专利名称：一种基于人muc1重复序列与gm-csf融合表达的重组卡介苗疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及抗肿瘤疫苗的制备，特别涉及一种基于 人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗，及其制备方法和用 途。
背景技术：
1、 MUC1分子与MUC1肿瘤疫苗的相关研究 U MUC1的分子生物学
Mucinl黏蛋白(MUC1)，又称多形性上皮黏蛋白(polymorphic epithelial mucin, PEM) 、 DF3等。MUC1是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白，正常情况 下主要表达于多种组织、器官中的上皮细胞腺腔面，呈顶端表达，极性分布；在 癌细胞表面MUC1异常表达，呈非极性分布。
MUC1基因位于1号染色体长臂21带处，由7个外显子组成4 7 kb不等的 长度。MUC1基因的一个重要特征是其多态性(polymorphism)，其第2个外显子 中含有许多连续重复序列(variable number of tandem repeats, VNTRs)，重复序列 的数目决定MUC1基因的长度，VNTRs区同时也是MUC1分子的抗原表位表 达的转录区。
MUC1由肽核心蛋白和糖链组成，其骨架胞外段含有20 125个连续重 列(variable numbers of tandem repeats, VNTR),每个VNTR由20个氨基酸组成， 其氨基酸序列为GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH,是核心蛋白的主要成分，是 MUC1最具免疫原性的结构。在分泌组织的正常细胞中，VNTR富含O-糖基化 位点(丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，高度糖基化)，而在肿瘤细胞中糖基化较少。 一般认为，糖基化是抗体结合肽骨架的障碍，减少或消灭糖基化被认为是对肿瘤 MUC1产生有效免疫反应的必要条件。MUC1第2个外显子的抗原肽链表位在正常表达时，MUC1核心蛋白被外周 糖链所掩盖，不能被识别；而在癌变细胞由于糖基转移酶活性增高而导致糖基化 不完全，使MUC1多肽骨架上的抗原决定簇暴露出来，成为CTL细胞识别的靶 点，也成为肿瘤免疫治疗的耙点。所以，以MUC1为靶抗原的免疫治疗特异性杀 伤表达MUC1肽表位的肿瘤细胞，而对正常组织无损伤，是肿瘤主动性免疫治疗 的耙抗原；在不同的肿瘤中，MUC1表现出不同的基因表型和蛋白表型，尤其是 对乳腺癌的免疫治疗，MUC1是理想的耙抗原。
1.2MUC1诱导抗肿瘤免疫的生物学功能
1989年，Finn首先从乳腺癌和卵巢癌患者体内分离到了能以HLA非限制性 方式杀伤表达MUC1细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，他们还发现CTL识 别的表位位于VNTR内。其可能的机制是MUC1通过VNTR使TCR发生交联， 从而以MHCI类非限制性的方式直接活化CTL。
同时，MUC1也可以通过MHC限制性的方式诱导产生免疫应答。1995年， Apostolopoulos用人的MUC1免疫小鼠后诱导出了 MHC I类限制性的抗MUCl 的免疫应答，HLA限帝胜的CTL也从HLA-A2转基因小鼠中分离得到。同年， Domenech发现人的CTL细胞能识别由HLA-A 11呈递的MUCl多肽表位。1996 年，Agmwal用MUCl的串连重复多肽剌激T辅助细胞，并诱导了T辅助细胞的 增殖。此外，肿瘤细胞表面固C1多肽表位暴露，还能刺激机体产生针对多肽表 位的抗体。
1.3 MUCl肿瘤疫苗石开究现状
由于MUCl独特的分子生物学特点和生物学功能，以MUCl为耙点的肿瘤 疫苗方面的研究近年来成为肿瘤生物治疗领域研究的热点之一。 1.3 .1糖链疫苗
由于癌变时MUC1糖链结构发生变化，主要表现为糖基化不全，导致新的糖 链表位产生，因此利用人工合成的相应Hf连表位及适当的载体交联，加以佐剂， 可诱发针对相应表位的免疫应答。试验表明，合成Tn表位与KLH交联，以Detox为佐剂免疫小鼠，可抑制肿瘤的生长并延长其寿命，目前该疫苗己进入I期临床
试验阶段(MaeleanGetal， Jlmmunotber,1996， 19: 309)。另一个合成的STn 糖链疫苗也与KLH交联，以Detox为佐剂，免疫前静脉注入或口服小剂量环磷 酰胺，可促进患者体内产生高效价的抗体，目前该疫苗已进入II期临床试验阶段 (Miles DWetal, Br J Cancer. 1996 Oct;74(8): 1292-6.)。 1.3 .2基因疫苗
基因疫苗即携带目的基因的表达载体可诱发特异性细胞及体液免疫应答，进而杀 灭肿瘤细胞。Johnen等用携带MUCl基因的质粒在C57BL6小鼠内注射2次进行免 疫，第15天后把表达人MUC1的MC38癌细胞株植入小鼠，发现85%的鼠肿瘤生 长受到抑制，观察到明显的MUC1特异性体液免疫和细胞免疫应答，而对照组肿 瘤生长明显。3个月后^EMC38癌细胞株再次植入免疫过的小鼠，没有发现有肿瘤 生长，显示了长期的抗肿瘤作用。(JohnenH，etal， Cancer Immunol Immunother. 2001 Sep;50(7):356-60.)Kontani等报道，在小鼠模型中同一位置注射MUC1的DNA 疫苗和树突细胞，可明显提i^MUCl特异性的抗肿瘤免疫(Kontani K， et al ， Cancer GeneTher， 2002， 9(4): 330)。袁时芳等开展的针对MUC1的DNA疫苗研究也 取得了进展，发现接种MUC1基因疫苗可诱导机体产^MUC1特异的CTL应答和 抗体应答， 一定程度上抑制了乳腺癌移植瘤的生长(袁时芳，等.细胞与分子免 疫学杂志,2004,20(6): 737-740.)。 1.3 .3多肽或蛋白疫苗
MUC1的多肽骨架中含有许多连续重复序列，可非MHC限制性或MHC限 制性活化CTL，特异地杀伤肿瘤细胞。因此，可设计含有一定数量连续重复序列 的肽作为疫苗，诱导针对肿瘤细胞的特异性细胞免疫应答。Fontenot的研究表明， 合成MUC1的正确折叠与连续重复序列的数量有关，含有3个连续重复序列的肽 较只含有1个或2个的肽更易正确折叠，而肽的正确折叠对于抗原表位的形成具 有重要意义。(Kim SK, et al ， Vaccine. 2000 Oct 15;19(4-5):530-7) Kim等通过合成不同长度的MUC1串连重复序列，将30个氨基酸重复序列与KLH连接，免 疫鼠诱导出高效价的MUC1抗体，明显抑制了肿瘤的生长，该疫苗在2000年已 进人I期临床研究。Mechenzie等研制的Mannan-MUCl也进入了临床阶段，其 抗月中瘤效果比MUC1-KLH更为明显。美国Biomira公司正在研制基于MUCl的 多肽疫苗，已进入非小细鹏市癌的II期临床试验(Morse MA. Curr OpinMol Ther， 2001. 3: 102)。 1.3.4细胞疫苗
