专利名称：当归多糖作为制备治疗肝损伤病的药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及当归多糖作为制备治疗肝损伤病的药物的应用。
背景技术：
多种因素引起的肝损伤目前尚无疗效确切的药物予以治疗，且从分子水平对其作用机制和靶点的研究极少，影响了临床合理安全用药。
发明内容
本发明就是针对上述问题提供当归多糖作为制备治疗肝损伤病的药物的应用，用当归多糖制备的治疗肝损伤病的药物对肝损伤具有较好的疗效，且副作用少。
本发明提供的技术方案是当归多糖作为制备治疗肝损伤病的药物的应用。将当归多糖和药用载体和/或赋形剂制得药用组合物。所制得的药用组合物用于肝损伤的治疗，具有疗效好，副作用少等优点。
图1为当归多糖对凋亡相关基因Bcl-2、Bax的影响图；图2为当归多糖对免疫性肝损伤肝组织中MAPK信号转导通路的影响图；图3为当归多糖对免疫性肝损伤肝组织中NFkappaBp65、STAT1、c-fos、c-Jun表达的影响图；图4为当归多糖对免疫性肝损伤肝组织中cNOS，iNOS，COX-2，PKA表达的影响图。
具体实施例方式
本发明通过以下实施例作进一步说明实施例1当归多糖组合物由当归多糖2～10克、纤维素490～498克制成1000粒。其制备方法为将当归水提取，乙醇沉淀，离心，沉淀为多糖。滤液浓缩，加入3倍量体积乙醇再沉淀，得多糖。将多糖与纤维素制粒，然后压片或灌装胶囊，每粒(片)含多糖5mg。
实施例2当归多糖组合物由1～5克当归多糖加注射用水至1升，分装成1000支制得。其制法为将当归多糖溶于注射用水中，加至1升，灭菌，分装。每支含2mg当归多糖。
当归多糖对免疫性肝损伤的保护作用动物试验雄性昆明种小鼠，体重18-24g，由武汉大学医学院动物实验中心提供，用颗粒型普通鼠饲料喂养，饮用自来水，饲养2d后随机分为5组空白对照组；Model(肝损伤组)一次ip(腹腔注射)给予BCG 1.5mg.10g-1，7d后ip(腹腔注射)给予LPS2μg.10g-1；Model+ASP1(肝损伤+小剂量当归多糖组)、Model+ASP2(肝损伤+大剂量当归多糖组)给予BCG的同时，ig(经口给予)ASP(当归多糖)30mg.kg-1、60mg.kg-1，qd*7d(一天一次，连续给药7天)。于给予LPS 6h后，小鼠断头处死，分离血清，测定ALT、GST、GSH，数据以x±S表示，组间差异采用t检验进行统计处理。结果当归多糖对免疫性肝损伤小鼠sALT，sGST and GSH含量的影响见下表，Group sALT sGSTGSH(mmol·min-1·L-1) (μmol·min-1·L-1) (μmol·mg-1·pro.)Control 1.29±0.1421±323±7Model4.02±0.27**30±6**9.3±2.9**Model+ASP1 3.0±0.4**ΔΔ17.7±2.6ΔΔ15±5**ΔΔModel+ASP2 2.55±0.29*ΔΔ20±9Δ13±5**Δ结论当归多糖对免疫性肝损伤具有保护作用。
当归多糖对免疫性肝损伤信号转导通路的影响动物试验动物处理方法同前。原位杂交法观察NFkappaBp65、STAT1 mRNA表达；免疫组化染色观察结构型、诱导型一氧化氮合酶(cNOS、iNOS)、诱导型环氧合酶(COX-2)、蛋白激酶A(PKA)及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、早期反应基因c-fos、c-Jun、表皮生长因子受体EGFR、原癌基因ras的表达。Griess法测定NO含量；放射免疫法测定PGE2、cAMP含量。
结果表明1.对凋亡相关基因Bcl-2、Bax的影响见图1，当归多糖可明显上调凋亡抑制基因Bcl-2的表达。2.对免疫性肝损伤肝组织中MAPK信号转导通路的影响见图2，当归多糖能激活MAPK信号转导通路，使EGFR、ras、Erk1的表达上调。3.对免疫性肝损伤肝组织中NFkappaBp65、STAT1、c-fos、c-Jun表达的影响见图3，当归多糖仅能减少c-fos在肝组织中的表达。4.对免疫性肝损伤肝组织中cNOS，iNOS，COX-2，PKA表达的影响见图4，当归多糖能显著上调PKA的表达，同时可增加cNOS的表达。5.对免疫性肝损伤肝组织中第二信使NO、PGE2、cAMP含量的影响见下表，Group NOPGE2cAMP(pmol·mg-1·pro.-1)(pg·mg-1·pro.-1)(pmol·mg-1·pro.-1)Control 2.5±0.4 7.8±1.4 0.158±0.015Model3.9±0.4**13±3**0.126±0.020**Model+ASP1 3.13±0.13ΔΔ10.2±1.0Δ0.151±0.022ΔModel+ASP2 3.2±0.3ΔΔ10.9±2.5 0.20±0.04ΔΔ结论当归多糖可显著增加NO、cAMP含量，减少PGE2含量。
