海豹油基脂质乳液及其用途的制作方法

专利名称：海豹油基脂质乳液及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂质乳液体系领域，并且具体说涉及用于肠胃外施用的海豹油基脂质乳液。
背景技术：
脂质乳液被广泛地用作总肠胃外营养(TPN)输注溶液的基础，用来给那些不能以口服途径接受营养的患者提供热量和必要脂肪酸。例如，在20世纪60年代，欧洲便开发出Intralipid静脉内用脂质乳液，并且到了1975年批准在美国使用。目前可商购获得的用于肠胃外用途的脂质乳液由植物油(诸如大豆油或红花油)、乳化剂(诸如蛋磷脂类)、甘油和水组成。这些可商购获得的乳液包括Liposyn和LiposynII(Abbott Laboratories)；Travemusion(Baxter Healthcare)及Soyacale(Alpha Therapeutics)。
脂质生物化学的进展已经确认了多不饱和Omega-3(ω-3)和Omega-6(ω-6)脂肪酸的生物学必需性。脂肪酸通过它们所具有的C原子和双键的数目并且通过第一个双键相对于分子甲基末端的位置来表征。由此，命名C182ω-6表示的是具有18C原子和2个双键的脂肪酸，第一个双键位于从甲基末端的第6个C原子处。多不饱和脂肪酸作为建立生物化学过程阻断和调制剂的膜是重要的。生物学上最重要的ω-6脂肪酸是花生四烯酸(AA；C204)及其前体，亚油酸(C182)。α-亚麻酸是长链ω-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的母体物质，这些长链ω-3脂肪酸是人体中的必需脂肪酸。作为在高度生物学活性eiconaoids的合成中的前体，AA和EPA影响着炎性反应(Burton JL.Lancet，1989，433-5)和免疫学抗性(Endrers S，等，Eur J Clin Invest，1995，25629-38)以及心血管疾病(Burr ML，等，Lancet，1989，2757-61；Hu FB，等，JAMA，2002，287(14)1815-21)，脂质代谢紊乱、血栓形成过程和肿瘤性转化疾病(Jeeski LI，等，Pro Soc Exp Biol Med 1995，210227-33；Tevar R，等，J Parenter Enteral Nutr，2002，26(5)285-9；BarberMD，等，Nutr Cancer，2001，40(2)118-24；Senzaki H，等，WorldRev Nutr Diet，2001，88117-25)。一些临床症状(例如皮肤损害，生长中止，肾退化和代谢速率增加)与ω-6脂肪酸的缺乏有关系(Caldwell M.D.，Human essential fatty acids deficiencyA reviewin fat emulsion in parenteral nutrition.Meng H.C.和Wilmore D.W.(eds.)Chicago，ILAmer.Med.Assoc.P.24，1978)。
流行病学研究(它显示食物脂肪含量与心血管疾病发生之间的关系)认为多不饱和脂肪酸是预防有效的。在此内容中，在海洋生物油中发现的ω-3脂肪酸据证明是特别有益的。近来，人们认识到，保持ω-3和ω-6脂肪酸消耗之间的平衡，对实现这些脂肪酸的保护性药理学效果是必要的。ω-3与ω-6脂肪酸之比为1∶2-1∶4是推荐的(Helmut G.等，JPEN，1994，18417-421)。
如上所述，大部分可商购获得的脂质乳液得自于植物油。与乳液得自于植物油相关的缺陷是双重的。首先，植物油缺乏ω-3不饱和脂肪酸，其次，植物中含有显著量的维生素K(例如，在Intralipid和LiposynII的10％乳液中，据发现维生素K1的浓度分别为30.8和13.2微克/dL)。维生素K在血液凝固过程中是关键因素之一并且由此可能使得手术过程变得复杂，特别是对接受抗凝血疗法的患者来说。
随着目前的研究显示用ω-3脂肪酸补充肠胃外营养在某些临床条件下可引出各种保护性效果10，11，人们开发出鱼油基脂质乳液，Omegaven(Fresenius Kabi)，并且已允许在欧洲市场上使用。Omegaven是10％鱼油乳液，其含有高百分比含量的ω-3脂肪酸EPA和DHA。许多生物学有益效果据显示都与使用Omegaven有联系，包括LTC5产生增加、血小板聚集降低、免疫学功能提高和水肿形成减慢。将Omegavene与基本脂质乳液如Intralipid同时静脉内施予也提供最佳的ω-3与ω-6脂肪酸的比例。
然而，鱼油中含有非常少量的ω-3脂肪酸DPA。与多不饱和脂肪酸EPA和DHA一样，DPA是营养学重要的，人体血液中循环的长链ω-3脂肪酸的约三分之一都归属于DPA。近来的研究证实，EPA在血管壁中可以实际上转化成DPA，而DPA本身在这些环境下是有效试剂。虽然通常相信EPA在产生前列腺素中是关键因素，其中前列腺素使动脉壁柔软和不含动脉粥样斑，但这个研究表明，DPA在此方面可以是10-20倍地比EPA更有作用。由此DPA可以起强有效的抗致动脉粥样化因素的作用(Schiefenneier M.& Yavin E.，J Lipid Res，2002，43(1)124-31；Hansen JB，等，J Lipid Res，2000，41(9)1376-83)。
在脂质乳液中使用鱼油的另一个潜在的缺陷是提取鱼油的方法目前依赖于蒸汽或加热，其使ω-3脂肪酸氧化。高温还具有加速ω-3脂肪酸从其天然的顺式几何形状异构化成反式几何形状的可能。氧化和反式脂肪酸都对人体的健康是有害的。
因此，仍然需要一种脂质乳液，其含有高百分比含量的ω-3脂肪酸EPA、DPA和DHA，低含量维生素K及低比例的氧化和反式脂肪酸。