把肿瘤中的MUC1基因转入抗原提呈细胞(APC)，使APC表达黏蛋白分子， 因为APC表面有丰富的共刺激分子如B7.1 、 B7.2，这样APC在直接和T细胞作 用时就加入了活化T细胞所必需的共刺激分子。Jerome等从黑猩猩中得到EB病 毒永生化的B淋巴细胞系，在体外增殖后用MUC1 cDNA转染，并用糖基化抑制 剂(Phenyl-Gal-NAc)处理，给黑猩猩皮下注射。结果表明，在外周血和引流淋巴 结中发现有MUC1特异性CTL，并观察到MUC1特异性DTH。他们用MUC1 cDNA转染乳腺癌、胰腺癌病人自体或异体EB病毒永生化B细胞，并加入糖基 化抑制剂进行处理，转染后的B细胞在体外刺激患者引流淋巴结或外周血中的淋 巴细胞，发现了 MUC1特异性CTL。 Gong等将MUC1 RNA转染树突状细胞 (DC)，这种DC既表达MUC1抗原，又是强大的抗原呈递细胞。用转染后的DC 给小鼠尾部进行注射时发现，接种后的野生荷瘤鼠可产生对]^11(:1+肿瘤细胞的 抗肿瘤免疫，CTL活性增强，保护野生荷瘤鼠不受MUCl+肿瘤细胞的侵袭，且 可清除MUC1+肿瘤细胞。Kontani等研究了针对MUC1肿瘤抗原的DC疫苗免 疫的临床效果将装载MUC1抗原的DC接种到14个乳腺癌和肺癌晚期病人(9 个MUC1阳性，5个MUC1阴銜后，所有MUC1阳性的病人均获得了抗原特异 性免疫。结果表明获得免疫的病人肿瘤大小、肿瘤标记物水平都有显著的减小或 降低。9例MUC1阳性病人中有6例恶性胸腔积液消失，且MUC1阳性病人与 MUC1阴性病人相比生存期有显著延长。
虽然多种疫苗在动物实验中取得了较好的结果，但仍面临着疫苗免疫原性弱、难以诱导细胞免疫等缺点。糖链疫苗需要化学合成制备，工艺复杂，不利于
工业化生产；基因疫苗虽然制备简便，节省了纯化蛋白的步骤，且在体内可以诱 导体液和细胞免疫，但对于载体的安全性以及进入人体的有效途径还有待探沐 DC疫苗尽管可以诱导T细胞反应，但对于DC的来源及应用对象有一定的局限 性。因此，在多种以MUC1为耙点的肿瘤疫苗中，就其稳定性、安全性、有效性 和可行性而言，均有待提高。
2、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为肿瘤疫苗免疫佐剂的研究现状 肿瘤疫苗通过激活患者自身免疫系统以清除或控制肿瘤，是治疗肿瘤的理想方
法。然而肿瘤疫苗研制中存在的一个重要问题是大多数肿瘤抗原的免疫原性弱， 不能有效地激活细胞毒性T淋细胞(cytotoxicT lymphocyte, CTL)，为了提高其免 疫原性，常需加入佐剂。Drano馆次将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colonystimulating factor, GM-CSF)作为黑色素瘤疫苗免疫佐剂，发现 相对于其他细胞因子，GM-CSF可以更持久、更有效地增强肿瘤疫苗的免疫效果 (DranofG, Oncogene. 2003 . 22(20): 3188—3192.)。
2.1 GM-CSF的免疫作用
GM-CSF是一种主要由巨噬细胞和活化T细胞产生的细胞因子，其可通过促 进树突状细胞(dendritic cell, DC)、巨噬细胞等抗原呈递细胞(antigen presenting cdl， APQ分化、成熟和活化进而促进Th、 Tc、 NK细胞识别肿瘤相关抗原，引 起系统性抗肿瘤反应，杀伤肿瘤；还可促进CD45RO+ T细胞分化成熟及 Langerhans细胞协同刺激因子及黏附分子B7/BBl的表达，提高其抗原呈递能 力；另外还可增加巨噬细胞主要组织相容性复合物-II(MHC-n)的表达，提高其 抗原呈递能力。
2.2 GM-CSF作为肿瘤疫苗的免疫佐剂作用
应用GM-CSF能够有效地增强肿瘤疫苗所诱导的抗肿瘤免疫反应。Moret Tatay等将转染GM-CSF的B16恶性黑色素瘤细胞经150 Gy照射灭活制备成GM-CSF高表达及低表达月中瘤细胞疫苗免疫荷瘤小鼠，观察小鼠生存时间，90 d 后发现，高表达1组80%小鼠未见肿瘤生长，高表达2组无一只小鼠见肿瘤生长， 低表达1组及低表达2组则全部死亡。进一步的研究证实GM-CSF作为肿瘤细 胞疫苗免疫佐剂效果确切持久，并且呈剂量反应相关关系(Motet Tatay, et al， Cancer Gene Ther， 2003， 10(12): 887—897. ) 。 Ellem首次将GM-CSF基因转 染自糊中瘤细胞疫苗应用于临床，治疗1例恶性黑色素瘤伴全身广泛转移患者并 取得了一定的效果。目前已有多项GM-CSF修饰自体肿瘤细胞疫苗(GVAX)进入 临床I 、 II期试验。Atzpodien等在分析合成多肽疫苗联合GM-CSF治疗IIA— IIIC期恶性黑色素瘤术后患者的研究中指出，GM-CSF可能通过增强DC的抗原 呈递能力而增强了多肽疫苗的治疗有效性。Ross等构建表达前列腺特异性抗原 (PSA)的DNA疫苗(pVax-PSA)，协同pcDNA3-GM-CSF通过肌肉注射导入C57BL / 6小鼠体内，然后以EL4-PSA细胞攻击免疫小鼠，观察免疫小鼠肿瘤体积增长 情况。结果显示，GM-CSF可以作为疫苗的有效佐剂提高其细胞免疫及抗肿瘤免 疫反应(Roos AK， etal， Prostate, 2005， 62(3): 217—-223.)。袁时芳等的研 究也表明GM-CSF有效的增强了 MUC1基因疫苗诱导机体产生MUC1特异的 CTL应答和抗体应答，增强了对乳腺癌生长的抑制作用(袁时芳，等.细胞与分 子免疫学杂志,2004， 20(6): 737-740.)。
随着分子生物学及免疫学的不断发展，研制肿瘤疫苗通过激活患者自身免疫 系统以清除或控制肿瘤将是治疗恶性肿瘤最有前景的手段之一。GM-CSF以其显 著的免疫调节作用和低毒性成为肿瘤疫苗重要的免疫佐剂。目前，已有多项将 GM-CSF作为肿瘤疫苗免疫佐剂的研究进入临床I 、 II期试验。
3、 BCG作为一种疫苗载体的研究现状
