专利名称：当归多糖组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及当归多糖组合物及其制备方法。
本发明提供的技术方案是当归多糖组合物，由0.4～2％的当归多糖和98～99.6％纤维素组成，以上百分比为重量百分比。
本发明还提供了上述当归多糖组合物的制备方法将当归水提取，乙醇沉淀，离心，沉淀为多糖；滤液浓缩，加入2～4倍量体积乙醇再沉淀，得多糖；将多糖与纤维素混合制粒，得当归多糖组合物。
本发明提供的药用组合物用于肝损伤的治疗，具有疗效确切，副作用少等优点。
实施例2当归多糖组合物由1％的当归多糖和99％纤维素组成，以上百分比为重量百分比。
实施例3当归多糖组合物由2％的当归多糖和98％纤维素组成，以上百分比为重量百分比。
实施例4按实施例1～3中的任一配比，取当归多糖与纤维素混合制粒，得当归多糖组合物。
制备将当归水提取，乙醇沉淀，离心，沉淀为多糖。滤液浓缩，加入3倍量体积乙醇再沉淀，得多糖。将多糖与纤维素制粒，然后压片或灌装胶囊，每粒(片)含多糖5mg。
用法用量每日三次，每次3～6片；口服。
当归多糖组合物对免疫性肝损伤的保护作用动物试验雄性昆明种小鼠，体重18-24g，由武汉大学医学院动物实验中心提供，用颗粒型普通鼠饲料喂养，饮用自来水，饲养2d后随机分为5组空白对照组；Model(肝损伤组)一次ip(腹腔注射)给予BCG1.5mg.10g-1，7d后ip(腹腔注射)给予LPS2μg.10g-1；Model+ASP1(肝损伤+小剂量当归多糖组)、Model+ASP2(肝损伤+大剂量当归多糖组)给予BCG的同时，ig(经口给予)ASP(当归多糖)30mg.kg-1、60mg.kg-1(每公斤小鼠所用当归多糖组合物的当归多糖含量)，qd*7d(一天一次，连续给药7天)。于给予LPS 6h后，小鼠断头处死，分离血清，测定ALT、GST、GSH，数据以x±S表示，组间差异采用t检验进行统计处理。结果当归多糖组合物对免疫性肝损伤小鼠sALT，sGST and GSH含量的影响见下表，Group sALT sGST GSH(mmol·min-1·L-1) (μmol·min-1·L-1) (μmol·mg-1·pro.)Control 1.29±0.1421±3 23±7Model 4.02±0.27**30±6**9.3±2.9**Model+ASP1 3.0±0.4**▲▲17.7±2.6▲▲15±5**▲▲Model+ASP22.55±0.29*▲▲20±9▲13±5**▲结论本发明的当归多糖组合物对免疫性肝损伤具有保护作用。
当归多糖组合物对免疫性肝损伤信号转导通路的影响动物试验动物处理方法同前。原位杂交法观察NFkappaBp65、STAT1 mRNA表达；免疫组化染色观察结构型、诱导型一氧化氮合酶(cNOS、iNOS)、诱导型环氧合酶(COX-2)、蛋白激酶A(PKA)及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、早期反应基因c-fos、c-Jun、表皮生长因子受体EGFR、原癌基因ras的表达。Griess法测定NO含量；放射免疫法测定PGE2、cAMP含量。
结果表明1.对凋亡相关基因Bcl-2、Bax的影响见
图1，当归多糖组合物可明显上调凋亡抑制基因Bcl-2的表达。
2.对免疫性肝损伤肝组织中MAPK信号转导通路的影响见图2，当归多糖组合物能激活MAPK信号转导通路，使EGFR、ras、Erk1的表达上调。
3.对免疫性肝损伤肝组织中NFkappaBp65、STAT1、c-fos、c-Jun表达的影响见图3，当归多糖组合物仅能减少c-fos在肝组织中的表达。
4.对免疫性肝损伤肝组织中cNOS，iNOS，COX-2，PKA表达的影响见图4，当归多糖组合物能显著上调PKA的表达，同时可增加cNOS的表达。
