专利名称：降低流体中草酸(盐)浓度的材料和方法
交叉引用一个相关申请本申请要求2001年10月5日提交的美国临时专利申请60/327,544的利益。
背景技术：
草酸(草酸盐)是脊椎动物和许多可食用植物的代谢过程的天然副产物。不幸得很，在相当大的一部分人中草酸盐不能完全降解，这种情况可能导致在那些人中肾结石的形成。据估计所有肾结石的70％是由草酸盐组成。大约12％的美国人将在他们一生的某个时候患肾结石。患肾结石或者具有形成肾结石危险的人以及有脂类吸收不良问题的患者(如口炎性腹泻、胰腺功能不全、炎性肠疾病、肠切除，等)，具有尿草酸盐水平升高的倾向。
在终末期肾病(ESRD)中，草酸盐积累导致高草酸盐血症和继发性草酸盐沉积症(Tomson，C.R.等人，1989，Clin Nephrol 3287-95)。为了提供正常发挥作用的肾的功能，血液透析清除血浆草酸和血浆草酸钙。然而，血液透析治疗不能彻底消除草酸和草酸钙(Marangella等人，1992，Nephron.6074-80)。如果没有血液透析，ERSD和原发性高草酸盐尿(PH)的患者具有更高的患进行性系统性草酸盐沉积症的危险(Hoppe等人，1999，Kidney International 56268-274)。
除了在泌尿道形成结石外，草酸盐在流体中的存在可以在许多情况下成为问题。例如，已被确认在支架和导管上的草酸钙沉积的形成能破坏这些器械行使他们的功能的能力，并且可能是微生物感染形成的一个起作用的因素。同样地，草酸盐沉积的形成也在包括酿造工业的发酵过程中导致下降的效率和损害。
关于本发明的一个实施方案的特别的意义是内置(indwelling)导管和支架上的草酸盐的有害影响。导管和支架在医疗过程中经常使用，这些医疗过程包括，例如尿和腹膜透析流的处理，血液透析，以及激光或碎石术治疗后肾结石的排出。因为壳垢(encrustation)和细菌粘附的发生，增加了器械堵塞和尿路感染(UTI)的危险，在泌尿道中使用长期内置导管和支架具有局限性。
与泌尿器械相关的尿路感染的发病机理经常涉及生物膜的形成。生物膜形成的一个重要步骤是尿的成分以条件膜(conditioning film)的形式在器械上的沉积(Fuse等人，1994，J.Urol.1511703-1706；Tiezer等人，1998，J.UroL.160876-881；Santin等人，1999，Biomaterials，201245-1251)。几个小时内，这层膜就组成妨碍尿液流动的壳垢沉积物。对这种壳垢(encrustation)的生物化学和光学分析已经显示草酸钙的存在。
关于在多种泌尿疾病中支架壳垢发生的流行病学研究已经指出尿石形成是支架壳垢的一个主要危险因素。已经报道在结石形成者中壳垢有相当高的发生率(Keane等人，1994，Br.J.Urol.73687-691；Robert等人，1997，Urol. Int.58100-104)。Keane等人报道58％的支架有壳垢并且支架壳垢发生的主要危险因素是尿石病历史。这显然因为结石形成者的尿中以钙和草酸为主的致结石成分过饱和。尿中草酸浓度是草酸钙饱和的一个最重要的参数。因为尿中每个草酸根离子结合多于10个钙离子，草酸的小量增加导致超过草酸钙过饱和阈值，引起结晶。
因为患者在放置内置医疗器械前通常接受抗生素，正常尿道菌群经常已经被具有尿路病原体药物抗性的善于栖居表面的生物代替。导管或者支架的存在也可以促进细菌上升侵入肾盂和肾组织。一旦器械相关感染形成，他们通常难以治疗并且一般有取出器械的必要。
除了成为感染部位，已经显示许多支架具有不可通行的阻塞(El-faqih等人1991，J.Urol.1461487-1491)。在泌尿道人造材料上的壳垢沉积在感染和无菌的尿液中都会发生。在感染尿液中壳垢的形成机制同尿路结石的形成是相似的产生脲酶的微生物通过尿素水解提高尿液pH，从而产生一个碱性环境，在该环境中镁和钙容易从溶液中沉淀出来形成结晶。
在无菌尿中，生物材料上壳垢的形成看来是取决于尿的组分和人造材料性质(Ramsay JWA 1987，Br.J.Urol.1987，6666-70；Denstedt等人1998，J.Endourol.12493-500)。现在有多种的输尿管支架和输尿管导管。硅氧烷(silicone)是一种高度生物相容的材料并且用于输尿管导管以及输尿管支架的制造。尽管已经有关于开发具有改性表面性质的材料的研究，这些材料没有一个具有壳垢抗性(Tunney等人，1996，Biomaterials，171541-1547)。一些常用的器械是已经特别设计来降低壳垢危险的标准硅氧烷胶乳器械(Sof Flex，Cook Urology，Indiana)，亲水支架(Boston Scientific，MA)和低表面能支架(Lse，Cook Urology，IN)。在西安大略大学(University of Western Ontario)的泌尿科学ESWL中心进行的详尽研究已经记录了在上述常用生物材料上的壳垢和生物膜形成过程(Tiezer等人1998，J.Urol.160876-881；Wollin等人1998，J.Endourol.12101-111；Teizer等人1998，Biomater.43321-330；Reid等人1992，J.Urol.1481592-1594)。
