末端闭锁的五螺旋蛋白及其用途的制作方法

专利名称：末端闭锁的五螺旋蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，更具体地说，涉及一种末端闭锁的五螺旋蛋白及其用途。该种末端闭锁的五螺旋蛋白可作为HIV膜融合的抑制剂；也可作为药物靶物来筛选小分子抑制剂；以及作为结构明确并有完整抗原决定部位的免疫原来开发疫苗。
HIV和Ebola等包膜蛋白病毒感染细胞的首要步骤为病毒粘附到宿主细胞及病毒与细胞膜融合。该首要步骤由病毒表面的包膜糖蛋白调节。包括HIV的gp41及Ebola病毒的GP2在内的这些包膜糖蛋白也被称为融合蛋白，它们对膜融合至关重要。融合蛋白的外部通常为由三个相同亚基组成的棒状α-螺旋三聚体。该三聚体的每个亚基都为一个内多肽及一个外多肽的一部分，这三个亚基形成一个六螺旋束。该六螺旋束的核心为一个由N-α-螺旋组成的平行三股α-螺旋绕线。该核心的外层由三个C-α-螺旋的外层反平行地包绕。这一结构特征为许多包膜病毒的融合调节糖蛋白所共有，例如HIV的gp41亚基，Ebola病毒的GP2亚基，流感病毒的HA2亚基，SV5副黏液病毒的F1亚基，以及MuMoLV、HTLV和SIV等逆病毒的TM亚基。上述所有病毒的融合糖蛋白都形成棒状α-螺旋束(详见综述-Skehel and Wiley，Cell95，871，1998)。
当HIV感染细胞时，HIV的gp41发生下述构象改变gp41的N-螺旋区插入细胞膜，而gp41 C-螺旋区仍在病毒包膜中。通过这种重新安排，gp41将细胞膜和病毒包膜联接到一起，从而使融合这一HIV感染的首要步骤成为可能。因此，科学家们相信阻遏gp41的膜融合功能将抑制HIV感染宿主细胞。
为了阻遏gp41的膜融合功能，科学家们已采取了许多策略。其手段之一就是集中发展相应于gp41C-螺旋区的C-多肽，并以此作为潜在的膜融合抑制剂(Jiang，S.，et al.，Nature365，113，1993，Wild，C.T.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，9770，1994)。据建议，这些C-多肽以支配性否定的方式与gp41的N-多肽区相结合，从而抑制膜融合。作为C-多肽之一的T-20目前正在临床试验中，并在艾滋病人中显示出抗病毒活性(Kilby，J.M.，et al.，Nature Med.4，1302，1998)。然而，如想采用基因工程技术来生产，C-多肽又太短，工业化生产将很困难。此外，C-多肽在人体内很容易水解失效。因此，用C-多肽作为融合抑制剂面临着稳定性和产业化的双重挑战。另一方面，相应于gp41 N-螺旋区的N-多肽不仅存在着同样的稳定性和产业化问题，而且还有溶解度的障碍。如想发展小分子抑制剂，作为药物靶物，C-多肽及N-多肽都因无明确结构而无实用价值。
因此，有必要发展稳定性好的可溶性蛋白，以实现下述目的1)作为阻遏膜融合的抑制剂；2)作为药物靶物来筛选小分子抑制剂；3)作为结构明确并有完整抗原决定部位的免疫原来开发疫苗。
本发明的技术方案如下。
(1)一种末端闭锁的五螺旋蛋白，它由HIV gp41蛋白的三个N-螺旋和两个C-螺旋，以及四个内部接链和一或两个末端接链所组成；这些内部接链将五个螺旋连接在一起，并且连接在某个螺旋的末端接链又与上述四个内部接链中的一个内部接链形成交链。
(2)如技术方案(1)所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其中，它的组成如下(从N-到C-)一个N-末端接链，第一个N-螺旋，第一个内部接链，第一个C-螺旋，第二个内部接链，第二个N-螺旋，第三个内部接链，第二个C-螺旋，第四个内部接链，第三个N-螺旋，以及一个C-末端接链；其中，N-末端接链与第二个或第四个内部接链形成交链，并且C-末端接链与第一个或第三个内部接链形成交链。
(3)如技术方案(2)所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其中，它的末端接链和内部接链均由氨基酸残基组成。
(4)如技术方案(3)所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其中，它的末端接链和内部接链的交链是通过氨基酸残基侧链的相互作用而成。
(5)如技术方案(4)所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其中，它的末端接链和内部接链的交链的相互作用是通过共价健而成。
(6)如技术方案(5)所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其中，它的末端接链和内部接链的交链的共价健是二硫键。
(7)如技术方案(1)所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其中，它的组成如下(从N-到C-)第一个N-螺旋，第一个内部接链，第一个C-螺旋，第二个内部接链，第二个N-螺旋，第三个内部接链，第二个C-螺旋，第四个内部接链，第三个N-螺旋，以及一个C-末端接链；其中，C-末端接链与第一个或第三个内部接链形成交链。
(8)如技术方案(1)所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其中，它的组成如下(从N-到C-)一个N-末端接链，第一个N-螺旋，第一个内部接链，第一个C-螺旋，第二个内部接链，第二个N-螺旋，第三个内部接链，第二个C-螺旋，第四个内部接链，第三个N-螺旋；其中，N-末端接链与第二个或第四个内部接链形成交链。
