重组人muc1-mbp融合蛋白抗肿瘤疫苗及生产工艺的制作方法

专利名称：重组人muc1-mbp融合蛋白抗肿瘤疫苗及生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤生物治疗中主动特异性免疫的疫苗技术，尤其是提供了一种重组人MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗及生产工艺，以达到预防和治疗肿瘤目的，属于基因工程融合蛋白技术领域。
背景技术：
MUC1是Mucins粘蛋白家族的重要成员，存在于正常腺管上皮细胞及其来源的肿瘤细胞表面，由多肽核芯(核芯肽)和侧枝糖链构成。正常组织MUC1与肿瘤组织不同，前者分布于腺管上皮细胞分泌极，与免疫细胞相对隔离，糖基化丰富；而后者广泛分布并异常丰富地表达于癌细胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情况下隐蔽的表位，成为免疫细胞攻击的靶点。
目前，以MUC1为靶点的疫苗包括蛋白或多肽疫苗、糖疫苗和DNA疫苗，其中蛋白疫苗表现出良好的应用前景。Livingston研究小组1996年通过合成不同长度的MUC1串联重复序列，将30aa重复序列与KLH连接，免疫鼠诱导出高效价的MUC1特异性抗体，尽管未诱导出CTL，但明显抑制了肿瘤的生长，而单独使用多肽免疫不能产生任何免疫应答。美国Biomira公司正在研制基于MUC1的多肽疫苗，命名为BLP-25，已进入非小细胞肺癌的临床II期试验阶段。研究发现单纯的多肽不能诱导任何免疫应答，只有制备成融合蛋白后，方能不同程度的诱导免疫反应。而以往研制的融合蛋白疫苗，多半为人工合成多肽，并且多数面临着免疫原性弱不能诱导细胞毒性T细胞(CTL)等缺点。
麦芽糖结合蛋白(MBP)是大肠杆菌的成分，由大肠杆菌malE基因编码，其具有强的免疫原性。

发明内容
本发明利用基因工程的方法，提供一种重组人MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗的生产工艺，制备MUC1-MBP融合蛋白-肿瘤疫苗，是肿瘤生物治疗中主动特异性免疫的治疗方法，以达到预防和治疗肿瘤目的。
本发明是将MBP基因与MUC1基因融合在一起，研制一种基因工程融合蛋白疫苗。用MBP代替其他的融合蛋白诱导CTL反应。pMAL-p2是高效表达麦芽糖融合蛋白的原核表达载体，我们将MUC1基因的串联重复序列插入malE基因的下游，一方面能在大肠杆菌中直接高效诱导表达与MBP融合的蛋白，另一方面省却了化学合成融合蛋白的步骤。
本发明的技术解决方案如下1.将该MUC1基因450个碱基按照正确阅读框插入pMAL-p2原核表达载体malE基因下游，使MUC1与MBP基因连接到一起，通过酶切鉴定该重组载体pMAL-MUC1的正确性。(图1)2.表达MUC1-MBP融合蛋白的重组质粒pMAL-MUC1转化大肠杆菌DH5α，在IPTG的诱导下，表达了分子量62KD的融合蛋白MBP-MUC1，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定其正确性，并得到稳定的表达菌株pMAL-MUC1/DH5α。(图2，图3)3、常规基因测序测定MUC1-MBP融合蛋白的基因序列。
4.大量培养pMAL-MUC1/DH5α，经过超声破碎提取全菌体上清液，通过凝胶过滤层析→淀粉糖亲和层析→超滤获得了较纯的MUC1-MBP融合蛋白和MBP蛋白。通过SDS-PAGE得到了鉴定.(Fig.4)5.MUC1-MBP抗肿瘤免疫活性的测定。
(1)抗MUC1特异性抗体的测定将重组MUC1-MBP融合蛋白免疫C57小鼠，通过ELISA检测多克隆抗体。
(2)抗MUC1特异CTL细胞毒活性的测定通过MTT法测定CTL细胞毒杀伤活性。
(4)免疫鼠成瘤实验将高表达MUC1的人乳腺癌细胞(MCF7)注射给免疫的C57小鼠，3-5周后观察肺部及局部肿瘤生长情况。
MUC1-MBP融合蛋白核苷酸序列特征长度1710个碱基类型 核酸链性 单链1.atgaaaaaat tattattcgc aattccttta gtggtacctt tctattctca ctcggccgat61 atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt121 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat181 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt241 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc
301 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac361 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa421 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaa gagatcc cggcgctgga taaagaactg481 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg541 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa601 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt661 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa721 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa781 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttc aagggtc aaccatccaa accgttcgtt841 ggcgtgctga gcgcaggtat taa cgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc901 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg961 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc1021 actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc1081 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa1141 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac1201 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatccc ccgggctgca ggaattcccc1261.gcccccccag cccacggagt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1321.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1381.gccccccaag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1441.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1501.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1561.gcccccccac tccacggtgt cacctcggcc ccggagaaca ggccggcccc gggctccacc1621.gcgcccgcag cccacggtgt cacctcggcc ccggagagca ggccggaatt cgatatcaag1681.cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tga本发明适用于下述医疗用途1.预防和治疗各种腺癌及其转移癌。
2.肿瘤手术后残留病灶的治疗。
3.BCG作为佐剂增强MUC1-MBP诱导的免疫。
4.与IL-2或GM-CSF配伍使用。
5.与化疗药物配伍使用。
目前肿瘤治疗采取综合疗法包括手术、放疗和化疗。但面临着主要问题是残留病灶，不能彻底根治。随着对肿瘤的病因学、细胞生物学、分子生物学的发展，人们对肿瘤和宿主免疫学关系的认识不断加深，肿瘤生物治疗，尤其是以肿瘤抗原为基础研制的肿瘤疫苗受到普遍关注，有效的肿瘤疫苗不仅抗肿瘤作用强，而且无放疗化疗的毒副作用，使解决肿瘤治疗中的残留病灶成为可能。
下述的动物实验证实了本发明药物制剂具有预防和治疗各种腺癌及其转移癌等作用1.重组MUC1-MBP诱导的抗体应答采用竞争ELISA对抗MUC1特异抗体进行了测定。结果表明，重组人类MUC1蛋白诱导小鼠产生了抗人类MUC1的特异性抗体。PBS对照组及纯品MBP组免疫鼠均未见抗MUC1特异抗体，但后者血清中出现高效价的抗MBP抗体，表明MBP是诱导鼠产生MUC1抗体的有利载体。MUC1-MBP免疫组抗MUC1抗体的效价为15760±3221。(Fig.5，Fig.6)用重组的MUC1-MBP融合蛋白免疫C57小鼠，产生了高效价的特异的抗人类MUC1抗体。佐剂BCG明显增强了抗体反应。