更新的进展之一是在内置医疗器械上使用水凝胶涂层。这些亲水性的聚氨基甲酸酯多聚物和水接触后膨胀并且在他们的多阴离子结构中保留相当大的一部分水。这被认为可以降低摩擦力和支架壳垢。也已经开展关于下述水凝胶的研究，非离子型合成的水凝胶，如聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，聚乙二醇和聚甲氧基-PEG甲基丙烯酸酯，和离子型水凝胶，如交联的聚丙烯酰胺-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物(Kulik E.和Y.Ikada，1996，J.Biomed.Mater.Res.30295-304)。一种连接在血清白蛋白的基于聚乙二醇的水凝胶已经报道是一种适合于酶在生物医学器械上固定的基质(D’Urso EM等1995，Immobil.Biotechnol 23587-595)。
酶的表面固定是在工业和实验室环境下使得酶简单回收和再利用的便利和经济的方法。通过应用多种生物偶联技术，酶已经和底物共价连接。常用底物包括有机材料，例如聚碳酸酯和多糖材料(包括壳多糖)和无机材料，例如石英玻璃。这些底物为了共价连接酶，经常被表面官能化。
因为硅氧烷弹性体具有生物惰性、低摩擦系数和弹性，所以它是在泌尿道导管制造中常用的材料。已经尝试对硅氧烷弹性体表面进行改性，目的是产生具有更高的亲水性(Urban，M.W.，M.T.Stewart，1990，“ATR FT-IR studies of gas plasma modified silicone elastomersurfaces”J Appl Polym Sci.39265-283；Howard I.H.1991，“Surfacemodification of polymers by radio frequency plasma”，博士论文，佛罗里达大学，P76；和Lee，S.D.，G.H.Hsiue，C.Y.Kao，1996，“Preparation and characterization of a homobifunctional siliconerubber membrane grafted with acrylic acid via plasma-induced graftcopolymerization”J.Polym Sci PolChem 34141-148)，官能化的(Mutlu，M.等人，1991，“Matrix surface modification by plasmapolymerization for enzyme immobilization”J.Mater Chem 1447-450；Gaboury，S.R.，M.W.Urban，1993，“Analysis of gas plasma-modifiedpoly-(dimethylsiloxane)elastomer surface-attenuated-total-reflectanceFourier-trahsform infrared-spectroscopy”Adv Chem Ser 777-790；和Rau，K.R.，2000，“Surface modification of biomaterials by pulsed laserablation deposition and plasma/gamma polymerization”博士论文，佛罗里达大学，Gainesville，FL)，或者接枝聚合的(Lee，S.D.，G.H.Hsiue，C.Y.Kao，1996，“Preparation and characterization of ahomobifunctional silicone rubber membrane grafted with acrylic acidvia plasma-induced graft copolymerization’J.Polym Sci Pol Chem34141-148；Lee，S.D.，G.H.Hsiue，C.C.Wang，1994，“Characterization of Plasma-induced graft-polymerization of2-hydroxyethyl methacrylate onto silicone rubber”J.Appl Polym Sci541279-1287；Lee，S.D.等人，1996，“Plasma-induced graftedpolymerization of acrylic acid and subsequent grafting of collagenonto polymer film as biomaterials”Biomaterials 171599-1608；Ksiue，G.H.