(9)一种末端闭锁的五螺旋蛋白，其中，它具有的序列编码为SEQID NO.1。
(10)技术方案(1)至(9)的任一项所述的末端闭锁的五螺旋蛋白用于制造针对HIV病毒、流感病毒、Ebola病毒、SV5副粘液病毒以及MuMoLV逆病毒、HTLV逆病毒和SIV逆病毒中任一种病毒的抗病毒疫苗或抗病毒化合物的用途。
本发明还提供了将本发明的末端闭锁的五螺旋蛋白用于制成治疗HIV感染的针剂、口服剂、直肠给药剂和皮肤吸收剂型制剂的用途。下面说明药物制剂、剂量和给药形式。首先说明药用组合物。
本发明的抗病毒的末端闭锁的五螺旋蛋白和至少一种其它治疗剂的药用组合物，可用于治疗或预防人或非人的病毒性感染。本发明的所述的联合用药可产生加合/协同效果。
优选药用组合物含有末端闭锁的五螺旋蛋白，并含有至少一种其它抗病毒剂如逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、mRNA加工的抑制剂、蛋白糖基化抑制剂、病毒吸附剂、CD4受体阻断剂、趋化因子受体抑制剂、中和性抗体、整合酶抑制剂及其它融合抑制剂。这类治疗剂包括(但不限于)核苷类似物或链终止剂；趋化因子受体抑制剂AMD-3100(Tremblay，C.L.etal.，2000，艾滋病杂志(J.AIDS)125(2)99-10)。
在本发明范围内，可与末端闭锁的五螺旋蛋白联合使用的其它治疗剂包括(但不限于)2-脱氧-D-葡萄糖(2dGlc)、脱氧野尻霉素无环乌苷、病毒唑(virazole)、利福平(rifadin)，金刚烷胺、利福布丁(rifabutine)，更普洛韦(ganciclover、DHPG)、法昔洛韦(Famciclover)、布普洛韦(Buciclover、DHBG)、氟化碘化阿糖胞胞嘧啶(fluoroiodoaracytosine)、碘苷、三氟胸腺嘧啶核苷、阿糖腺苷(ara-A)、ara-AMP、溴乙烯基去氧尿苷、溴乙烯阿糖尿嘧啶(BV-arau)、l-b-D-阿糖呋喃糖苷-E-5-[2-溴乙烯基]尿嘧啶、金刚乙胺，羟基脲，苯乙庚二酮、二芳基脒、(S)-(对硝基苄基)-6-硫代肌苷和膦酰基甲酸盐。本发明包括含有末端闭锁的五螺旋蛋白和任何上述其它化合物的药用组合物。
本发明的末端闭锁的五螺旋蛋白用作预防性疫苗的实施方案包括给予宿主一定浓度的有效末端闭锁的五螺旋蛋白以产生足够中和HIV的免疫应答，如抑制HIV感染细胞的能力。可使用该领域内普通技术人员熟知的标准技术来测定免疫应答的产生。用作疫苗的末端闭锁的五螺旋蛋白通常肌注给药。
为增强免疫应答，所述的末端闭锁的五螺旋蛋白可和适当的添加剂配在一起。这类添加剂包括(但不限于)矿物质凝胶如氢氧化铝；表面活性物质如溶血卵磷脂；Puronic多元醇，聚阴离子；油乳剂；以及其它潜在的人用添加剂如卡介苗(BCG)和小棒状杆菌。给予所述疫苗制剂的途径包括(但不限于)口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉、皮下和鼻内。
下面说明末端闭锁的五螺旋蛋白的剂量。
在治疗急性病毒感染的哺乳动物(包括人)时，须给予足以抑制病毒复制的有效量的末端闭锁的五螺旋蛋白。给予本发明的有效剂量可用该领域内技术人员所周知的方法来确定，如设置生物半衰期，生物利用率及毒性等参数。例如，可按约每天0.2-10.0mg/kg的剂量输注末端闭锁的五螺旋蛋白，持续4～52周。优选剂量为2mg～50mg/天。最优选的剂量约为5mg-10mg/天；大约持续52周。末端闭锁的五螺旋蛋白的给药间隔约为每两天一次到每天四次，最好是每天1-2次。最佳剂量是使末端闭锁的五螺旋蛋白的血浆峰浓度达到1mg/ml-10mg/ml。可先用适宜缓冲盐水配制20％的末端闭锁的五螺旋蛋白无菌注射液，连续输注，再通过HPLC测血浓度，再确定所用末端闭锁的五螺旋蛋白的量是否可以维持所需的血浓度。
与末端闭锁的五螺旋蛋白联合使用的治疗剂(如抗病毒剂)的有效剂量的确定以该领域技术人员所熟知的各种抗病毒剂的推荐剂量为基础。联合用药的剂量优选比文献所推荐的单独应用的剂量约低10-50％。医护人员须注意出现毒性反应的剂量。当出现骨髓、肝、肾功能不全或严重药物相互作用时，医生应知道如何终止及何时终止、及时中断或调整药物至较低剂量。反之，如未达到临床治疗效果，医生也应知道如何提高剂量。
有效治疗剂量指该组合物足以改善病人症状或延长病人存活期的用量。这类化合物的毒性和治疗效果可按标准药学程序经细胞培养或动物实验来确定。如确定半数致死量LD50(实验群体中有50％致死的剂量)和半数有效量ED50(实验群体中50％达到治疗效果的剂量)。毒性和治疗有效剂量的比率叫做治疗指数，可用LD50/ED50的比率来表示。治疗指数越大的化合物越好。从细胞实验和动物实验获得的数据可推测人的剂量范围。这类化合物的剂量最好在一定血药浓度范围内，即包括ED50且无毒性或毒性很低，然后再根据所采用的剂型和给药途径来调整剂量。从这些资料可以较精确地确定人的使用剂量。血浆中的药物浓度可用高效液相色谱(HPLC)来测定。
下面说明药物制剂和给药途径。
将含有末端闭锁的五螺旋蛋白的药用组合物直接给予病人，或将含有末端闭锁的五螺旋蛋白的药用组合物与适宜的载体或赋形剂混合，以达到治疗病毒感染、特别是HIV感染的剂量。本申请的化合物制剂和给药技术为本领域技术人员所熟知。
