β－淀粉样蛋白结合因子及其抑制剂的制作方法

专利名称：β－淀粉样蛋白结合因子及其抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合β-淀粉样蛋白的VEGF多肽。本发明还涉及螯合β-淀粉样蛋白的化合物。反过来说，本发明涉及螯合VEGF的化合物。因此，本发明还涉及筛选一种化合物的方法，该化合物可抑制VEGF与β-淀粉样蛋白的结合。另外，本发明涉及诊断和治疗阿尔茨海默氏病以及治疗血管生成过多的方法。
b)相关技术阿尔茨海默氏病(AD)是老年人痴呆的最常见病因，它是临床特征在于认知能力进行性丧失的中枢神经系统综合病症。AD的病理学特点是，细胞外老年斑，细胞内神经原纤维缠结，神经元丢失，大脑淀粉样蛋白血管病，以及脑部一些区域的脑血管变性(Marti等，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95(26)15809-15814；Yamada M.，Neuropathology 2000，20(1)8-22；YanknerBA，Neuron 1996，16(5)921-932)。β-淀粉样蛋白(Aβ)是老年斑的主要成分，由蛋白水解裂解淀粉样前体蛋白产生(Vassar等，Neuron 2000，27(3)419-422)。尽管积累的证据表明Aβ是AD的关键性致病剂(Calhoun等，Nature1998，395(6704)755-756；Hardy等，Science 1992，256(5054)184-185；Hsiao等，Science 1996，274(5284)99-102；Lewis等，Science 2001，293(5534)1487-1491；Schenk等，Nature 1999，400(6740)173-177；SommerB.，Curr Opin Pharmacol 2002，2(1)87-92；Thomas等，Nature 1996，380(6570)168-171)，但是AD中神经元变性的确切机制尚不清楚。尽管如此，很可能多种因素与该疾病的形成相关。
AD的大多数病例伴随着脑血管病变，例如脑淀粉样蛋白血管病，内皮变性，和血流灌注不足(de la Torre JC.Stroke2002，33(4)1152-1162；KalariaRN.Neurobiol Aging 2000，21(2)321-330；Kokmen等，Neurology 1996，46(1)154-159；Snowdon等，JAMA 1997，277(10)813-817；Thomas等，Nature1996，380(6570)168-171)。已知与脑血管疾病和中风相关联的血管危险因素，例如高血压，动脉粥样硬化，糖尿病，和心脏病，明显增加形成AD的危险。这些血管病中大多数引起通常在AD患者中出现的大脑局部缺血。这些观察结果表明脑血管机能障碍可能在AD的神经变性级联中起重要作用。
血管内皮生长因子(VEGF)是包括渗透性过高，内皮细胞生长，和葡萄糖运输增强的血管功能的主要调节剂。VEGF也在生理性血管形成和诸如肿瘤生长和局部缺血疾病等病理性新血管生成中起关键作用(Ferrara N.，Am JPhysiol Cell Physiol 2001，280(6)C1358-C1366；Harrigan等，Neurosurgery2002，50(3)589-598；Plate等，Nature 1992，359(6398)845-848；Shweiki等，Nature 1992，359(6398)843-845；Zhang等，J Cin Invest 2000，106(7)829-838)。在包括脑的各种器官中VEGF及其受体的表达与AD中出现的低氧或低血糖应激反应而上调(Marti等，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95(26)15809-15814；Marti等，Am J Pathol 2000，156(3)965-976；Stein等，Mol Cell Biol 1995，15(10)5363-5368)。
也有报道与老年对照相比，在AD患者的脑脊液中VEGF水平升高，且患有AD的受试者中，在血管周星形细胞和脑血管壁的周围，VEGF免疫反应增强(Kalaria等，Brain Res Mol Brain Res 1998，62(1)101-105；Tarkowski等，Neurobiol Aging 2002，23(2)237-243)。而且，由于AD相关性脑血管病变引起大脑局部缺血，VEGF在神经元和神经胶质细胞中高度表达(Kalaria等，Brain Res Mol Brain Res 1998，62(1)101-105；Tarkowski等，NeurobiolAging 2002，23(2)237-243)。然而，在这些报道中，还没有确定VEGF与Aβ的直接相互作用和共同定位。
最近，报道了VEGF对局部缺血和谷氨酸诱导的兴奋毒性(excitotoxic)损伤具有神经营养以及神经保护功能(Jin等，Proc Natl Acad Sci USA 2000，97(18)10242-10247；Matsuzaki等，FASEB J2001，15(7)1218-122P；Ogunshola等，J Biol Chem 2002，277(13)11410-11415；Oosthuyse等，Nature Genet 2001，28(2)131-138；Schratzberger等，Nature Med 2000，6(4)405-413；Sondell等，J Neurosci 1999，19(14)5731-5740)。这些研究提出了这样的可能性，即VEGF可能涉及与AD相关的血管和神经元病理学。本申请描述了在患有AD的患者脑中VEGF与Aβ斑的过度积累和共同定位。体外实验表明VEGF与Aβ以高亲和性结合且与Aβ共聚集。一旦结合，VEGF以非常缓慢的速度从复合物中释放。
本领域仍然需要提供更精确和敏感的分子方法用于检测存在的B-淀粉样蛋白形成和聚集，以便可在早期检测和治疗诸如阿尔茨海默氏病等神经疾病。另外，本领域仍然需要可抑制VEGF与Aβ结合的化合物以便释放VEGF用于在脑中发挥其神经保护和神经营养活性。
发明简述本发明提供了上述问题的解决方案。本发明基于这样的惊人发现，即VEGF多肽与β-淀粉样蛋白特异性结合。阐明了可互相结合的VEGF和β-淀粉样蛋白的具体片段。且由于VEGF与β-淀粉样蛋白斑共同积累，因此本发明涉及通过使用标记的VEGF多肽或特异性结合VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物的抗体测定聚集的β-淀粉样蛋白或斑的存在。因此，本发明涉及诊断阿尔茨海默氏病或特征在于存在淀粉样蛋白斑的任何其它疾病的方法。
本发明还涉及根据VEGF多肽设计的，可结合并吸收自由流动的B-淀粉样蛋白，从而导致β-淀粉样蛋白不能聚集的多肽。反过来，在另一实施方案中，本发明涉及基于β-淀粉样蛋白序列设计的，用于螯合并失活VEGF的多肽，其中该多肽有利于从环境中去掉VEGF，以治疗或预防由过度的血管生成引起的疾病，例如癌症，动脉粥样硬化，类风湿性关节炎，子宫内膜异位，肾病或肥胖，及其它疾病。
具体地说，本发明涉及特异性结合肝素和β-淀粉样蛋白的β-淀粉样蛋白结合多肽(β-ABP)，其中该多肽不是SEQ ID NO5。该多肽可与SEQ ID NO3具有至少85％的序列相同性，与SEQ ID NO3具有至少90％，95％，或至少97％的序列相同性。具体地说，该多肽以SEQ ID NO3表示，且可从N-末端或C-末端增加或减少大约5个氨基酸。而且，该多肽可与β-淀粉样蛋白上的一个区域特异性结合，该区域从SEQ ID NO4的大约位置25的Gly残基到大约位置35的Met残基。
该多肽对β-淀粉样蛋白的结合亲和性以解离常数表示为大约10nM，1nM或100pM。
本发明还涉及特异性结合上述多肽的抗体。该抗体可以是对上述多肽特异性的单克隆抗体。
本发明涉及编码上述多肽的分离核酸。另外，本发明涉及含有该核酸的表达载体。此外，本发明涉及含有该表达载体的宿主细胞。
本发明还涉及预防β-淀粉样蛋白与内源性VEGF之间结合的方法，包括(a)产生含有与启动子可操作地连接的编码VEGF多肽的DNA序列的重组病毒或质粒载体；和(b)给需要的患者施用该病毒或质粒载体，以便所述DNA序列在脑内的表达导致β-淀粉样蛋白和VEGF多肽之间结合。
在另一实施方案中，本发明涉及在血管生成过多的区域灭活内源性VEGF的方法，包括(a)产生含有与启动子可操作地连接的编码β-淀粉样蛋白多肽的DNA序列的重组病毒或质粒载体；和(b)给需要的患者施用该病毒或质粒载体，以便所述DNA序列在血管生成过多的位点的表达导致β-淀粉样蛋白和内源性VEGF之间结合。
在另一实施方案中，本发明涉及测定VEGF多肽与β-淀粉样蛋白的结合的方法，包含(a)给怀疑含有β-淀粉样蛋白的样品提供VEGF；和(b)如果样品中存在β-淀粉样蛋白，则检测VEGF与β-淀粉样蛋白的结合。
在该方法中，该多肽可与聚集前的(pre-aggregated)β-淀粉样蛋白结合。另外，该多肽可与细胞外斑(plaque)结合。另外，在该方法中，该多肽是VEGF的肝素结合区。此外，该多肽实质上是肝素结合区的C-末端半分子。
本发明的另一实施方案涉及诊断由存在淀粉样蛋白斑指示的疾病的方法，包括(a)提供怀疑含有淀粉样蛋白斑的样品组织；(b)将所述的样品组织与能够特异性结合β-淀粉样蛋白的VEGF多肽接触；和(c)检测所述多肽与所述淀粉样蛋白斑的结合，其中结合指示为患病状态。
在该方法中，VEGF多肽可以是β-淀粉样结合多肽(β-ABP)。另外，可标记该多肽。此外，在上述方法的步骤(c)中，所述的检测通过检测特异性结合所述VEGF多肽，β-淀粉样蛋白，或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物之一的配体实现，其中标记了所述的配体。
本发明还涉及诊断试剂盒，包括(a)一种容器，包含特异性结合β-淀粉样蛋白的VEGF多肽；(b)与所述VEGF多肽，β-淀粉样蛋白，或多肽/β-淀粉样蛋白复合物特异性结合的第一配体；(c)与所述第一配体特异性结合的标记的第二配体；和(d)其使用说明。
本发明涉及预防VEGF与β-淀粉样蛋白之间结合的方法，包括提供抑制VEGF和β-淀粉样蛋白之间的相互作用的化合物。在该方法中，给患有由淀粉样蛋白斑形成指示的疾病的哺乳动物提供该化合物。该化合物可以是包含具有酚或硫酸取代基的糖主链的单体或多聚体。另外，该化合物可以是儿茶素或儿茶素酚化合物。
在另一实施方案中，本发明涉及筛选抑制VEGF/β-淀粉样蛋白结合的化合物的方法，包括(a)将化合物与含有VEGF和β-淀粉样蛋白的样品接触；(b)在VEGF与β-淀粉样蛋白正常情况下特异性互相结合的条件下测定VEGF与β-淀粉样蛋白的结合水平；(c)在存在所述化合物的条件下测定VEGF与β-淀粉样蛋白的结合水平；并比较(a)和(b)部分中所述的VEGF与β-淀粉样蛋白的结合水平，其中如果(c)中所述水平比(b)的低，则所述的化合物是VEGF/β-淀粉样蛋白结合的抑制剂。
本发明还涉及治疗阿尔茨海默氏病的方法，包括给需要的人施用治疗有效量的抑制VEGF与β-淀粉样蛋白之间结合的化合物。
本发明还涉及含有β-淀粉样蛋白多肽的分离的分子，它能结合VEGF以形成无功能的复合物，它包含(a)含有包含与VEGF结合的β-淀粉样蛋白多肽的氨基酸序列的第一多肽组分；和(b)多聚化组分。
本发明涉及形成VEGF的无功能复合物的方法，包括将怀疑含有VEGF的样品与上述分子接触。
本发明涉及含有VEGF多肽的分离的分子，它能够结合β-淀粉样蛋白以形成无功能复合物，且包含(a)含有包含与β-淀粉样蛋白多肽结合的VEGF多肽的氨基酸序列的第一多肽组分；和(b)多聚化组分。
另外，本发明涉及形成β-淀粉样蛋白的无功能复合物的方法，包括将怀疑含有β-淀粉样蛋白的样品与上述分子接触。
从本发明下面的描述，参照其附图和所附的权利要求书将能更充分地理解本发明的这些及其它主题。


从本文下面给出的详细描述，和仅以例证的方式给出且因此不限制本发明的附图将能更充分地理解本发明，且其中图1A-1G显示了患有AD的人受试者大脑皮层中Aβ和VEGF的共同定位。AD患者(70岁，男性，Braak stage VI，A，B)和老年正常受试者(85岁，男性，C，D)的脑切片用VEGF抗体(A，C)和刚果红(B，D)染色。箭头表示嗜刚果红斑。另一AD患者的脑切片(80岁，男性，Braak stage VI)用Aβ抗体(E)和VEGF抗体(F)进行双重免疫染色，并重叠其图像(G)。箭头表示的位点也用刚果红染色(数据未显示)。注意VEGF的浓染色区以及两者之间的匹配模式。放大率400x。显示了来自老年正常受试者(n＝4)和AD患者(n＝7)的代表性数据。
图2A-2C显示了VEGF与Aβs的特异性结合。A和B，已知的Aβ-结合蛋白和VEGF与固定在CM5感应芯片上的Aβ肽相互作用的胞质团(Plasmon)共振分析。RU，共振单位。A，已知的Aβ-结合蛋白和VEGF与Aβ肽的结合。α2M，α2-巨球蛋白；α1ACT，α1-抗胰凝乳蛋白酶；SAP，血清淀粉样蛋白P成份；ApoE4，载脂蛋白E4。B，应用于固定化Aβ1-40上的各种浓度的VEGF的感应图(Sensorgrams)。用Aβ1-42获得了相似的结合感应图(数据未显示)。C，未标记的VEGF抑制125I-VEGF结合固定的Aβ1-40。用固定的Aβ1-42获得了相似的抑制模式(数据未显示)。所有值表示为平均值±SEM。