等人，1998“Surface characterization and biological propertiesstudy of silicone rubber membrane grafted with phospholipid asbiomaterial via plasma induced graft copolymerization”J BiomedMater Res 42134-147和Langefeld，S等人，1999，Functionally adaptedsurfaces on a silicone keratoprosthesis”Int.J.Artif Organs 22235-241)表面。表面改性已经用多种方法实施，包括化学发应、紫外线(UV)照射、γ射线辐射、和射频等离子体放电(RFPD)。RF等离子体放电是不改变主体性质而改变材料表面性质的有用技术，以加强生物相容性，例如蛋白质吸附的改变，或者可以用来提高希望的细胞粘附和在生物材料表面的生长(Lee，S.D.，G.H.Hsiue，C.C.Wang，1994，“Characterization of plasma-induced graft-polymerization of2-hydroxyethyl methacrylate onto silicone rubber”J.Appl Polym Sci541279-1287；Ksiue，G.H.等人，1998“Surface characterization andbiological properties study of silicone rubber membrane grafted withphospholipid as biomaterial via plasma induced graftcopolymerization”J Biomed Mater Res 42134-147；Langefeld，S.等人，1999，“Functionally adapted surfaces on a siliconekeratoprosthesis”Int.J.Artif Organs 22235-241；和Mason，M.等人，2000，“Attachment of hyaluronic acid topolypropylene，polystyrene，and polytetrafluoroethylene”Biomaterials2131-36)。
内置医疗器械开发的许多近期进展集中在防止细菌感染。用抗微生物物质，如重金属、银氧化物和抗生素，涂层或者灌注生物材料可以降低感染的发生率，尤其是对于需要短期器械插入的患者(JohnsonJR等人1990，J.Infect.Dis.1621145-1150；Gilchrist T等人1991，Biomaterials1276-78)正如上面指出的，在流体中草酸盐的存在可以在内置医疗器械以外的情况中引起问题。在发酵工业中，结垢的形成是通过设备上的这些物质的表面沉积1)水不溶的钙和镁的硫酸盐和碳酸盐(矿物质结垢)和2)在正常发酵过程中形成的草酸钙。如果及早处理，器械上结垢的存在不是危险的。然而如果任其发展不制止，可以导致重大的操作问题。
在医疗器械的例子中，结垢标志着微生物危害。结垢的晶体结构给腐败生物(例如片球菌属(Pediococcus)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)提供很大的保护使其免受清洁剂和灭菌剂的作用。其次，结垢形成很大程度上降低了穿过器械表面的热传递。这必然地降低加热和制冷运行效率，将转化为增加的运行时间、降低的生长量和膨胀的能量消耗。第三，结垢尤其对锅炉有害，因为它在锅炉运行的苛刻条件下快速沉积。这种累积能导致锅炉失灵以及可能爆炸。
不幸得很，导致结垢形成的化学反应是发酵过程固有的。例如，结垢是通过许多化学反应形成的，这些化学反应是在整个酿造过程中发生的。一种通常已知为啤酒石的结垢形式，是在混合条件下通过钙和草酸的反应形成的。草酸是大麦的一种有机酸组成。除了形成结垢，草酸钙还与瓶装啤酒的喷出和胶体不稳定相关。
现在酿造厂中有许多种可选择方法来处理结垢。这些包括离子交换、螯合试剂和酸性去垢剂。本发明提供了除去流体系统中的草酸(盐)的一种可供选择的办法。
简要概述本发明提供了降低流体中草酸(盐)(oxalate)浓度的材料和方法。在一个优选的实施方案中，草酸降解酶固定在表面上并且提供了降低与该表面接触流体中的游离草酸的有效方法。此处举例的具体实施方案中，草酸降解酶(oxalate-degrading enzyme)结合在与生物流体接触的表面上。这些表面可能在，例如导管、支架、或透析膜上。
此处描述的另一实施方案中，草酸降解酶连在与发酵过程涉及的流体接触的表面上。这些改性表面因此可以用以降低结垢的发生率。