2.融合蛋白MUC1-MBP诱导的抗MUC特异的CTL反应通过MTT法测定了小鼠脾CTL活性，分别用MCF-7和鼠Lewis肺癌细胞作为靶细胞，在效靶比例为100∶1时，BCG组与PBS对照组相比杀伤活性无明显差别；MUC1-MBP免疫组小鼠脾细胞对MCF-7细胞和Lewis肺癌细胞杀伤活性分别为47.7±4.3％和67.5±6.5％，与PBS对照组及BCG组相比P＜0.01，有显著性差异；当用K562作为靶细胞时，MUC1-MBP免疫组、BCG组和PBS对照组小鼠脾细胞杀伤活性组间比较P.＞0.05，无显著性差异。该结果表明，无论对于人类MCF-7还是鼠Lewis肺癌细胞每只鼠均诱导出MUC1特异的CTL活性，并且杀伤率随着效靶比例的增高而增加(Fig.7))。该结果表明重组MUC1-MBP融合蛋白不仅存在B细胞表位，同时也存在CTL表位。
用融合蛋白MUC1-MBP免疫C57鼠产生了强烈的抗MUC1特异的CTL，其针对人类MCF7和鼠Lewis肺癌细胞，均表现出明显的杀伤活性。由于我们在实验中使用的材料是脾细胞，因此所测定的杀伤活性可能包含非特异性杀伤(NK)，为排除这种可能，我们用K562作为对照，MUC1免疫组与PBS对照组相比，对K562的杀伤活性虽然略有增高，但无统计学意义，因此可排除诱导NK细胞活性的可能。另外，为排除BCG诱导的非特异性杀伤，我们用BCG单独免疫小鼠，测定脾细胞的杀伤活性也未见增高。上述结果均证实MUC1-MBP免疫鼠诱导了MUC1特异的CTL活性。CTL特异性杀伤通常受自身MHC的限制，而经MUC1-MBP融合蛋白免疫鼠诱导的CTL能够杀伤人类乳腺癌细胞，表明其诱导的杀伤不受MHC限制。
3.MUC1-MBP诱导的主动免疫对于人乳腺癌细胞系(MCF7)生长抑制在荷瘤鼠实验中，使用肿瘤细胞是MCF7做动物模型。在用疫苗免疫后的第3-10天给C57小鼠注射MCF7细胞，三周后，对照组在背部注射局部均长出大小不等的肿瘤，其中体积最大的是2250mm3，有的肿瘤中心破溃；鼠状态消瘦，毛色灰暗无光泽，28天后该鼠死亡。对照组肿瘤平均体积537mm3；；而经融合蛋白MUC1-MBP免疫鼠，仅有6只在背部长出18-31mm3大小的肿瘤。疫苗免疫组肿瘤平均体积14mm3。统计学处理结果表明实验组与对照组相比有显著性差异(p＜0.001)。人类重组MUC1-MBP融合蛋白诱导的免疫明显抑制了人腺癌细胞的生长。
表1.MUC1免疫鼠注射MCF7R人乳腺癌的生长肿瘤体积(mm3)NO对照组疫苗免疫组1 1500182 456 263 502 04 722 315 268 06 151 197 353 248 198 09 821 2710397 0本发明的积极效果在于本发明是通过诱导机体特异性免疫应答，尤其是细胞免疫应答，来达到抗肿瘤的目的。克服了以往融合蛋白疫苗免疫原性弱不能诱导细胞毒性T细胞(CTL)等缺点。本疫苗是利用基因工程的方法在大肠杆菌中制备，成本低廉，适合于商业化生产。


图1重组pMAL-MUC1酶切片段的分析。
用BamHI和HindIII消化pMAL-MUC1、pMAL和pBS-MUC1。
第1列pMAL-MUC1，第2列pMAL，第3列pBS-MUC1，第4列DNA标准品。
图2重组的MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达。
第一列蛋白标准品，第二列未经转化的DH5α，第三列未经IPTG诱导的pMAL/DH5α，第四列从第4列到第8列分别为经IPTG诱导1到5小时的pMAL/DH5α。第九列未经IPTG诱导的pMAL-MUC1/DH5α，从第10列到第14列分别为经IPTG诱导1到5小时的pMAL-MUC1/DH5α。
图3 MUC1-MBP的表达通过Westemblot的分析。
第一列pMAL-MUC1/DH5α的总蛋白，第二列pMAL-MUC1/DH5α的质周腔蛋白，第三列未经IPTG诱导的pMAL-MUC1/DH5α的总蛋白，第四列pMAL/DH5α的总蛋白。
图4纯化的MUC-MBP通过SDS-PAGE的分析。
第一列蛋白标准品，第二列纯化的MUC1-MBP，第三列纯化的MBP。
图5抗MUC1抗体与MUC1-MBP的反应。
首先，将抗血清与过量的MBP反应，封闭抗血清中抗MBP抗体与融合蛋白MUC1-MBP反应位点，然后再通过ELISA测定抗MUC1抗体。
图6抗MUC1抗体的效价分别通过MUC1-MBP(◆)、MBP(▲)、PBS(■)和BCG(●)。注射的C57小鼠血清中抗MUC1抗体的效价通过竞争ELISA进行测定。免疫过程中用BCG作佐剂。
图7 MUC1-MBP免疫鼠脾脏抗MUC1特异的CTL反应。
(●)为MUC1-MBP免疫组，，(◆)为PBS对照组，(■)为BCG对照组。
A是Lewis肺癌作为靶细胞，B是MCF7作为靶细胞，C是K562作为靶细胞。
具体实施例方式实施例一.MUC1-MBP融合蛋白表达载体的构建1.常规质粒提取与纯化.(参见分子克隆实验指南，j。萨姆布鲁克，主编科学出版社出版，1998)2.酶切片段的分离与回收.