这个背景信息是为制作已知信息的目的而提供的，申请人相信这些信息与本发明具有可能的关联性。没有必要承认也不应当解释为前述的任何信息构成对本发明的现有技术。
发明概述本发明的一个目的是提供海豹油基脂质乳液及其用途。本发明的一个方面是提供一种脂质乳液，该乳液含有(a)5-40wt％的纯化海豹油；(b)0.5-5wt％的乳化剂，和(c)水，其中所述乳液的最终pH为6.0-9.0。
本发明的另一方面提供一种营养组合物，该组合物含有(a)含5-40wt％的纯化海豹油、0.5-5wt％的乳化剂和水的脂质乳液，和(b)一种或多种营养化合物，
其中所述组合物的最终pH为6.0-9.0。
本发明的另一方面是提供一种营养组合物，该组合物含有含5-40wt％的纯化海豹油、0.5-5wt％的乳化剂和水的脂质乳液，和一种或多种治疗剂。
本发明的另一方面是提供一种营养组合物，该组合物含有含5-40wt％的纯化海豹油、0.5-5wt％的乳化剂和水的脂质乳液，和一种或多种诊断剂。
本发明的另一方面是提供一种含5-40wt％的纯化海豹油、0.5-5wt％的乳化剂和水的脂质乳液在需要的患者的总肠胃外营养中的用途。
本发明的另一方面是提供一种含5-40wt％的纯化海豹油、0.5-5wt％的乳化剂和水的脂质乳液作为治疗剂或诊断剂用的传递载体的用途。
附图简介

图1描绘了卵磷脂与海豹油之比对10％海豹油乳液的液滴粒度的影响。
图2描绘了pH对10％海豹油乳液的ζ电势的影响。
图3描绘了pH对10％海豹油乳液的过氧化的影响。
图4描绘了EDTA和/或维生素E对10％海豹油乳液的过氧化的影响。
图5描绘了EDTA浓度对10％海豹油乳液的过氧化的影响。
图6描绘了含有不同油的乳液的过氧化值。菱形Intralipid，由大豆油制备；正方形Omegaven，由鱼油制备；三角形10％海豹油乳液。
图7描绘了高压灭菌时间对10％海豹油乳液的过氧化的影响。
图8描绘了高压灭菌时间对10％海豹油乳液的pH的影响。
图9描绘了高压灭菌时间对10％海豹油乳液的ζ电势的影响。
图10描绘了高压灭菌时间对10％海豹油乳液的颗粒粒度的影响。
发明详述本发明提供一种脂质乳液，其含有海豹油作为内芯脂类，用于在治疗应用中使用，包括在总肠胃外营养中的应用。
定义除非有另外的说明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。
本文中所用的术语“约”是相对标称值有+/-5％的变化。应当理解的是这种变化总是包括在本文所提供的任何给定的数值范围内，无论是否特别指出。
脂质乳液的组分根据本发明，脂质乳液含有海豹油和分散在水中的乳化剂。乳液还可以含有附加组分，诸如抗氧化剂，螯合剂，缓冲剂，助乳化剂，渗透性(osmolality)改进剂，中和剂等等，它们用来提高乳液的稳定性、均匀性和/或其它特性。
相比目前可获得的鱼油基乳液，本发明的海豹油基脂质乳液更稳定和更耐氧化。除此之外，海豹油基乳液中含有必需脂肪酸二十二碳五烯酸(DPA)，其在鱼油基乳液中仅以少量存在。
1.海豹油本发明的脂质乳液含有海豹油作为内芯脂质。各种品种的海豹都适合作为所述乳液用油的来源。在本发明的一个实施方案中，油得自格陵兰海豹(harp seal)。
如上所述，目前可获得的用于治疗用途的脂质乳液中含有得自植物的油或含有鱼油作为内芯脂质。海豹油提供了超过鱼油或植物油的许多优点。例如，大部分得自植物的油中都具有低含量的有益ω-3脂肪酸和相对高含量的维生素K，而海豹油中含有高含量的ω-3脂肪酸和低含量的维生素K。除此之外，海豹油的ω-3脂肪酸含量高于在鱼油中存在的含量，例如，格陵兰海豹油的ω-3脂肪酸含量一般为约20-35％。此外，海豹油中的大部分ω-3脂肪酸占据着取代甘油三酯分子的第1和第3位，与在人中的位置相同，而鱼油中的ω-3脂肪酸主要占据第2-位。因此，海豹油的这种取代方式可以让接受者更好地吸收乳液中的脂质，因为海豹油的脂质更类似于内源脂质。
就ω-3脂肪酸的含量而言，海豹油比鱼油含有更高的二十二碳六烯酸(DHA)/二十碳五烯酸(EPA)之比，以及更低含量的不期望的单不饱和及饱和脂肪酸。此外，海豹油中含有显著量的必需脂肪酸二十二碳五烯酸(DPA)，而其在鱼油中存在的含量非常低。加之在制备非常适合治疗目的的海豹油中，上述特性赋予海豹油优越的液体性能，使得其不太可能形成能够阻塞血管的半固体。
根据本发明，用于作为乳液内芯脂质使用的海豹油是高度纯化的并且含有高浓度的多不饱和脂肪酸，特别是ω-3脂肪酸。该油中含有的ω-3脂肪酸的比例比ω-6脂肪酸要高。
海豹油中ω-3脂肪酸的浓度一般是总重量的约20-35％，和ω-6脂肪酸的浓度一般是总重量的约2-10％。然而，本领域技术人员能够领会，油的脂肪酸组成是取决于萃取和精炼的方法而不同的。
根据本发明，在乳液中使用的海豹油含有总重量的大于约20％的ω-3脂肪酸。在一个实施方案中，海豹油含有总重量的大于约25％的ω-3脂肪酸。在另一个实施方案中，海豹油含有总重量的大于约27％的ω-3脂肪酸。
在海豹油中，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)在油的ω-3脂肪酸含量中占有较高比例。例如，一般来说，在格陵兰海豹油中，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的浓度占ω-3脂肪酸总重量的约45-70％，而亚麻酸占ω-3脂肪酸总重量的约0.5-1.5％。
根据本发明，在本发明乳液中使用的海豹油中，DHA与EPA之比为约1∶1至约3.5∶1。