卡介苗(BCG)是一种活的预防性疫苗，是目前唯一用于结核病预防的疫苗， 具有诸多优点，如BCG是用于实验动物和人的最强免疫佐剂。随着研究的深入， 人们发现BCG不仅是一种活疫苗，而且也是外源基因的表达载体。重组BCG (rBCG)将BCG作为工程菌，禾鹏基因工程技术将几种外源基因导入同一 BCG中，依靠BCG在宿主内的复制，表达多种外源抗原，以诱导对多种疾病的特异 性体液和细胞免疫，但不影响该疫苗株的生存与繁殖。rBCG集佐剂和载体于一 身、兼多种外源基因与活疫苗于一体，是一种活载体疫苗， 一次接种可获得强而 持久的多种特异性免疫；作为重组细菌活载体的rBCG比重组腺病毒活载体更容 易开发。目前，已能在BCG中表达多种外源基因，如HIV-lnef基因、HIV-lgag 基因、HlV-lgpl20基因、破伤风毒素C片段等基因。对啮齿类动物的实验研究 表明，适宜的rBCG能特异地活化细胞免疫系统，包括DTH、 T细胞增生应答、 Thl型细胞因子的产生，以及MHC- I类限制的CTL应答等。现有的iBCG疫苗 多包含信号肽序列，可使rBCG载体大量分泌重组蛋白，诱导Thl优势的抗原特 异性免疫应答，以增强其免疫原性。
目前，rBCG载体多用于抗结核病的研究。Horwitz等将编码结核分支杆菌 (Mycobacteria tuberculosis, MTB)的Ag85B基因导入穿梭载体pSMT3，构建重组 质粒pMTB30，电穿孔转化BCG，构建rBCG-Ag85B疫苗。将lxl(^CFU疫苗皮 下注射免疫豚鼠3次，末次免疫6周后，用lxl05 CFUMTB Erdman株雾化吸入 进行攻击，攻击后10周发现疫苗免疫和MTB攻击鼠的体重轻微降低，鼠肺和脾 细菌数目显著减少，鼠肺和肝组织的结核病灶较小较少，肺部只有轻微的组织病 理学变化，提示rBCG-Ag85B疫苗可诱导豚鼠产生抗MTB的保护性免疫反应。 Ohara等将编码MTB的Ag85A、 Ag85B和MPB51基因组成复合基因BAS1 ，导 入穿梭表达载体pMSCl，构建重组质粒pMSC-BASl，电穿孔转化BCG，构建 rBCG-BA51疫苗，发现其分泌抗原水平较普通BCG提高5倍以上。袁时芳等将 热休克蛋白65(Heat shock protein 65， Hsp65) and hlL-2融合基因导入穿梭载体 pDE22，构建重组质粒，电穿孑L转化BCG，构建rBCG-Hsp65-hlL-2疫苗。免疫 结果显示有良好的抗结核病能力，可诱导小鼠产生抗MTB的保护性免疫反应。 (Shi C, Yuan S， et al ， Scand J Immunol. 2009 Feb; 69(2): 140-9.)
Chung等将BCG作为外源基因的表达载体用于抗肿瘤的研究,用全长MUC1 和人白介素2(IL-2)重组的BCG疫苗免疫hu-PBL-SCID鼠，每2周接种一次，共3次，发现其可抑制乳腺癌的生长，但其诱发的免疫反应和保护力尚存在不足， 可能与MUC1全长序列影响其免疫效果等因素有关。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种人MUC1重复序列与GM-CS F融合表达的 表达载体，提高MUC1的免疫原性，克服上述的缺陷；
并将上述载体转染卡介苗，制备重组卡介苗疫苗，进一步实现抗原、佐剂和 疫苗载体的有效结合，使得MUC1肿瘤疫苗的免疫原性达到更有效、更持久的效 果，同时安全无毒副作用，提供一种新的抗肿瘤疫苗。
本发明是通过以下技术方案来实现的
一种包含人MUC1重复序列的融合基因，人MUC1重复序列串联体通过 连接DNA (DNA linker)与GM-CSF基因连接。
所述的人MUC1重复序列串联体为至少包含两个重复序列的串联体。
所述的人MUC1重复序列串联体为人MUCl重复序列4串联体或者人 MUCl重复序列8串联体。
所述的人MUCl重复序列串联体还依次连接有信号肽序列和Kozak序列； 连接有信号肽序列和Kozak序列的人MUCl重复序列4串联体的核苷酸序列如 SEQ.ID.N0.2所示；连接有信号肽序列和Kozak序列的人MUCl重复序列8串 联体的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示。
更进一步，本发明提供一种抗肿瘤疫苗
所述的抗肿瘤疫苗为细胞疫苗，宿主细胞为卡介苗疫苗，转染卡介苗疫苗的 载体片段包含人MUCl重复序列串联体和GM-CSF融合基因片段。
所述的抗肿瘤疫苗转染卡介苗疫苗的载体片段还包含信号肽序列和Kozak 序列。
所述转染卡介苗疫苗的载体片段为pDE22-MUClVNTRs-GM-CSF载体，在 大肠-分枝杆菌穿梭载体上克隆包含信号肽序列和Kozak序列的人MUCl重复 序列串联体和GM-CSF融合基因片段。本发明更进一步证实了以下应用
所述的抗肿瘤疫苗应用于以MUC1阳性表达的肿瘤细胞为靶点的治疗性抗 肿瘤疫苗或者御防性抗肿瘤疫苗的制备。
所述的抗肿瘤疫苗应用于抗乳腺癌的治疗性疫苗或御防性疫苗的制备。 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果-
1、 本发明构建了含Kozak序列和信号肽的人MUCl重复序列串联体基因，Kozak 序列可以提高VNTR翻译的精确性和产率，信号肽序列可以保持对MVNTKs-CSF 融合蛋白的分泌功能。所述的重复序列串联体为多串体，以提高MUC1的抗原性， 为诱导特异性T细胞免疫应答提供分子基础。
2、 本发明构建了包含人MUC1重复序列多串联体和GM-CSF，能够表达MUC1 重复序列和GM-CSF的融合蛋白，以GM-CSF因子作为佐剂，以及通过GM-CSF因 子的免疫调节作用提高MUC1蛋白的免疫原性。
3、 本发明构建了包含人MUC1重复序列多串联体和GM-CSF融合基因的重组 BCG疫苗，通过潮霉素抗性筛选和PCR鉴定，筛选分泌表达MVNTRs和GM-CSF 因子的融合蛋白，进一步实现抗原、佐剂和疫苗载体的有效结合，使得MUC1肿瘤 疫苗的免疫原性达到更有效、更持久的效果；而BCG疫苗作为抗原、佐剂的疫苗载 体安全无毒副作用，是一种针对MUC1为肿瘤耙点的抗肿瘤疫苗。
4、 本发明构建的重组BCG疫苗，在对月中瘤的免疫治疗作用和对乳腺癌的免疫 预防作用都起到了显著的效果，明显降低了植入肿瘤细胞的肿瘤生成率、明显抑制肿 瘤的生长、明显提高了存活率；特别是对乳腺癌的免疫治疗和预防。
5、 通过肿瘤组织切片免疫组化染色显示，在瘤体组织中观察到CD4+和CD8+T 淋巴细胞浸润，表明重组BCG疫苗诱导了 CD4+和CD8+T淋巴细胞的特异性增殖， 并且激活的CD4+和CD8+T淋巴细胞识别了阳性表达MUC1的肿瘤组织、并产生细 胞免疫应答，诱导了 CTL的抗肿瘤效应，杀伤MUC1阳性表达的肿瘤细胞，比如乳 腺癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等。
