专利名称：稳定的腺病毒配方的制作方法
发明描述本发明涉及，例如，通过向组合物中加入稳定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇部分[PEG(还称为聚环氧乙烷结构)，具有O-(CH2CH2O)z-H结构，其中z为至少2]的非离子洗涤剂，例如Brij洗涤剂或聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20，而稳定包含病毒，如空气传播病毒(例如腺病毒)的组合物，如药物组合物的方法。在优选的实施方案中，该非离子洗涤剂具有式I或式II或式III或式IV所示的结构或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-HI其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基，其任选被一个或多个(例如1-3个)羧基、脲、卤素(F、Cl、Br、I)、羟基、氨基或1-3个环取代，所述环可以是芳香(例如具有6-14个原子)或环烷基(例如具有3-12个C原子)，其还可以为杂环(例如具有4-14个C原子和1-3个N、S、O或P原子)，且其中所述环任选被一个或多个烷基(例如具有1-12个C原子)、羟基、氨基、卤素(如上述)、硝基、硫氧基(sulfoxy)、羧基或脲(其中环基团可以优选为一、二或三环)取代， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义，
其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100，其中X为5-15，优选7-10，环A为亚苯基或亚环己基，而R′如上述的R。
在特别优选的实施方案中，在式I中，R为(CH3)(CH2)Y-，其中Y为10-15；在最优选的实施方案中，X为23而Y为12(Brij 35)，或者X为20而Y为12(Brij 58)；在式II中，R为CaH(2a+1)CO2-，其中a为10-70，而在最优选的实施方案中，R＝C11H23CO2-(吐温20)；在式III中，R为CH3，X为55，Y为29，而Z＝55(普朗尼克F68)，或者R为CH3，X为98，Y为67，而Z为98(普朗尼克F-127)；或者在式IV中，R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚苯基，而X为9-10(Triton X-100，NP40)，或者R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚环己基，而X为9-10(还原的Triton X-100)。
本发明的一个方面是用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的本发明的非离子洗涤剂，例如以上式I、II、III或IV的非离子洗涤剂，或者它们的组合；其中该腺病毒为表达转基因，例如用于基因治疗的治疗基因的重组腺病毒；其中该非离子洗涤剂为Brij洗涤剂，如Brij 35或Brij 58，聚山梨醇酯(吐温)洗涤剂，如聚山梨醇酯20、40、60或65，特别是聚山梨醇酯20，或者普朗尼克(pluronic)分子，如普朗尼克F127或F68，或类似Triton的分子，如Triton X-100、Triton X-114或NP-40，所述非离子洗涤剂的浓度为约临界胶团浓度(CMC)，例如约0.005％至约0.1％(vol/vol)，优选约0.05％至约0.08％，更优选约0.05％。
本发明的另一方面为包含由上述方法制备的稳定的腺病毒组合物和至少一种药学可接受的载体的药物组合物。
本发明的另一方面为一种组合物，例如药物组合物，其包含腺病毒和稳定有效量的本发明的非离子洗涤剂，例如以上式I、II、III或IV的非离子洗涤剂，或者它们的组合，和任选的一种或多种盐和/或赋形剂，且在药物组合物的情况下，其包含一种或多种药学可接受的载体、盐和/或赋形剂；其中腺病毒为表达转基因，例如用于基因治疗的治疗基因的重组腺病毒；其中中性洗涤剂为Brij洗涤剂，如Brij35或Brij 58，聚山梨醇酯(吐温)洗涤剂，如聚山梨醇酯20、40、60或65，特别是聚山梨醇酯20，普朗尼克分子，如普朗尼克F127或F68，或类似Triton的分子，如Triton X-100、Triton X-114或NP-40，所述非离子洗涤剂的浓度为约CMC，例如约0.005％至约0.1％(vol/vol)，优选约0.05％至约0.08％，更优选约0.05％。