图3A-3C显示了VEGF与Aβ的共聚集。A，VEGF与Aβ1-40共聚集而不与Aβ40-1共聚集。离心后在沉淀中出现大约相同比例的输入Aβ1-40和标记VEGF。*，P＝0.0076。B，VEGF对Aβ的聚集速率无影响。显示了温育单独的Aβ1-40(■，实线)以及温育Aβ1-40与VEGF(▲，虚线)在不同温育时间点后的可沉积Aβ。C，VEGF与聚集前的，而不是新溶解的Aβ1-40有效共沉淀。结果表明VEGF与聚集前的Aβ结合。**，P＜0.0001。所有值都表示为平均值±SEM。
图4A-4B显示了从Aβ/VEGF共聚集体缓慢释放VEGF。A，VEGF从Aβ/VEGF共聚集体中缓慢解离。插图，注意3天后从共聚集体中释放不超过1.5％的VEGF。所有值都表示为平均值±SEM。B，Aβ/VEGF复合物对SDS处理敏感。显示了在非还原条件下对A中获得的沉淀进行SDS-PAGE后的放射自显影图。泳道1单独的125I-VEGF。泳道2Aβ/125I-VEGF复合物。左侧的数字表示分子量大小标记的位置。注意与单独的VEGF相比在Aβ/VEGF复合物中无增加的带。
图5显示了Aβ主要与VEGF的肝素结合区的C-末端(29-55氨基酸)区结合。Aβ与肝素结合区的C-末端亚区结合，而不与肝素结合区的N-末端半分子结合。所有值都表示为平均值±SEM。GST-HBD与GST融合的完整肝素结合区，GST-NHBD与GST融合的肝素结合区的N-末端半分子(氨基酸1-29)；GST-CHBD与GST融合的肝素结合区的C-末端半分子(氨基酸29-55)。
图6显示了VEGF与Aβ的残基25-35结合。在试验的各种部分Aβ片段中，Aβ25-35与Aβ竞争结合固定的VEGFl65。该结果表明Aβ25-35很可能是VEGF的结合位点。
图7显示了肝素抑制Aβ与VEGF的结合。GST-肝素结合区固定在微量滴定孔上并测定在不含或存在肝素的条件下生物素标记的Aβ1-42的结合。随着肝素浓度增加，生物素标记的Aβ与肝素结合区的结合受到抑制。IC50≅25ng/ml.]]>图8显示了Aβ与VEGF的结合受到黄棓酰单宁(PGG)，表儿茶素没食子酸盐(EGCG)和鞣酸的抑制。将VEGF165(50ng/孔)覆盖在塑料孔上且在浓度递增的PGG，EGCG或鞣酸存在下加入生物素标记的Aβ(100ng/ml)。与VEGF165结合的经生物素标记的Aβ，通过与偶联了辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白的相互作用来检测。
优选实施方案详述在本申请中，“一”和“一个”用于指单个和多个对象。
本文使用的“大约”或“基本上”通常为防止被局限于确切的数字提供了余地。例如，在多肽序列长度背景中使用的“大约”或“基本上”表示该多肽不局限于列举的氨基酸数目。可包括在N-末端或C-末端添加或减去几个氨基酸，只要其仍具有诸如结合活性等功能活性。
本文使用的一种或多种其它治疗剂的“组合”给药包括同时(并行)和以任何顺序连续的给药。
本文使用的“氨基酸”和“多个氨基酸”是指所有天然存在的L-α-氨基酸。该定义意味着包括正亮氨酸，鸟氨酸，和高半胱氨酸。
一般来说，本文使用的术语“氨基酸序列变异体"是指与参照(例如，天然序列)多肽相比在其氨基酸序列中具有一些差异的分子。氨基酸变更可以是在天然氨基酸序列中的取代，插入，缺失或这些改变的任何所需组合。
取代变异体是去掉了天然序列中至少一个氨基酸残基且在相同位置插入一个不同的氨基酸代替的变异体。该取代可以是只取代了分子中的一个氨基酸的单一取代，或者可以是在相同分子中取代了两个或多个氨基酸的多重取代。
序列内的氨基酸取代可选自该氨基酸所属类型中的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本发明范围内还包括表现出相同或相似生物学活性的蛋白质或其片段或衍生物和在翻译期间或之后通过例如，糖基化，蛋白水解裂解，与抗体分子或其它细胞配体连接等方式差别修饰的衍生物。
插入变异体是在天然氨基酸序列中紧靠特定位置的氨基酸插入了一个或多个氨基酸的变异体。紧靠一个氨基酸意思是与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团之一连接。
缺失变异体是指去掉了天然氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的变异体。一般来说，缺失变异体在该分子的特定区域缺失了一个或两个氨基酸。
在一个方面，本发明的多肽变异体可在多肽的非-β-淀粉样蛋白结合区或非-VEGF结合区含有任意数目的氨基酸或氨基酸变更，包括在该多肽分子的任何其它区域的取代和/或插入和/或缺失，只要该多肽变异体包含与SEQ IDNO3或SEQ ID NO4表示的多肽序列具有至少大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列，且存在该变异不会妨碍VEGF多肽与β-淀粉样蛋白和β-淀粉样蛋白多肽与VEGF的特异性结合。
本文使用的“β-淀粉样蛋白结合多肽”或“β-ABP”是指特异性结合β-淀粉样蛋白且与SEQ ID NO3表示的多肽序列具有至少大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同性的多肽。具体地说，β-ABP结合β-淀粉样蛋白从大约残基25开始到大约残基35的区域。另外，β-ABP可在N-末端或C-末端的任一端从SEQ ID NO3的核心多肽增加或减少大约0到10个氨基酸，大约0到5个氨基酸，或者从0到4个，或者从0到3个，或者从0到2个，或者从0到1个氨基酸。
本文使用的“β-淀粉样蛋白多肽”是指从β-淀粉样蛋白产生的多肽，但不限于来自β-淀粉样蛋白的具体序列。应理解可容忍各种突变和保守氨基酸改变，以及一些非保守氨基酸改变，只要该多肽能结合VEGF即可。片段和一些糖基化也是允许的，事实上对β-淀粉样蛋白多肽的几乎任何改变都是允许的，只要该多肽保留了结合VEGF的能力。
申请人首次发现了β-淀粉样蛋白与VEGF结合，因此，对该序列作出一些改变，且保留与β-淀粉样蛋白结合的能力在本领域的技术人员的能力范围内。具体地说，当用于捕获结构以便与VEGF形成无功能复合物时，可使用各种β-淀粉样蛋白序列，包括与SEQ ID NO4所示的多肽具有大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列相同性的分子。另外，该多肽可以是全长1-40或1-42氨基酸的β-淀粉样蛋白或者可包括诸如区域25-35等片段。
本文使用的术语“在高度严格条件下能够杂交”是指在高度严格条件下与目的DNA互补的DNA链退火。同样，“在低度严格条件下能够杂交”是指在低度严格条件下与目的DNA互补的DNA链退火。用于退火过程的“高度严格条件”可包括，例如，不利于错配碱基对之间的氢键连接的高温和/或低盐含量。“低度严格条件”可包括比高度严格条件更低的温度，和/或更高的盐浓度。该条件允许在两条链之间存在基本互补性，尽管不是几乎完全互补时两条DNA链可退火，例如在编码同一蛋白质但是由于遗传密码的简并性在序列上有区别的DNA链之间的情况。例如，在大约45℃的6xSSC中促进DNA杂交，接着在50℃的2x SSC中洗涤的合适的严格条件是本领域的技术人员已知的或者可参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y.(1989)，6.31-6.3.6。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可选自从50℃下大约2x SSC的低度严格条件到50℃下大约0.2xSSC的高度严格条件。另外，洗涤步骤中的温度可从室温，大约22℃的低度严格条件增加到大约75℃的高度严格条件。其它严格性参数在Maniatis，T.，等，Molecular CloningALaboratory Manual，冷泉港实验室出版社，Cold Spring N，Y.，(1982)，第387-389页中描述；也参见Sambrook J.等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，第2卷，冷泉港实验室出版社，Cold Spring，N.Y.，第8.46-8.47页(1989)。
本文使用的“载体”包括药用上可接受的载体，赋形剂，或者在所用剂量和浓度下对与其接触的细胞或哺乳动物无毒性的稳定剂。通常药用上可接受的载体是含水pH缓冲溶液。药用上可接受的载体的例子包括，但不限于诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸等缓冲液；抗氧化剂(包括抗坏血酸)；低分子量(不超过大约10个残基)的多肽；诸如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白等蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性多聚体；诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸等氨基酸；单糖，二糖，以及其它糖类(包括葡萄糖，甘露糖，或糊精)；诸如EDTA等螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇等糖醇；诸如钠等成盐反离子；和/或诸如TWEEN，聚乙二醇(PEG)，和PLURONICS等非离子表面活性剂。
本文使用的“共价衍生物”包括用有机蛋白或非蛋白衍生化试剂修饰天然多肽或其片段，和翻译后修饰。通过周能与选定侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂与靶氨基酸残基反应，或者通过在选定重组宿主细胞中进行的翻译后修饰的加工机制按常规可导入共价修饰。一些翻译后修饰由重组宿主细胞对表达多肽的作用引起。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常在翻译后脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。另外，这些残基在适度酸性条件下脱酰胺基。在本发明的B-淀粉样蛋白或VEGF结合多肽中可能存在这些残基的任一形式。其它翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰，酪氨酸或苏氨酰残基的羟基磷酸化，赖氨酸，精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86页(1983))。
本文使用的“有效量”是指足以实现有益的或所需的临床或生化结果的量。有效量可一次或多次给药。为了本发明的目的，抑制剂化合物的有效量是指足以减轻，改善，稳定，逆转，减缓或延迟该疾病状态进行的量。在本发明优选的实施方案中，“有效量”定义为能够防止VEGF与β-淀粉样蛋白或淀粉样蛋白斑结合的化合物的量。在另一实施方案中，“有效量”定义为VEGF的神经营养和神经保护有效量。在另一实施方案中，“有效量”可以是结合和螯合自由流动的未聚集的β-淀粉样蛋白使其不能反应的VEGF多肽的量。在本发明的另一实施方案中，“有效量”可指在需要防止或减少血管生成的情况下足以结合和螯合VEGF并使其在进一步的反应中失活的β-淀粉样蛋白多肽的量。
本文使用的“片段”是指保留了可用的和有功能的特征的多肽的一部分。例如，在本发明说明书中使用的多肽片段具有结合β-淀粉样蛋白，聚集前的β-淀粉样蛋白，或含有β-淀粉样蛋白的斑块的功能。另外，β-淀粉样蛋白的片段可与VEGF结合。
本文使用的“GFP”是指绿色荧光蛋白。
本文使用的“GST”是指谷胱甘肽S转移酶。
本文使用的“宿主细胞”包括可以是或者已成为本发明载体的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且该后代由于天然，偶然，或故意突变和/或改变可不必与原始亲代细胞完全相同(在形态学上或在总DNA成份上)。宿主细胞包括用含有编码血管生成因子的多核苷酸的载体体内转染或感染的细胞。
本文使用的“免疫组织化学”是指测量各种组织中特定蛋白质水平的方法。
本文使用的“免疫沉淀”是指定量测量蛋白质表达水平和定性多肽间相互作用的生物学方法。
本文使用的“抑制剂”是指抑制VEGF与β-淀粉样蛋白结合的分子。
本文使用的“配体”是指与诸如多肽等分子共价或瞬时特异性结合的任何分子或试剂，或者化合物。在一些上下文中使用的配体可包括抗体。在另一上下文中，“配体”可指在诸如配体捕获中寻找被另一分子以高亲和性结合的分子。
本文使用的用于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类，家畜和农场动物，和动物园，运动场，或宠物动物，例如狗，猫，牛，马，绵羊，猪，等等。优选地，该哺乳动物是人。
本文使用的“midkine”是指主要在胎儿中出现表达的结合肝素的神经营养生长因子。
本文使用的“纯化的”或“分离的”分子是指从其天然环境中取出的和分离或分开的且不含与其天然相联的其它成份的生物学分子。
本文使用的“样品”或“生物学样品”是指其最广义，且包括根据需要进行的试验类型从可能含有β-淀粉样蛋白或VEGF的个体，体液，细胞系，组织培养物，或其它来源获得的任何生物学样品。因此，生物学样品包括体液，例如精液，淋巴，血清，血浆，尿，滑液，脊髓液等等。从哺乳动物获得组织活检标本和体液的方法是本领域熟知的。脑组织的活检标本是优选的来源。
在该生物学样品中，也可通过成像在体内检测该多肽。用于蛋白质的体内成像的标记包括通过X-射线照相术，NMR或ESR检测的那些标记。对于X-射线照相术，合适的标记包括诸如钡或铯等放射性同位素，它们发出可检测的射线但对受试者无明显伤害。NMR和ESR的合适标记包括诸如氘等具有可检测的特征性自旋的那些标记，可使用常规技术通过标记将它们掺入多肽中。