本发明的抗病毒活性可表现出一种亚型特异性，即特异的蛋白仅对特异性的病毒有抑制作用。本发明对HIV-1最敏感，这种优点可体现在诊断试剂领域。如可利用本发明的抗HIV-1特异性来鉴别某一病毒分离株的类型(HIV-1或HIV-2)。例如在末端闭锁的五螺旋蛋白存在的条件下，用一未知病毒株感染所分离的未感染的CD4+细胞，然后继续培养。并对细胞上清液的逆转录病毒活性进行测定。如果逆转录病毒活性几乎完全被抑制，则该病毒分离株含HIV-1。如果病毒活性未被抑制或仅有少量抑制，该病毒分离株可能不含HIV-1。
本发明还包括使用药学上可接受的载体，按本文公开的和/或药用组合物配制成适宜的剂型，用于全身给药。正确地选用载体和适当的生产工艺，可使本发明的组合物，特别是配成溶液的组合物通过胃肠外途径给药，包括(但不限于)静脉注射。所述的化合物还可采用该领域熟知的并且药学上可接受的载体配成适宜于口服给药的剂型。这类载体能将本发明的化合物配制成片、丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、淤浆和混悬等剂型。
本发明及上述药用组合物可用本领域技术人员所熟知的途径给药。给药途径可包括口腔、直肠、透膜或肠道给药；胃肠外给药包括肌内、皮下、髓内注射、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射；透皮、局部用药、阴道用药等。剂型包括(但不限于)片剂、锭剂、散剂、悬浮剂、栓剂、溶液、胶囊、霜剂、贴剂、微泵剂。
为了方便起见，本发明涉及的药用组合物可使用一种或多种生理学可接受的载体，并以常规方式配制成药学上可接受的任何制剂。本发明涉及的药用组合物可含一种或多种赋形剂和便于加工活性化合物的辅助剂。合适的制剂取决于所选的给药途径。为了方便注射，可将本发明的治疗剂配成水溶液，如生理盐水。对透膜给药，制剂中应使用利于透过屏障的渗透剂，这些渗透剂是该领域内普遍熟知的。
本发明涉及的蛋白及其药用组合物的口服制剂可用固体赋形剂磨碎成均匀的混合物，再加工成颗粒，必要时加入适宜的辅助剂，制成片剂或糖衣片的片芯。适宜的赋形剂及填料如糖；包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制品剂如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄耆胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果必要，可以加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或藻酸或其盐类如藻酸钠。糖衣片芯应提供适当包衣。可采用浓缩糖溶液，溶液中可含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、硝基纤维素溶液及适当的有机溶剂或溶剂混合物。为了区别或标示活性化合物，可将不同组合的染料或食用色素加到片剂或糖衣片的包衣中。
用于口服的药用组合物包括由明胶制成的装填式胶囊，以及由明胶和一种增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。装填式胶囊含有填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石或硬脂酸盐。也可用稳定剂来稳定活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于适当的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液状聚乙二醇。此外，还可加入稳定剂。口服的所有制剂都应是方便病人服用的合适剂型。对于口腔给药而言，所述组合物可采用片剂或锭剂等方便的形式配制。
对于吸入给药，本发明使用的化合物可用气雾剂喷射的形式很方便地释放出来。可通过高压包或喷雾器，或使用某种合适的抛射剂如二氯二氟甲烷，三氯氟代甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它适合的气体来实现。在高压气雾剂的情况下，剂量单位可通过一个阀的计量释放来确定。用作吸入器或吹气器的明胶胶囊和药筒可制成含有所述的蛋白和一种合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的混合物。
可将所述的蛋白配制成便于胃肠外给药的剂型，如注射，包括集合药团注射或连续静脉滴注。便于注射的制剂可包装成单位剂量形式，如安瓶。多剂量的制剂可包装成单位剂多剂量的制剂可包装成单位剂量形式，如安瓶或多剂量容器，并加入保存剂。所述组合物也可采用混悬液、溶液或以油或水为介质的乳剂形式，且可含有一定的配方剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给药的药用组合物包括活性物质的水溶液，即水溶形式。活性物质的悬浮液也可制成适宜的油状注射悬浮液。合适的亲油溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油、或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。所述悬浮液也可选择性地包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度的物质，以制备高浓度的溶液。粉针剂的活性成分可与适当的溶媒，如无菌去热源注射用水配合，然后使用。