正如此处所述，草酸降解酶可以涂层在用来生产器械的材料上，目的是有效地原位降解草酸阻止导致壳垢的草酸钙沉淀的起始步骤发生。这个方法可以用以防止器械的阻塞和微生物感染的危险。
在本发明的一个实施方案中，射频等离子体放电(RFPD)用以激活和官能化惰性的硅氧烷弹性体表面。然后表面用3-氨丙基三乙氧基硅烷(AMEO)涂层，使弹性体表面获得胺官能度，提供偶联草酸氧化酶的胺基位点。
详细内容本发明提供了降低在流体中草酸(盐)浓度的材料和方法。这种草酸浓度的降低通过降解草酸或者从流体中除去草酸获得。在一个优选的实施方案中，草酸在生物流体中被降解。此处具体举例的是支架和导管，导管已经改进以降低在周围流体中的草酸浓度从而降低或者消除壳垢。
本发明的另一方面关于透析膜，这些透析膜已经改进以降解草酸(盐)从而降低周围流体中的草酸(盐)浓度并且提高透析过程的效率。
在另一实施方案中，草酸盐在包括发酵培养基的其他流体中降解。在发酵液的情况下的具体举例是酿造过程涉及的流体中草酸的降解。
在本发明的一个优选实施方案中，将与流体接触的表面通过结合草酸降解酶而被改性。依照本发明的改性表面可能用，例如一种聚合材料制造。在一个实施方案中，表面包括硅(氧)橡胶。
本发明使用的方法与用于分析目的的将酶附在表面上是不同的。因此，本发明的方法通过降低在流体中的草酸浓度提供功能上的优势。功能优势可能是，例如降低草酸钙沉积的形成、微生物感染、壳垢、细菌粘附和结垢形成。
酶和表面的结合可能通过，例如，直接连接、通过连接物连接、或者通过掺入表面涂层内的结合。本领域技术人员已知有多种方法使草酸降解酶和目的表面结合。结合方法的主要要求是必须保持酶降解草酸(盐)的能力。所以例如本领域技术人员所知的将酶和人造材料直接相连的方法。另外，酶可以通过连接物和目的表面相连。许多这种连接物为本领域技术人员所知，包括树形聚合物(dendrimer)，例如在美国专利6,080,404号所描述的那些。
在另一个实施方案中，草酸降解化合物可以包埋在涂层内。涂层可能是例如在美国专利5,554,147号；5,607,417和5,788,687中所述的那些涂层。这些专利，此处引用作为参考，也描述了多种这样的试剂，他们可以包埋在器械涂层中并且可以结合本发明的草酸降解酶使用。
尽管在支架和导管的生物材料的改进上正在做显著的研究，但是没有一个目前使用的器械令人满意地降低壳垢的程度。有优势的是，本发明的器械可以用在进行内泌尿科治疗过程的患者群体上。这些器械给那些易于形成草酸盐结石和患晚期恶性梗阻的患者使用是尤其有利的。
硅(氧)橡胶(SR)被用于很多生物医学器械，因为它具有极好的生物相容性，在生理环境内提供弹性和长期机械稳定性。为了防止在泌尿环境下条件膜的快速沉积，水凝胶涂层已经用于SR器械。已经开发了若干技术通过共价接枝多种聚合物用以SR的表面改性(Lee，S等人1996，Journal of Polymer SciencePart APolyymer Chemistry34141-148；De Fife KM等人1999，J.Biomed.Material.Res.44298-307；DiTizio，V等人1998，Biomaterials，191877-1884；Langefeld，S等人1999，Int.J.Art.Organs，22235-241)。SR的表面被活化来提供能够连接可聚合单体的官能团。应用常规的能源可以完成活化，如钴-60、射频或微波气体放电、以及等离子体放电(De FifeKM等人1999，J.Biomed.Material.Res.44298-307)。另外，应用紫外线和氧化还原试剂的光化学反应已经用于化学改性SR表面(DiTizio，V等人1998，Biomaterials 191877-1884)。
用氩等离子体处理，在硅氧烷表面上产生自由基，然后将样品暴露于气体产生官能团，例如用氧气产生过氧化物，和用氨气产生胺基基团。Langefeld等人(Langefeld，S等人1999，Int.J.Art.Organs22235-241)用等离子体处理技术产生表面过氧化氢来起始聚丙烯酸(PAA)和聚甘氨酰甲基丙烯酸酯(polyglycidylmethacrylate)接枝聚合，并且开发了在活化PAA上共价固定纤维粘连蛋白的方法。这种方法用作将草酸降解酶直接共价固定在SR和PAA的水凝胶基质的的手段。
SR也可以用聚乙二醇(PEG)-明胶水凝胶改性。在一个实施方案中，这种涂层可以用来包埋抗生素。可以使用的抗生素的例子包括氟喹诺酮、β—内酰胺、和头孢菌素。抗生素可以包埋在脂质体里。这种抗微生物涂层连同草酸降解酶的结合可以用于处理两种类型的导管壳垢，即，细菌诱导的鸟粪石和磷酸钙沉积，以及非感染环境的草酸钙沉积。
本发明的一个实施方案中，草酸降解酶可以共价结合至射频等离子体表面改性的硅氧烷弹性体。这些表面改性的材料可以用于，比如，防止泌尿生物材料上草酸钙壳垢。草酸降解酶只需要作用于环绕导管表面的微环境以防止草酸钙晶体在表面上形成。另外，通过OXO介导的游离草酸降解产生的H2O2，可以提供在泌尿环境的抗微生物作用。