另外，从患者获得的“生物学样品”可称为“生物学样品”或“患者样品”。可以理解，分析“患者样品”不必取出患者的细胞或组织。例如，可给受试者注射合适标记的多肽(例如，结合β-淀粉样蛋白的抗体或多肽，例如VEGF多肽，VEGF的肝素结合区或β-ABP)并使用标准成像技术(例如，CAT，NMR，EPR，PET等)观察(当与靶结合时)。
本文使用的“序列相同性”定义为在对位排列该序列并按需要导入间隔以达到最大序列相同性百分数，且任何保守取代都不作为序列相同性部分后与天然多肽序列中氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基百分数。％序列相同性值通过NCBI BLAST2.0软件按Altschul等，(1997)，“Gapped BLASTand PSI-BLASTa new generation of protein database search programs”，NucleicAcids Res.，253389-3402的限定产生。除了错配扣分设定为-1外，参数都设定为默认值。
本文使用的术语“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合结合反应，例如，与抗原免疫反应的抗体分子之间，或与诸如β-淀粉样蛋白等另一多肽反应的非抗体配体。另外，该特异性结合也可在化学化合物或小肽与VEGF之间发生。
本文使用的“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。
本文使用的“治疗”是获得有益的或所需的临床效果的方案。为了本发明的目的，有益的或所需的临床效果包括，但不限于，症状减轻，疾病程度减轻，疾病状态稳定(即，不恶化)，疾病进展延迟或减缓，疾病状态的改善或减轻，和缓解(无论部分或总体)，而不论该效果是可检测的还是不能检测的。“治疗”也可指与不接受治疗时预期的存活期相比存活期延长。“治疗”是指治疗性处理和预防性措施。需要治疗的情况包括已患有疾病的情况以及需要预防该疾病的情况。“减轻”疾病是指与无治疗的情况相比，疾病状态的程度和/或不希望的临床表现减轻和/或该疾病进行的时间过程减缓或延长。
本文使用的“载体”，“多核苷酸载体”，“构建体”和“多核苷酸构建体”在本文中可互换使用。本发明的多核苷酸载体可以是一些形式中的任一种，包括，但不限于，RNA，DNA，包入逆转录病毒衣壳中的RNA，包入腺病毒衣壳中的DNA，在另一病毒或病毒样形式(例如，单纯疱疹病毒，和腺伴随病毒(AAV))中包装的DNA，包入脂质体中的DNA，与聚赖氨酸复合的，与合成聚阳离子分子复合的，与诸如聚乙二醇(PEG)等化合物复合以便在免疫学上“屏蔽”该分子和/或延长半寿期的，或者与非病毒蛋白质偶联的DNA。优选地，该多核苷酸是DNA。本文使用的“DNA”不仅包括碱基A，T，C，和G，而且包括其任一类似物或这些碱基的修饰形式，例如甲基化核苷酸，核苷酸间修饰，例如不带电荷的连接和thioates，使用糖类似物，和修饰的和/或选择的主链结构，例如聚酰胺。
本文使用的“VEGF多肽”是指来自于VEGF的多肽，但不限于来自VEGF的具体序列。应理解可容忍各种突变和保守氨基酸改变，以及一些非保守氨基酸改变，只要该多肽能与β-淀粉样蛋白结合。片段和一些糖基化也是允许的，事实上几乎对VEGF多肽的任何改变都是允许的，只要该多肽保留了结合β-淀粉样蛋白的能力。在另一实施方案中该多肽也结合肝素。应明白，申请人首次发现VEGF且特别是其肝素结合区与β-淀粉样蛋白结合，因此对该序列进行一些突变而保留其与β-淀粉样蛋白结合的能力在本领域的技术人员的技能范围内。VEGF多肽包括，但不限于，β-ABP。VEGF多肽还包括与SEQ ID NO1所示的多肽具有70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的序列相同性的多肽。
VEGF的β-淀粉样蛋白结合区VEGF前体RNA进行各种任选的RNA剪接事件，导致产生4种成熟的同型二聚体蛋白，各单体分别具有121，165，189和206个氨基酸(分别为VEGF121，VEGF 165，VEGF189和VEGF206)(Leung等，Science 1989，2461306-1309；Tischer等，J.Biol.Chem.1991，26611947-11954；Houck等，Mol.Endocrinol.1991，5，1806-1814)。其中，VEGF165是最丰富的VEGF表达同种型。在各种同种型中，VEGF165，189和206在C-末端具有肝素结合区且与细胞表面和细胞外基质中的肝素硫酸蛋白聚糖结合。VEGF121缺乏肝素结合区且不能结合硫酸肝素。VEGF的肝素结合区的作用似乎是将VEGF螯合到诸如内皮细胞等靶细胞表面并提高VEGF与其细胞表面受体的结合亲和力(Gitay-Goren等，J.Biol.Chem.1992，267，6093-6098)。事实上，VEGF165比VEGF121对其细胞表面受体具有更高的结合亲和力。另外，VEGF165的生物活性比VEGF121高100倍(Keyt等，J.Biol.Chem.1996，2717788-7795)。
VEGF的受体结合区与血小板衍生的生长因子(PDGF)和与包括神经生长因子(NGF)和转化生长因子(TGFβ)的生长因子家族在结构上相关(Ferrara等，Endocrinol Rev.1992，13，18-32；Murray-Rust等，Structure 1993，1，153-159)。然而，我们发现在所测试的一些生长因子如NGF，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，PDGF..VEGF和midkine等(Yu等，Neurosci Lett 1998，254，125-128，对于midkine的描述)中，只有VEGF和midkine与Aβ结合。尽管似乎midkine与Aβ的结合可通过肝素结合区，但是VEGF(Fairbrother等，Structure 1998，6，637-648)和midkine(Iwasaki等，EMBO J 1997，16，6936-6947)的肝素结合区似乎互不相关，因为在其各自的肝素结合区之间只有4％的序列相同性。midkine的肝素结合区的氨基酸序列如下ADCKYKFENW GACDGGTGTK VRQGTLKKAR YNAQCQETIRVTKPCTPKTK AKAKAKKGKG KD(SEQ ID NO5)。
VEGF的亚基通过两个同型亚基的不对称缔合组装成二聚体，VEGF165的两个肝素结合区暴露且可被纤溶酶选择性裂解，释放55个氨基酸的C-末端肝素结合区和110个氨基酸的VEGF主体(Fairbrother等，Structure 1998，6，637-648)。
55个氨基酸的肝素结合区的三维结构现已明确(Fairbrother等，Structure1998；6，637-648)，并提示下列残基的带正电荷的侧链与肝素结合相关Arg13，Arg14，Lys15，Lys30，Arg35，Arg39和Arg46，且Lys52，Arg54和Arg55也可能有贡献。还提示肝素多聚体中的己糖单位与肝素结合区的正电荷结合。我们发现当55个氨基酸的肝素结合区分成N-末端(大约1-29个氨基酸)和C-末端(大约29-55个氨基酸)部分时，Aβ主要与C-末端半分子结合(图5)。
VEGF165的氨基酸序列如下APMAEGGGQN HHEVVKFMDVYQRSYCHPIE TLVDIFQEYP DEIEYIFKPS CVPLMRCGGC CNDEGLECVPTEESNITMQI MRIKPHQGQH IGEMSFLQHN KCECRPKKDRARQENPCGPC SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQLELNERTCRC DKPRR(SEQ ID NO1)。VEGF165的肝素结合区具有下列序列ARQENPCGPC SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQLELNERTCRC DKPRR(SEQ ID NO2)。VEGF165的肝素结合区的例证性C-末端半分子是SEQ ID NO2的残基29-55CK NTDSRCKARQLELNERTCRC DKPRR(SEQ ID NO3)。
对1-55(VEGF165的111-165区)的肝素结合区的三维结构分析揭示了肝素结合区的1-29 N-末端部分具有反向平行的β-折叠结构(18-21，26-29)，且肝素结合区的29-55 C-末端部分具有与一个反向平行的β-折叠结构(42-44，49-51)堆积在一起的一个短的α-螺旋(33-38)区。
在本发明的一个方面，与β-淀粉样蛋白结合的VEGF多肽与SEQ IDNO1具有大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列相同性。在本发明的另一方面，与β-淀粉样蛋白结合的VEGF多肽与SEQ ID NO2的多肽具有大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列相同性。在本发明的另一方面，与β-淀粉样蛋白结合的VEGF多肽与SEQ ID NO3具有大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列相同性。在本发明的另一实施方案中，VEGF多肽保留与肝素和β-淀粉样蛋白都特异性结合，但不必同时结合的能力。多肽的长度可以是大约17至100个氨基酸长，大约17至70个氨基酸长，大约17至47个氨基酸长，大约20至45个氨基酸长，大约25至大约40个氨基酸长，大约22至32个氨基酸长，大约25至30个氨基酸长，或大约27至47个氨基酸长。
VEGF/β-淀粉样蛋白的共积累在患有AD的患者大脑中VEGF与淀粉样蛋白斑严重共积累和共定位。VEGF以高亲和力和特异性直接与Aβ肽结合。相反，在年龄匹配的受试者皮层切片中很少检测到VEGF。体外实验表明VEGF以高亲和力和特异性结合Aβs，但不能结合反向肽，即Aβ40-1。另外，Aβ与VEGF的结合不影响VEGF与表达neuropilin-1的内皮和肿瘤细胞上受体的结合，也不影响VEGF诱导的内皮细胞增殖。相反，VEGF与Aβ1-40共聚集对Aβ的聚集率无明显影响，且强烈结合聚集前的Aβ。VEGF从共聚集的Aβ/VEGF复合物中非常缓慢地释放，但是Aβ/VEGF复合物对SDS处理敏感。
令人惊奇的是作为已知最有效的血管生成因子之一的VEGF直接与Aβ以高亲和力结合，并在患有AD的患者大脑中严重积累且与Aβ斑共定位。我们的结果表明VEGF比已知结合Aβs的其它分子对Aβ1-42和Aβ1-40的结合强得多(Bohrmann等，J Biol Chem 1999，274(23)15990-15955；Hamazaki H.，J Biol Chem 1995，270(18)10392-10394；Hughes等，Proc Natl Acad Sci USA1998，95(6)3275-3280；Strittmatter等，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90(17)8098-8102)。在试验的分子中VEGF是Aβ最强的结合配偶体(KD≈50pM)，且VEGF与Aβ之间的亲和力比得上VEGF对其自身受体，即KDR/Flk-1和Flt-1的亲和力(de Vries等，Science 1992，255(5047)989-991；Terman等，Biochem Biophys Res Commun 1992，187(3)1579-1586)。
在我们的研究中，Aβs不影响VEGF的细胞结合和促分裂活性，尽管它们与VEGF以高亲和力结合。与正常老年受试者相比在AD患者大脑中VEGF与Aβ沉积物的严重积累和共定位可能是由于VEGF的高度表达，VEGF与Aβ的强烈相互作用和共聚集，和VEGF从这些复合物中释放非常缓慢共同引起。这样可引起VEGF与不溶性Aβ沉积物在AD患者大脑中持续积累和共定位。
不受理论的约束，预期在AD大脑中VEGF与Aβ斑的显著积累与脑血管机能障碍相关。大多数AD病例伴随着脑血管病，例如脑淀粉样蛋白血管病和内皮退化，表明血管机能障碍可能在AD的神经变性级联中起致病作用(de la Torre JC.Stroke 2002，33(4)1152-1162；Kalaria RN.Neurobiol Aging2000，21(2)321-330；Kokmen等，Neurology 1996，46(1)154-159；Snowdon等，JAMA 1997，277(10)813-817；Thomas等，Nature 1996，380(6570)168-171)。由于其脑血管病变，AD中脑细胞严重患有葡萄糖和氧的血流灌注不足。证据表明脑血流灌注不足是分散型和家族型AD早期的主要临床特征之一，且局部缺血性中风的病史和共存增加了AD的危险性(Kalaria RN.Neurobiol Aging 2000，21(2)321-330；Kokmen等，Neurology1996，46(1)154-159；Snowdon等，JAMA 1997，277(10)813-817)。