6、 通过脾脏切片免疫组化染色显示重组BCG菌株在体内分泌表达人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白的持久性，从而诱导了更持久、更有效的抗肿瘤效应。
图1是人MUC1 二串体重复序列的构建示意图2是pDE22-MUClVNTRs-GM-CSF载体Pstl/Clal双酶切鉴定结果图； 图3是pDE22-MVNTRs-GM-CSF载体的质粒图谱；
图4是包含人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白的重组BCG菌株的 SDS-PAGE蛋白电泳鉴定结果图5是包含人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白的重组BCG菌株的 Westem-blot鉴定结果图，其中，图5a是为抗MUC1抗体的Westem-blot鉴定结 果，图5b为抗GM-CSF抗体的Western-blot鉴定结果；
图6是重组BCG菌株与普通BCG的生长曲线比较，其中，横坐标为生长时 间，纵坐标为光密度(OD)值；
图7是重组BCG疫苗对成瘤小鼠的肿瘤体积生长的抑制作用曲线图，其中， 横坐标为肿瘤细胞接种后时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm3》
图8是预防接种重组BCG疫苗对成瘤小鼠的肿瘤体积生长的抑制作用曲线 图，其中，横坐标为肿瘤细胞接种后时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm3》
图9是肿瘤组织切片免疫组化染色检测重组BCG疫苗诱导的特异性T细胞 免疫应答结果的观察图10是脾脏切片免疫组化染色检测重组BCG分泌的MUC1、 GM-CSF及 BCG蛋白在脾脏的表达结果的观察图。
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，所述，本发明 的解释而不是限定。
本发明利用基因重组技术，通过克隆人MUC1串联体连续重复序列，并将其 与GM-CSF基因融合，得到新的表达载体MUClVNTRs-GM-CSF，该载体表达 融合蛋白MVNTRs-GM-CSF,以提高MUC1的免疫原性;本发明所述的人MUC1串联体连续重，列为多串联体连续重复序列，具体以1串体、4串体和8串联 为例进行说明，分别表示为MUC1VNTR1-GM-CSF、 MUC1VNTR4-GM-CSF、 MUC1VNTR8-GM-CSF，为了便于描述以上3种串体描述为MUC1VNTR1/4/8 -GM-CSF;
将上述融合基因转染BCG，筛选表达外源基因MUClVNTRs-GM-CSF得到 表达的重组BCG菌株；该重组BCG疫苗一方面可达到增强MUC1的免疫原性 的目的，另一方面可通过分泌型rBCG活载体疫苗的分泌蛋白特性，在体内不断 分泌重组的MVNTRs-GM-CSF融合蛋白，实现抗原、佐剂和疫苗载体的最佳结 合，从而解决以往的MUC1疫苗的免疫应答弱、保护期短等问题。
本发明筛选出优化的重组rBCG-MUClVNTRs-GM-CSF疫苗，进一步提高其 抗肿瘤活性和安全性，为临床应用奠定基础；持久表达并分泌人MUC1重复序 列与巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的重组BCG疫苗的构建，其对乳腺癌生长 的防治起到积极的作用。
下面对其具体的构建过程进行说明，其中，所用到的质粒及试剂如下
菌株与质粒分支杆菌表达载体pDE22、 BCG疫苗株、pBV-GM-CSF质 粒、人乳腺癌MCF-7细胞及大肠杆菌DH5a菌株，上述菌株与质粒各大实验室 均有保藏，或者可以通过商业购买获得。
主要实验材料
限制性内切酶、DL-2000、 T4DNA连接酶、pUC18载体购自Takara公司； 高纯质粒小量制备试剂盒(离心柱型)、快捷型琼脂糖凝胶核酸回收试剂盒 (离心柱型)均购自北京百泰克生物技术有限公司；
抗人MUC1单克隆抗体为Sigma, St. Louis, MO公司产品； 抗人GM-CSF单克隆抗体为R&D公司产品，USA; 抗人CD4+ T淋巴细胞抗体，抗人CD8+ T淋巴细胞抗体及抗人BCG抗体 PAKOCorp.)，荧光抗体羊抗鼠IgG-FITC购自华美公司； 7H9液体、7H10固体培养基以及ADC购于Difco公司；丙烯酰胺，NW-甲叉双丙烯酰胺，SDS及Agrose等购自Bio-Rad公司； 小牛血清购自Gibco公司；DMEM培养基购自Gibco公司；RPM 1640培 养液为Gibco, USA公司产品。
实验动物SCK)鼠，4-6周龄，购于中科院上海实验动物中心。 1、 MUC1重复序列串联体基因的克隆
按人MUC1基因重复序列设计、合成编码人MUC1基因的一个重，列和 Kozak序列、信号肽及相应酶切位点的基因片段，并通过HindIII和EcoRI位点 克隆入pUC18载体并鉴定(由北京奥科生物技术有限责任公司合成并鉴定)。
所述的编码MUC1的一个重复序列的寡核苷酸片段的设计如SEQ.ID.NO.l
所示
ctgcagacca tgttcttcct gctgctgctc ctcacagtgc ttacagttgt tggatccggc 60 tccaccgccc ccccagccca cggtgtcacc tcggccccgg acaccaggcc ggccccgaga 120
tcttgaatcg at 132 其中，5'端l-6bp为Pstl酶切位点，52-57bp为BamHI酶切位点，118-123bp
为BgUI酶切位点，3端127-132bp为Clal酶切位点，上述多克隆位点均为连接
DNA (DNA linker)。
所述的Kozak序列为acc (7-9 bp);
所述的信号肽序列为ttcttcct gctgctgctc ctcacagtgc ttacagttgt t (13-41bp);
MUC1基因的一个重复序列为ggc tccaccgccc ccccagccca cggtgtcacc tcggccccgg acaccaggcc ggccccg (58-117 bp);其两端分另!j的多克隆位点为 BamHI酶切位点和BglII酶切位点，而两者的序列互补，彼此的黏性末端可以互补 连接。
Kozak序列可以提高VNTR翻译的精确性和产率；信号肽序列可以引导 VNTR在翻译的同时直接进入内质网，加强抗原的MHC I类递呈，并可以保持对MUC1VNTR-GM-CSF融合蛋白的分泌功能。