草酸降解酶主要有三类草酸降解酶。草酸氧化酶表达于高等植物中，并催化氧依赖的氧化反应，将草酸氧化成CO2伴随H2O2的形成。已经建立了从大麦根中获得草酸氧化酶的快速的三步骤纯化方法(Kotsira VP和YD Klonis，1997，Arch.Biochem.Biophys.340239-249)。编码大麦根草酸氧化酶的基因已经克隆、测序和表达(Thompson C等人1995，Euphytica 85169-172)。
草酸脱羧酶，是第二类草酸代谢酶，主要存在于真菌中(Shimazono H.，1955，J.Biochem.42321-340)。真菌草酸脱羧酶催化游离草酸降解为CO2和甲酸。已经报道这种酶存在于数种真菌中，包括疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)，黑曲霉(Aspergillus niger)的某些株，以及白腐病真菌采绒革盖菌(Coriolus versicolor)。编码金针菇(Flammulina velutipes)草酸脱羧酶的基因已经克隆和测序(Mehta A和A.Datta，1991，J.Biol.Chem.26623，548-53；国际专利WO98/42827号)。
用于草酸降解的细菌酶草酰-CoA脱羧酶对CoA激活底物有活性并将其转化为甲酰-CoA。然后甲酰-CoA转移酶作用使甲酸和草酸交换CoA.这些酶已经在草酸降解细菌中进行研究，有存在土壤中的草酸假单孢菌(Pseudomonas oxalaticus)(Qyayle PR等人1961，Biochemical J.78611-615)和存在于包括人类的脊椎动物的胃肠道中的产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)(Allison，M.J等人1985，Arch Microbiol.14147)。已经表明产甲酸草酸杆菌和它的宿主具有共生关系，通过调节草酸在肠中的吸收和血浆中草酸的水平。已经发现这种细菌的缺乏的结果是成为草酸相关疾病的危险因素，如复发性先天草酸钙尿石症(Sidhu，H.等人1999 J.Am.Soc.Neph.10S334-S340；Kleinschmidt，K.等人，1993，InUrolithiasis 2，Plem Press，NY.)和空肠回肠旁路外科手术、囊性纤维化和炎性肠疾病继发的肠源性尿草酸盐过多(Allison，M.J.等人1986，J.Nutr.116455-460；Sidhu，H.等人1998，Lancet 3521026-1029)。这种细菌高度特异性地只利用草酸作为生存生长的能源。结果是草酸降解酶草酰-CoA脱羧酶和甲酰-CoA转移酶占其细胞蛋白的大约20-30％。用于草酸-甲酸交换的蛋白质和膜转运体都已经被纯化和充分的性质测定(Baetz AL和MJ Allison，1989，J.Bact.1712605-2608；Baetz AL和MJ Allison，1990，J.Bact.1723537-3540；Ruan ZS 等人，1992，J.Biol.Chem.26710537-19543)。而且，所有三种蛋白质的基因已经克隆、测序并表达为生物活性重组蛋白质(Abe，K.等人，1996，J.Biol.Chem.2716789-6793；Lung H.Y.等人，1994，J.Bact.1793378-3381；Sidhu，H.等人，1997，J.Bact.1793378-3381)描述多种草酸降解酶和编码这些酶的基因的专利包括美国专利5,912,125、6,090,628和6,214,980号。此处引用这些专利作为参考。
材料和方法硅氧烷弹性体硅氧烷弹性体(MDX4-4210，医用级弹性体，Dow Corning，Midland，MI，supplied by Factor II，Inc.，Lakeside，AZ)依照制造商的操作指南制备.简要地说，通过在有2-mm间隔物分开的丙烯酸板间固化树脂将弹性体铸造成2-mm厚的薄片。使制备好的薄片在室温下固化48个小时。用一种软木塞钻孔工具(Boekel，Feasterville，PA)从固化薄片上割下直径为10-mm的圆盘。圆盘在HPLC级的己烷(Fisher Scientific Co.，Pittsburgh，PA)中萃取48小时来除去未反应的物质。
表面改性射频(RF)等离子体放电体系由钟罩型反应室、样品支架、蒸气入口、有液氮冷阱的真空系统以及RF发生器(RF Plasma Products，Inc.，model HFS 401 S)(在固定频率为13.56MHz、最大输出功率为500w下运行)和匹配网路(使等离子体放电的阻抗同RF发生器协调)组成。硅氧烷弹性体圆盘放置于反应室内，随后送至真空度为40mtorr的真空并且用氩气以1000 standard cm3/min的流速吹洗5次，每次15秒。最后的氩气吹洗点燃形成等离子体，在50 mtorr，50 watts功率下清洗和活化硅氧烷圆盘15分钟。通过针形阀将超纯水蒸气缓慢加入反应室代替等离子体中的氩气(15分钟，50 mtorr，50 watts功率)。等离子体处理后，圆盘用100％乙醇漂洗15分钟，然后与含2％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷(AMEO；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的95％乙醇溶液反应45分钟，用100％乙醇漂洗。圆盘在室温条件留置16-24小时固化。