VEGF是血管功能的主要调节剂。VEGF是低氧症和低血糖诱导的血管生成肽。另外，低氧症诱导的VEGF及其受体可增强血管生成和脑血管灌注，且显著改善脑局部缺血的神经恢复(Harrigan等，Neurosurgery 2002，50(3)589-598；Marti等，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95(26)15809-15814；Zhang等，J Clin Invest 2000，106(7)829-838)。最近的研究表明VEGF具有其它活性，例如在低氧症和葡萄糖缺乏状况下的神经营养功能以及对谷氨酸毒性和局部缺血性外周神经病的神经保护功能(Jin等，Proc Natl Acad SciUSA 2000，97(18)10242-10247；Matsuzaki等，FASEB J 2001，15(7)1218-1220；Oosthuyse等，Nature Genet 2001，28(2)131-138；Schratzberger等，Nature Med 2000，6(4)405-413；Sondell等，J Neurosci 1999，19(14)5731-5740)，与AD的神经元病变相关。
由于与老年匹配的对照相比在AD患者脑中VEGF的水平升高(Kalaria等，Brain Res Mol Brain Res 1998，62(1)101-105；Tarkowski等，NeurobiolAging 2002，23(2)237-243)，很可能在AD脑中诱导的VEGF可导致新血管生成增强以补偿血流灌注不足的攻击并通过其对神经元细胞的直接神经保护作用和其血管生成活性抑制局部缺血诱导的神经元死亡。
然而，在AD患者中，我们的结果表明AD病程期间表达的大多数VEGF与Aβ沉积物结合而不周转。该情况可能导致缺乏用于保护脑血管和神经元抵抗与AD病理学相关的血流灌注不足所需的可溶性VEGF。还值得注意的是局部缺血触发淀粉样蛋白前体蛋白的积累和裂解成Aβ以及Aβ在大脑中的沉积(Bennett等，Neurobiol Aging 2000，21(2)207-214；Jendroska等，ActaNeuropathol(Berl)1995，90(5)461-466)。除了其在AD发病机理中推测的作用(Calhoun等，Nature 1998，395(6704)755-756；Hardy等，Science 1992，256(5054)184-185；Hsiao等，Science 1996，274(5284)99-102；Lewis等，Science 2001，293(5534)1487-1491；Schenk等，Nature 1999，400(6740)173-177；Sommer B.，Curr Opin Pharmacol 2002，2(1)87-92；Thomas等，Nature 1996，380(6570)168-171)外，Aβ可能充当AD大脑中表达的VEGF的分子库，通过封闭VEGF的血管生成和神经保护活性而加重AD的进行。
β-淀粉样蛋白的VEGF结合区Aβ1-42的序列是DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNRGAIIGLMVGGVV IA(SEQ ID NO4)。1-28区是具有高比例带电残基(46％)的亲水区；具有交叉-β结构且形成原纤维。29-42区是具有高比例β-分支氨基酸的充分疏水区。25-35区是其神经毒性功能的生物活性结构域。申请人发现VEGF与Aβ的25-35区结合(图6)。
在本发明的一个方面，与VEGF结合的β-淀粉样多肽与SEQ ID NO4具有大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列相同性。在本发明的另一方面，该多肽保留了与VEGF特异性结合的能力。可保留VEGF结合活性的β-淀粉样多肽的长度可从大约10个变化到大约42个且可包括与其连接的其它序列。具体地说，β-淀粉样多肽可从大约10个到大约40个氨基酸长，从大约10个到大约35个，从大约10个到大约30个，从大约10个到25个，从大约10个到20个，从大约10个到15个，或大约10个氨基酸长。在本发明的另一方面，该10个氨基酸的片段可以是SEQ ID NO4的残基25至35。
在本发明的一个方面，β-淀粉样多肽可用作捕获剂以便在诸如血管生成过多，如类风湿性关节炎，癌症，动脉粥样硬化，子宫内膜异位，肾病和肥胖等中的不需要VEGF活性的区域固定VEGF。β-淀粉样多肽可以是全长或更长或更短或变异体或衍生物，只要该多肽与SEQ ID NO4具有至少70％的序列相同性且保留了特异性结合VEGF的能力。
VEGF/β-淀粉样蛋白结合的抑制剂在一个实施方案中，本发明涉及筛选化合物的方法，例如抑制VEGF与β-淀粉样蛋白结合的多肽或化合物。预期该抑制剂化合物可治疗患有至少部分由β-淀粉样蛋白沉积物与VEGF引起的疾病的病人。如果使用抑制剂，VEGF不能与β-淀粉样蛋白沉积物堆积，因此，它能游离出来发挥正常功能并诱导对病变区的神经保护和神经营养作用从而治疗该疾病。
在这点上，在一个方面，本发明涉及能与VEGF相互作用以封闭VEGF与β-淀粉样蛋白结合的任何抑制剂分子。具体地说，该分子与VEGF的肝素结合区相互作用，且更具体地说，该分子与肝素结合区的C-末端一侧相互作用。作为选择，该分子可与β-淀粉样蛋白结合从而破坏VEGF/β-淀粉样蛋白结合。
一个这样的抑制剂可以是这样的VEGF多肽，即它保留了β-淀粉样蛋白结合功能但与诸如受体结合活性或激活信号转导途径等等VEGF功能相关的一些或全部其它特征的水平缺乏或下降。该抑制剂VEGF多肽可包括肝素结合区。在另一实施方案中，该抑制剂VEGF多肽可以是β-ABP。
应明白该抑制剂化合物可削弱VEGF多肽与β-淀粉样蛋白之间的相互作用，该削弱作用可通过诸如竞争性，非竞争性，或反竞争性抑制等任何生化或酶促抑制动力学进行，只要该化合物削弱了VEGF多肽与β-淀粉样蛋白的结合。
因此，在一个具体方面，本发明涉及使用能够抑制VEGF与β-淀粉样蛋白之间结合的任何多聚体或单体化合物。在一个具体实施方案中，该多聚体或单体具有糖主链。该糖主链单位可以是葡萄糖或蔗糖，或者是具有一个氧原子和其余是碳原子的六元环的任何基团。该主链可具有任何化学类型的取代基团。优选地，该取代基团是苯酚或多元酚，例如可通过与没食子酸反应形成的多元酚。在该方面，鞣酸以及同时包含葡萄糖和多元酚基团的黄棓酰单宁(PGG)在本文中作为VEGF/β-淀粉样蛋白结合的抑制剂进行了例证。另外，可预期该抑制剂是儿茶素或儿茶素酚化合物，包括但不限于表儿茶素(EC)，表儿茶素没食子酸盐(ECG)，表儿茶素(EGC)，或表儿茶素没食子酸盐(EGCG)。参见Jung等，Int J Exp Path 2001，82309-316(以其整体引用以供参考)对于这些化合物及其活性的描述。
也应明白可对糖主链作出一些不同的变异。因此，在本发明的一个具体实施方案中，模拟肝素或PGG的分子也在本发明的框架内，只要这些模拟物和类似物能抑制VEGF与β-淀粉样蛋白之间的结合。在该方面，应明白本发明包含肝素，PGG，EGCG，和鞣酸的类似物和模拟物。另外，该抑制剂可包括各种类型的糖胺聚糖链，例如透明质酸，硫酸软骨素，硫酸角质素，硫酸皮肤素等，它们可以是与肝素相关的分子。
一些肝素相关性分子可包括但不限于透明质酸，其中D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺单位可重复多达大约50,000个单位；硫酸软骨素，其中D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺单位可重复多达大约250,000个单位；硫酸皮肤素，其中L-艾杜糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺单位可重复多达大约250,000个单位，且至少一个羟基可被硫酸基团取代；肝素或硫酸乙酰肝素，其中D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸和N-乙酰基或者N-硫代-D-葡萄糖胺单位可重复大约15至30个单位，其中在一些情况下，优选用至少一个硫酸基团取代羟基基团；硫酸角质素，其中D-半乳糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺单位可重复大约20至40次，其中至少一个羟基被硫酸基团取代。
在本发明的另一实施方案中，涉及包含VEGF/β-淀粉样蛋白复合物的抑制剂的天然食品提取物或“功能性食品”。茶的儿茶素仅仅是这类抑制剂的一个例子。除了儿茶素外，作为功能性食品主要成分的其它多元酚包括，但不限于类黄酮，白藜芦醇，和栎皮黄酮。
肝素的化学结构如下所示。
PGG的化学结构如下所示。
EGCG的化学结构如下所示。
鞣酸的化学结构如下所示。
l+m+n＝0，1，2，3，4，5，6，7编码与β-淀粉样蛋白或VEGF结合的多肽的核酸用“分离的”多核苷酸序列试图包含从其天然环境中分离的核酸分子，DNA或RNA。它包括编码本发明的VEGF多肽或β-淀粉样多肽的DNA片段，且还包含诸如载体序列或其它外源DNA等异源性序列。例如，为达到本发明的目的，载体中包含的重组DNA分子认为是分离的，它可以是部分或基本上纯化的。
另外，本发明的分离的核酸分子包括这样的DNA分子，即它们包含由于遗传密码的简并性或者其它变异体基本上不同于上述序列，但仍然编码VEGF多肽或β-淀粉样多肽及其肽的序列。因此，对本领域的技术人员而言产生上述变异体以便例如，优化对特定宿主的密码子表达或一般性功能是常规技术。
在另一方面，本发明提供了含有多核苷酸的分离的核酸分子，该多核苷酸在严格杂交条件下与上述本发明的核酸分子中的部分多核苷酸杂交。杂交多核苷酸用作上述的诊断探针和引物。可用作探针和引物的与以SEQ IDNOS1-3举例并描述的VEGF多肽编码序列杂交的部分多核苷酸可由5′和3′碱基位置或由上述核苷酸碱基大小明确限定或者以相同的方式明确排除。同样，与以SEQ ID NOS4举例并描述的与β-淀粉样多肽杂交的部分多核苷酸可用作探针和引物。本发明优选的杂交多核苷酸是当标记并用于本领域已知的杂交试验(例如，Southern和Northern印迹分析)时显示出最大的信号强度的序列而不考虑以等摩尔量存在的其它异源性序列。
变异体和突变体多核苷酸本发明还涉及编码VEGF多肽或β-淀粉样多肽的一部分，类似物或衍生物的核酸分子变异体。变异体可以是天然存在的，例如天然等位基因变异体。“等位基因变异体”是指占据生物染色体给定基因座的一个基因的几种选择形式之一。非天然存在的变异体可使用本领域已知的诱变技术产生。
该核酸变异体包括通过核苷酸取代，缺失，或添加产生的变异体。取代，缺失，或添加可涉及一个或多个核苷酸。氨基酸序列的改变可产生保守或非保守的氨基酸取代，缺失或添加。其中特别优选的是沉默取代，添加和缺失，它不改变本发明的多肽或其部分的特性和活性。在这点上还优选保守取代。
本申请涉及编码多肽的核酸分子，该多肽在分别保留特异性结合β-淀粉样蛋白或VEGF的功能的条件下，与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的多肽至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。
本发明允许将该序列用于表达载体中，以及用于转染宿主细胞和细胞系，不论是原核还是真核细胞。本发明还允许纯化从该表达载体表达的多肽。该表达载体可含有便于纯化的各种分子标记。随后可将获得的表达构建体转化进选定的任何宿主细胞中。用本领域熟知的既定方法可分离宿主细胞的溶胞产物。含有GFP-或GST-的表达载体可用于定位宿主细胞中的VEGF多肽或β-淀粉样多肽。该表达载体可含有诱导型或组成型启动子。
变异体和突变体多肽为了改良或改变本发明的VEGF多肽或β-淀粉样多肽的特征，可使用氨基酸工程学方法。可使用本领域的技术人员已知的重组DNA技术产生包含单个或多个氨基酸取代，缺失，添加的新型突变多肽，或融合蛋白。该修饰的多肽表现出，例如增大/减小的活性或增大/减小的稳定性。另外，它们与相应的天然多肽相比至少在一些纯化和贮存条件下纯化出更高的产量和表现出更好的稳定性。
特别感兴趣的是带电荷的氨基酸被其它带电荷或中性氨基酸取代，可产生具有非常需要的改良特性的蛋白质，例如产生的多肽较少聚集。聚集不仅可降低活性，而且在制备药用配制品时也成问题，因为聚集体可能具有免疫原性。
抗体在一个实施方案中，本发明涉及使用各种检测方法检测β-淀粉样蛋白形成。一种检测VEGF多肽与β-淀粉样蛋白结合的方法是使用本领域的技术人员常规使用的标记和分离技术直接标记VEGF多肽并测定其结合。其它方法包括使用可特异性结合VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物的标记配体。该配体可以是抗体。
可使用纯化的VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物产生单克隆或多克隆抗体。也可使用VEGF多肽的片段产生单克隆或多克隆抗体。随后可使用获得的单克隆或多克隆抗体测定各种样品中VEGF多肽与β-淀粉样蛋白的结合和VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物的形成，该样品包括细胞，组织，和体液，例如但不限于血清，血浆，和尿。可使用各种分子生物学方法测定VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物，该方法包括但不限于原位杂交，免疫沉淀，免疫荧光染色，Western印迹分析等。使用抗VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物的单克隆抗体进行ELISA可测定脑组织中或包括相信具有所示疾病的人类受试者体液的身体其它部分中的β-淀粉样蛋白的含量，其中在所述疾病中β-淀粉样蛋白聚集和积累并形成淀粉样蛋白斑。