对含一个重复序列的质粒载体进行扩增提取， 一份用ScaI和BglII双切，回 收包含信号肽序列和Kozak序列的MUC1单体小片段；另一份用Seal和BamHI 双切，信号肽序列和Kozak序列和一部分载体片段被切除，回收包含pUC18载 体序列和MUC1单体的大片段；回收的大、小片段通过T4DNA连接酶连接，得 到包含MUClVNTR二串体的pUC-MUClVNTR2质粒载体；其中，所涉的3个 酶切位点，Seal为pUC质粒的酶切位点，BamHI和BglII酶切位点位于 MUC1VNTR单体之间，两者的序列互补，彼此的黏性末端可以互补连接，即两 个MUClVNTR单体通过agatcc的DNAlinker连接(互补的BamHI和BglII酶 切位点)连接，其构建示意图如图1所示；
按照同样的方法，将包含二个重复序列的(二串体)pUC-MVNTR2质粒载 体进行扩增提取， 一份用ScaI和BglII双切，另一份用Seal和BamHI双切，分 别回收大、小片段，通过T4DNA连接酶连接，得到包含MUC1VNTR4串体的 pUC-MUClVNTR4质粒载体，在其5'端连接有信号肽序列和Kozak序列，相邻 的MUC1重，列均通过aga tcc的DNA linker连接；
按照同样的方法，再将包含四串体的pUC-MVNTR4质粒载体进行扩增提 取，酶切提取片段后连接，得到包含MUClWni8串体的pUC-MUClVNTR8 质粒载体。
并将上述包含多个重复序列的多串体载体进行Pstl和Clal双酶切及序列分 析证实上述质粒载体均构建成功。经过序列分析证实的包含信号肽序列和Kozak 序列的MUC1VNTR 4串体、8串体的核苷酸序列分别如SEQ.ID.N0.2和 SEQ.ID.NO.3所示。
2、 GM-CSF基因的克隆
设计含连接DNA (DNAlinker)的扩增人的GM-CSF基因的引物P1和P2: Pl: attagatctg gatccggtgg ttcagcacct gcccgttctc cgag44 ; P2: tcatcgattc actcctggac tggctcccag 30 ;其中，5'端4-9bp为Pl引物BglII酶切位点，5端3-8bp为P2引物Clal酶切位点。
PCR扩增以P1、 P2引物，以pBV-GM-CSF为模板，常规PCR，回收产 物克隆入pMD18-T中，转化，挑取克隆进行酶切鉴定及序列分析，所得扩增人 的GM-CSF序列如GenBank中人的GM-CSF基因的序列一致。
3、 融合基因MUClVNTRs-GM-CSF的构建
取测序正确的重组pMD18T-GM-CSF载体经BglII/Clal双酶切，回收400bp 大小的GM-CSF基因片段；
回收同样经BglI17Clal双酶切的pUC-MUClVNTRl、 pUC-MUClVNTR4、 pUC-MUClVNTR8质粒载体所得的包含MUClVNTRs的载体片段，丁4DNA连 接酶连接，构建MUClVNTRs-GM-CSF融合基因，所得载体分别为pUC-MUC1VNTR1國GM國CSF、 pUC-MUClVNTR4-GM國CSF、 pUC-MUClVNTR8-GM-CSF，并经酶切鉴定及序列测定证实。
4、 pDE22-MUClVNTRs-GM-CSF的构建
取大肠-分枝杆菌穿梭载体pDE22用Pstl/Clal双酶切，琼脂糖电泳后回收载 体片段；
对pUC- MUC1VNTR1陽GM-CSF、 pUC國MUC1VNTR4國GM國CSF 、 pUC-MUC1VNTR8-GM-CSF (pUC-MUClVNTRl/4/8-GM-CSF)质粒载体分别同样 Pstl/Clal双酶切，分别回收目的片段MUC1VNTR1-GM-CSF、 MUC1VNTR4-GM -CSF、 MUC1VNTR8-GM-CSF;
将上述两种片段分别在T4DNA连接酶的作用下构建重组表达载体 pDE22-而ClVNTRl-GM-CSF 、 pDE22-固ClVNTR4-GM-CSF和pDE22-MUC1VNTR8-GM-CSF，并对重组表达载体进行酶切鉴定及序列分析证实。其 酶切鉴定结果如图2所示，其中，泳道M为Mark,泳道1为 pDE22-MUClVNTRl-GM-CSF的酶切鉴定，其所示的535bp的条带为 MUC1VNTR1-GM-CSF条带；泳道2为pDE22-MUClVNTR4-GM-CSF的酶切鉴定，其所示的733bp的条带为MUC1VNTR4-GM-CSF条带；泳道3为 pDE22-MUClVNTR8-GM-CSF的酶切鉴定，其所示的997bp的条带为 MUC1VNTR8-GM-CSF条带。
所得到的pDE22-MUClVNTRs-GM-CSF的载体为，包含人MUC1重复序 列与GM-CSF融合蛋白的大肠-分枝杆菌穿梭载体，其质粒构建图谱如图3所 示；含潮霉素抗性基因的穿梭载体pDE22可以介导外源基因 MUClVNTRs-GM-CSF在分枝杆菌中分泌表达。
5、 重组BCG菌株rBCG-MUClVNTRl/4/8-GM-CSF的构建 将BCG在7H9培养基中大量培养4周后，按1%的比例转接；培养至3周
时，加入2M的甘氨酸，继续培养2d后冰浴30min。
用冰浴的10%甘油制备5xl(f个BCG感受态细胞，然后将纯化的pDE22-而C1 VNTR1-GM-CSF、 pDE22-固C1 VNTR4國GM-CSF、 pDE22-固C1 VNTR8 -GM-CSF用电穿 L法转化感受态BCG; 37-C培养24h后涂布于含ADC (葡萄糖 -牛血清白蛋白因子v-过氧化氢酶)和潮霉素的7H10平板中，设空白质粒作为 对照，37。C培养28 30d。利用潮霉素抗性筛选外源基因MUClVNTRs-GM-CSF 得到表达的重组BCG菌株，得到rBCG- MUC1VNTR1/4/8- GM-CSF的克隆菌落。 所述的电穿孔法其具体参数为0.4cm的电穿孑L杯，电压2,5KV，电容25uF， 电阻IOOOQ。
6、 重组BCG菌株rBCG-MUClVNTRl/4/8-GM-CSF的表达、鉴定 从重组载体转染BCG成功的7H10平板中挑出克隆，接种于5ml 7H9培养
基中培养21d后，上述培养的重组BCG菌株，提取质粒，用PCR法进一步鉴定 转染阳性的克隆，弓l物对为上述设计的引物对44bp的Pl和30bp的P2。
挑取鉴定结果正确的阳性克隆加入潮霉素，在7H9培养基中培养，37-C震 荡培养30d， 10000rpm离心3min，收集菌体沉淀，PBS缓冲液洗涤2次得到重 组BCG菌体。