海豹油的脂肪酸含量还可以是脂肪酸的酯的形式，例如亚油酸(18:2n6)、花生四烯酸(20:4n6)、亚麻酸(18:3n3)、二十碳五烯酸或EPA(20:5n3)及二十二碳六烯酸或DHA(22:6n3)的酯，以及其它饱和脂肪酸的酯，如肉豆蔻酸(14:00)、棕榈酸(16:00)和硬脂酸(18:00)的酯。就酸值而言(按照United States Pharmacopoeia 1993)，海豹油中一般含有低含量的游离脂肪酸酯(约0.2-0.9ml/g)。本领域技术人员能够领会，油中的脂肪酸酯的量取决于在油精炼过程中所采用的工艺。
根据本发明，乳液中所用海豹油的游离脂肪酸含量小于约0.5ml/g。在一个实施方案中，游离脂肪酸含量小于约0.4ml/g。在另一个实施方案中，游离脂肪酸含量小于约0.3ml/g(所有数值均按照United States Pharmacopoeia 1993测定)。
油的品质可以通过本领域已知的参数来评价，例如，过氧化值、碘值或脂肪酸组成。这些参数可以通过本领域技术人员已知的许多方法来测定，例如，参数可以通过气相色谱法来测定(还参见the United StatesPharmacopoeia XXI和XXII及British Pharmacopoeia 1993和1998中描述的分析过程)。
根据本发明，在乳液中使用的海豹油的过氧化值为约3mEq/kg至约35mEq/kg并且平均碘值为大于60mEq/kg。在一个实施方案中，海豹油的碘值为约85mEq/kg至约100mEq/kg。
萃取和精炼油的方法是本领域公知的。例如，国际专利申请PCT/CA00/00028描述了一种使用低热来精炼动物和植物油的方法。低温的使用可以最大程度地降低纯化油中存在的有害的氧化和反式脂肪酸的量。附加地，海豹油往往比鱼油更耐自然氧化过程，初步实验证明，在海豹油中，ω-3多不饱和脂肪酸的体外氧化程度小于在鱼油中所观察的一半。根据本发明，海豹油具有低含量的氧化和反式脂肪酸。
在本发明的一个实施方案中，通过低温方法萃取和精炼海豹油，以便最大程度地减少氧化。在另一个实施方案中，将加工温度保持在或低于22℃。
本发明的脂质乳液一般含有约5％至约40％(w/v)的海豹油。在一个实施方案中，乳液含有约5％至约30％(w/v)的海豹油。在另一个实施方案中，乳液含有约5％至约20％(w/v)的海豹油。在另一个实施方案中，乳液含有约5％至约15％(w/v)的海豹油。在另一个实施方案中，乳液含有约10％(w/v)的海豹油。
2.乳化剂为制备本发明的脂质乳液，将一种或多种乳化剂与海豹油组分混合。用于此目的的乳化剂通常是天然、合成或半合成来源的磷脂类。各种适宜的乳化剂是本领域已知的。适宜乳化剂的实例包括但不限于蛋磷脂酰胆碱，蛋卵磷脂，L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，DL-α-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和大豆卵磷脂。根据本发明，乳化剂中的甘油三酯以及游离脂肪酸的总浓度应当是低的，以便最大程度地降低对乳液总油浓度的影响。在本发明的一个实施方案中，乳化剂中的甘油三酯以及游离脂肪酸的总浓度小于约3.5％。
在本发明的一个实施方案中，使用卵磷脂作为脂质乳液的中的乳化剂。在另一个实施方案中，使用蛋卵磷脂作为乳化剂。在另一个实施方案中，使用含有80-85％磷脂酰胆碱和小于约3.5％脂肪的蛋卵磷脂作为乳化剂。本领域技术人员能够领会，在蛋卵磷脂中可以存在不会不利地影响乳化性能的其它组分。例如，蛋卵磷脂中可以含有磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂和其它天然组分中的一种或多种。
本发明的脂质乳液中一般含有约0.5％至约5％(w/v)的乳化剂。在本发明的一个实施方案中，乳液含有约0.6％至约2％(w/v)的乳化剂。在另一个实施方案中，乳液含有约0.8％至约1.8％(w/v)的乳化剂。在另一个实施方案中，乳液含有约1.0％至约1.5％(w/v)的乳化剂。在另一个实施方案中，乳液含有约1.2％(w/v)的乳化剂。
乳液中的卵磷脂与海豹油之比在决定乳液内所形成的油滴的粒度方面是重要的。根据本发明，乳液中的油滴粒度低于1μm。因此，卵磷脂与海豹油之比为约1∶4至约1∶20。在本发明的一个实施方案中，卵磷脂与海豹油之比为约1∶4至约1∶18。在另一个实施方案中，卵磷脂与海豹油之比为约1∶4至约1∶15。在另一个实施方案中，卵磷脂与海豹油之比为约1∶4至约1∶10。
3.其它添加剂本发明的脂质乳液中还可以含有附加组分，诸如抗氧化剂、螯合剂、渗透性改进剂、缓冲剂，中和剂等等，它们用来提高乳液的稳定性、均匀性和/或其它特性。
本发明包括向脂质乳液添加一种或多种抗氧化剂，以便有助于防止形成不期望的氧化脂肪酸。可以向脂质乳液中添加的适宜的抗氧化剂包括但不限于α-生育酚(维生素E)和生育三烯酚(tocotrienols)。正如本领域所知，生育三烯酚是生育三烯酚和维生素E萃取物的天然共混物，由米糠油蒸溜物中浓缩而成，其具有类似于α-生育酚(维生素E)的抗氧化活性。生育三烯酚具有与维生素E相似的结构并且在分子的碳侧链上含有三个双键。
当使用时，向乳液中添加的抗氧化剂的浓度一般为约0.002至约1.0％(w/v)。在一个实施方案中，在乳液中所用的抗氧化剂的浓度为约0.02％至约0.5％(w/v)。
在本发明的一个实施方案中，将生育三烯酚作为抗氧化剂添加至乳液中。在另一个实施方案中，向乳液中添加约0.5％(w/v)的生育三烯酚。在另一个实施方案中，将维生素E作为抗氧化剂添加至乳液中。在另一个实施方案中，向乳液中添加约0.02％(w/v)的维生素E。