表面性质测定对等离子体处理过的圆盘表面应用水下俘获空气接触角测角术和X-射线光电子能谱法进行性质鉴定。接触角的测定应用Rame-Hart-A-100测角仪在超纯水中进行。三个大约相同大小的气泡用一个弯曲的微量注射器从下面引到硅氧烷树脂表面上。当气泡和改性的硅氧烷圆盘表面间形成角度时立即测定每个接触角。对相同等离子体处理的7个圆盘总共进行21个测量，从中确定平均接触角。应用XPS确定未改性的、等离子体处理的以及等离子体处理AMEO涂层的硅氧烷弹性体的表面元素化学的改变。应用具有DS800数据收集系统的Kratos分析型XSAM800对每个样品进行了低分辨率的全扫描(survey seam)和高分辨率的元素扫描。Kratos配备有Mg Ka X-射线源，在这样条件下运行，通过能量(pass energy)为1253.6eV，使用15kV和9-mA电流。谱图在相对于样品表面90°的弹起角(take-off angle)获得。从碳(Cls)、氧(Ols)、硅(Si2p)，和氮(Nls)峰的相对峰面积中进行提供相对原子浓度的元素分析。碳峰用于高分辨率扫描的校正峰。
酶的固定使用来自大麦苗的草酸降解酶草酸氧化酶(OXO)(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)。用溶于0.01-M磷酸盐缓冲液(PBS)的2.5％(v/v)的戊二醛(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，pH 7.4，将酶共价结合在活化的硅氧烷弹性体圆盘上。等离子体处理后的圆盘放置于24孔组织培养板的不同的孔中。圆盘在摇床上轻微摇动下用PBS洗涤2次(每次5分钟)。向每个孔中的圆盘加入2.5％的戊二醛溶液，然后培养板在室温下轻微摇动孵育1小时。圆盘随后用PBS洗涤三次(每次5分钟)，接下来用45-mM琥珀酸钠缓冲液(pH 4.0)洗涤二次(每次5分钟)。然后将圆盘转至干净的组织培养板。向每个圆盘加入1ml在45-mM琥珀酸钠缓冲液(pH 4.0)中制备的100-μg/ml的草酸氧化酶溶液。向没有圆盘的孔加入同样量的酶，作为酶活力分析的对照反应。组织培养板在摇床上在4℃，以20rpm孵育48小时。孵育后，吸出酶溶液并且用琥珀酸钠缓冲液洗涤圆盘(5分钟)。检测圆盘来测定结合的蛋白质和酶活力。
固定化酶的性质测定OXO活力分析是通过Requena和Bornemann(Requena，L.等人，1999，Biochem J 343185-190)方法测定。该分析是基于H2O2比色法测定，H2O2是OXO降解草酸(盐)过程产生的。在干净的24孔组织培养板的单独的孔里将固定化酶圆盘和10μg游离孵育过的酶，与1ml溶于琥珀酸钠缓冲液的40mM草酸钾(pH 4.0)中在37℃，100rpm下孵育(30分钟)。移走样品并煮沸终止酶反应，冷却至室温。体积为0.5ml的上述反应混合物加入到1-ml的一次性比色杯中，比色杯中含有均溶于45-mM琥珀酸钠缓冲液(pH 4.0)的0.5ml 10-mMABTS(2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，2-2’azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)和10μl 2400-U/ml辣根过氧化物酶。盖上比色杯并且在室温下孵育15分钟。用ShimadzuUV 160分光光度计在650nm下测定吸光度，以缓冲草酸钾、ABTS和辣根过氧花物酶作为空白对照。摩尔消光系数10000M-1cm-1用来计算草酸氧化酶的活力。一个活力单位定义为每分钟降解1μmole草酸(盐)所需的酶量。
共价固定在硅氧烷弹性体表面上的酶量用QuantiProTMBCA(二辛可宁酸，bicinchoninic acid)分析试剂盒(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)测定。用OXO涂层的硅氧烷弹性体和1ml QP BCA工作试剂在组织培养板孔中37℃孵育(2小时)，然后使其冷却至室温，在562nm读吸光度。固定酶量从BSA标准曲线中推知。