进行如下的SDS-PAGE电泳和Westem-blot验证由于重组BCG表达MVNTRs-GM-CSF融合蛋白是分泌型的，取部分重组 BCG菌株的培养上清进行经12XSDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜。以含 5X脱脂奶粉的TBST (Tris-Tween盐缓冲液)4'C封闭过夜，TBST洗膜，分别加 入抗人MUC1单抗(h 500稀释)和抗人GM-CSF单抗(1: 500稀释)作用1 h， TBST洗膜；HRP标记的山羊抗小鼠抗体(二抗)(1: 500稀释)(Sigma) 室温孵育lh， TBST洗膜后，加入ECL化学发光试剂(Amersham公司)，曝光， 冲片。
SDS-PAGE电泳和Westem-blot结果证实重组BCG菌株有MVNTRs -GM-CSF融合蛋白的表达，其结果分别如图4、图5所示
如图4所示的SDS-PAGE电泳结果图，其中，泳道M为蛋白Mark;泳道1 为rBCG-pDE22 ;泳道2为rBCG-MUClVNTRl-GM-CSF ，其所示的19kDa 的条带为MVNTR1-GM-CSF融合蛋白；3为rBCG-MUClVNTR4-GM-CSF ， 其所示的26kDa的条带为MVNTR4-CSF融合蛋白；泳道4为 rBCG-MUClVNTR8-GM-CSF ，其所示的35kDa的条带为MVNTR8-CSF融合 蛋白。SDS-PAGE 电泳结果说明MUC1 重组BCG菌株 rBCG-MUClVNTRl/4/8-GM-CSF各自有MVNTRs-GM-CSF融合蛋白的表达。
如图5所示的Westem-blot鉴定结果，其中，图5a为抗MUC1抗体的 Westem-blot鉴定结果，所示的泳道1所示的19kDa的条带为MVNTR1-CSF融 合蛋白；泳道2其所示的26kDa的条带为MVNTR4-CSF融合蛋白；3其所示的 35kDa的条带为MVNTR8-CSF融合蛋白。
图5b为抗GM-CSF抗体的Westem-blot鉴定结果，泳道1所示的19kDa的 条带为MVNTR1-CSF融合蛋白；泳道2其所示的26kDa的条带为MVNTR4-CSF 融合蛋白；3其所示的35kDa的条带为MVNTR8-CSF融合蛋白。
Westem-blot结果说明人MUC1重复序列与GM-CSF融合基因的重组BCG 疫苗rBCG-MUClVNTRl/4/8-GM-CSF各自有MVNTRs与GM-CSF融合蛋白的 表达。7、重组BCG菌株rBCG-M UClVNTRs- GM-CSF的生物学特性鉴定 将分泌表达MVNTRs与GM-CSF融合蛋白的rBCG-M UCl VNTR1- GM-CSF、 rBCG-M UCl VNTR4-GM-CSF和rBCG-M UCl VNTR8- GM-CSF的rBCG 和普通BCG接种在含10c/。ADC的7H9培养液中，37"C振荡培养，测定不同时 间点的OD6oo值，绘制生长曲线，观察比较rBCG的增殖特性与普通BCG的差 别。其生长曲线的比较结果如图6所示，重组BCG菌株rBCG-M UCl VNTRs-CSF 与普通BCG的增殖特性无明显差别；说明上述重组BCG菌株rBCG-M UCl VN TRs-CSF与普通BCG的增殖特性无明显差别。
下面对本发明所提供的包含人MUC1重复序列与GM-CSF融合基因的重组 BCG疫苗的作用进行说明，尤其， L腺癌生长的免疫治疗及防治作用
a、 乳腺癌细胞MCF-7的准备
人乳腺癌细胞MCF-7均在含有10%小牛血清(Gibco公司)和100U/ml的 青霉素、链霉素的RPMI1640培养基(Gibco)中培养；取对数生长期的细胞， 用0.25%胰蛋白酶消化、计数，在倒置显微镜下观察，发现纤维状细胞边缘，部 分脱壁，立即加入5ml含有血清的培养液终止消化，吹打离心收集细胞，用无血 清的培养液洗涤2次，将单细胞悬液用不含小牛血清的培养 释至计数，使细 胞的浓度为2xl()7/ml备用。
b、 hu-PBL-SCID鼠免疫重建
l.人外周血淋巴细胞(PBL)分离富含人PBL的白膜层来源于第四军医大 学西京医院血库中心。将富含人PBL的白膜层液加在等量的Ficoll-Paque淋巴细 胞分离液上，室温2500ipm水平离心20min，分离人淋巴细胞(PBL， HLA-A2)。 此时离心管中形成3层上层是血浆，中间层为PBL，下层为红细胞。小心吸 取中间PBL，加入两倍体积Hank's液悬浮PBL，混匀后2000rpmxl0min洗涤两 次，收集沉淀，以10% RPM 1640完全培养液重新悬浮，调整细胞浓度为 5xl07/ml。2. hu-PBL-SCID鼠免疫重建雌性SCID小鼠，4-6周龄，上述人PBL通过 腹腔注射途径接种，5xl0"只，建立hu-PBL-SCID鼠模型。 c、 MUC1重组BCG菌株的免疫治疗
SCID鼠免疫重建后(hu-PBL-SCID)，进行分组，设为5个组，每组8只 鼠。每只鼠均按0.2ml/只的剂量(4xl06AR)胸部皮下接种MCF-7细胞。接 种肿瘤细胞7天后，分别采用腹腔注射方式免疫接种rBCG-pDE22， rBCG-MUClVNTRl-GM-CSF、rBCG國MUC1 VNTR4-GM國CSF和rBCG- MUClVNTR8 GM-CSF疫苗，剂量为1()6CFU/0.1ml/只，同时设PBS对照组O.lml/只；3周 免疫1次，共3次，每周观察小鼠的成瘤率及肿瘤体积的变化，共观察9周； 用1/50mm精度游标卡尺测肿瘤的长径和短径，按下式计算肿瘤体积
肿瘤体积(mm3) -肿瘤长径(mm) x肿瘤短径(mm) 2x0.52
在9周内观察上述5组小鼠的成瘤率，rBCG-MUClVNTR4-GM-CSF和 rBCG-MUClVNTR8-GM-CSF免疫治疗组在MCF-7乳腺癌细胞接种后35天， 肿瘤成瘤率分别为37.5%和25°/。，而BCG-pDE22对照组和PBS对照组的肿 瘤成瘤率均为100%(8/8)，统计学差异显著PO.05;在MCF-7乳腺癌细胞接 种后56-70天，肿瘤成瘤率分别为62.5°/。和37.5%，而BCG-pDE22对照组和 PBS对照组的肿瘤成瘤率均为100% (8/8)，统计学差异显著PO.05;结果表 明rBCG-MVNTR4-GM-CSF和rBCG- MUC1VNTR8-GM-CSF免疫治疗组显 著降低了成瘤率；