乳液中还可以含有螯合剂，用来提高乳液的稳定性和降低氧化脂肪酸的形成。适宜的螯合剂是本领域所已知的并且是通认为安全的(GRAS)化合物，其实例包括但不限于EDTA。在本发明的一个实施方案中，乳液中含有EDTA。在另一个实施方案中，乳液中含有约1×10-6M至5×10-5M浓度的EDTA。
还可以将渗透性改进剂掺入乳液中，以便将乳液的渗透性调节至适宜于肠胃外给予的数值。在肠胃外乳液中使用的渗透性改进剂的量和类型是本领域公知的。适宜的渗透性改进剂的一个实例是甘油。渗透性改进剂的浓度一般为约2％至约5％(w/v)。在本发明的一个实施方案中，向乳液中添加的渗透性改进剂的量为约2％至约4％。在另一个实施方案中，向乳液中添加的渗透性改进剂的量为约2％至约3％。在另一个实施方案中，将约2.25％(w/v)的甘油作为渗透性改进剂添加至乳液中。
本领域技术人员能够理解，乳液的pH可以通过使用缓冲剂或中和剂来调整。据显示，pH值接近生理学pH或之上的乳液较少有脂肪酸过氧化的倾向。本领域技术人员能够领会，可以通过使用适当的碱(中和脂肪酸上的负电荷)、通过使用适当的缓冲剂或者其组合，来调节乳液的pH。各种类型的碱和缓冲剂适用于本发明的乳液。本领域技术人员能够领会，向乳液添加缓冲剂不仅能够影响最终pH，而且还影响乳液的离子强度。高离子强度可以负面地影响乳液的ζ电势(即油滴的表面电荷)并且因此是不期望的。选择适当的缓冲剂强度来提供适宜的pH和ζ电势(如本文所定义)被认为属于本领域技术人员的普通知识。
在本发明的一个实施方案中，使用氢氧化钠来调节乳液的pH。在另一个实施方案中，用缓冲剂调节pH。在另一个实施方案中，缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。在另一个实施方案中，将氢氧化钠和磷酸盐缓冲剂同时添加至乳液中。
乳液的最终pH一般为约6.0至约9.0。在本发明的一个实施方案中，乳液的pH为约7.0至约8.5。在另一个实施方案中，乳液的pH为约7.0至约8.0。
脂质乳液中还可以含有用于调整乳液稳定性的组分，例如氨基酸或碳水化合物，例如果糖或葡萄糖。还可以将脂质乳液配制成含有诸如葡萄糖、氨基酸、维生素或其它肠胃外营养补剂的营养素。将脂质乳液配制成掺加治疗剂也被认为属于本发明的范围。本文中所用的“治疗剂”是指生理学或药理学活性的物质，其可在动物中产生局部或全身效果或多种效果，并且通常指药物、营养补剂、维生素、矿物质、酶、激素、蛋白质、多肽、抗原和其它治疗或诊断有用的化合物。
脂质乳液的制备本发明的脂质乳液可以通过许多本领域技术人员已知的常规技术来制备。总的来说，首先将内芯脂质与乳化剂和抗氧化剂(如果使用其的话)混合。然后，通过将此油相缓慢添加至水中同时进行恒定搅拌，来制备乳液。如果使用渗透性改进剂的话，将其添加至水中，然后与油相混合。如果需要的话，可以在此阶段调节pH，并且如果需要的话可以用水调整最终体积。
乳液的油滴粒度(即颗粒粒度)对于乳液的治疗效果和品质而言是重要的参数。由于脂质颗粒会以类似于乳糜微粒的方式从体循环中除去，因而乳液中的脂质颗粒的粒度需要保持在天然存在的乳糜微粒的粒度范围(即0.4-1.0μm)之内或之下。如果颗粒粒度大于此范围，脂质颗粒会沉积在肝、脾和肺中，导致在输注后产生显著的脂肪负荷(RahuiC.M.，等，Am.J Hosp.Pharm.1992，492749-2755)。具有小颗粒粒度的脂质较好地分散在乳液中，并且往往产生较安全和较稳定的乳液。本发明的脂质乳液一般具有比可商购获得的脂质乳液更小和更均匀的颗粒粒度。适当的颗粒粒度是具有平均直径低于1μm，一般是约0.05μm至约0.5μm。在本发明的一个实施方案中，平均颗粒粒度为约100nm至约500nm。在另一个实施方案中，平均颗粒粒度为约200nm至约400nm。在其它实施方案中，平均颗粒粒度为约250nm至约350nm和约300nm至约350nm。本领域技术人员能够理解，可获得的颗粒粒度取决于制剂的组成以及制备过程。
具有适当平均颗粒粒度(即直径小于1μm)的脂质乳液可以通过本领域已知的许多技术来制备。例如，可以对通过如上所述向水中添加油相而制得的分散液进行均质处理、声处理或微流化处理。可以商购获得各种各样的适宜的机械设备，来实现乳液的制备。在本发明的一个实施方案中，使分散液通过均质器一次或多次。在另一个实施方案中，通过使用均质器，使用20,000-27,000Psi的压力来产生乳液。在另一个实施方案中，通过使用均质器，使用180,000kPa的压力来产生乳液。本领域技术人员能够领会，按此方式制备的乳液的颗粒粒度与油含量、乳化剂浓度以及均质器的压力和通过其的次数有关。适合于制备本发明乳液的条件的选择被认为属于本领域技术人员的普通技术范畴。
如果需要的话，在此阶段，可以将所得的乳液通过适当的滤器例如0.45μm膜过滤。或者，可以通过高压灭菌处理，将乳液灭菌。据发现，本发明的含海豹油的乳液对在121℃下高压灭菌处理最多60分钟是稳定的。
通常，将最终的乳液保持在无菌条件中并且可以包装在密闭容器中进行短期或长期保藏。
在惰性气氛下制备脂质乳液以便最大程度地降低在加工过程中发生脂质氧化也属于本发明的范围。
在本发明的一个实施方案中，脂质乳液含有5-20％的海豹油、0.5-5％的含80-85％磷脂、0.002-0.5％生育三烯酚或α-生育酚的蛋卵磷脂、2-5％甘油和水。在另一个实施方案中，海豹油中含有20-35％的ω-3脂肪酸。在另一个实施方案中，使用将温度保持在22℃或低于22℃的工艺，将海豹油进行精炼。在另一个实施方案中，乳液的平均颗粒粒度为约250nm至约350nm。在另一个实施方案中，乳液的最终pH为约7至约8。
脂质乳液的稳定性最大程度减少脂质的氧化对脂质乳液来说是特别重要的，因为氧化会导致发展成酸败和产生具有潜在毒性的分子。正如本领域所已知的，油滴的粒度、油的浓度、乳化剂的性质和抗氧化剂的存在对乳液中所发生的脂质氧化的量来说是重要的决定因素。