所述的化合物也可配制成直肠给药制剂如栓剂或滞留灌肠剂。可用常规基质如可可脂或其它甘油酯配制。
除了已描述过的制剂外，还可将所述的蛋白或药用组合物配成长效制剂。这种长效制剂可采用皮下或肌肉植入法或肌注给药。因此，所述蛋白及其衍生物或药用组合物可用合适的聚合物或疏水物质(如油乳剂)或离子交换树脂、或微溶的衍生物如微溶盐来配制。
本发明的疏水化合物的药物载体为含苄醇，非极性表面活性剂，与水混溶的有机聚合物和水相的共溶体系。该共溶体系可为VPD共溶体系。VPD是一种由3％(重量/容量W/V)苄醇溶液，8％(W/V)的非极性表面活性剂多乙氧基醚，及65％(W/V)的聚乙二醇300在无水乙醇中组成的溶液。而VPD共溶体系(VPD5W)由1∶1稀释的VPD与5％的葡萄糖在水溶液中配成。这种共溶体系能较好地溶解疏水性化合物，而体系本身对全身给药的毒性很低。在不破坏其溶解度和毒性的情况下，共溶体系的比例可有较大的变化。而且，共溶成分的同一性也可以变化，如可用其它低毒性的非极性表面活性剂来取代多乙氧基醚；聚乙二醇的所占比例也可改变；其它生物相容的聚合物也可取代聚乙二醇，如聚乙烯吡咯烷酮；其它糖或多糖可代替葡萄糖。
所述的药用组合物也可包括适当的固相或凝胶相载体式赋形剂。这类载体或赋形剂包括(但不限于)碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶及聚合物如聚乙二醇。适于本发明的药用组合物也包括为达到治疗目的所用的有效量的活性成分的组合物。有效量的确定方法为本领域技术人员所熟知。
与本领域的同类现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.稳定性好，因此有效作用的时间长，从而可以减少用药次数；
2.对病毒融合作用的抑制效果好，因此可以减少单次用药的剂量；3.既可作为HIV膜融合的抑制剂；也可作为药物靶物来筛选小分子抑制剂；以及作为结构明确并有完整抗原决定部位的免疫原来开发疫苗。
对附图的简要说明

图1a与1b表示五螺旋蛋白的设计与结构。图1a是五螺旋蛋白的设计草图。核心部分有3个N-螺旋(内层)和2个C-螺旋(外层)，由4个内部接链结合在一起。图1b是五螺旋蛋白的仰视、侧视和俯视图。虚线标明了缺失天然HIV gp41的第三个C-螺旋部位。缺失的C-螺旋暴露了α-螺旋束的内核上的结合部位。因而使五螺旋蛋白具有模拟HIV gp41内核的功能。
图2表示末端闭锁的五螺旋蛋白的设计草图。该图显示引进了位于五螺旋蛋白每端的两个半胱氨酸，其中一对来自于N-末端和第二内部接链，另一对来自于C-末端和第三内部接链。
图3表示末端闭锁的五螺旋蛋白从Superdex-75色谱分离柱洗脱的特征峰图。其分子量为23.4k道尔顿，并表明末端闭锁的五螺旋蛋白可溶。分子量与洗脱峰(13.2ml)的一致性表明末端闭锁的五螺旋蛋白可再折叠。
图4表示末端闭锁的五螺旋蛋白的二向色性图谱(CD图谱)。图示其具有典型的α-螺旋结构的CD图谱，且表明末端闭锁的五螺旋蛋白呈正确的再折叠。
图5a与5b表示末端闭锁的五螺旋蛋白与天然gp41(N36C34)的稳定性比较。图5a是天然型gp41(N36C34)在PBS溶液中的熔融曲线，熔点仅53℃。图5b是末端闭锁的五螺旋蛋白在3M GuHCl的PBS溶液中的熔融曲线，熔点为69℃。
图6表示末端闭锁的五螺旋蛋白对HIV病毒感染的抑制活性。据病毒-细胞融合分析，从HXB2(CXCR4)衍生的末端闭锁的五螺旋对HIV JRFL(CCR5)病毒的50％抑制浓度(EC50)为0.75nM，而对HIV HXB2病毒的50％抑制浓度(EC50)为15.03nM。证明末端闭锁的五螺旋蛋白对HIV病毒感染的抑制活性是广谱的。
下面结合附图详细地描述本发明。
除C-多肽外，融合蛋白的内核对开发抑制剂和药物靶物也是非常有吸引力的候选者(Wild，C.T.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，10537，1992)。当gp41的N-多肽与其C-多肽区结合时，N-多肽也应能抑制膜融合。然而，如果在结构的外部无外层多肽(C-多肽区)，仅由三个内部多肽(N-多肽区)形成的内核本身通常既不稳定，也不易溶解。为此，用N-多肽发展融合抑制剂或药物靶物的难度相当大。
为了获得稳定易溶的融合蛋白内核，本发明人设计了一个由三个内部多肽(N-多肽)和两个外部多肽(C-多肽)组成并由接链结合的五螺旋束(见图1a)。此蛋白被称为五螺旋蛋白。这个五螺旋蛋白具有与天然gp41同样的内核(都由三个N-螺旋组成)，但仅有两个C-螺旋，因此在gp41的C-螺旋部位产生了一个空位点(见图1b)。五螺旋蛋白上的这个空位点对gp41 C-螺旋具有高亲和力。为此，发明人建议这个五螺旋蛋白可能有许多不同的用途，包括作为膜融合抑制剂，HIV疫苗以及筛选其它抑制剂的工具。
五螺旋蛋白的初步分析数据提示虽然它本身比N-螺旋稳定，但对许多想要开发的用途来说，五螺旋蛋白还不够稳定。由于其N-末端和C-末端仍然开放，此五螺旋蛋白可能容易松开并失去其构象。该构象的必要性不仅在于与gp41的C-区结合，还体现在与小分子抑制剂结合及激发抗HIV感染的中和性抗体等其它方面。因此，本发明人推理如果五螺旋蛋白的两端都被闭锁，其稳定性和溶解度都将大大改善，从而使其更适于上述提议的用途。