从第4周起幵始有肿瘤生成，对成瘤小鼠观察重组BCG疫苗对肿瘤生长 的抑制作用，其结果如图7所示，可以看出rBCG-MUClVNTR4-GM-CSF 组和rBCG-MUClVNTR8-GM-CSF组显著抑制了 MUC1阳性表达的人乳腺 癌细胞生长从接种肿瘤第5周起(免疫后第4周)与其他3组相比，肿瘤 体积的增长显著降低，rBCG- MUC1VNTR4- GM-CSF和rBCG-MUC1VNTR8 -GM-CSF免疫接种显著抑制MCF-7乳腺癌细胞生长，统计学差异显示 P<0.01，且对肿瘤体积的生长抑制作用随着VNTR的增加而增强；例如，在 接种肿瘤细胞后35天，PBS对照组和rBCG-pDE22对照组的肿瘤体积分别 为485.2士63.5和463.1士60.8mm3 ，而rBCG画MUC1VNTR1-GM-CSF， rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF和rBCG-MUClVNTR8-GM-CSF组的肿瘤体积分别 为401.5±41.6，212.6±38.0和165.5士40.3 mm3(P<0.01, rBCG-MVNTR4/8國CSF vs.对照组)；肿瘤细胞接种后70天，PBS对照组和rBCG-pDE22组肿瘤体积 为1556.3±134.5和1523.4士154.3醒3， 而rBCG- MUC1VNTR1陽GM CSF， rBCG-MUClVNTR4-GM-CSF和rBCG-MUClVNTR8-GM-CSF组肿瘤体积 为1235.8±85.7, 723.6±89.0和565.7±68.1 mm3 (P<0.01， rBCG-固C1VNTR 4/8-GM-CSF vs.对照组)。
肿瘤细胞接种70天后，接种rBCG-MUClVNTR4-GM-CSF组和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF组小鼠的生存率分别为62.5°/。和75%，而BCG-pDE22 对照组的生存率为12.5%，统计学差异显示PO.05 (rBCG-MVNTR8-CSFvs. 对照组)，说明重组BCG疫苗显著延长了乳腺癌细胞生长小鼠的生存率。
d、 MUC1重组BCG菌株的免疫预防
对免疫重建的hu-PBL-SCID鼠进行分组免疫，实验组设为5个组，每组 8只，分别采用腹腔注射方式接种rBCG-pDE22， rBCG-MUCIVNTRI-GM-CSF, rBCG-MUClVNTR4-GM-CSF和rBCG-MUClVNTR8-GM-CSF,剂量 为106CFU/0.1ml/只，同时设PBS对照组O.lml/只；3周免疫1次，共3次， 第3次免疫后2周，各只小鼠均按0.2ml/只的剂量(4><106/只)胸部皮下接种 MCF-7细胞。每周观察鼠的成瘤率，并对成瘤小鼠用1/50mm精度游标卡尺 测肿瘤的长径和短径，按上述肿瘤体积计算公式计算肿瘤体积。
rBCG-MVNTR4-CSF和rBCG-MVNTR8-CSF免疫预防组在MCF-7乳 腺癌细胞接种70天后，肿瘤成瘤率分别为50%和37.5%，而BCG-pDE22对 照组和PBS对照组的肿瘤成瘤率均为100% (8/8)，统计学差异显著PO.05;肿瘤的生长曲线如图8所示，接种肿瘤第5周起不同免疫组的小鼠的肿 瘤生长出现明显差别，rBCG-MUClVNTR4-CSF和rBCG-MUCIVNTRS-CSF 预防接种显著抑制 MCF-7 乳腺癌细胞生长， 统计学差异PO.01;且生 长抑制作用也随着VNTR的增加而增强。例如，在接种肿瘤细胞35天后， BCG-pDE22对照组和PBS对照组的肿瘤体积为308.3±94.5 and 289.4±84.9 mm3，而rBCG-MVNTRl-CSF，rBCG-MVNTR4-CSF和rBCG-MVNTR8-CSF 组的肿瘤体积为251.8士52.7，121.3土49.0和75.4±50.8 mm3;
肿瘤细胞接种70天后，rBCG-MVNTR4-CSF和r BCG-MVNTR8-CSF组 小鼠的生存率分别为75%和87.5%，而BCG-pDE22对照组的生存率为12.5%， 统计学差异P<0.05。
e、瘤体组织学分析
1)瘤体组织抗人CD4+ T淋巴细胞抗体和抗人CD8+ T淋巴细胞抗体免 疫组化染色，检测重组BCG疫苗诱导的特异性T细胞免疫应答。
免疫组化染色的方法步骤取上述免疫预防组的接种MCF-7乳腺癌细胞 70天后生存的小鼠，采血后处死，立即取瘤体及脾脏。
所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，5拜连续切片；
切片常规脱蜡，水化后，用内源性过氧化物酶阻断剂和正常马血清分别 室温孵育30分钟以减低非特异性染色；
MUC1单克隆抗体(1 : 100)4'C孵育过夜；
CD4+、 CD8+淋巴细胞抗体(1 : 100)4。C孵育过夜；
生物素标记的羊抗鼠IgG 二抗和抗生物素-过氧化物酶连接物室温分别 孵育30分钟；
DAB显色1 3分钟；
苏木素衬染，脱水、透明、封片、光镜观察；观察瘤体组织间隙中CD4+ 和CD8+T淋巴细胞染色结果，阳性染色说明为产生T细胞免疫应答；实验 中以空白试验和替代试验作为阴性对照，以确保实验的特异和可靠性；肿瘤组织切片免疫组化染色显示结果如图9所示，接种重组BCG疫苗 rBCG-MUClVNTR4-GM-CSF和rBCG-MUClVNTR8-GM-CSF的免疫组瘤体 组织间隙中观察到CD4+和CD8+T淋巴细胞，如图9A、 B所示；而PBS和 rBCG-pDE22对照组肿瘤组织观察不到CD4+和CD8+T淋巴细胞分布，如图 9C、 D所示。
以上对比实验说明rBCG- MUC1VNTR4/8-GM-CSF均诱导的CD4+和 CD8+T淋巴细胞识别了阳性表达MUC1的肿瘤组织、并产生细胞免疫应答， 杀伤MUC1阳性表达的肿瘤细胞。
2)采用MUC1单克隆抗体、GM-CSF单克隆抗体及分枝杆菌抗体作为 一抗，采用上述的免疫组化染色方法，检测GM-CSF及BCG蛋白在脾脏的 表达
脾脏切片免疫组化染色显示结果如图IO所示，其中，图A为BCG-pDE22 组BCG蛋白阳性表达，图B为rBCG-MUClVNTR8-GM-CSF组BCG蛋白 阳性表达，图C为rBCG- MUC1VNTR8-GM-CSF组MUC1蛋白阳性表达， 图D为rBCG-MUClVNTR8-GM-CSF组GM-CSF蛋白阳性表达，E和F为 阴性对照组。
上述结果表明，重组BCG菌株在体内分泌表达人MUC1重复序列与 GM-CSF融合蛋白的持久性。rBCG-MUClVNTR4-CSF和 rBCG-MUCl VNTR8-CSF 免疫组在MCF-7乳腺癌细胞接种70天后，脾组织切片免 疫组化染色显示，rBCG- MUC1VNTR4/8-CSF组和rBCG-pDE22组的脾组织 均可见BCG蛋白阳性表达。重组BCG疫苗rBCG-MUC1VNTR4/8-CSF组免 疫的脾组织可见MUC1和GM-CSF蛋白阳性表达，而rBCG-pDE22对照组脾 组织观察不到MUC1和GM-CSF表达，说明重组BCG菌株rBCG-MUCl VNTR4/8-CSF 在体内持久分泌表达人MUC1重复序列与GM-CSF融 合蛋白至少保持70天，从而诱导了更持久、更有效的抗肿瘤效应。