脂质乳液的稳定性可以通过许多本领域已知的并且在本文和在别处所描述的试验来测定，包括但不限于视觉检测乳液的乳液分层和/或分离、加速老化测试、高速离心、测量颗粒粒度及ζ-电势的分布和变化。通过测定过氧化值可以预先评价海豹油的氧化状态，并且由此确定乳液的品质。测定油的过氧化物含量的方法是本领域已知的(例如，参见the United States Pharmacopoeia XXI或the British Pharmacopoeia1993中描述的分析过程)。海豹油一般具有约4mEq/kg至约32mEq/kg的低过氧化值，取决于制造的方法。由此，在本发明的一个实施方案中，海豹油的过氧化值为小于35mEq/kg。在另一个实施方案中，海豹油的过氧化值为约5mEq/kg至约30mEq/kg。
脂质乳液的氧化水平还可以通过测定过氧化值、通过监测氧的消耗或通过检测脂类过氧化物来测定。
毒性测试使用本领域已知的标准方法，可以体外和体内测试脂质乳液的毒性(参见，例如，Current Protocols in Toxicology，Maines，M.，等编)，J.Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)。例如，可以使用LimulusAmebocyte Lysate(LAL)血凝块试验(Marilyn J.Gould，NephrologyNews & Issues，November 1988，pp26)，来体外测试乳液中的内毒素存在。或者，或除此之外，可以使用标准急性毒性试验，其中将乳液施用给适宜的试验动物(一般来说是小鼠或大鼠)，来体内测试乳液。在施用适当的时间后，将动物杀死，收集主器官中的组织并且进行分析。将结果与对照组动物比较，其中给对照组使用安慰剂或标准产品。
测试脂质乳液可以采用许多本领域技术人员已知的临床试验，来测定本发明脂质乳液在总肠胃外营养方面或者用于治疗应用的功效。例如，通过标准生物等效研究(参见，例如，Current Protocols in Toxicology，Maines，M.，等(编)，J.Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)，可以测定脂质乳液被动物体吸收的能力。在这些研究中，监测适当动物模型在输注本发明脂质乳液或对照乳液(一般是可商购获得的植物油或鱼油基乳液)之后，脂肪酸从血流中的消失情况。还可以通过标准过程来测定肝脂质的脂肪酸分布并且通过检测例如肝、肾、心、肺、脾或胸腺的病理组织学来测定脂肪酸的分布。
本发明脂质乳液的治疗效果可以在适当的动物疾病模型中得到测定。例如，经常使用灼伤小鼠模型来测试脂质乳液的治疗有益性[参见，Hayashi，Nutrition，17211(2001)]。在此情形中，将脂质乳液施用给小鼠并且监测各种生理学参数，例如，血液和尿液的氮含量或者某些蛋白质如血液白蛋白的再生。
在短期或长期安排后，也可以进行本领域已知的其它生物利用性研究和毒性试验。
脂质乳液的用途本发明的脂质乳液可以被用作富含顺式-ω-3脂肪酸的总肠胃外营养(TPN)产品。为此目的，如果需要，可以将脂质乳液与富含ω-6的脂质乳液例如植物油基乳液合并，以便提供最佳ω-3∶ω-6脂肪酸比。除此之外，可以通过标准技术将本发明的脂质乳液配制成营养组合物的形式，以便其含有一种或多种其它营养素，诸如葡萄糖、氨基酸、维生素和/或其它肠胃外营养性补剂。
如前所述，已知ω-3脂肪酸可影响炎性反应和免疫学抗性，以及心血管疾病，脂肪代谢紊乱，血栓形成过程和肿瘤性转化疾病。因此，本发明的脂质乳液还可以用于有益于术后和创伤后患者(特别是经过用抗凝血剂治疗的患者)、经历早期脓毒/全身性炎性响应综合征(SIRS)的患者、处于高炎性过程危险的患者、其免疫功能需要支持的患者、患有炎性肠疾病(Crohn′s病，溃疡性结肠炎)的患者、患有炎性皮肤疾病(牛皮癣，特异反应性湿疹)的患者，关节炎患者，心血管疾病患者、癌症患者、肺病患者(如哮喘)和糖尿病患者。
使用脂质乳液来配制掺加有一种或多种治疗性或诊断性化合物的组合物也属于本发明的范畴。在此实施方案中，脂质乳液起治疗性或诊断性化合物的传递载体的作用，以及提供如上所述的有益效果。配制脂质乳液，使其含有一种或多种治疗性或诊断性化合物，是本领域技术人员使用标准技术容易实现的。
给患者施用脂质乳液以便进行TPN应用或治疗有益效果的方法是本领域已知的。一般，通过在适宜的时间期限内输注来施予乳液。适当的剂量和施予制度是临床领域的技术人员容易确定的。
试剂盒本发明还附加提供含有脂质乳液的试剂盒子，用于给患者施用。该试剂盒能够提供在规定期限内的合适的剂量。
本发明的试剂盒包含一个或多个含有脂质乳液的包装或容器以及一套指导说明，其中所述指导通常是书面的指导，涉及脂质乳液的使用和剂量。试剂盒可还含有附加的含有一种或多种营养素或者治疗性或诊断性化合物的容器，这些营养素或化合物可以在施用前添加至乳液中。含有脂质乳液的包装可以是单位剂量的形式或者呈大批量包装的形式(例如，多剂量包装)。剂量的包装形式可以是使每剂量与例如一周内的每日剂量有关。也可以将试剂盒与注意事项联系起来，其中所述注意事项是由调整制造、使用或销售生物制品的政府机构来规定的，这种注意事项反映了政府机构对用于人或动物施用的制造、使用或销售的许可。
为取得对本发明更好的理解，可以参考以下实施例。应当理解的是这些实施例仅仅是为举例说明的目的而列举的。因此，它们应当不以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1制备含有格陵兰海豹油的脂质乳液将磷脂类、海豹油、甘油、生育三烯酚或α-生育酚和胆固醇通过在室温下搅拌约30分钟彻底混合。将无菌水添加至混合物中并且将其搅拌另外2-3分钟。然后，将整个混合物倾入均质器(EmulsiFelex-C5，Avestin Inc.，Ottawa，加拿大)的腔内并且在高压条件(20,000-27,000psi)下经过该均质器数次。