改良Robbins设备OXO涂层的硅氧烷弹性体的防止草酸钙壳垢形成的能力是在模拟的泌尿环境下、通过应用连续流(continuous-flow)结壳模型改良Robbins设备(MRD)评估的。这个设备由23-cm丙烯酸块构成，围住一个1.0×1.5-cm的管道，每端有管道连接器。有10个直径为1-cm预穿孔的0.5-cm厚的丙烯酸薄片用螺丝固定在丙烯酸块上，为了防止泄漏，一个橡胶垫圈置于两个丙烯酸部件之间。圆盘置于每个有2-mm深的池(well)的塞子中，插入1-cm孔。使插入的圆盘保持与丙烯酸顶部部件齐平，维持设备内的层流(laminar flow)。人造尿(AU)，其组成列于表1，以0.8ml/min的速率用泵使其流过改良Robbins设备。制备了两种AU溶液，一种含有草酸钠，另外一种含有氯化钙，来防止草酸钙结晶。两种溶液混合作为人造尿泵入MRD，产生pH 6.0和通过EQUIL(Werness，P.G.等人，1985，J.Urol 1341242-1244)计算的最终相对过饱和度为8的混合溶液。
四个OXO包被圆盘和四个对照(不含酶)圆盘安装入样品塞子中并且和AU孵育6天。在2、4和6天时取出一个酶涂层的圆盘和一个对照圆盘，用45-mM琥珀酸钠缓冲液(pH 4.0)漂洗。如前述测定这些圆盘的酶活力然后测定壳垢程度。在第6日剩余的圆盘用蒸馏水漂洗，使其干燥，用于扫描电子显微术(SEM)和能量弥散X-射线光谱法(EDS)。
壳垢评定圆盘用去离子水漂洗并且用1ml的0.05M的HCl在4℃处理过夜(15-20小时)以溶解壳垢物质。该溶有草酸盐的盐酸溶液用SigmaDiagnostics Kitfor Oxalate(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)测定草酸盐浓度。草酸盐浓度用于定量圆盘表面壳垢程度。圆盘壳垢的结构和元素分析也通过应用扫描电子显微术(SEM)和能量弥散X-射线光谱法(EDS)完成。硅氧烷弹性体样品用一片导电胶带安置在5/8-in的铝短线(aluminum stub)上。样品和短线在标准条件下用金/钯涂层。样品用JEOL 6400显微镜分析，所述显微镜在15-kV加速电压，孔径设定为2-3以及聚光镜当前范围为9-10nA的条件下运行。数字化图像的获取应用附带的Oxford微分析硬件和Link ISISTM软件包进行。用同样的JEOL 6400 SEM相关的硬件和软件进行EDS对表面壳垢的组成分析。
下面是实施例用以举例说明实现本发明的方法。这些实施例不应作为限制。除非另外指出，所有的百分含量是按重量计算并且所有的溶剂混合物的比例是按体积计算。
实施例1-酶在SR上的吸附通过将底物浸入含有蛋白质的溶液中在37℃，轻微搅动数小时，根据本发明使用的草酸降解酶可以被吸附到SR表面。尽管蛋白质吸附到SR上是很可能的，但是不能期待通过这种方法可以得到高浓度的蛋白质。Ruggieri等人(81)已经使用一种离子表面活性剂，氯化-三-十二烷基甲基铵盐(TDMAC)，将肝素复合到疏水的导管表面(胶乳，PVC和PTFE)。尽管这种方法在降低导管表面的细菌粘附上是成功的，但是发现肝素在大约一个星期后流失。因为这些酶固定的简单方法固有的困难，可以使用其他的，更持久的酶固定方法。可供选择的方法包括1)SR可以在等离子体反应室内活化并且用超纯氨气处理。活化的SR然后可以浸入包含偶联剂的溶液中，如戊二醛或三羟甲基膦(THP)。已经表明THP是一种非常有效的获得胺官能度的偶联剂，并且它比戊二醛更不易于水解(Osward，P.R.等人，1998，Enzyme andMicrobial Technology，2314-19)。最后，改性的硅氧烷可以浸入包含酶的溶液中使酶通过它的胺基碱性残基共价结合偶联剂。(氨基酸分析表明草酸降解酶包含许多这样的胺基残基)。包含胺基的侧链，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸通常暴露在蛋白质的表面并且可以轻而易举地被衍生。
2)DiTizio等人(DiTizio，V.等人，1998，Biomaterials，191977-1884)描述的方法也可以使用。这个方法包括将PEG-明胶-脂质体混合物应用到硅氧烷表面，该表面已经用一薄层4-叠氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酸(AFB)修饰的明胶预先处理。AFB-明胶可以按照他们出版物中概述的那样合成。AFB-明胶用紫外光照射固定在硅氧烷表面，然后水凝胶混合物通过将涂层生物材料浸入碱性溶液施加，并且通过NPC-PEG(聚氧乙烯双-对-硝基苯基碳酸酯，polyoxyethylene bis p-nitrophenyl carbonate)和明胶的胺基基团反应交联。这种方法可以用草酸降解酶替代脂质体组分而被采用。酶具有胺基基团，可以随同明胶的胺基基团和NPC-PEG共价结合。
3)聚丙烯酸(PAA)也可以用氩气等离子体技术接枝到SR上(Langefeld，S.等人，1999，Int.J.Art.Organs，22∶235∶241)。通过用N(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(N(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride)活化接枝PAA链末端，可以将酶和PAA共价连接。
