨5克～15克，葡萄糖5～15克，NaCl 3～7克。培养基PH值6.6-7.0，培养温度为28℃～35℃。在固体培养基中可加入15～20克琼脂。优选的培养条件为培养基组成为以1000毫升体积计，含牛肉膏5克，蛋白胨1克，葡萄糖10克，NaCl 5克，培养基pH值为6.8，培养温度为32℃，固体培养基可加入20克琼脂。
本发明提供的地衣芽孢杆菌CX990C2具有下列形态学及生理生化特征1)个体形态特征正常菌体长2.2～3.4um，宽0.6～1.0um；形状为椭圆形；革兰氏反应阳性；菌体生长排列以单个为主；芽孢位置为中生；孢囊不膨大。
2)群体形态特征在琼脂平板上菌落呈现下列特征形状不规则；菌落较小；边缘叶裂状；表面质地粗糙有褶皱；光学特征为不透明；颜色为暗腊色；隆起程度是稍隆起；生长速度较慢。
3)液体培养特征有菌膜；菌液呈现较混浊；但无沉淀。
4)生理生化特征
本发明培养的菌种可采用传统的方法浓缩收集，如离心法、冷冻干燥法；本发明培养的菌种提取物也是采用传统的提取方法，如离心去沉淀，上清液浓缩、过滤而得提取物。
在本发明的另一个方面，提供了新的微生物单独制成的饲料添加剂在预防与治疗禽流感病毒性疾病，猪流感病毒性疾病，动物口蹄疫疾病，猪附红细胞体病，猪疾病性腹泻病，草鱼出血性病毒性疾病以及伪狂犬病毒性疾病中的应用。在本发明的一个优选方案中提供了新的微生物也可同其它有益的微生物如光合菌、放线菌、酵母菌、乳酸菌中的一种或多种混合使用，在预防与治疗禽流感病毒性疾病，猪流感病毒性疾病，动物口蹄疫疾病，猪附红细胞体病，猪病毒性腹泻，草鱼出血性病毒性疾病以及伪狂犬病毒性疾病中的应用。
在本发明的另一个方面，提供了新的微生物的提取物单独制成的饲料添加剂在预防与治疗禽流感病毒性疾病，猪流感病毒性疾病，动物口蹄疫疾病，猪附红细胞体病，猪病毒性腹泻，草鱼出血性病毒性疾病以及伪狂犬病毒性疾病中的应用。本发明提供的新的微生物提取物也可同其它有益的微生物如光合菌、乳酸菌等菌种发酵提取物混合使用，在预防与治疗禽流感病毒性疾病，猪流感病毒性疾病，动物口蹄疫疾病，猪附红细胞体病，猪病毒性腹泻，草鱼出血性病毒性疾病以及伪狂犬病毒性疾病中的应用。
在本发明的另一方面，提供了新的微生物单独或与口服液中可接收的载体等制成的口服液在预防与治疗乙型肝炎病毒性疾病，疱疹病毒性疾病，腺病毒性疾病的药品中的应用。本发明提供的新的微生物也可同其它有益微生物如乳酸菌，酪酸梭菌，双歧杆菌等以及口服液中可接收的载体等制成的口服液在预防与治疗乙型肝炎病毒性疾病，疱疹病毒性疾病，腺病毒性疾病的药品中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了新的微生物提取物或与口服液中可接收的载体制成的口服液在预防乙型肝炎病毒性疾病、疱疹病毒性疾病、腺病毒性疾病，流感病毒性疾病的药品中的应用。本发明提供新的微生物提取物也可同其它有益微生物如乳酸菌、酪酸梭菌，双歧杆菌等中的一种或多种提取物以及口服液中可接收的载体等制成的口服液在预防乙型肝炎病毒疾病、疱疹病毒性疾病、腺病毒性疾病，流感病毒疾病的药品中的应用。