在一种组合中，海豹油10％，蛋卵磷脂2.4％，生育三烯酚0.5％，甘油2.25％和胆固醇5％，使乳液在20,000Psi压力下经过均质器4次后，脂滴的平均粒度为452nm。在27,000Psi增加压力下经过均质器一次后，颗粒粒度降低至340nm。然而，当将胆固醇从组合中省去时，在20,000Psi的压力下可以获得280nm的颗粒粒度。
实施例2乳液组成的优化由于脂质乳液是热力学不稳定体系，因而为制备稳定的且有效的药物产品就必需考虑许多因素。这些因素包括油和乳化剂的性质、各组分的浓度和配制方法。然而，对在各种含量下的所有因素进行测试是不切实际的，因此，常使用析因或部分析因设计。析因或部分析因设计为筛选各种因素和优化乳液的配制提供了一条有效途径，参见Phan-Tan-Luu，R.和Didier，M.Experimental design in emulsion andsuspension formulationstheoretical aspects.P.465-535；及Neilloud，F.，Marti-Mestres，G.，Maillols，H.Application ofexperimental methodology to emulsion and suspensions. P.535-557，Pharmaceutical emulsion and Suspensions.Neilloud，F.和Marti-Mestres编，G.，Marcel Dekker Inc.，2000)。
下面描述的是全析因设计的一个样品，用于评价改变脂质乳液中某些因素对10％海豹油乳液稳定性影响的结果。
三个因素的变化范围示于下表1。
表1.

在该样品中，考虑的响应是乳液的颗粒粒度。
通过该方法也评价脂质氧化的其它参数以及生物稳定性数据。
全析因设计(23)和响应示于下表2。
表2.

此样品中基体效应的计算表明，胆固醇的存在和浓度对决定此类型乳液的颗粒粒度而言是重要的因素。
实施例3调节脂质乳液的颗粒粒度如上所述，乳液的颗粒粒度与许多因素有关。控制颗粒粒度和将此粒度保持在某范围内对乳液的稳定性具有很大影响，并且还决定着乳液的有效性和毒性。由以下组合组成的乳液海豹油10％，蛋卵磷脂2.4％，生育三烯酚0.5％，甘油2.25％和胆固醇5％，使乳液在20,000Psi。压力条件下经过均质器4次后，其平均脂质滴粒度为452nm。当将压力增加至27,000Psi时，仅仅经过一次，此脂质滴的粒度下降至340nm。然而，如果从此组合中省去胆固醇，则在20,000Psi压力条件下，乳液的颗粒粒度便可以达到280nm。
实施例4制备10％海豹油乳液将卵磷脂(12g，Lipoid E80，Lipoid GmbH，Ludwigshafen，德国)、甘油(22.5g，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)、海豹油(100g，或者得自Caboto Seafood Ltd.，Baie Verte，Newfoundland and Labrador，加拿大，或者得自Seafreez Seafood Ltd，Catalina，Newfoundland and Labrador，加拿大)、维生素E(0.2g，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)、0.1M NaOH溶液(2.0g，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)、K2HPO4(0.38g，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)、EDTA(0.75mg，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)和注射用水，USP(Baxter加拿大Ltd.，Mississauga，Ontario，加拿大)至1000g，搅拌30min。通过使此混合物经过高压均质器4-8次(EmulsiFlex-C5，Avestin，Ottawa，Ontario，加拿大)，制备乳液。将压力保持在180,000kPa。将产品通过高压灭菌器在121℃下灭菌20min并且在无菌条件下包装在瓶或塑料袋中。
实施例510％海豹油乳液的组成分析使用气相色谱法(GC)和红外分光光度测定法，分析三种不同格陵兰海豹油制品的脂肪酸组成，其中所述三种不同格陵兰海豹油获自不同供应商。简言之，使用NaOH将海豹油水解成游离脂肪酸，然后进行甲基转移化。将酯化的脂肪酸甲基酯在HP-5964毛细管气相色谱仪上进行分析。采用相同的过程，将从Sigma购买的脂肪酸标准样酯化。定量分析海豹油的脂肪酸组成(参见Fidler N，等，J Lipid Res，2000，41(9)1376-83)。结果汇总于下表3。
表3海豹油乳液的组成

从表3中可以看出，鱼油和海豹油中的长链ω-3多不饱和脂肪酸的组成是非常不同的。虽然鱼油中含有EPA和DHA，但它的DPA数量非常少。鱼油中EPA的含量比DHA高。
实施例6.海豹油的酸值按照US药典来测定酸值并且以中和10.0g格陵兰海豹油中的游离脂肪酸所需要的0.1N碱的mL数量来表示。
来自供应商#1的油2.356来自供应商#2的年老格陵兰海豹油2.262来自供应商#2的Beater(年老)油1.695来自供应商#2的Beater(幼小)油0.986来自供应商#2的Bedlamer油2.300Beater处在其生命中第一年的幼小格陵兰或灰色海豹，在三至四周的年龄完成了其第一次蜕皮，形成柔软的带有斑点灰色外皮。