利用基因芯片技术筛选当归多糖护肝相关基因动物试验动物处理方法同前，小鼠处死后，取肝脏，立即液氮冻存备用。
总RNA抽提及mRNA分离纯化一步法提取肝组织总RNA。将液氮冻存组织放在陶瓷碾钵(RNase free)中彻底碾碎成粉末状，加入溶液D(3mol/L NaAc，10％SDS，1mol/L Tris-HCl)和1％巯基乙醇，匀浆，离心后上清液经1∶1酚∶氯仿两次抽提后，经NaAc和5∶1酸性酚-氯仿两次抽提后，再经等体积异丙醇沉淀，离心后，用Milli-Q水溶解沉淀，紫外分析显示获得了高纯度总RNA。按Oligotex mRNA spin-column protocal(Qiagen)分离纯化mRNA，紫外分析。
探针制备在50μl逆转录反应体系中加入3μg mRNA，参照Schena的方法，逆转录标记及纯化mRNA，用Cy3-dUTP标记正常组织mRNA，用Cy5-dUTP标记损伤组织或经药物处理的组织mRNA，乙醇沉淀后将Cy3-dUTP、Cy5-dUTP标记的探针混合溶解在20μl 5×SSC+0.2％SDS杂交液中。
芯片杂交 将芯片和杂交探针分别置于95℃水浴变性5min，立即将探针加在基因芯片上，盖玻片封片，置于密封舱内60℃杂交15-17h。揭开盖玻片，用SSC和SDS溶液洗涤10min，室温晾干。
检测与分析 用ScanArray5000扫描仪扫描芯片，得到Cy3/Cy5图像文件，通过划格，确定杂交点范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光强度值。用预先选定的内参照基因(42个管家基因)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正。用ImaGene 3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。用以下三个条件作为判断基因差异表达的标准(1)Cy3和Cy5信号比值的自然对数的绝对值＞0.69(基因的表达变化在2倍以上)；(2)Cy3和Cy5信号值之一＞600；(3)PCR结果良好。
结果当归多糖 对免疫性肝损伤差异表达基因的调控见下表
Ratio is Cy5/Cy3high expression(ratio＞2.0)，low expression(ratio＜0.5)
结论与正常肝组织相比，经当归多糖预处理的免疫性肝损伤小鼠肝组织内显示7个差异表达基因，其中6个下调表达，1个上调表达。
本发明采用分子生物学方法(基因芯片技术、原位杂交技术等)，从分子水平表明了当归多糖护肝作用的靶点当归多糖可显著上调凋亡抑制基因Bcl-2表达、下调c-fos(早期反应基因)基因的表达，减少肝细胞的凋亡；明显升高cAMP(3‘5’-cyclic adenosinemonophosphate，3’5’-环腺甘酸)、NO(一氧化氮)含量、减少PGE2(前列腺素)含量、增加cAMP依赖型蛋白激酶PKA及增加cNOS(结构型一氧化氮合酶)的表达、上调MAPK(mitogenactivatedprotein kinase，有丝分裂原激活的蛋白激酶)信号级联通路中EGFR(epidermal growth factorreceptor，内皮生长因子受体)、ras(原癌基因)、Erk1(extracellular signal-regulatedkinase，细胞外信号调节激酶)的表达，促进肝细胞的再生与修复；并对经卡介苗处理的免疫性肝损伤基因编码(Genbank-ID)为Humscp2a、Humoat、Hsngmrna、humpafaa、humhbgfb、Hsu83843的基因表达明显下调、对humnlk基因明显上调。
权利要求
当归多糖作为制备治疗肝损伤病的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及当归多糖作为制备治疗肝损伤病的药物的应用。将当归多糖和药用载体和/或赋形剂制得药用组合物。所制得的药用组合物用于肝损伤的治疗，具有疗效好，副作用少等优点。
文档编号A61K31/715GK1481807SQ0311848
公开日2004年3月17日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者丁虹, 丁 虹 申请人:武汉大学