实施例2-硅氧弹性体上草酸氧化酶的固定硅氧弹性体表面依次在氩气和水蒸气条件下用RF等离子体改性。正如用接触角和XPS分析测定，氩气等离子体导致表面亲水性和相对氧含量显著增加。和氩气等离子体处理相比，水蒸气等离子体导致表面亲水性和氧含量进一步的增加。对等离子体处理的硅氧烷弹性体使用AMEO涂层导致表面亲水性的相对下降。如XPS测定的，AMEO涂层表面的增加的氮含量表明表面胺化。
有活性的草酸氧化酶通过戊二醛生物偶联固定在胺化表面。固定化的OXO保留了大量的天然活力。
应用改良Robbins设备测定了在PDMS圆盘上的固定化的草酸氧化酶在泌尿环境中针对防止草酸钙壳垢的效力。在循环的人造尿中孵育4和6天后，和未涂层的圆盘相比，用OXO给硅氧烷圆盘涂层导致壳垢物质上草酸盐浓度分别下降54％和56％。在酶涂层的表面壳垢抑制可以进一步通过SEM和EDS对圆盘表面的形态学的和元素分析证明。
表面改性图2是不同等离子体处理后XPS测定的俘获空气接触角测量结果和表面元素组成。
下降的接触角表明，Ar和H2O等离子体处理产生的表面，同对照的硅氧烷弹性体相比，与增加的亲水性相关联，具有增加的氧含量和相应下降的碳含量。H2O等离子体处理后用AMEO涂层导致强疏水性表面(接触角为96°)，具有和对照PDMS样品相当的氧和碳含量。AMEO涂层的表面是唯一导致表面胺化的处理。等离子体处理后硅氧烷含量基本保持不变。
酶的固定表3中是用QP BCA蛋白质测定方法测定的固定化蛋白质的量以及酶活力。
通过戊二醛生物偶联，平均一个胺化的直径为10mm的硅氧烷圆盘上可以固定20.8μg草酸氧化酶(OXO)，这相当于0.26μg/mm2。正如应用游离酶所测定，发现固定化蛋白质具有酶活力并且保留了它的天然活力的47.5％(表3)壳垢评定表4显示从在MRD中孵育6天后的硅氧烷弹性体圆盘中再溶的草酸盐量，代表了壳垢的程度。在MRD中孵育2天后，在对照或OXO涂层的圆盘上都有很少壳垢沉积。仅仅4天后，OXO涂层的硅氧烷弹性体圆盘显著抑制壳垢沉积，6天后有更明显的效果。
对照圆盘PDMS表面的扫描电子显微镜(SEM)显示一些壳垢沉积，而相应的OXO结合的PDMS圆盘的SEM表明更少的壳垢沉积。壳垢沉积主要显示形态学上像草酸盐一水合物结晶。二者表面的电子弥散谱(EDS)证明壳垢沉积包含钙。钙的组成谱图证明同OXO结合PDMS样品相比对照PDMS有更多的壳垢沉积。
应当理解，此处描述的实施例和实施方案只作举例说明的目的，对于本领域技术人员，根据它可有多种改进或者改变，并且包括在本申请的实质和范围内。
权利要求
1.降低含有草酸(盐)的流体中草酸(盐)浓度的方法，其中所述的方法包含用至少一种固定在表面上的草酸降解酶与该流体接触。
2.权利要求1的方法，其中流体是生物流体。
3.权利要求2的方法，其中生物流体选自血液和尿液。
4.权利要求1的方法，其中草酸降解酶被固定在内置医疗器械的表面。
5.权利要求4的方法，其中草酸降解酶被固定在导管、支架或者透析膜的表面。
6.权利要求1的方法，其中在发酵过程的流体中降低草酸(盐)浓度。
7.权利要求6的方法，其中草酸(盐)浓度的降低减少了结垢的发生率。
8.权利要求1的方法，其中其上固定酶的表面是聚合的物质。
9.权利要求1的方法，其中其上固定酶的表面是硅氧烷弹性体。
10.权利要求1的方法，其中草酸降解酶通过连接物结合在所述表面上。
11.权利要求1的方法，其中所述表面进一步包含抗微生物化合物。
12.权利要求1的方法，其中所述的酶选自草酸氧化酶、草酸脱羧酶、草酰-CoA脱羧酶和甲酰-CoA转移酶。
13.权利要求1的方法，其中多种草酸降解酶被固定在表面上。
14.权利要求1的方法，在哺乳动物体内实施。
15.权利要求14的方法，该哺乳动物是人。
16.结合至少一种草酸降解酶的表面，并且其中所述的表面是在透析膜、内置医疗器械或者发酵体系上。
17.权利要求16的表面，其中所述的内置医疗器械选自支架和导管。
18.权利要求16的表面，其是聚合的物质。
19.权利要求18的表面，其是硅氧烷弹性体。
20.权利要求16的表面，其中草酸降解酶通过连接物结合在表面上。
21.权利要求16的表面，其中表面进一步包含抗微生物化合物。
22.权利要求16的表面，其中所述的酶选自草酸氧化酶、草酸脱羧酶、草酰-CoA脱羧酶和甲酰-CoA转移酶。
全文摘要
本发明提供了降低流体中草酸浓度的材料和方法。在优选的实施方案中，降低了生物流体中的草酸浓度。具体地修饰了支架、导管和透析膜以降解循环流体中的草酸。在另外的实施方案中，降低了包括发酵液的其他流体中的草酸。在发酵液的情况中，具体说明了从酿造过程中涉及的流体中去除草酸。
文档编号A61M25/00GK1578833SQ02821478
公开日2005年2月9日 申请日期2002年10月7日 优先权日2001年10月5日
发明者H·西德尤 申请人:伊克西翁生物技术公司