另一方面为稳定包含腺病毒的组合物的方法，其改进之处是将稳定有效量的本发明的非离子洗涤剂，例如式I、II、III或IV的非离子洗涤剂加到该组合物中。
本发明的另一方面是稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的本发明的非离子洗涤剂，例如以上式I、II、III或IV的非离子洗涤剂，或者它们的组合。本发明的另一方面为一种组合物，例如药物组合物，其包含空气传播病毒，本发明的非离子洗涤剂，例如以上式I、II、III或IV的非离子洗涤剂，或者它们的组合，和任选的一种或多种盐或赋形剂。药物组合物包含一种或多种药学可接受的载体、盐和/或赋形剂。
“稳定”，例如稳定包含病毒的组合物在此意指与在除了不存在稳定剂之外的相同条件下保存的样品的损失量相比，在确定的时间内抑制组合物中病毒可用(可测定)量和/或活性的损失。
由本发明的方法实现的典型的稳定程度如实施例2和图1-6所示。例如，如图1所示，将在玻璃容器中于2-8℃下在不存在稳定剂的情况下温育的高度纯化的腺病毒组合物在一个月后侵染性损失约2.5logs(230倍损失)；但在存在吐温20时，该损失小于约0.5log(约3倍损失)。换句话说，在2-8℃下在吐温20存在下1个月后回收的病毒活性比不存在吐温20的情况下回收的活性大约80倍。图1还表明，当在塑料容器中进行相同的实验时，在存在吐温20的情况下的相对活性降低为约40％。在图2中，(通过HPLC)测定病毒浓度。图2表明，在玻璃或塑料容器中，腺病毒组合物在于2-8℃和存在吐温20的情况下一个月后不表现出可检测的腺病毒浓度损失。相反，在玻璃容器中的病毒在此温度下仅0.25个月后其浓度损失约1/3。
图3和4表明，吐温20稳定在-70℃下温育的腺病毒组合物。图3表明，在玻璃或塑料容器中，当病毒在-70℃下温育时，没有发生可检测的侵染性损失。在1至12个月的温育中的任何时间的病毒侵染性回收在存在吐温20的情况下比不存在吐温20的情况下高约0.5-0.8logs(高约3-4倍)。图4显示在(通过HPLC)测量病毒浓度时的类似发现。
图5和6表明，吐温20稳定在-20℃下温育的腺病毒组合物。图5表明，在玻璃或塑料容器中，当病毒在-20℃下温育时，在存在吐温20时温育2.5个月后的病毒侵染性回收保持基本不变；但在不存在吐温20的情况下，仅在1个月温育之后侵染性即降低约0.6logs(约80％)。在图6中，(通过HPLC)测量病毒浓度。图6表明，在玻璃或塑料容器中，病毒浓度在-20℃下在存在吐温20的情况下温育达14个月后仍保持基本不变。当不加入吐温20时，病毒浓度降至这种测定法的检测限之下。在玻璃管或塑料管中温育时，病毒回收比在不存在吐温20的情况下至少好约15倍。
本发明涉及用于稳定包含病毒，例如腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入一定量的以上非离子洗涤剂，其中在给定的时间(例如至少5小时)内在约2-8℃、室温、37℃、-20℃或-70℃下，病毒量和/或活性的损失与不存在所述试剂时的损失相比小于约30％，例如0-30％，优选小于约10％，更优选小于约5％，最优选小于约2％。可以在至少约5-24小时，优选至少约1-30天，更优选至少约1-12个月，最优选至少约2-3年或更长时间内用本发明的方法将病毒制剂稳定至这种程度。在确定的时间之后，与初始量相比的残余病毒量可以大于2％至例如100％，例如大于约2％、5％、10％、25％或75％。在最优选的实施方案中，该量大于约90％(例如约95、98或99％)。
“活性”在此意指病毒的生存力和/或侵染性(感染单位、感染效价)。
不希望拘泥于理论，本发明的稳定剂可以通过，例如抑制病毒的自身聚集和/或病毒结合(吸附)至它们所停留的容器表面或结合(吸附)至该组合物的其它组分而发挥功能。这种稳定在不干扰病毒的结构完整性(例如表面蛋白未变性)或它们的侵染性的情况下得以实现。