(1)用EcoRI和HindIII双酶切pMAL-P2及PSK-MUC1质粒，25-37℃ 1-3小时。
(2)在0.7-1.5％琼脂糖凝胶上电泳分离DNA片段，用冻融法或试剂盒回收载体片段pMAL-p2和450bp目的片段MUC1。
(3)在0.7-1.5％琼脂糖凝胶上电泳鉴定回收的载体片段及目的片段。
3.pMAL-p2载体与MUC1片段的连接pMAL-p2载体片段1-10μlMUC1片段 5-20μlEcoRI2-4μlHindIII2-4μlT4连接酶 1-2μl按上述量，在50-100μl反应体系中16℃的条件下反应一个晚上.通过T4连接酶将MUC1片段按正确的阅读框连接到经BamHI和HindIII双酶切的载体片段上，然后取出1-10μl常规转化大肠杆菌DH5α。
4.常规制备感受态(参见分子克隆实验指南，j。萨姆布鲁克，主编科学出版社出版，1998)5.大肠杆菌转化(1)在每管250μl的感受态中加入1-5μl的质粒，轻轻旋转混匀，冰浴30分钟。
(2)42℃休克2分钟.
(3)冰浴2分钟..
(4)4℃5000rpm离心10分钟.
(5)弃上清剩余100μl重悬菌体.铺于含氨卞青霉素的LB琼脂平板表面.
(6)37℃恒温倒置过夜培养.
6重组克隆的筛选与鉴定经氨苄青霉素筛选转化菌落，挑取不同的克隆小量培养，如前所述提取质粒，用EcoRI和HindIII双酶切质粒，然后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分离DNA，通过插入片段的分子量大小确定MUC1片段。
二.MUC1-MBP融合蛋白重组载体(pMAL-MUC1)的表达与鉴定1重组MUC1基因的诱导表达(1)将正确连接的pMAL-MUC1载体转化大肠杆菌DH5α，并将其铺于含有氨苄青霉素的LB培养基平板中，25-37℃过夜培养.
(2)挑取不同的菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养中，于25-37℃过夜培养.
(3)将50μl的每种过夜培养物分别接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基上，25-37℃通气培养3-4小时，以0.1mM-1.0mM IPTG诱导培养3-6小时，离心沉淀细菌，弃上清，将沉淀保存于-20℃.
(4)重悬沉淀，然后加入相同体积的载样液混匀，80-100℃煮沸5分钟，离心，取上清10-30μl加入到SDS-PAGE上电泳鉴定蛋白的表达情况.
2.pMAL-MUC1在大肠杆菌中的大量表达(1)将冻存的pMAL-MUC1/DH5α接种于5-150ml LB培养液中，25-37℃振摇过夜.
(2)次日，将培养物接种于500-2000ml LB培养液中(3)离心沉淀.弃上清，将沉淀保存于-20℃。
(4)加入0.1-1.0mM IPTG继续培养3-8小时。
(5)离心沉淀.弃上清.将沉淀保存于-20℃。
(6)称取湿菌的重量.-20℃保存.
3.聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)(1)安装电泳玻璃板装置，(2)配制5％浓缩胶和10％分离胶，(3)将细菌沉淀重悬于1×载样液中，100℃煮沸5分钟破碎细菌，(4)安装电泳槽(5)取上清10-30μl加入10％SDS-PAGE(6)设恒压100-200V，电泳1-2h(7)卸下凝胶，考马斯亮蓝R-250振摇染色1h.
(8)在50％甲醇，7％乙酸，水溶液中脱色1h.