从地衣芽孢杆菌CX990C2中获取的提取物单独使用可有效地抑制伪狂犬病毒PRV对猪肾细胞PK15；禽流感病毒AIV对原代鸡成纤维细胞；鱼呼肠孤病毒FRV对草鱼肾细胞GIK；人疱疹病毒I型HSV-1对人宫颈瘤细胞Hela，腺病毒ADV-III对原代肾细胞293的感染，其有效抑制病毒滴度平均在8个TCID50左右。从地衣芽孢杆菌CX990C2中获取的提取物与从其它有益微生物如乳酸菌酵母菌中的提取物混合后，其有效抑制病毒滴度平均在8～10个TCID50左右。用芽孢杆菌单独或混合制备的饲料添加剂饲养动物，与不同添加剂如化学添加剂，抗生素添加剂的实验对照组比，抗病毒感染高出80％以上。
下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如殷震，刘累华主编，科学出版社，1997，动物病毒学；熊宗贵主编，高等教育出版社，1999，生物技术制药；以及沈萍主编，高等教育出版社，1999，微生物学等书中所述的条件，或接照制造厂商所建议的条件。实施例1、抗病毒芽孢杆菌的筛选和获得从1984年开始，从土壤、中草药、污水、畜禽粪便等样品中，分离出100多株芽孢杆菌，通过紫外线诱导，亚硝基胍处理，以抗病毒为目的反复多次筛选，最后选出6株芽孢杆菌，再进行传代培养，优选生长稳定，抗病毒力强的一株新的芽孢杆菌进行菌种鉴定根据实验结果发现本发明获得的芽孢杆菌具有现有的芽孢杆菌不同的特性，是地衣芽孢杆菌变种(Bacillus lickeniformis)，命名为CX990C2。实施例2 抗病毒芽孢杆菌的培养方法培养基成份，以1000毫升计，牛肉膏5克，蛋白胨10克，葡萄糖10克，氯化钠5克，调PH为6.8。固体培养基加琼脂20克，灭菌制成平板，划线接种芽孢杆菌。置30℃，培养24小时，可见典型芽孢杆菌菌落。实施例3 抗病毒芽孢杆菌的培养方法培养其成份，以1000毫升计，牛肉膏5克，蛋白胨10克，葡萄糖10克，NaCl 5克，调PH为7.0。灭菌，接种芽孢杆菌0.5毫升，置28℃，培养36小时，用分光光度计测细菌OD600＝0.8实施例4 地衣芽孢杆菌及其提取物的获得将实施例3中培养的芽孢杆菌3000rmp离心30分钟，收集沉淀即芽孢杆菌的活菌种。取上清用0.22μm膜滤器除菌即得其提取物。实施例5 地衣芽孢杆菌提取物抗伪狂犬病毒在96孔培养板中接种猪肾细胞PK-15，每孔细胞100μl，细胞浓度为5×104个/ml，培养24小时，至细胞40％形成单层。一组接种不同稀释度的伪狂犬病毒PRV；另一组对应接种不同稀释度的伪狂犬病毒和实施例4中获得的芽孢杆菌提取物。吸附24小时，用5％正常维持培养基更换，倒置显微镜下观察细胞病变。一周内，芽孢杆菌提取物可有效抑制8个TCID50伪狂犬病毒。实施例6 地衣芽孢杆菌与乳酸菌、双歧杆菌提取物抗禽流感病毒取13日龄鸡胚，无菌条件下制备鸡胚成纤维细胞，在96孔培养板中接种鸡胚成纤维细胞，每孔100μl，细胞浓度为1×105个/ml，培养24小时至80％形成单层，一组接种不同稀释度的禽流感病毒AIV，另一组对应接种不同稀释度的禽流感病毒AIV与二株菌的混合提取物，吸附24小时，用5％正常维持培养基更换。倒置显微镜下观察细胞病变，在3天内，混合提取物能有效抑制10个TCID50禽流感病毒。实施例7 抗病毒芽孢杆菌作饲料添加剂抗病毒实验将实施例4收集活菌产物用作饲料添加剂饲养10日龄雏鸡，同时设常规饲料对照组。