24核苷酸序列表
<110>中国人民解^c军第四军医大学
<120> —种基于人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗
<160>3
<210> 1
<211>132
<212>DNA
<213>人工合成
<400> 1
ctgcagacca tgttcttcctgctgctgctcctcacagtgcttacagttgttggatccggc60
tccaccgccc ccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgaga120
tcttgaatcg at132
<210>2
<211>330
<212>DNA
<213>人工合成
<400> 2
ctgcagacca tgttcttcctgctgctgctcctcacagtgcttacagttgttggatccggc60
tccaccgccc ccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgaga120
tccggctcca ccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggcc180
ccgagatccg gctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccagg240
ccggccccga gatccggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggac300
accaggccgg ccccgagatcttgaatcgat330
<210>3
<211>594
<212>DNA<213>人工合成 <400>3
ctgcagaccatgttcttcctgctgctgctcctcacagtgcttacagttgttggatccggc60
tccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgaga120
tccggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggcc180
ccgagatccggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccagg240
ccggccccgagatccggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggac300
accaggccggccccgagatccggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggcc360
ccggacaccaggccggccccgagatccggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacc420
tcggccccggacaccaggccggccccgagatccggctccaccgcccccccagcccacggt480
gtcacctcggccccggacaccaggccggccccgagatccggctccaccgcccccccagcc540
cacggtgtca cctcggcccc ggacaccagg ccggccccga gatcttgaat cgat 59权利要求
1、一种包含人MUC1重复序列的融合基因，其特征在于，人MUC1重复序列串联体通过连接DNA与GM-CSF基因连接。
2、 如权利要求1所述的包含人MUC1重复序列的S虫合基因，其特征在于， 所述的人MUC1重复序列串联体为至少包含两个重复序列的串联体。
3、 如权利要求2所述的包含人MUC1重复序列的融合基因，其特征在于， 所述的人MUC1重复序列串联体为人MUC1重，列4串联体或者人MUC1 重复序列8串联体。
4、 如权利要求1或2或3所述的包含人MUC1重复序列的融合基因，其特 征在于，人MUC1重复序列串联体还依次连接有信号肽序列和Kozak序列。
5、 如权利要求3所述的包含人MUC1重复序列的融合基因，其特征在于， 连接有信号肽序列和Kozak序列的人MUC1重复序列4串联体的核苷酸序列如 SEQ.ED.N0.2所示；连接有信号肽序列和Kozak序列的人MUC1重复序列8串联体的核苷酸序 列如SEQ.ID.N0.3所示。
6、 一种抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述的抗肿瘤疫苗为细胞疫苗，宿主细 胞为卡介苗疫苗，转染卡介苗疫苗的载体片段包含人MUC1重复序列串联体和 GM-CSF融合基因片段。
7、 如权禾腰求6所述的抗肿瘤疫苗，其特征在于，转染卡介苗疫苗的载体 片段还包含信号肽序列和Kozak序列。
8、 如权利要求6所述的抗肿瘤疫苗，其特征在于，转染卡介苗疫苗的载体 片段为pDE22-MUClVNTRs-GM-CSF载体，在大肠-分枝杆菌穿梭载体上克隆包 含信号肽序列和Kozak序列的人MUCl重复序列串联体和GM-CSF融合基因片 段。
9、 如权利要求6或7所述的抗肿瘤疫苗应用于以MUC1阳性表达的肿瘤细胞为靶点的治疗性抗肿瘤疫苗或者预防性抗肿瘤疫苗的制备。
10、如权利要求6或7所述的抗肿瘤疫苗应用于抗乳腺癌的治疗性疫苗或预 防性疫苗的制备。
全文摘要
本发明公开了一种基于人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗，首先构建人MUC1重复序列串联体通过连接DNA与GM-CSF基因连接的融合基因，进一步连接信号肽序列和Kozak序列，并构建成表达载体；将构建成的融合基因转染卡介苗疫苗，应用于以MUC1为靶点的抗肿瘤疫苗或者抗肿瘤药物的制备。本发明实现抗原、佐剂和疫苗载体的有效结合，使得MUC1肿瘤疫苗的免疫原性达到更有效、更持久的效果，同时安全无毒副作用，能够诱导特异性的T细胞免疫应答和持久性分泌表达人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白。
文档编号A61K39/00GK101575607SQ200910022248
公开日2009年11月11日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者瑞 凌, 师长宏, 张英起, 李南林, 廷 王, 袁时芳, 苇 韩 申请人:中国人民解放军第四军医大学