本发明的抗体包括，但不限于，多克隆，单克隆，多特异性，人的，人源化或嵌合的抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab′)片段，通过Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如抗本发明抗体的抗-Id抗体)，和上述任一抗体的表位结合片段。本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任一类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，种类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。
本发明的抗体可具有单特异性，双特异性，三特异性或更多特异性。多特异性抗体可以对本发明的一个多肽的不同表位具有特异性或者可以对本发明多肽以及对诸如异源多肽或固相支持物等异源表位具有特异性。
本发明的抗体可用它们所识别或特异性结合的本发明多肽的表位或部分进行描述或限定。表位或多肽部分按本文所述限定，例如通过N-末端和C-末端位置，通过连续氨基酸残基的大小进行限定。
本发明的抗体可用于例如，但不限于，纯化，检测，和靶向本发明的多肽，包括体外和体内诊断和治疗方法。例如，该抗体可用于定性和定量测量生物学样品中本发明的VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物水平的免疫测定中。
正如下面更详细的讨论，本发明的抗体可单独或者与其它成份组合使用。该抗体可重组融合到异源性多肽的N-或C-末端或者与多肽或其它成份化学偶联(包括共价和非共价偶联)。例如，本发明的抗体可与在检测试验中用作标记的分子以及诸如异源多肽，药物，放射性核素，或毒素等效应器分子重组融合或偶联。
本发明的抗体可通过本领域已知的任一合适的方法产生。抗目的抗原的多克隆抗体可通过本领域熟知的各种方法产生。例如，本发明的多肽可给药到各种宿主动物，包括但不限于兔，小鼠，大鼠等以诱导产生含有抗原特异性的多克隆抗体的血清。根据宿主种类的不同可使用各种佐剂以增强免疫学反应，该佐剂包括但不限于，弗氏(完全和不完全)佐剂，诸如氢氧化铝等矿物胶体，诸如溶血卵磷脂等表面活性物质，多聚醇，聚阴离子，肽，油状乳剂，匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，二硝基酚，以及诸如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(corynebacterium parvum)等潜在有用的人佐剂。这样的佐剂也是本领域熟知的。
可使用本领域已知的各种技术制备单克隆抗体，该技术包括使用杂交瘤，重组，和噬菌体展示技术，或其组合。例如，可使用包括本领域已知技术的杂交瘤技术产生单克隆抗体。本文使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指从包括任何真核，原核，或噬菌体克隆的单个克隆产生的抗体，而不论产生该抗体的方法。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域常规的和熟知的方法。在一个非限制性的例子中，可用VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物或表达该实体的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫反应，例如在小鼠血清中检测到对该抗原特异性的抗体，可收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过熟知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞，例如可从ATCC得到的细胞系SP20的细胞融合。选择杂交瘤并通过有限稀释克隆。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌抗体的细胞，该抗体能够结合本发明的多肽或该多肽与其结合配偶体的复合物。通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠可产生一般含有高水平抗体的腹水液。
抗体也可附着到固相支持物上，它对于靶抗原的免疫沉淀或纯化特别有用。该固相支持物包括，但不限于，玻璃，纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙稀或聚丙烯。
抗体结合试验可用本领域已知的任何方法测定本发明的抗体的免疫特异性结合。可使用的免疫测定法包括但不限于竞争性和非竞争性试验系统，该系统使用的技术有例如Western印迹，放射免疫测定法，ELISA(酶联免疫吸附测定法)，“夹心”免疫测定法，免疫沉淀测定法，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散试验，凝集试验，补体结合试验，免疫放射测定法，荧光免疫测定，蛋白质A免疫测定法，列举的只是少数。该测定法是本领域常规的和熟知的(参见，例如，Ausubel等，编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，本文引用其整体以供参考)。举例性的免疫测定法在下文简单描述但不打算用作限制。
免疫沉淀方案一般包含在诸如添加了蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA，PMSF，抑肽酶，钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或TritonX-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01 M磷酸钠，pH7.2，1％抑肽酶)等裂解缓冲液中裂解细胞群体，向细胞溶胞产物中加入目的抗体，在4℃下温育一段时间(例如，1-4小时)，向细胞溶胞产物中加入蛋白质A和/或蛋白质G的琼脂糖珠，在4℃下温育大约1小时或更长时间，在裂解缓冲液中洗涤珠并将珠重悬于SDS/样品缓冲液中。目的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可通过例如，Western印迹分析进行评估。本领域的技术人员了解可修改参数以增强抗体与抗原的结合和降低本底(例如，用琼脂糖珠预澄清溶胞产物)。对于免疫沉淀方案的进一步讨论参见，例如，Ausubel等，编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，见10.16.1节。
Western印迹分析一般包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，根据抗原的分子量用8％-20％SDS-PAGE)中电泳蛋白质样品，从聚丙烯酰胺凝胶将蛋白质样品转移到诸如硝酸纤维素，PVDF或尼龙等膜上，在封闭溶液(例如，含3％BSA或脱脂奶粉的PBS)中封闭该膜，在洗涤缓冲液(例如，PBS-Tween 20)中洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的第一抗体(目的抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的与酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如，32P或125I)偶联的第二抗体(可识别第一抗体，例如，抗人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，并检测存在的抗原。本领域的技术人员了解可修改参数以增强检测的信号和降低本底噪声。关于western印迹方案的进一步讨论参见，例如，Ausubel等，编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，见10.8.1节。
ELISAs包括制备抗原，该抗原可包括含有VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白的样品，用该抗原覆盖96孔微量滴定板的孔，向孔中加入与诸如酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)等可检测化合物偶联的目的抗体并温育一段时间，检测该抗原的存在。在ELISAs中，目的抗体不必与可检测的化合物偶联，相反，可向孔中加入与可检测的化合物偶联的第二抗体(可识别目的抗体)。另外，代替用抗原覆盖孔，可用抗体覆盖孔。在这种情况中，可在向覆盖的孔中加入目的抗原的同时或者之后加入与可检测的化合物偶联的第二抗体。本领域的技术人员了解可修改参数以增强检测的信号以及作出本领域已知的对ELISAs的其它改变。关于ELISAs的进一步讨论参见，例如，Ausubel等，编，1994，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，见11.2.1节。
诊断试验本发明还提供了检测生物学样品中存在β-淀粉样蛋白的诊断方法。可直接(例如，通过使用与VEGF多肽或其片段反应诱导的抗体测定多肽水平)或者间接(例如，通过测定对VEGF多肽或其片段具有特异性的抗体)进行该测定。
如果已经作出了疾病状态的诊断，通过测量患者中存在的β-淀粉样蛋白/VEGF复合物的量或者根据表现出β-淀粉样蛋白生产增强的患者相对于以较低水平产生β-淀粉样蛋白的患者具有更差的临床结果可将本发明用于监测该疾病状态的进行或消退。
可使用本领域已知用于体内扫描的方法在患者中检测标记分子的存在。这些方法依赖于所用的标记类型。技术人员能够确定检测特定标记的合适方法。可在本发明的诊断方法中使用的方法和装置包括，但不限于计算机体层摄影(CT)，诸如正电子发射体层摄影(PET)等整体扫描，磁共振成像(MRI)，和声象图检查，以及电子顺磁共振(EPR)和核磁共振(NMR)。
在一个具体实施方案中，用放射性同位素标记诸如与β-淀粉样蛋白特异性结合的多肽等分子并使用放射反应外科仪器检测患者(Thurston等，美国专利号5,441,050)。在另一实施方案中，用荧光化合物标记该分子并使用荧光反应扫描仪器检测患者。在另一实施方案中，用正电子发射金属标记该分子并使用正电子发射体层摄影检测患者。在另一实施方案中，用顺磁标记物标记该分子并使用磁共振成像(MRI)检测患者。
在一个方面，通过使用按上述方法或一些其它原理可检测且对受试者无毒性的标记，将标记的多肽注射进受试者以便该多肽迁移并结合到诸如β-淀粉样蛋白聚集区等与其结合的靶上，从而检测诸如β-淀粉样蛋白或β-淀粉样蛋白聚集物等靶物质的存在可作出体内诊断。
标记合适的酶标记包括，例如来自氧化酶类的那些酶，它们通过与底物反应催化过氧化氢的产生。葡萄糖氧化酶是特别优选的，因为它具有良好的稳定性且其底物(葡萄糖)容易得到。通过测量酶标记的抗体/底物反应形成的过氧化氢浓度可测定氧化酶标记的活性。除了酶外，其它合适的标记包括放射性同位素，例如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(112In)，和锝(99mTc)，和荧光标记，例如荧光素和罗丹明，和生物素。
下面提供了用于本发明的VEGF多肽-，β-淀粉样蛋白-或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物-特异性抗体的其它合适标记。合适的酶标记的例子包括苹果酸脱氢酶，δ-5-类固醇异构酶，酵母乙醇脱氢酶，α-甘油磷酸脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶，和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素标记的例子包括3H，111In，125I，131I，32P，35S，14C，51Cr，57To，58Co，59Fe，75Se，152Eu，90Y，67Cu，217Ci，211At，212Pb，47Sc，109Pd，等。111In是使用体内成像时优选的同位素，因为其避免了125I或131I-标记的多肽被肝脏脱卤的问题。另外，该放射性核素具有更有利于成像的γ发射能力。例如，与带有1-(P-异硫氰酸苯甲基)-DPTA的单克隆抗体偶联的111In显示出在非肿瘤组织，特别是肝脏中吸收低，因此增强了肿瘤定位的特异性。
合适的非放射性同位素标记的例子包括157Gd，55Mn，162Dy，52Tr，和56Fe。
合适的荧光标记的例子包括152Eu标记，荧光素标记，异硫氰酸盐标记，罗丹明标记，藻红蛋白标记，藻蓝蛋白标记，别藻蓝蛋白标记，邻苯二醛(o-phthaldehyde)标记，和荧光胺标记。
合适的毒素标记的例子包括，假单胞菌属毒素，白喉毒素，蓖麻毒蛋白，和霍乱毒素。
化学发光标记的例子包括鲁米那(luminal)标记，异鲁米那(isoluminal)标记，芳香吖啶鎓酯(aromatic acridinium ester)标记，咪唑标记，吖啶鎓盐(acridinium salt)标记，草酸酯标记，萤光素标记，萤光素酶标记，和水母发光蛋白标记。
核磁共振造影剂的例子包括重金属原子核，例如Gd，Mn，和铁。也可使用氘。对于EPR，PET或其它成像原理还存在其它造影剂，这是本领域的技术人员已知的。