一周后，用禽流感病毒喷雾鸡舍，对雏鸡攻毒，攻毒3天内，对照组雏鸡大量死亡。结果如下 实施例8地衣芽孢杆菌变种和光合细菌，酵母菌、放线菌作饲料添加剂抗鱼呼肠孤病毒将地衣芽孢杆菌变种和光合细菌，酵母菌、放线菌作饲料添加剂饲养草鱼，同时设正常对照组。饲养20天。每池放入人工注射患呼肠孤病毒的草鱼30尾作病毒源，饲养水温控制在32±2℃。十天内，对所有死鱼进行解剖，确认死因，结果如下 实施例9 地衣芽孢杆菌变种提取物地抗乙肝病毒效果。
本发明的地衣芽孢杆菌变种提取物经32例志愿者服用，临床观察。志愿者的选择采取自愿的原则，并选择病史、病情、年龄性别及原治疗方法相当的乙肝病毒患者52例为对照组。实验组与对照组的病例按WHO 1980年制定的乙肝病毒诊断标准确诊的成年乙肝病毒患者，年龄在27-70岁之间，病程半年以上。试验组，在原治疗基础上，停用其它药，服用本发明的提取物；对照组，常规治疗方案，观察其三个月，一个月一个疗程，共三个疗程。服用方法，25毫升/次，日服2次。结果如下表
权利要求
1 一种微生物，其特征在于它是地衣芽孢杆菌变种(Bacillus lickeniformis)，具有抗病毒功能。
2 一种培养权利要求1所述微生物的方法，其特征是培养基组成以1000毫升体积计，含牛肉膏3～7克，蛋白胨5克～15克，NaCl 3～7克，葡萄糖5～15克。培养基PH值6.6-7.0，培养温度为28℃～35℃。
3 根据权利要求2所述的方法，其特征是培养基组成为以1000毫升体积计，含牛肉膏5克，蛋白胨10克，NaCl 5克，葡萄糖10克，培养基pH值为6.8，培养温度为32℃。
4 一种权利要求1所述微生物单独或同其它有益微生物制成的饲料添加剂在预防与治疗禽流感病毒性疾病，猪流感病毒性疾病，动物口蹄疫疾病，猪附红细胞体病，猪病毒性腹泻，草鱼出血性病毒性疾病以及伪狂犬病毒性疾病中的应用。
5 一种权利要求1所述微生物的提取物单独或同其它有益微生物的提取物制成的饲料添加剂在预防与治疗禽流感病毒性疾病，猪流感病毒性疾病，动物口蹄疫疾病，猪附红细胞体病，猪病毒性腹泻，草鱼出血性病毒性疾病以及伪狂犬病毒性疾病中的应用。
6 一种权利要求1所述微生物单独或同其它有益微生物制成的口服液在预防与治疗乙型肝炎病毒性疾病，疱疹病毒性疾病，腺病毒性疾病的药品中的应用。
7 一种权利要求1所述微生物的提取物单独或同其它有益微生物的提取物制成的口服液在预防与治疗乙型肝炎病毒性疾病，疱疹病毒性疾病，腺病毒性疾病的药品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新的微生物，该微生物是地衣芽孢杆菌类，具有抗病毒活力；本发明还公开了一种培养该微生物的方法，以及由该微生物的活菌单独或同其它有益微生物制成的口服液或饲料添加剂在抗病毒性疾病中应用，和该微生物的提取物单独或同其它有益微生物提取物制成的口服液或饲料添加剂在抗病毒性疾病中应用。
文档编号A61P31/00GK1470631SQ02138818
公开日2004年1月28日 申请日期2002年7月23日 优先权日2002年7月23日
发明者苏雄, 苏 雄 申请人:湖北畅响生物工程股份有限公司