Bedlamer约一至五岁的幼年格陵兰或灰色海豹，其具有带斑点的外皮。格陵兰海豹在性成熟的早期逐渐发育区别性的鞍形(saddle)或竖琴(harp)形印记。
实施例7重金属含量和PCBs分析通过PSC Analytical Services(Bedford，NS，加拿大)进行痕量金属(USEPA方法#3050B)、汞(USEPA方法#245.5)和多氯联苯(PCBs)的ICP-质谱分析。
对由海豹油、鱼油(Omegaven)和大豆油(Intralipid)制备的五种油样品和三种脂质乳液样品进行测试。所有样品均没有发现可检测含量的重金属和PCBs。
实施例8影响海豹油乳液品质的各种因素通过监测乳液中油滴的粒度来评价物理稳定性。试验在加速条件、高速离心或在高温条件下进行。在15℃下对乳液样品(10mL)进行在41,600g下的高速离心处理一周。每天收集乳液的等分试样(50μL)，进行颗粒粒度分析。在独立的一组实验中，将乳液样品(10mL)保持在37、45和60℃的水浴中5天。每24小时间隔，取出样品的等分试样(50μL)，进行颗粒粒度分析。
通过过氧化值来定义化学稳定性。将乳液样品保持在37℃的试管中。第0、1、2、3和4天收集样品并且分析过氧化值。
将乳液0.2mL添加至1.5mL异辛烷/异丙醇(3∶2，v/v)中。将混合物涡旋约30秒并且在2000xg下离心2min。收集顶层(20μL)，并且与2.8mL甲醇/1-丁醇(2∶1，v/v)和15μL硫氰酸盐/Fe2+溶液*混合。然后将混合物涡旋。在室温下保温20min之后，测定510nm下的吸光度。根据由一系列已知浓度的氢过氧化枯烯获得的标准曲线，测定过氧化物的浓度。
*硫氰酸盐/Fe2+溶液通过将3.94M硫氰酸盐溶液与0.072M Fe2+溶液以1∶1的比混合来制备。
8.1.卵磷脂与海豹油之比对油滴粒度的影响如前所述，油滴粒度是乳液的特征之一。我们发现使用的表面活性剂(卵磷脂)对所形成的油滴的粒度有影响。如图1所示，随着卵磷脂与油的比例降低，油滴粒度增加。
8.2.pH对表面电荷的影响已知油滴表面上的电荷对乳液的稳定性具有影响。高电荷使油滴彼此相互排斥。结果，油滴能够在乳液中停留较长时间。使用ζ电势来定义油滴表面上的电荷。测定海豹油乳液在不同pH条件下的ζ电势并且结果示于图2。该结果证实随着乳液的pH增加，ζ电势增加。
8.3.pH对过氧化的影响海豹油中含有多不饱和脂肪酸，它们易于过氧化。氧化脂肪酸与癌症、心血管疾病和炎性过程有关。对于含不饱和脂肪酸的油而言，首要关心的是脂肪酸的过氧化问题。已知过氧化反应的程度和/或速率受许多因素的影响，包括pH。评价pH对海豹油乳液的过氧化物的影响并且结果示于图3。结果显示当乳液的pH为～7或pH＜3时，过氧化反应缓慢。当pH在4-6之间时发生更多的过氧化反应。
基于上述结果，选择磷酸盐缓冲剂来控制乳液pH为7。所用的K2HPO4的浓度为2.5mM。在此pH下，发现ζ电势在35-42mV范围。虽然较高浓度的磷酸盐缓冲剂可以增加缓冲能力，但它还会增加溶液的离子强度，从而可以导致ζ电势的快速降低，这是不期望的。
8.4抗氧化剂和螯合剂对过氧化物的影响图4显示了在维生素E(作为抗氧化剂)、EDTA及维生素E/EDTA一起不存在或存在时，海豹油乳液的过氧化结果。结果显示，EDTA和维生素E都可显著地降低过氧化反应。EDTA和维生素E的结合非常有效。据报导，卵磷脂(来自蛋或大豆)中存在痕量的过渡金属离子如Cu2+和Fe3+。已知这些金属离子对氧化反应是优越的催化剂。据信，诸如EDTA的螯合剂能够与金属离子形成络合物。结果，离子所催化的反应受到抑制。然而，在待输注至患者血浆中的产品中存在大量的EDTA是不期望的。为找出EDTA在海豹油脂质乳液中的最低有效浓度，测试不同量的EDTA。据发现，当EDTA的浓度高于2×10-6M时，过氧化反应被消除(图5)。因此，所有海豹油乳液制品选择这个浓度。维生素E的浓度为0.02％，其与鱼油乳液(Omegaven)的数值是相同的。
实施例910％海豹油乳液的表征9.1.颗粒粒度和ζ电势均匀的颗粒粒度是乳液的理想特性。已知ζ电势影响乳液的稳定性。因此，评价采用不同组分和在不同条件下制备的海豹油乳液的颗粒粒度和ζ电势。
通过颗粒分析仪Delsa 440SX(Beckman Coulter制造，Fullerton，California，USA)，分析按照实施例4制备的10％海豹油乳液的颗粒粒度和ζ电势，发现结果分别为320±40nm和44.7±15.3mV。乳液的pH通过pH计测定发现是7.5±0.5。
9.2.无菌性试验通过Health Care Corporation的医药微生物实验室(St.John′s，Newfoundland and Labrador，加拿大)来检查无菌性。无菌性试验证明，产品不含任何细菌污染。表4汇总了不同批次的海豹油和使用这些海豹油产品按照实施例4制备的10％海豹油乳液的无菌性检查结果。
表4无菌性试验

9.3.内毒素试验鲎变形细胞溶解物试验从Associates of Cape Cod Incorporated(Cape Cod，Massachusetts，USA)购买内毒素标准样(0.2ng/mL)和LAL试剂盒。将注射用无菌水USP(10mL/vial，Baxter加拿大，Mississauga，Ontario，加拿大)作为负对照。将内毒素标准样(0.2ng/mL)稀释至0.1、0.05、0.025和0.0125ng/mL。将实施例4的10％海豹油乳液也稀释至2、4、8、16和32倍。为进行试验，将0.1mL的负对照、内毒素标准样(0.2，0.1，0.05，0.025和0.0125ng/mL)或海豹油乳液及其稀释样品添加至0.1mL的LAL试剂盒中。将样品摇动完全混合。将样品在37±1℃下保温1小时并且检测。通过凝胶的形成来指示内毒素的存在。