将上述标记与多肽结合的一般技术由Kennedy等(1976)Clin.Chim.Acta701-31，和Schurs等(1977)Clin.Chim.Acta 811-40提供。偶联技术包括戊二醛法，过碘酸盐法，二马来酰亚胺法，m-马来酰亚胺苯甲基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯法，所有这些方法在本文中引用以供参考。
本发明的多肽和抗体，包括其片段，可用于使用生物芯片和生物传感器技术检测VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物。本发明的生物芯片和生物传感器可包含本发明的多肽以检测能特异性识别VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物的抗体。本发明的生物芯片和生物传感器也可包含特异性识别本发明多肽的抗体以检测VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物。
试剂盒本发明还包括分析样品的试剂盒，用于分析生物学样品中存在的VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物。在一般实施方案中，该试剂盒包含在一个或多个容器中的特异性结合VEGF多肽，β-淀粉样蛋白或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物的配体，可优选抗VEGF多肽，或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物的纯化抗体。在一个具体实施方案中，本发明的试剂盒含有基本上分离的多肽，该多肽含有与试剂盒中包含的抗体具有特异性免疫反应的表位。优选地，本发明的试剂盒还包含不能与目的多肽反应的对照抗体。该试剂盒还包含关于其使用的说明书和标签。
在另一具体实施方案中，本发明的试剂盒含有检测抗体与目的多肽结合的工具(例如，该抗体可与诸如荧光化合物，酶底物，放射性化合物或发光化合物等可检测的底物偶联，或者可识别第一抗体的第二抗体与可检测的底物偶联)，和关于其使用的说明书和标签。
该试剂盒也可含有作为β-淀粉样蛋白指示剂的带有其使用说明书的标记VEGF多肽。
β-淀粉样蛋白和VEGF的高亲和力捕获物(Trap)封闭配体活性的配体捕获物可通过螯合配体且因而导致其不能与诸如受体或共聚集组件等天然配对物相互作用来充当其关连配体的选择性高亲和力拮抗剂。关于制备该配体捕获物的一些详细情况可参见美国专利号6,472,179，本文引用其整体以供参考。
配体捕获物可包含与其它分子，包括但不限于，诸如异数(heteromeric)免疫球蛋白重链/轻链受体等多肽相联的VEGF多肽以形成可结合或螯合β-淀粉样蛋白，优选自由流动的β-淀粉样蛋白的捕获物。反之，该配体捕获物可包含与其它分子，包括但不限于诸如异数免疫球蛋白重链/轻链受体等多肽相联的β-淀粉样多肽以形成可结合或螯合VEGF的捕获物。如果需要化学结合的捕获物，则异数配体捕获物可由二硫键连接的蛋白质组成。或者，可通过使用重组融合蛋白形成该配体捕获物。
例如，在一个实施方案中，可制备诸如VEGF或β-淀粉样蛋白等配体的高亲和力捕获物，其中本领域的技术人员可构建含有编码包含配体结合区的氨基酸序列的第一多肽元件的核苷酸序列，和编码包含多聚化元件(例如，IgG的Fc区)的氨基酸序列的多肽元件的至少一个其它核苷酸序列的融合核酸以产生该配体的高亲和力捕获物。融合构建体可由编码至少一个配体结合区多肽和至少一个编码多聚化元件(multimerizer)的多肽的DNA组成。或者，该多聚化元件和配体结合区可在不同的DNA构建体中编码和表达。然而，应明白该多聚化元件不限于多肽，而且可包括一方面能够结合配体且另一方面与其它多聚化元件相联以形成配体捕获物的任何分子。
该配体结合捕获物可以是可溶性的或者可与固相表面相联。另外，可在各种不同的试验中检测该配体结合捕获物与VEGF或β-淀粉样蛋白结合的能力。例如，结合在配体捕获物上的VEGF或β-淀粉样蛋白的解离率，可以与VEGF或β-淀粉样蛋白从抗-VEGF或抗-β-淀粉样蛋白单克隆中和抗体上解离的速率平行测量。预定量的标记配体可以与单克隆抗体或配体捕获物预温育大约20小时。加入过量的未标记配体。定期取反应液的等分试样并用蛋白质G-琼脂糖沉淀配体捕获物，测定保持结合的标记计数的数量。
基因治疗在一个具体实施方案中，可通过基因治疗的方式施用包含编码VEGF多肽或β-淀粉样多肽的序列的核酸以治疗，抑制或预防与本发明的多肽的异常表达和/或活性相关的疾病或病症。基因治疗是指通过给受试者施用表达的或可表达的核酸进行的治疗。在本发明的该实施方案中，该核酸产生其编码的蛋白质，该蛋白质介导治疗效应。
根据本发明可使用本领域可得到的任一基因治疗方法。举例性的方法在下面描述。
关于基因治疗方法的综述参见Goldspiel等，Clinical Pharmacy12488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)155-215(1993)。可使用的重组DNA技术的本领域公知方法在Ausubel等(编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中描述。
在一个优选的方面，核酸序列可编码VEGF多肽或β-淀粉样多肽，其中该核酸序列是在合适宿主中表达该多肽的表达载体的一部分。具体地说，该核酸序列具有与多肽编码区可操作地相连的启动子，所述的启动子是诱导型或组成型，且任选具有组织特异性。在另一具体实施方案中，使用多肽编码序列和任何其它目的序列侧翼为可在基因组目的位点启动同源重组的区域的核酸分子，从而提供编码抗体的核酸的染色体内表达(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342435-438(1989)。
可直接或者间接将核酸给药到患者中，在直接的情况下，患者直接接触该核酸或携带核酸的载体，在间接的情况下，首先用该核酸体外转化细胞，然后移植进患者。这两种方法分别称为体内或离体基因治疗。
在一个具体实施方案中，该核酸序列可直接体内给药，其中该核酸表达以产生编码产物。这一点可通过本领域已知的众多方法中的任一种实现，例如，通过将它们构建成合适的核酸表达载体的一部分并给药使其变成细胞内成份，例如，通过使用缺陷型或减毒的逆转录病毒或其它病毒载体感染，或者通过通过直接注射裸露的DNA，或者用脂类或细胞表面受体或转染剂包裹，在脂质体，微颗粒，或微胶囊中包埋，或者通过将它们与已知进入细胞核的肽连接给药，通过将它与进行受体介导的胞吞的配体连接给药(参见，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))(可用于靶向特异性表达该受体的细胞类型)等等。在另一实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中该配体包含融合病毒肽以破坏核内体，使得该核酸可避免溶酶体降解。在另一实施方案中，该核酸通过靶向特异性受体可体内靶向细胞特异性吸收。作为选择，该核酸可通过同源重组在细胞内导入和掺入宿主细胞DNA中进行表达(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342435-438(1989))。
在一个具体实施方案中，使用含有编码该多肽的核酸序列的病毒载体。将编码用于基因治疗的多肽的核酸序列克隆进有利于将基因递送进患者的一种或多种载体中。逆转录病毒载体，腺病毒载体和腺伴随病毒是可使用的病毒载体的例子。逆转录病毒载体含有修正病毒基因组包装和整合进宿主细胞DNA中必需的元件。
腺病毒是将基因送递到呼吸上皮的特别有吸引力的载体，因为它们天然感染呼吸上皮，并引起较轻的疾病。基于腺病毒的给药系统的其它靶是肝脏，中央神经系统，内皮细胞，和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。另外，腺伴随病毒(AAV)也有建议用于基因治疗。
基因治疗的另一方案涉及通过诸如电穿孔，脂转染，磷酸钙介导的转染，或病毒感染等方法将基因转移进组织培养物的细胞中。通常，转移方法包括将可选择的标记转移给细胞。然后将该细胞放在选择条件下以分离吸收并表达该转移基因的那些细胞。然后将这些细胞送递给患者。
在该实施方案中，体内施用所得的重组细胞前将该核酸导入细胞中。通过本领域已知的任何方法可实现该导入，该方法包括但不限于转染，电穿孔，微注射，用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染，细胞融合，染色体介导的基因转移，微细胞介导的基因转移，原生质球融合等等。将外源基因导入细胞的许多技术是本领域已知的且可用于本发明中，只要它不破坏受体细胞的必要发育和生理功能。该技术应将核酸稳定转移进细胞，以便该细胞可表达该核酸且优选可通过其细胞后代遗传和表达。
可导入核酸用于基因治疗目的的细胞包含任何所需的，可得到的细胞类型，且包括但不限于上皮细胞，内皮细胞，角质细胞，成纤维细胞，肌肉细胞，肝细胞，诸如T-淋巴细胞，B-淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性白细胞，嗜酸性粒细胞，巨核细胞，粒细胞等血液细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是例如从骨髓，脐带血，外周血，胎儿肝脏获得的造血干细胞或祖细胞等等。
在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自身的。
在基因治疗中使用重组细胞的一个实施方案中，可将编码该多肽的核酸序列导入该细胞中以便通过该细胞或其后代可表达它们，然后体内施用该重组细胞以达到治疗效果。在一个具体实施方案中，可使用干细胞或祖细胞。可分离并在体外维持的任何干细胞和/或祖细胞可潜在地用于根据本发明的该实施方案。
在一个具体实施方案中，为基因治疗目的导入的核酸包含与编码区可操作地连接的诱导型启动子，以便通过控制合适的转录诱导剂的存在或缺乏，来控制该核酸的表达。
治疗组合物在一个实施方案中，本发明涉及治疗以形成β-淀粉样蛋白聚集物或淀粉样蛋白斑为特征的各种疾病。这样，通过提供抑制VEGF与Aβ结合的化合物给患有，或者倾向于患有该疾病的病人施用本发明的治疗化合物。具体地说，该疾病与痴呆，脑慢性神经变性疾病，神经细胞损失，特别是在海马和大脑皮层中的神经细胞损失，神经递质减少，脑血管变性，和/或认知能力丧失相关。更具体地说，本发明涉及治疗阿尔茨海默氏病。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗以血管生成过多为特征的各种疾病，该疾病包括但不限于癌症，动脉粥样硬化，类风湿性关节炎，子宫内膜异位，肾病或肥胖。可给患有这些疾病的患者施用包括β-淀粉样蛋白配体捕获物的各种形式的β-淀粉样肽以便结合并失活作为血管生成主要引发剂的VEGF。
治疗性化合物的剂型是本领域公知的且通常可参考Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，USA。例如，可按每天每千克体重从大约0.05μg到大约20mg给药。可调整剂量方案以获得最佳治疗反应。例如，可每天给药几个分开的剂量或者按治疗情况的急迫性所示按比例降低该剂量。该活性化合物可按常规方式给药，例如，通过口服，静脉内(如果是水溶性的)，肌肉内，皮下，鼻内，真皮内或栓剂途径或植入(例如，通过腹膜内途径使用缓释分子或者通过使用细胞，例如体外致敏的单核细胞或树突细胞和过继转移到接受者)。根据给药途径，需要在一种材料中包裹该肽以防止受到可灭活所述成份的酶，酸和其它天然条件的影响。
例如，该肽的低亲油性使其在胃肠道被能够裂解肽键的酶破坏和在胃中被酸水解。为了通过非肠胃外给药施用肽，可用一种材料包裹它们或者与其一起给药以防止其失活。例如，肽可在佐剂中给药，与酶抑制剂共同给药或者在脂质体中给药。本文涉及的佐剂包括间苯二酚，诸如聚氧化乙烯油酰醚和n-十六烷基聚乙烯醚等非离子表面活性剂。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂，二异丙基氟磷酸(DEP)和抑肽酶。脂质体包括水包油包水的CGF乳剂以及常规脂质体。
该活性化合物也可通过肠胃外或腹膜内给药。也可在甘油液态聚乙二醇，和其混合物和在油中制备分散体。在常规贮存和使用条件下，这些制品含有防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射的药用形式包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。在所有情况中该形式必须是无菌的且必须是能够容易地进行注射的流体。它在制备和贮存条件下必须是稳定的，且必需保存在防止诸如细菌和真菌等微生物污染的条件下。该载体可以是含有，例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物，和植物油的溶剂或者分散介质。例如，通过使用诸如卵磷脂等包衣，通过在分散情况下维持所需颗粒的大小和通过使用表面活性剂(superfactants)可维持合适的流动性。通过诸如氯丁醇，苯酚，山梨酸，theomersal等各种抗细菌和抗真菌剂可实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选包含等渗剂如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如硬脂酸铝和明胶可实现注射组合物的长时间吸收。