5.Western blot(1)当SDS-PAGE电泳即将结束时，用蒸馏水冲洗半干式转移槽的石墨板，擦干。
(2)切胶，6张滤纸和一张硝酸纤维素膜，大小相同。用转移液浸泡5分钟。
(3)安装转移槽，平放石墨板底座，在石墨板上放置3张经转移液浸泡的滤纸，然后把硝酸纤维素膜放在滤纸上，保证对齐。
(4)将凝胶平放于纤维素膜上，把另一组3张滤纸放在凝胶上。
(5)将转移槽盖扣到石墨板上，连接电源，设电流60-100mA转移1-2小时。
(6)转移结束后，将转移膜冲洗后放入1-3％BSA封闭液中，封闭1-2小时。
(7)快速冲洗2次，洗膜3次。
(8)把转移膜放入杂交袋，以2-8μl/ml浓度加入一级抗体鼠抗人MUC1抗体，振摇1-2小时。
(9)如(7)洗膜。
(10)加入二级抗体山羊抗鼠IgG-HRP，60倍稀释。反应1-2小时。
(11)洗膜。
(12)加入底物反应5分钟，底物溶液二氨基联苯胺(DAB)7mg，30％H2O210μl溶于TBS溶液。
三.常规基因测序MUC1-MBP融合蛋白核苷酸序列见附图8特征长度1710个碱基类型 核酸链性 单链四.MUC1-MBP融合蛋白及MBP的纯化1.大肠杆菌超声破碎每克湿重菌加入10-30ml TE缓冲液，超声破碎，声频15-35KHz，10-20次，每次12秒，间隔10秒钟。4℃，4000-10000rpm离心10-30min，留取上清，SDS-PAGE电泳鉴定。
2.Amyrose亲和层析(1)取amylose resin 4ml用蒸馏水洗3次，10ml/次。
(2)将水洗过的amylose resin装入1.5cm直径的玻璃柱，柱床体积4ml。
(3)超声破碎的细菌上清8ml装柱。
(4)用洗液(20mM Tris PH 7.4，0.2M NaCL，10mM 2ME，1mMEDTA)洗3次。
(5)测定蛋白含量OD 280/260。
(6)SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的纯度。其纯度95％。
5.Sephadex G-25除盐或超率除盐(1)Sephadex G-25加水溶涨一个晚上。
(2)装入细长的柱子上。
(3)装入一个柱床体积的蛋白溶液，接取过柱流出液。
(4)PBS洗3次，接取洗脱液。
(5)SDS-PAGE电泳、Western blot、ELISA鉴定所纯化的蛋白。
6.蛋白质定量.利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白浓度.
(1)标准蛋白质溶液，BSA 300μg/ml.
(2)染色液0.01％考马斯亮蓝G-250，4.7％乙醇，8.5％H3PO4，4℃保存。
(3)取10μl MUC1蛋白溶液稀释100倍加入900μl H2O待用。
(4)配制不同浓度的BSA溶液，0，7，15，30，60，90μg/ml。
(5)分别取上述溶液及待测溶液1ml，加入3ml染色液，室温15分钟。
(6)OD595比色测定。
五.MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤活性的测定1.动物18-20g雌性C57小鼠购自长春高新动物有限公司2.免疫程序每只鼠注射剂量100-500μl，其中含MUC1-MBP和BCG，BCG作为佐剂。颈背部皮下多点及两侧腹股沟皮下注射，隔周一次，共免疫两次，在第二周免疫后2-10天取眶上静脉血检测抗体效价。
3.C57小鼠免疫(1)将C57小鼠40只分成4组，3组为对照组，分别是PBS，PBS+BCG，PBS+BCG+MBP；一组为实验组MUGl-MBP+BCG(2)给药途径颈背部皮下多点及两侧腹股沟皮下注射。
(3)给药剂量MUC1 10-100μg/只，BCG 1-5mg/只。
(4)免疫程序隔周一次共两次。
(5)最后免疫的第2-10天眶上静脉采血测定抗体效价。
4.抗体效价测定(1)竞争ELISA用过量的MBP与抗血清发生发应封闭抗MBP抗体的结合位点后，分别与MUC1-MBP及MBP发生反应，通过颜色变化的不同来测定抗MUC1抗体的存在。
1)首先用相同摩尔数的MUC1-MBP及MBP包板，一个晚上。
2)稀释抗血清。
3)以终浓度为5、10、20μg/ml的MBP与稀释的抗血清发生反应1-3h。
4)洗酶标板。
5)封闭液封闭1.5h。
6)MBP中和过的抗血清加入酶标板反应1-2小时。
7)加底物反应5分钟，加终止液。
8)酶标仪测定OD490。
(2)合成MUC1的氨基酸序列，直接用ELISA测定抗MUC1抗体.