本发明提供了一个末端闭锁的五螺旋蛋白，该蛋白的组成为HIVgp41的三个N-螺旋和两个C-螺旋，以及四个内部接链和一或两个末端接链；这些螺旋由内部接链结合在一起，并由一个末端接链结合到一个螺旋上，该末端接链能与四个内部接链中的一个形成交链。
上文所述的“N-螺旋”和“C-螺旋”分别指多肽序列相应于HIV gp41亚基的N-多肽部分和C-多肽部分。
上文所述的“五螺旋蛋白”指通过基因工程产生的蛋白，它包括三个N-螺旋和两个C-螺旋，并通过内部接链连在一起。
上文所述的“末端闭锁的五螺旋蛋白”指由一或两个末端接链连接的五螺旋蛋白；该末端接链又与其中一个内部接链交叉结合在一起。该五螺旋蛋白的闭锁可以发生在任何一端或双端。
蛋白是由一些氨基酸经肽键联接而成的，肽键则是通过一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基反应形成的。如上所述，“交链”指非肽键的其它化学键。这些化学键可以是共价键、离子键或具有类似强度的其它键。
上文所述的“内部接链”指联接两个螺旋(最好是N-螺旋和C-螺旋)的接链。
上文所述的“末端接链”指仅仅联接一个螺旋(最好是N-螺旋)并能与其中一个内部接链交叉联接的接链。
只要可以保留末端闭锁的五螺旋蛋白的构象并形成内部接链和末端接链之间交链，不论是内部接链还是末端接链都可具有任意长度或组成。接链最好是由氨基酸残基组成。
只要保留与HIV gp41蛋白与C-多肽区结构互补的表面(最好是能与C-多肽区结合)，此末端闭锁的五螺旋蛋白的氨基酸序列可被改变。为进一步增加此蛋白的稳定性和水溶性，改变序列也许有必要。
在本发明所首选的具体表述中，此五螺旋蛋白的组成如下(从N-到C-)一个N-末端接链，第一个N-螺旋，第一个内部接链，第一个C-螺旋，第二个内部接链，第二个N-螺旋，第三个内部接链，第二个C-螺旋，第四个内部接链，第三个N-螺旋，以及一个C-末端接链；其中N-末端接链与第二个或第四个内部接链形成交链，并且C-末端接链与第一个或第三个内部接链形成交链。
在本发明所首选的具体表述中，两个末端接链均由氨基酸残基组成。这些接链的长度可从一个氨基酸残基到几个氨基酸残基不等，但最好多于一个氨基酸。换言之，这些接链最好是多肽。末端接链的长度应随着与之交链的内部接链的长度而改变。内部接链和末端接链的长度应长到可在接链间形成化学键并能保持五螺旋蛋白构象的程度。另一方面，这些接链还应短至能以反向方式”锁住”N-多肽和C-多肽的程度。如果这些接链太长，交链将不能防止N-多肽和C-多肽的解聚。
根据本发明首选的具体表述，该五螺旋蛋白的末端接链通过氨基酸残基侧链的相互作用与内部接链交链。被交链的氨基酸残基可为末端接链或内部接链中任何位置的氨基酸残基。但更为理想的是，内部接链被交链的氨基酸残基应位于内部接链的中间，而末端接链被交链的氨基酸残基最好是末端氨基酸残基。末端接链及其相应的内部接链应至少有一个能形成侧链交链的氨基酸残基。
交链也能在内部接链中的氨基酸残基侧链与末端接链中的末端氨基酸的α-羧基或α-氨基之间形成。
根据本发明首选的进一步具体表述，此末端闭锁的五螺旋蛋白的末端接链通过一个共价键与内部接链形成交链。
根据本发明首选的最佳具体表述，五螺旋蛋白的末端接链通过一个很强的共价键——二硫键与内部接链形成交链。在两个半胱氨酸残基的侧链之间形成的二硫键(S-S)是在一个或两个多肽的两个不同片段中的最常见的交链方式。两个半胱氨酸残基的硫醇基(SH)被氧化形成二硫基(S-S)，从而导致两个半胱氨酸残基被联在一起，形成为所谓的胱氨酸(Cys-S-S-Cys)。
二硫键能在一个分子内(即一个单多肽链内)形成，也可在分子间(即两个多肽链之间)形成。分子内二硫键能稳定蛋白的三级结构，而分子间的二硫键则涉及蛋白四级结构的稳定性。二硫键的数量越多，蛋白受洗涤剂、热等其它影响而导致变性的可能性就越小。因此，将一些二硫键引入五螺旋蛋白应能增加其在体内和在体外的稳定性。
二硫键的形成发生在真核细胞的内质网和原核生物的胞质间隙。二巯基硫羟基的取代和二硫键的形成是由硫羟-二巯氧化还原酶催化的。在真核细胞中，此过程由蛋白二硫基同化酶(PDI)所催化；原核生物的催化酶则为dsbA。PDI和dsbA的活性部位与硫基还原酶的活性部位具有结构类似的结构。
氧化是形成二硫键的必要条件。真核细胞的内质网比外周的细胞浆的氧化程度高。这种高氧化环境是靠氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽之间的高比率来维持的。因此，真核细胞的大多数分泌蛋白都有二硫键，而大部分胞浆蛋白则无二硫键。由于缺乏还原势来维持硫原子的还原性，细胞外蛋白中的半胱氨酸残基通常由二硫键交链。因此，末端闭锁的五螺旋蛋白既可用于细胞外的条件，也可用于体外条件。
各种氧化剂如氧(空气)、二甲亚砜、氧化型谷胱甘肽、氰铁酸钾及三氟乙酰铊都曾被用于巯基-二硫基的转化。在体外，半胱氨酸残基的氧化和二硫键的形成可由空气中的氧气来催化。另一方面，虽然二硫键是一种很强的共价键，但它却能被象β-巯基乙醇(HSCH2CH2OH)这样适当的还原剂所破坏。为了抑制纯化中二硫键的形成，可加入抗坏血酸(维生素-C)或二硫赤藓糖醇(DTT)，以防止半胱氨酸被空气中的氧所氧化。因此，可用适当的氧化剂和还原剂来控制五螺旋蛋白中二硫键的形成。
如上所述，基于棒状融合蛋白的结构信息，可以用各种方式在每端引入两个半胱氨酸来使N-末端和C-末端闭锁。半胱氨酸的引入也可通过其它方式来实现，但下述设计更为理想。