5.对免疫性肝损伤肝组织中第二信使NO、PGE2、cAMP含量的影响见下表，GroupNO PGE2cAMP(pmol·mg-1·pro.-1) (pg·mg-1·pro-1) (pmol·mg-1·pro-1)Control 2.5±0.4 7.8±1.40.158±0.015Model3.9±0.4**13±3**0.126±0.020**Model+ASP1 3.13±0.13▲▲10.2±1.0▲0.151±0.022▲Model+ASP2 3.2±0.3▲▲10.9±2.50.20±0.04▲▲结论当归多糖组合物可显著增加NO、cAMP含量，减少PGE2含量。
利用基因芯片技术筛选当归多糖护肝相关基因动物试验动物处理方法同前，小鼠处死后，取肝脏，立即液氮冻存备用。
总RNA抽提及mRNA分离纯化一步法提取肝组织总RNA。将液氮冻存组织放在陶瓷碾钵(RNase free)中彻底碾碎成粉末状，加入溶液D(3mol/L NaAc，10％SDS，1mol/L Tris-HCl)和1％巯基乙醇，匀浆，离心后上清液经1∶1酚∶氯仿两次抽提后，经NaAc和5∶1酸性酚-氯仿两次抽提后，再经等体积异丙醇沉淀，离心后，用Milli-Q水溶解沉淀，紫外分析显示获得了高纯度总RNA。按Oligotex mRNA spin-column protocal(Qiagen)分离纯化mRNA，紫外分析。
探针制备 在50μl逆转录反应体系中加入3μg mRNA，参照Schena的方法，逆转录标记及纯化mRNA，用Cy3-dUTP标记正常组织mRNA，用Cy5-dUTP标记损伤组织或经药物处理的组织mRNA，乙醇沉淀后将Cy3-dUTP、Cy5-dUTP标记的探针混合溶解在20μl5×SSC+0.2％SDS杂交液中。
芯片杂交 将芯片和杂交探针分别置于95℃水浴变性5min，立即将探针加在基因芯片上，盖玻片封片，置于密封舱内60℃杂交15-17h。揭开盖玻片，用SSC和SDS溶液洗涤10min，室温晾干。
检测与分析 用ScanArray5000扫描仪扫描芯片，得到Cy3/Cy5图像文件，通过划格，确定杂交点范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光强度值。用预先选定的内参照基因(42个管家基因)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正。用ImaGene 3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。用以下三个条件作为判断基因差异表达的标准(1)Cy3和Cy5信号比值的自然对数的绝对值＞0.69(基因的表达变化在2倍以上)；(2)Cy3和Cy5信号值之一＞600；(3)PCR结果良好。
结果当归多糖组合物对免疫性肝损伤差异表达基因的调控见下表
Ratio is Cy5/Cy3high expression(ratio＞2.0)，low expression(ratio＜0.5)结论与正常肝组织相比，经当归多糖预处理的免疫性肝损伤小鼠肝组织内显示7个差异表达基因，其中6个下调表达，1个上调表达。
权利要求
1.当归多糖组合物，由0.4～2％的当归多糖和98～99.6％纤维素组成，以上百分比为重量百分比。
2.权利要求1所述当归多糖组合物的制备方法，其特征在于将当归水提取，乙醇沉淀，离心，沉淀为多糖；滤液浓缩，加入2-4倍量体积乙醇再沉淀，得多糖；将多糖与纤维素混合制粒，得当归多糖组合物。
全文摘要
本发明涉及当归多糖组合物，由0.4～2％的当归多糖和98～99.6％纤维素组成，以上百分比为重量百分比。本发明还提供了上述当归多糖组合物的制备方法将当归水提取，乙醇沉淀，离心，沉淀为多糖；滤液浓缩，加入2～4倍量体积乙醇再沉淀，得多糖；将多糖与纤维素混合制粒，得当归多糖组合物。本发明提供的药用组合物用于肝损伤的治疗，具有疗效确切，副作用少等优点。
文档编号A61K31/715GK1430969SQ0311848
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者丁虹 申请人:武汉大学