无菌注射液可通过将所需量的活性化合物与上面列举的各种其它成份按需要掺入合适的溶剂中，接着过滤灭菌来制备。一般来说，通过将各种无菌活性成份掺入含有基础分散介质和上面列举的所需其它成份的无菌载体中可制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，它可产生活性成份加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其它所需成份的粉末。
当该肽按上述适当保护时，该活性化合物可与例如，惰性稀释剂或能同化的可食载体一起口服给药，或者可密封进硬或软壳明胶胶囊中，或者可压成片剂，或者可直接掺入食物中。对于口服治疗给药，该活性化合物可掺入赋形剂中并以可服用的片剂，口含片，锭剂，胶囊，酏剂，悬液，糖浆剂，糯米纸囊剂等的形式使用。该组合物和制品应含有至少1％重量的活性化合物。当然，该组合物和制品的百分数可变化且通常在大约5到大约80％的重量单位之间。在该治疗上有用的组合物中的活性化合物的量是可获得的合适剂量。可制备根据本发明的优选的组合物或制品以便该口服剂量单位形式含有大约0.1μg和2000mg的活性化合物。
片剂，丸剂，胶囊剂等也可含有下列成份诸如胶黄芪，阿拉伯胶，玉米淀粉或明胶等粘合剂；诸如磷酸二钙等赋形剂，诸如玉米淀粉，马铃薯淀粉，海藻酸等分解剂；诸如硬脂酸镁等润滑剂；且可加入诸如蔗糖，乳糖或糖精等甜味剂或诸如薄荷，冬青油，或樱桃调料等调味剂。当剂量单位形式是胶囊剂时，除了上述类型的物质外，可含有液体载体。可存在各种其它物质作为包衣或者可修饰该剂量单位的物理形式。例如，片剂，丸剂，或胶囊剂可用虫胶，糖或两者同时包裹。糖浆剂或酏剂可含有活性化合物，作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯，诸如樱桃或橙味的染料和调味剂。当然，在制备任一剂量单位形式中使用的任何材料应是药用上纯的且在所用剂量下基本上是无毒的。另外，该活性化合物可掺入缓释制品和剂型中。
本文使用的“药用上可接受的载体和/或稀释剂”包括任何和全部溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌剂，等渗剂和延迟吸收剂等。将该介质和试剂用于药用活性物质是本领域熟知的。除了任一常规介质或试剂与该活性成份不相容的情况外，其在治疗组合物中的用途是可预期的。也可向该组合物中掺入补充活性成份。
以容易给药和剂量均匀的剂量单位形式配制肠胃外组合物特别具有优势。本文使用的剂量单位形式是指物理上分离的单位，它们适于作为需要治疗的哺乳动物受试者的单位剂量；每个单位含有预定量的活性物质以及所需的药用载体，其中活性物质的预定量是经过计算可产生所需治疗效果的量。本发明的剂量单位形式的规格通过下列情况指定，且直接依赖于下列情况(a)该活性物质的特有特征和需要达到的具体治疗效果，和(b)配合该活性物质用于治疗具有损害身体健康的疾病状态的活受试者时本领域固有的限制。
该主要活性成份在剂量单位形式中以有效量与合适的药用上可接受的载体配合用于方便和有效地给药。例如，单位剂量形式可含有从0.5μg到大约2000mg量范围的主要活性化合物。按比例表示时，该活性化合物一般以大约0.5μg/ml载体存在。对于含有补充活性成份的组合物，通过参考所述成份给药的通常剂量和方式测定该剂量。
给药系统各种给药系统是已知的且可用于本发明化合物的给药，例如密封在脂质体，微颗粒，微胶囊中，能够表达该化合物的重组细胞，受体介导的胞吞，构建核酸作为逆转录病毒或其它载体的一部分，等。导入方法包括但不限于真皮内，肌肉内，腹膜内，静脉内，皮下，鼻内，硬膜外，和口腔途径。该化合物或组合物可按任何方便的途径给药，例如通过输注或大丸剂注射，通过上皮或粘膜内层(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜，等)吸收且可与其它生物学活性剂一起给药。给药可以是全身性的或局部给药。另外，可能需要通过包括心室内和鞘内注射的任何合适的途径将本发明的药用化合物或组合物导入中央神经系统；心室内注射可借助于例如连接到诸如Ommaya贮液池等贮液池上的心室内导管。也可采用肺部给药，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和含有烟雾剂的配制品。
在一个具体实施方案中，可能需要给需要治疗的区域局部施用本发明的药用化合物或组合物；实现这点可通过例如但不限于手术期间局部输注，局部应用，例如与手术后的伤口敷料结合，通过注射，借助于导管，借助于栓剂，或借助于植入物，所述的植入物是多孔，无孔，或胶状材料，包括膜，例如sailastic膜，或纤维。优选地，当施用包括本发明的抗体或肽的蛋白质时，必需小心使用该蛋白质不能吸收的材料。在另一实施方案中，该化合物或组合物可在载体，特别是脂质体中给药。在另一实施方案中，该化合物或组合物可在控释系统中给药。在一个实施方案中，可使用泵。在另一实施方案中，可使用聚合材料。在另一实施方案中，控释系统可放在治疗靶，即脑的附近，从而只需要部分系统剂量。
当一种组合物的给药可以被接受者动物耐受，且该组合物适合于给该动物给药，则认为该组合物是“药学上或生理学上可接受的”。当给药量是生理学上有效的，则认为该试剂是以“治疗有效量”给药。当一种试剂的存在导致在接受者患者生理学上有可检测的变化，则该试剂是生理学上有效的。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。事实上，除了本文所述的内容外，本发明的各种修饰对于本领域的技术人员而言根据上面的描述和附图将是显而易见的。该修饰试图落在所附权利要求书的范围内。下面的实施例仅以例证本发明的方式而不是以限制的方式提供。
实施例实施例1-组织学和免疫细胞化学福尔马林固定的大脑皮层尸体解剖组织从波士顿大学阿尔茨海默氏病中心(Boston University Alzheimer’s Disease Center)获得。冷冻的大脑以30μm的厚度切片。切片在明胶覆盖的载玻片上封固，其后用3.5％的低聚甲醛固定30分钟，再用0.3％H2O2预温育15分钟。为进行免疫组织化学，可将该切片用0.25％Triton X-100处理，用10％马血清温育l小时，并与小鼠抗Aβ的单克隆抗体(ZYMED，South San Francisco，USA)或山羊抗人VEGF的多克隆抗体(R&D Systems Inc.，Minneapolis，USA)反应12-16小时。然后将切片与偶联了德克萨斯红(Texas red)的抗小鼠IgG(Vector Laboratories，Burlingame，USA)或标记了生物素的兔抗山羊IgG(Vector Laboratories)反应。后者与偶联了荧光素的链霉抗生物素蛋白(Vector Laboratories)反应。为进行刚果红(Congo Red)染色，将免疫标记的切片在已于使用前用2.5mM NaOH碱化的饱和醇氯化钠溶液(含4％(w/v)NaCl的80％EtOH)中温育20分钟，然后加入0.2％刚果红(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)。20分钟后，切片用无水乙醇漂洗并用VECTASHIELD封固介质(Vector Laboratories)封固。
实施例2-结合试验通过表面胞质团共振分光术(surface plasmon resonance spectroscopy)测定已知的Aβ-结合蛋白和VEGF与Aβ肽的结合。Aβ1-40，Aβ1-42，和Aβ40-1(BACHEM，Bubendorf，Switzerland)用胺偶联试剂固定在CM5传感器芯片(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)上。α2-巨球蛋白，α1-抗凝乳蛋白酶，血清淀粉样蛋白P成份，载脂蛋白E4，和VEGF165(100nM)以10μl/分钟的流速使其与固定的Aβ结合并实时记录传感器图。为了测定结合亲和性，用0.5μM的Aβ肽(100μl)覆盖微量滴定孔，用结合缓冲液(含0.1％BSA的M199/25mMHEPES/NaOH，pH7.4)封闭多余的位点，且通过单独或在存在各种浓度的未标记VEGF下加入50pM的125I-VEGF(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)测定结合。
实施例3-共聚集试验Aβ1-40的聚集按改良的方法(Chang等，Brain Res Brain Res Protoc 2000，6(1-2)6-12)来测定。将Aβ1-40(100μM)与偶联了FITC的Aβ1-40(1μM)在50mM MES，pH5.8中37℃温育2天后，离心该混合物，测量该沉淀中的荧光。对于VEGF与Aβ的共聚集，将100μM的Aβ1-40或Aβ40-1与125I-VEGF165(1nM)混合并在37℃温育2天。然后离心该混合物并在γ-计数器中测定沉淀的放射性。为了研究VEGF对Aβ聚集率的影响，在37℃下温育单独的Aβ1-40混合物(50μM的Aβ1-40和1μM的FITC-Aβ1-40)或含1μM VEGF的Aβ1-40，离心后通过测量沉淀中的荧光测定聚集程度。对于VEGF与聚集前的Aβ1-40的结合，将50μM新鲜的Aβ或预温育2天的Aβ与125I-VEGF(1nM)混合并立即离心。测定沉淀中的放射性。
实施例4-解离试验对于VEGF从Aβ/VEGF共聚集体的解离，可将在共聚集试验中获得的沉淀重悬于50mM MES，pH5.8中，温育不同时间并离心。测定上清液中的放射性。为了研究Aβ/VEGF复合物对SDS处理的敏感性，向125I-VEGF165或在共聚集试验中获得的沉淀中加入非还原型SDS-PAGE样品染料且混合物煮沸10分钟。通过SDS-PAGE(10％)分离混合物并放射自显影。
实施例5-结果实施例5.1-VEGF与患有AD的患者脑中的淀粉样蛋白斑共定位。我们检查了在AD患者颞叶皮层(temporal cortex)中VEGF的表达方式是否改变。我们观察到与老年对照相比AD患者脑中VEGF的免疫反应增强(图1A和C)。意想不到的是，在AD患者皮层区的嗜刚果红斑中观察到VEGF的严重积累(图1A和B)。在年龄匹配的受试者皮层切片中很少检测到VEGF免疫反应和淀粉样蛋白斑(图1C和D)。叠加免疫细胞化学揭示了VEGF与AD患者神经炎和弥散斑中的Aβ共定位(图1E-1G)。从我们检查的所有AD脑样品(7个患者)中获得了相似的结果。
实施例5.2-VEGF以高亲和力和特异性结合Aβ肽。我们研究了Aβ和VEGF是否特异性和以高亲和力相互作用。我们将Aβ1-42，Aβ1-40，和Aβ40-1固定在BIAcore CM5传感器芯片上并通过表面胞质团共振分光术研究了VEGF和其它分子与Aβ肽的结合(图2A和B)。该结果表明VEGF与Aβ1-42和Aβ1-40的结合比诸如α2-巨球蛋白，α1-抗凝乳蛋白酶，血清淀粉样蛋白P成份，和载脂蛋白E4等已知结合Aβs的其它分子强得多(Bohrmann等，J BiolChem 1999，274(23)15990-15955；Hamazaki H.，J Biol Chem 1995，270(18)10392-10394；Hughes等，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95(6)3275-3280；Strittmatter等，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90(17)8098-8102)。用生物素标记的Aβ1-40进行的ELISA分析显示出的结果与通过表面胞质团共振分光术获得的结果相似(数据未显示)。VEGF不与Aβ40-1结合，该肽具有与Aβ1-40相反顺序的氨基酸序列。我们通过分析在递增浓度的非标记VEGF存在下放射性标记的VEGF与固定的Aβ肽的结合测定了Aβ与VEGF之间的结合亲和力(图2C)。在该试验中，对于Aβ1-40获得了大约50pM的解离常数(KD＝IC50-[125I-VEGF])(DeBlasi等，TrendsPharmacol Sci 1989，10(6)227-229)。Aβ1-42对VEGF显示出相似的结合亲和性(数据未显示)。这些结果表明VEGF特异性和以高亲和力与Aβ肽直接结合。
实施例5.3-Aβ肽对VEGF的细胞结合和促分裂活性具有很小的影响。接着我们研究了Aβ肽对VEGF的细胞结合和促分裂活性的影响。即使在高浓度(1μM)下Aβ1-40或Aβ1-42都不影响VEGF与内皮细胞上的受体结合或VEGF诱导的内皮细胞增殖(数据未显示)。最近的研究表明VEGF与神经元和内皮细胞和一些肿瘤中表达的neuropilin-1相互作用(Soker等，Cell 1998，92(6)735-745)。Aβ1-40和Aβ1-42都不影响VEGF与表达neuropilin-1的MDA-MB-231肿瘤细胞的结合(数据未显示)。综合起来，Aβ肽似乎不影响VEGF的细胞结合和促分裂活性，尽管它们与VEGF以高亲和力结合。