如图2所描述，在一个末端闭锁的五螺旋蛋白的顶端，在N-末端接链上的半胱氨酸与第二个内部接链上的半胱氨酸配对。在尾端，C-末端接链的半胱氨酸与第三个内部接链上的半胱氨酸配对。
根据该应用的一种具体表述，此末端闭锁的五螺旋蛋白具有序列编码为SEQ ID NO.1，并如下所示MCGGGSQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQASGGSGGSWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLSGGCGGSQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQASGGCGGSWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLSGGSGGSQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQASGGGC(SEQ ID NO.1)以上是单字码序列，且划线部份代表末端接链和内部接链。
在带有灵活内部接链的每端或一末端的两个半胱氨酸之间的距离应足够近，才能形成以共价键联接的二硫键，从而使末端闭锁。由于内部接链和末端接链的灵活性和长度，二硫键的形成应该不改变蛋白的构象。此外，这些接链的长度不应长至将N-末端和C-末端锁到一起的程度。因此，末端闭锁的五螺旋蛋白束将能保持折叠状态，以便有效地增加其稳定性和水溶性。
要想合成含二硫键的蛋白，可首先用基因工程技术产生含半胱氨酸的序列，然后再将硫醇基氧化形成二硫键。如果只有一对半胱氨酸，二硫键的形成将很简单。如果有一对以上的半胱氨酸，二硫键的形成就变得复杂起来。如果要将五螺旋蛋白的两端闭锁，需要两对半胱氨酸。可按下述方法来避免半胱氨酸的错配。先合成蛋白，再用尿素打开，并用DTT等还原剂来防止半胱氨酸被空气中的氧所氧化。然后除去尿素，进行直接稀释或凝胶过滤。在蛋白被折叠后，两个二硫键就形成了，这是因为在此棒状蛋白每端的每对半胱氨酸都离得很近。如图2所阐明，在五螺旋蛋白正确折叠及接链长度适当的条件下，只能形成所想要的二硫键，蛋白末端也将被正确地闭锁。
Ellman试验可用来测量残留硫醇基的数量，从而监测半胱氨酸的氧化及二硫键形成的程度，反向色谱(RP-HPLC)可用来监测氧化的进度。
可用常规技术来克隆相应于上述设计蛋白的基因编码，并将其以可溶性蛋白或包涵体的形式表达到细菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中。如果以包涵体的形式表达蛋白，可将包涵体溶于8M尿素或6M盐酸胍，加5mM DTT，并通过直接稀释，逐渐透析或凝胶过滤的方法将蛋白重新折叠。只有在正确稳定的蛋白重新折叠后，二硫键才能形成。可加入铁盐来促进蛋白内二硫键的形成。
末端闭锁的五螺旋蛋白内的交链也可以是二硫键之外的共价键。例如，交链可在一个原胶原蛋白分子内发生，两个赖氨酸残基被氧化成醛基赖氨酸，一个醛，然后再缩合成lysinonorleucine(在原胶原蛋白分子的非螺旋N-区形式)。赖氨酸的氧化是由赖氨酰氧化酶催化的。随着赖氨酸被引入末端接链及相应的内部接链，可在适宜的条件下用此交链闭锁并稳定五螺旋蛋白。
半胱氨酸以外的氨基酸残基之间的交链可能不会自发形成。在五螺旋蛋白被合成后，可能要用化学试剂和酶来进一步处理，才能形成交链和末端闭锁的蛋白。
这些重组蛋白可被用于(但不局限于)下述一些方面末端闭锁的五螺旋蛋白可被用作融合抑制剂来阻止病毒入侵。业已证明，末端闭锁的五螺旋蛋白能抑制HIV与宿主细胞膜融合(见实施例3)。由于这些重组蛋白既稳定又可溶，它们本身就能作为候选药物来阻止病毒膜融合。这些蛋白将通过注射途径来给药。
末端闭锁的五螺旋蛋白可被用于疫苗。这些重组蛋白具有象天然病毒融合蛋白那样高度守恒的抗原决定部位。用这些重组蛋白引发的抗体将攻击天然病毒的表面蛋白，从而抵御病毒对宿主细胞的感染。
末端闭锁的五螺旋蛋白也可被用作筛选抗艾滋病药物的工具。这些可溶性重组蛋白还被用作药物靶物来鉴别和设计抑制病毒进入细胞的药物。例如，这些可溶性重组蛋白可被用作高通量分子文库筛选小分子抑制剂的靶物。可以用某种技术产生被标记的HIV gp41的C-多肽(例如在C-多肽的一端进行荧光标记)。通过监测带标记的C-多肽与末端闭锁的五螺旋蛋白之间结合力的干扰程度，可筛选大容量小分子文库，从而发现小分子药物导物。
虽然人类感染丝状病毒、Ebola病毒、Marburg病毒是比较罕见的，但由此引起的出血热与高死亡率有关。基因组测序已鉴别出四个Ebola病毒的亚型，它们分别为Zaire、Sudan、Ivory Coast和Reston。它们的单包膜糖蛋白(GP)被合成为单链前体，并一起被翻译及运转到内质网腔，然后在内质网腔形成三聚体。在翻译之后，它们又被切割成与HIV的gp120和gp41相似的两条链(GP1 and GP2)。GP2融合亚基的外表区域也是具有高度α-螺旋性及棒状构象的三聚体。然而GP2本身的内核并不稳定。设计HIV gp41抑制剂的策略也可被用来设计稳定可溶的GP2抑制剂，因为这些抑制剂的结构与GP2的内核相仿。这些基因工程蛋白也能被用作阻断Ebola病毒的抑制剂，用作引发对抗Ebola病毒感染免疫反应的疫苗，以及用作鉴别和设计抑制Ebola病毒进入细胞的药物的靶物。