5.小鼠CTL细胞毒活性测定(1)将免疫后的小鼠杀死后无菌取脾。
(2)制备脾细胞悬液。
(3)调制靶细胞MCF-7和Lewis肺癌细胞浓度。
(4)按照200∶1、100∶1、50∶1和25∶1的效靶比例加入96孔板中，200μl/well，轻轻震荡混匀，37℃，5％CO2孵箱培养4-10小时。
(5)加入MTT 5-20μl/well，继续培养4小时。
(6)加100-200μl/well DMSO溶解甲臜。
(7)用酶标仪测定OD490。
6.免疫鼠成瘤实验按上述免疫程序两次免疫后的第2-10天，用3-7 Grey射线照射小鼠，然后给予MCF7乳腺癌细胞背部皮下注射，注射细胞数为1-5×107/只。在清洁的环境下饲养，三周后测定肿瘤的大小。
权利要求
1.重组人MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗，其核苷酸序列长度为1710个碱基，类型为核酸，链性为单链，1.atgaaaaaat tattattcgc aattccttta gtggtacctt tctattctca ctcggccgat61 atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt121 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat181 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt241 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc301 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac361 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa421 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaa gagatcc cggcgctgga taaagaactg481 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg541 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa601 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt661 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa721 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa781 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttc aagggtc aaccatccaa accgttcgtt841 ggcgtgctga gcgcaggtat taa cgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc901 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg961 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc1021 actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc1081 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa1141 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac1201 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatccc ccgggctgca ggaattcccc1261.gcccccccag cccacggagt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1321.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1381.gccccccaag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1441.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1501.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1561.gcccccccac tccacggtgt cacctcggcc ccggagaaca ggccggcccc gggctccacc1621.gcgcccgcag cccacggtgt cacctcggcc ccggagagca ggccggaatt cgatatcaag1681.cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tga
2.重组人MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗的生产工艺，包括以下步骤1)将该MUC1基因450个碱基按照正确阅读框插入pMAL-p2原核表达载体malE基因下游，使MUC1与MBP基因连接到一起，通过酶切鉴定该重组载体pMAL-MUC1的正确性；2)表达MUC1-MBP融合蛋白的重组质粒pMAL-MUC1转化大肠杆菌DH5a，在IPTG的诱导下，表达了分子量62KD的融合蛋白MBP-MUC1，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定其正确性，并得到稳定的表达菌株pMAL-MUC1/DH5a；3)常规基因测序测定MUC1-MBP融合蛋白的基因序列；4)大量培养pMAL-MUC1/DH5a，经过超声破碎提取全菌体上清液，通过凝胶过滤层析→淀粉糖亲和层析→超滤获得了较纯的MUC1-MBP融合蛋白和MBP蛋白。
3.重组人MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗用于预防和治疗各种腺癌及其转移癌。
4.重组人MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗用于肿瘤手术后残留病灶的治疗。
5.重组人MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗用于BCG作为佐剂增强MUC1-MBP诱导的免疫。
6.重组人MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗用于与IL-2或GM-CSF配伍使用。
7.重组人MUC1-MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗用于与化疗药物配伍使用。
全文摘要
发明公开了一种重组人MUC1－MBP融合蛋白抗肿瘤疫苗及生产工艺，是将MBP基因与MUC1基因融合在一起，研制一种基因工程融合蛋白疫苗。用MBP代替其他的融合蛋白诱导CTL反应。pMAL－p2是高效表达麦芽糖融合蛋白的原核表达载体，将MUC1基因的串联重复序列插入malE基因的下游，一方面能在大肠杆菌中直接高效诱导表达与MBP融合的蛋白，另一方面省却了化学合成融合蛋白的步骤。发明适用于预防和治疗各种腺癌及其转移癌；肿瘤手术后残留病灶的治疗；BCG作为佐剂增强MUC1－MBP诱导的免疫；与IL－2或GM－CSF配伍使用；与化疗药物配伍使用等医疗用途。
文档编号A61K39/00GK1513556SQ0311104
公开日2004年7月21日 申请日期2003年2月19日 优先权日2003年2月19日
发明者台桂香 申请人:台桂香