实施例5.4-VEGF与Aβ共聚集，强烈结合聚集前的Aβ且从共聚集的复合物中非常缓慢地释放。由于VEGF在AD脑的Aβ斑中积累且与Aβ肽强烈相互作用，我们检查了VEGF与Aβ共聚集的机理。当我们温育单独的Aβ2天时，离心后在沉淀中出现大约60％的Aβ(数据未显示)。当在溶液中一起温育125I-VEGF和Aβ1-40时在沉淀中也出现大约相同比例的VEGF(图3A)。然而，反向肽Aβ40-1的存在不会引起VEGF的广泛沉积(P＝0.0076)。时间过程实验表明VEGF(1μM)对50μM和100μM的Aβ1-40的聚集无明显影响(图3B且数据未显示)。当VEGF与新鲜的或聚集前的Aβ混合并立即离心时，VEGF与聚集前的Aβ结合且这些复合物可通过离心沉淀(图3C)。接着我们研究了VEGF从Aβ/VEGF复合物的解离率。3天后，从复合物中释放不超过1.5％的VEGF(图4A)。然而，Aβ/VEGF复合物对SDS处理敏感(图4B)。这些结果清楚地表明VEGF可与Aβ共聚集而对Aβ的聚集率无任何明显的影响，强烈结合聚集前的Aβ，且从共聚集的Aβ/VEGF复合物中非常缓慢地释放。
实施例6-测定VEGF的Aβ结合区为了测定VEGF的Aβ结合区，我们按以前所述将完整VEGF，肝素结合区，和肝素结合区的部分区域与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合(Soker等，JBiol Chem 1996，272(50)31582-31588)。用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的蛋白质。GST和GST-融合蛋白以200nM的浓度固定在微量滴定孔中，而VEGF以100nM固定，因为VEGF二聚体具有两个肝素结合区。用3％BSA/PBS封闭非特异性结合位点，向每孔中加入200nM的Aβ且使其与固定蛋白结合。去掉未结合的Aβ且用兔抗-Aβ抗体接着用与辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体测定结合的Aβ。结果见图5。
实施例7-测定Aβ的VEGF结合区以两种方法测定Aβ中的VEGF结合区。VEGF以100nM的浓度固定在微量滴定孔上且用3％BSA/PBS封闭非特异性位点。单独或者在30μM突变体Aβs存在下向各孔中加入Aβ1-42(50nM)并使其结合到固定的VEGF上。去掉未结合的Aβ后，通过兔抗-Aβ抗体的结合接着用与辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体测定结合的Aβ。作为选择，单独或者在50μM突变体Aβs存在下向固定的VEGF中加入生物素标记的Aβ1-42(50nM)，代替Aβ。用与辣根过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白测定结合的生物素标记的Aβ。结果见图6。
实施例8-肝素作为VEGF/Aβ相互作用的抑制剂为了研究肝素对VEGF与Aβ相互作用的影响，将GST-肝素结合区以100nM的浓度固定在微量滴定孔中，并用3％BSA/PBS封闭非特异性位点。单独或者在递增浓度的肝素存在下向孔中加入生物素标记的Aβ1-42(50nM)。去掉未结合的生物素标记的Aβ后，用与辣根过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白测定结合的肽。结果见图7。
实施例9-PGG，EGCG，鞣酸作为VEGF/Aβ相互作用的抑制剂PGG，EGCG和鞣酸的抑制性效果测定如下在塑料孔中覆盖VEGF165(50ng/well)，用含3％牛血清白蛋白的PBS处理孔2小时并用PBS漂洗。在递增浓度的试验化合物存在下向各孔中加入生物素标记的Aβ(100ng/ml)。2小时后，用含0.05％Tween的PBS漂洗各孔几次。用与辣根过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白测定结合的生物素标记的Aβ。结果见图8。
本文引证的所有参考文献以其整体引用以供参考。
*****本领域的技术人员将认识到，或者使用不超出常规的实验能够确定，本文具体描述的本发明的具体实施方案的许多等价形式。该等价形式试图包含在权利要求的范围内。
序列表<110>POSCO公司(POSCO)学校法人 浦项工科大学校(POSTECH Foundation)蔡治范(Chae，Chi-Bom)高用松(Gho，Yong Song)杨胜弼(Yang，Seung-Pil)权炳吾(Kwon，Byung Oh)裴铜球(Bae，Dong-Goo)黄世旭(Hwang，Sewook)<120>β-淀粉样蛋白结合因子及其抑制剂<130>10011-00001<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>165<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys1 5 10 15Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu20 25 30Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys35 40 45Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu50 55 60Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe85 90 95Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg100 105 110Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe115 120 125Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser130 135 140Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys145 150 155 160Asp Lys Pro Arg Arg165<210>2<211>55<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His1 5 10 15Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr20 25 30Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys35 40 45Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg50 55
<210>3<211>27<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn1 5 10 15Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg20 25<210>4<211>42<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Arg Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>5<211>62<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Ala Asp Cys Lys Tyr Lys Phe Glu Asn Trp Gly Ala Cys Asp Gly Gly1 5 10 15
Thr Gly Thr Lys Val Arg Gln Gly Thr Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Asn20 25 30Ala Gln Cys Gln Glu Thr Ile Arg Val Thr Lys Pro Cys Thr Pro Lys35 40 45Thr Lys Ala Lys Ala Lys Ala Lys Lys Gly Lys Gly Lys Asp50 55 60
权利要求
1.一种特异性结合肝素和β-淀粉样蛋白的β-淀粉样蛋白结合多肽(β-ABP)，其中该多肽不是SEQ ID NO5。
2.权利要求1的多肽，它与SEQ ID NO3具有至少85％的序列相同性。
3.权利要求2的多肽，它与SEQ ID NO3具有至少90％的序列相同性。
4.权利要求3的多肽，它与SEQ ID NO3具有至少95％的序列相同性。
5.权利要求4的多肽，它与SEQ ID NO3具有至少97％的序列相同性。
6.权利要求5的多肽，它以SEQ ID NO3表示，且可在N-末端或C-末端增加或减少大约5个氨基酸。
7.权利要求1的多肽，它与β-淀粉样蛋白上从SEQ ID NO4的大约位置25的Gly残基到大约位置35的Met残基的区域特异性结合。
8.权利要求1的多肽，它对β-淀粉样蛋白具有以解离常数约10nM所表示的结合亲和力。
9.权利要求8的多肽，其中所述的解离常数是大约1nM。
10.权利要求9的多肽，其中所述的解离常数是大约100pM。
11.一种特异性结合权利要求1的多肽的抗体。
12.权利要求11的抗体，它是单克隆抗体。
13.一种编码权利要求1的多肽的分离的核酸。
14.一种含有权利要求13的核酸的表达载体。
15.一种含有权利要求14的表达载体的宿主细胞。
16.一种预防β-淀粉样蛋白与内源性VEGF结合的方法，包括(a)产生重组的病毒载体或质粒载体，它包含与启动子可操作相连的编码VEGF多肽的DNA序列；和(b)给需要的患者施用该病毒载体或质粒载体，以便所述的DNA序列在脑内的表达导致β-淀粉样蛋白与VEGF多肽结合。
17.一种在血管生成过多的区域灭活内源性VEGF的方法，包括(a)产生重组的病毒载体或质粒载体，它包含与启动子可操作相连的编码β-淀粉样多肽的DNA序列；和(b)给需要的患者施用该病毒载体或质粒载体，以便所述DNA序列在血管生成过多的位点的表达导致该β-淀粉样多肽与内源性VEGF结合。
18.测定VEGF多肽与β-淀粉样蛋白的结合的方法，包括(a)给怀疑含有β-淀粉样蛋白的样品提供VEGF；和(b)检测当样品中存在β-淀粉样蛋白时VEGF与β-淀粉样蛋白的结合。
19.权利要求18的方法，其中该多肽与聚集前的β-淀粉样蛋白结合。
20.权利要求18的方法，其中该多肽与细胞外斑结合。
21.权利要求18的方法，其中所述的多肽是VEGF的肝素结合区。
22.权利要求21的方法，其中所述的多肽基本上是肝素结合区的C-端半分子。
23.诊断以淀粉样蛋白斑的存在为指征的疾病的方法，包括(a)提供怀疑具有淀粉样蛋白斑的样品组织；(b)将所述样品组织与能够特异性结合β-淀粉样蛋白的VEGF多肽接触；和(c)检测所述多肽与所述淀粉样蛋白斑的结合，其中结合表示处于疾病状态。
24.权利要求23的方法，其中所述的VEGF多肽是β-淀粉样蛋白结合多肽(β-ABP)。
25.权利要求24的方法，其中所述的多肽被标记。
26.权利要求23的方法，其中在步骤(c)中，所述的检测通过检测特异性结合所述VEGF多肽，β-淀粉样蛋白，或VEGF多肽/β-淀粉样蛋白复合物的配体来实现，其中，所述的配体被标记。
27.一种诊断试剂盒，包含(a)一种含有特异性结合β-淀粉样蛋白的VEGF多肽的容器；(b)特异性结合所述VEGF多肽，β-淀粉样蛋白，或多肽/β-淀粉样蛋白复合物的第一配体；(c)标记的特异性结合所述第一配体的第二配体；以及其使用说明。
28.防止VEGF与β-淀粉样蛋白结合的方法，包括提供一种抑制VEGF与β-淀粉样蛋白之间的相互作用的化合物。
29.权利要求28的方法，其中将所述化合物提供给患有以淀粉样蛋白斑形成为指征的疾病的哺乳动物。
30.权利要求28的方法，其中所述化合物是一种单体或多聚体，它包含具有酚或硫酸取代基的糖主链。
31.权利要求28的方法，其中所述的化合物是儿茶素或儿茶素酚化合物。
32.一种筛选抑制VEGF/β-淀粉样蛋白结合的化合物的方法，包括(a)将化合物与含有VEGF和β-淀粉样蛋白的样品接触；(b)在VEGF与β-淀粉样蛋白正常特异性互相结合的条件下测定VEGF与β-淀粉样蛋白结合的水平；(c)在所述化合物存在的条件下测定VEGF与β-淀粉样蛋白结合的水平；和(d)比较(a)和(b)部分所述的VEGF与β-淀粉样蛋白结合的水平，其中当所述水平在(c)中比在(b)中低，则所述化合物是VEGF/β-淀粉样蛋白结合的抑制剂。
33.治疗阿尔茨海默氏病的方法，包括给需要的病人施用治疗有效量的抑制VEGF和β-淀粉样蛋白结合的化合物。
34.一种分离的含有β-淀粉样多肽的分子，它能够结合VEGF以形成无功能的复合物，它包含(a)第一多肽元件，该元件包含含有与VEGF结合的β-淀粉样多肽的氨基酸序列；和(b)多聚化元件。
35.一种形成VEGF的无功能复合物的方法，包含将怀疑含有VEGF的样品与权利要求34的分子接触。
36.一种分离的含有VEGF多肽的分子，它能够结合β-淀粉样蛋白以形成无功能的复合物，它包括(a)第一多肽元件，该元件包含含有与β-淀粉样多肽结合的VEGF多肽的氨基酸序列；和(b)多聚化元件。
37.一种形成β-淀粉样蛋白的无功能复合物的方法，包含将怀疑含有β-淀粉样蛋白的样品与权利要求36的分子接触。
全文摘要
本发明涉及与β－淀粉样蛋白结合的VEGF多肽。本发明还涉及螯合β－淀粉样蛋白的化合物。且反之，本发明涉及螯合VEGF的化合物。因此，本发明还涉及筛选抑制VEGF与β－淀粉样蛋白结合的化合物的方法，且因此涉及阿尔茨海默氏病的诊断和治疗。
文档编号A61P25/00GK1617884SQ02827991
公开日2005年5月18日 申请日期2002年12月13日 优先权日2001年12月13日
发明者蔡治范, 高用松, 杨胜弼, 裵铜球, 权炳吾, 黄世旭 申请人:Posco公司, 学校法人浦项工科大学校