体外内毒素试验(LAL化验)表明，海豹油乳液是非致热性的(＜0.006ng/mL或10EU/ng)。
实施例10海豹油、植物油和鱼油乳液的化学稳定性比较按照实施例8描述的过程测试10％海豹油乳液(按实施例4所述制备)、可商购获得的植物油乳液(Intralipi)和可商购获得的鱼油乳液(Omegaven)的化学稳定性(定义为过氧化程度)并且进行比较。结果示于图6，结果证明海豹油乳液比植物油或鱼油乳液都更稳定。Intralipid和Omegaven都是Fresenius-Kabi的商品名称。
实施例11高压灭菌处理对海豹油乳液的物理和化学稳定性的影响由于海豹油乳液制剂欲用于静脉内输注，因此需要进行高压灭菌处理，以便灭活细菌和其它病原体。因为海豹油的多不饱和脂肪酸对高温和压力不稳定，因而对乳液的高压灭菌后样品进行化学和物理稳定性的再检查是必要的。将五种海豹油乳液制品(各自20mL，海豹油得自不同年龄的海豹并且通过不同技术加工，并且按实施例4所述制备乳液)在121℃的高压灭菌条件下处理0、10、20、30、60分钟。检测样品的颗粒粒度、ζ电势和过氧化反应的速率(图7、8、9和10)。结果说明，在所有样品中测定的参数没有显著变化。根据US药典，高压灭菌体积为500mL的可注射制品需要30分钟。这些实验中所用的高压灭菌条件清楚地证明了海豹油乳液制剂的稳定性。
实施例12海豹油和鱼油乳液的比较比较按实施例4所述制备的10％海豹油乳液和可商购获得的鱼油乳液(Omegaven)的性能。
表5制剂比较

表6Omegaven和10％海豹油乳液的特征比较

实施例13急性毒性测试使用SD大鼠并且将大鼠分成两组，每组三只动物。在10天的期限内，通过尾部静脉给动物输注海豹油或者鱼油乳液每天1小时。海豹油或鱼油乳液的剂量比Omegaven每日推荐剂量(0.1g/kg/天)高10倍(1g/kg体重/天)。对照组用盐水溶液处理。10天的输注之后，将每只动物杀死并且收集包括肾、心和肝的组织、将这些组织固定并且通过Health Care Corporation的Pathology Lab(St.John′s)进行病理学检查。肾、肝、GI道和心中的所有组织(对照、饲喂Omegaven和海豹油乳液)都类似，没有肝沉积脂质。在大鼠模型中没有观察到急性毒性。
对本发明进行了描述，显然同样的问题可以通过很多方式改变。这些改变不认为是脱离了本发明的实质和范围，并且所用这些对本领域技术人员而言显而易见的改进被包括在以下权利要求的范围内。
权利要求
1.一种脂质乳液，该乳液含有(d)5-40wt％的纯化海豹油；(e)0.5-5wt％的乳化剂，和(f)水，其中所述乳液的最终pH为6.0-9.0。
2.根据权利要求1的脂质乳液，还含有2-5wt％的渗透性改进剂。
3.根据权利要求2的脂质乳液，其中所述渗透性改进剂是甘油。
4.根据权利要求1、2或3任一项的脂质乳液，还含有0.002-1.0％的抗氧化剂。
5.根据权利要求1、2、3或4任一项的脂质乳液，还含有1×10-6M至5×10-5M的EDTA。
6.根据权利要求1、2、3、4或5任一项的脂质乳液，其中所述乳化剂是卵磷脂。
7.一种营养组合物，该组合物含有(c)含5-40wt％的纯化海豹油、0.5-5wt％的乳化剂和水的脂质乳液，和(d)一种或多种营养化合物，其中所述组合物的最终pH为6.0-9.0。
8.根据权利要求7的营养组合物，还含有2-5wt％的渗透性改进剂。
9.根据权利要求8的营养组合物，其中所述渗透性改进剂是甘油。
10.权利要求7、8或9任一项的营养组合物，还含有0.002-1.0％的抗氧化剂。
11.根据权利要求7、8、9或10任一项的营养组合物，还含有1×10-6M至5×10-5M的EDTA。
12.根据权利要求7、8、9、10或11的营养组合物，其中所述乳化剂是卵磷脂。
13.一种含有权利要求1、2、3、4、5或6任一项的脂质乳液和一种或多种治疗性化合物的组合物。
14.一种含有权利要求1、2、3、4、5或6任一项的脂质乳液和一种或多种诊断性化合物的组合物。
15.权利要求1、2、3、4、5或6任一项的脂质乳液用于制备营养组合物的用途。
16.权利要求1、2、3、4、5或6任一项的脂质乳液用于制备治疗性组合物的用途，其中所述治疗性组合物用于将一种或多种治疗性化合物传递给需要的患者。
17.权利要求1、2、3、4、5或6任一项的脂质乳液用于制备诊断性组合物的用途，其中所述诊断性组合物用于将一种或多种诊断性化合物传递给需要的患者。
18.权利要求1、2、3、4、5或6任一项的脂质乳液在需要的患者的总肠胃外营养中的用途。
19.根据权利要求18的用途，其中配制所述乳液，以与含有植物油的第二种乳液组合施用。
20.权利要求7、8、9、10、11或12任一项的营养组合物在需要的患者的总肠胃外营养中的用途。
21.根据权利要求20的用途，其中配制所述组合物，以与含有植物油的第二种乳液组合施用。
22.权利要求13的组合物用于将一种或多种治疗性化合物肠胃外传递给需要的患者的用途。
23.权利要求14的组合物用于将一种或多种诊断性化合物肠胃外传递给需要的患者的用途。
全文摘要
本发明提供海豹油基脂质乳液，其富含长链ω－3脂肪酸。本发明还提供制备乳液的方法和该乳液在临床各种应用中的用途，包括在总肠胃外营养中的应用。
文档编号A61K9/00GK1620253SQ02828069
公开日2005年5月25日 申请日期2002年12月23日 优先权日2001年12月27日
发明者刘虎, 王力力, M·卡拉 申请人:创世纪集团公司