上述同样策略也适于下述药物的设计抗流感病毒HA2亚基的药物，抗SV5副黏液病毒的F1亚基的药物，以及MuMoLV、HTLV和SIV等逆病毒的TM亚基。在所有这些情况下，融合糖蛋白都形成一个棒状的α-螺旋束。五螺旋蛋白束的N-末端和C-末端都能闭锁，从而使其稳定可溶，这与通过引入半胱氨酸来形成二硫键来模仿其相应的内核很相似。
下面提供几个实施例来进一步阐明，但这些例证并不旨在限定本发明的范围。
2.蛋白表达编码该末端闭锁的五螺旋蛋白的片段进一步亚克隆至pRSET(Invitrogen)表达载体，并导入大肠杆菌BL21 DE3/pUBS。在LB/氨苄培养基和37°的条件下，当A595＝0.5时，加入0.1mM IPTG，细胞继续在37°下培养3小时。然后在每分钟5000转离心速度下离心15分钟。倒掉上清夜，剩下的沉淀物放在负20°下保存。
3.蛋白打开细菌在PBS溶液中用超声打粹，可溶部分在每分钟6000转(T.45 rotor，Beckman)离心40分钟。包涵体(Inclusion bodies)用PBS/0.5％ TritonX-100洗3次，再用PBS洗1次，然后溶解于8M的尿素和5mM DTT中。稀释该溶液至1mg/ml，加热至100度，保持30分，然后室温置放30分使蛋白完全打开。
4.纯化/再折叠和末端闭锁使用胶透色谱Superdex-75过滤柱(Pharmacia)，用PBS缓冲液，在pH7.0的条件下将蛋白再折叠并纯化。通过胶透色谱，蛋白缓冲液可交换。去掉尿素，蛋白将再折叠。只有当杆状蛋白适当的再折叠，位于末端接链与另一个内部接链之间的双硫键才会自动形成。
色谱分离柱洗脱的特征峰参见图3。峰值出现在13.5毫升，这同基于23.4kD的末端闭锁的五螺旋蛋白分子量而计算出的洗脱体积相一致。这说明末端闭锁的五螺旋蛋白是可溶的，且再折叠结构正确。实施例2 末端闭锁的五螺旋与GP41的稳定性比较末端闭锁的五螺旋蛋白的CD色谱(见图4)是在浓度为1mg/ml，PBS缓冲液，pH7.0的条件下，及20℃和1毫米的小杯里，用带温电控制器的AVIV623DS spectro-polarimeter记录的。它表现了典型的α-螺旋结构的CD谱，这就是预期的末端闭锁的五螺旋蛋白再折叠后的α-螺旋束结构。
热力学稳定性的测定范围在25-95℃，CD的波长222nm，浓度为0.4mg/ml(见图5a和5b)。天然gp41的6个α-螺旋束(N36氨基酸残基35-70；C34氨基酸残基117-150)是在PBS缓冲液，pH7.0的条件下测定的，而末端闭锁的五螺旋蛋白是在PBS缓冲液并含3M GuHCl，pH7.0的条件下测定的。浓度是用色谱OD值为280，消光系数59 580/M/cm条件下确定的。而天然型gp41(N36C34)在PBS溶液中的熔点仅53℃，而末端闭锁的五螺旋蛋白在含3M的GuHCl的PBS溶液中的熔点为69℃，远比天然型gp41的熔点高。所以末端闭锁的五螺旋蛋白比天然型gp41更稳定。这项实验进一步证明末端闭锁的五螺旋蛋白正确地再折叠，并且末端双硫键已形成。实施例3 末端闭锁的五螺旋蛋白对HIV病毒的抑制活性末端闭锁的五螺旋蛋白对HIV病毒的抑制活性是通过HIV荧光素酶鉴定法而确定的。病毒是通过用HIV-1的染色体(含经移码突变env和替代nef基因(NL43LucR-E-)的荧光素酶基因)和含有HXB2或JRFL gp160基因的pCMV-HXB2或PEBB-JRFL表达载体一同转染到293T细胞来产生的。因为染色体上缺少env基因，病毒感染后只能存活一代。细胞残片用低速离心去除。上清液中的病毒用来感染HOS-CD4(HXB2)或者HOS-CD4-CCR5(JRFL)细胞(来自N.Landau，美国NIH艾滋病试剂中心)。感染两天后，裂解细胞，测定荧光素酶的活性。IC50值(半量病毒被抑制的末端闭锁的五螺旋蛋白的浓度)是把数据拟合Langmuir方程式来计算的，[y＝k/(1+[末端闭锁的五螺旋蛋白]/IC50)]，其中y＝荧光素酶的活性，k是定标常数。
为了测定末端闭锁的五螺旋蛋白对gp41介导的细胞膜融合的抑制，我们使用的方法是如上所述的病毒-细胞融合鉴定法(见图6所示)。在病毒-细胞融合鉴定法中，末端闭锁的五螺旋蛋白对HIV HXB2病毒(实三角)的EC50值是15.03+/-1.41nM；而对HIV JRFL病毒(实方型)的EC50值是0.75+/-0.11nM。在治疗艾滋病过程中最主要的问题是由于HIV病毒高突变性而产生的耐药性。我们使用的末端闭锁的五螺旋蛋白源于HIVHXB2(该病毒使用CXCR4为辅助受体)。而末端闭锁的五螺旋蛋白对以CCR5为辅助受体的HIV JRFL的抗病毒活性更强。所以末端闭锁的五螺旋蛋白具有广谱的抗HIV病毒活性。
序列表<110> 周根发<120> 末端闭锁的五螺旋蛋白及其用途<130> PF020076CNI Deng Dingji，Zhongzi Law Office<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 215<212> PRT<213> 人类免疫缺陷病毒<220><221> DISULFID<222> (2)..(215)<223> 与残基87配对的残基2；与残基215配对的残基130<400> 1Met Cys Gly Gly Gly Ser Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln1 5 10 15Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu20 25 30Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly35 40 45Ser Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile50 55 60His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln65 70 75 80Glu Leu Leu Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser Gln Leu Leu Ser Gly Ile85 90 95Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala lle Glu Ala Gln Gln His100 105 110Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Ser Gly115 120 125Gly Cys Gly Gly Ser Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr130 135 140Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu145 150 155 160Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Leu165 170 175Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu180 185190Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu195 200 205Gln Ala Ser Gly Gly Gly Cys210 21权利要求
1.一种末端闭锁的五螺旋蛋白，其特征在于，它由HIV gp41蛋白的三个N-螺旋和两个C-螺旋，以及四个内部接链和一或两个末端接链所组成；这些内部接链将五个螺旋连接在一起，并且连接在某个螺旋的末端接链又与上述四个内部接链中的一个内部接链形成交链。
2.如权利要求1所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其特征在于，它的组成如下一个N-末端接链，第一个N-螺旋，第一个内部接链，第一个C-螺旋，第二个内部接链，第二个N-螺旋，第三个内部接链，第二个C-螺旋，第四个内部接链，第三个N-螺旋，以及一个C-末端接链；其中，N-末端接链与第二个或第四个内部接链形成交链，并且C-末端接链与第一个或第三个内部接链形成交链。
3.如权利要求2所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其特征在于，它的末端接链和内部接链均由氨基酸残基组成。
4.如权利要求3所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其特征在于，它的末端接链和内部接链的交链是通过氨基酸残基侧链的相互作用而成。
5.如权利要求4所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其特征在于，它的末端接链和内部接链的交链的相互作用是通过共价健而成。
6.如权利要求5所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其特征在于，它的末端接链和内部接链的交链的共价健是二硫键。
7.如权利要求1所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其特征在于，它的组成如下第一个N-螺旋，第一个内部接链，第一个C-螺旋，第二个内部接链，第二个N-螺旋，第三个内部接链，第二个C-螺旋，第四个内部接链，第三个N-螺旋，以及一个C-末端接链；其中，C-末端接链与第一个或第三个内部接链形成交链。
8.如权利要求1所述的末端闭锁的五螺旋蛋白，其特征在于，它的组成如下一个N-末端接链，第一个N-螺旋，第一个内部接链，第一个C-螺旋，第二个内部接链，第二个N-螺旋，第三个内部接链，第二个C-螺旋，第四个内部接链，第三个N-螺旋；其中，N-末端接链与第二个或第四个内部接链形成交链。
9.一种末端闭锁的五螺旋蛋白，其特征在于，它具有的序列编码为SEQ ID NO.1。
10.权利要求1至9的任一项所述的末端闭锁的五螺旋蛋白用于制造针对HIV病毒、流感病毒、Ebola病毒、SV5副粘液病毒以及MuMoLV逆病毒、HTLV逆病毒和SIV逆病毒中任一种病毒的抗病毒疫苗或抗病毒化合物的用途。
全文摘要
本发明提供一种末端闭锁的五螺旋蛋白，它由HIV gp41蛋白的三个N－螺旋和两个C－螺旋，以及四个内部接链和一或两个末端接链组成；这些内部接链将五个螺旋连接在一起，并且连接在某个螺旋的末端接链又与上述四个内部接链中的一个内部接链形成交链。并且，该末端闭锁的五螺旋蛋白的序列编码为SEQ ID NO.∶1。本发明可作为HIV膜融合的抑制剂；也可作为药物靶物来筛选小分子抑制剂；以及作为结构明确并具有完整抗原决定部位的免疫原来开发疫苗。
文档编号A61K38/16GK1410448SQ0214600
公开日2003年4月16日 申请日期2002年10月23日 优先权日2002年10月23日
发明者周根发 申请人:周根发