在优选的实施方案中，与不存在稳定试剂的情况下的腺病毒浓度和/或活性的降低相比，稳定腺病毒组合物的试剂抑制在给定的时间内，在特定的温度下保存腺病毒期间所发生的可检测的腺病毒浓度和/或活性损失。
本发明的方法的一个优点是它在任何不同温度下长时间地稳定病毒。例如，这允许长期保存病毒制剂，特别是在高于冷冻温度下保存病毒制剂，从而消除使用昂贵的冰箱和/或冷冻系统的需要。该方法用于，例如实验目的(例如用于在HPLC分析之前稳定玻璃或塑料自动进样瓶中的腺病毒制剂)；用于制备、保存和/或保藏药物组合物；并用于确保作为基准试剂，以及在采集用于诊断的临床样品中的病毒的侵染性保持。
本发明所包括的任何适宜的洗涤剂，例如以上式I、II、III或IV的洗涤剂，可以用于本发明的方法或组合物。例如，式I包括Brij 35(当X为23，而Y为12时)、Brij 58(当X为20，而Y为12时)和Brij 3J(当X为23，而Y为11时)。例如，式II包括不同的聚山梨醇酯(聚氧乙烯20脱水山梨醇分子)，包括聚山梨醇酯20(聚氧乙烯20脱水山梨醇一月桂酸酯，吐温20)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯20脱水山梨醇一棕榈酸酯，吐温40)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯20脱水山梨醇一硬脂酸酯，吐温60)和聚山梨醇酯65。式III包括，例如不同的普朗尼克，包括普朗尼克127，此时X＝98，Y＝67而Z＝98，和普朗尼克F68，此时X＝55，Y＝29而Z＝55。例如，式IV包括不同的类似Triton的分子，例如当X＝9-10而A＝亚环己基时，为还原的Triton X-100，而当X＝9-10而A＝亚苯基时，为Triton X-100或NP-40。
在优选的实施方案中，特别是对于作为药物组合物的组合物而言，该洗涤剂是已被批准用于患者的洗涤剂，例如注射级洗涤剂，如可注射的吐温20。
可以使用任何适宜的洗涤剂浓度，条件是它是稳定有效量，即可以实现组合物中病毒的稳定的量。一般地，洗涤剂存在的浓度为约CMC，例如约0.005％-0.1％vol/vol，优选约0.05-0.08％，更优选约0.05％。确定稳定组合物中病毒需要多少洗涤剂的方法是本领域中的常规方法。典型的测定病毒浓度或活性的方法在本文其它部分有述。
可以通过本发明的方法稳定的病毒对本领域技术人员来说是清楚的。这些病毒可以是致病或非致病的。一般地，可以由本发明的方法稳定的病毒是空气传播病毒。优选的这些病毒例如为DNA或RNA病毒，如属于以下科的病毒细小病毒(包括与腺有关的病毒)、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、乙型肝炎类病毒、微小核糖核酸病毒、杯状病毒(Calcivirus)、星状病毒、披膜病毒、黄热病毒(flavivirus)、冠状病毒、副粘病毒、弹状病毒、蜷丝状病毒、流感病毒、沙粒病毒、崩芽病毒、呼肠孤病毒、反转录病毒等。可以通过本发明的方法稳定的病毒是呼吸道感染中涉及的病毒，例如反转录病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)。可以通过本发明的方法稳定的病毒包括具有蛋白质外衣和疏水表面的病毒。
最优选腺病毒，例如鸟类或哺乳动物腺病毒，已鉴定的任何血清型包括腺病毒2和腺病毒5。在最优选的实施方案中，使用重组病毒，例如适于基因治疗的重组腺病毒。已描述了不同的病毒载体，包括适宜基因缺陷腺病毒(例如E1基因缺失腺病毒)，其适于基因治疗应用。任何不同的基因可以用作，例如标记物或治疗剂，并可以在适宜的调控序列的控制下克隆入这些载体中，然后在例如基因疗法中导入患者中。适宜的载体和可以在其中表达的基因，以及制备这些构建体和将它们用于体外或体内基因疗法的方法的选择对本领域技术人员来说是常规和已知的(例如参见Sambrook，J等人(1989).Molecular CloningA Laboratory Mamal.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)。可以用于本发明的方法的基因包括，例如编码多肽，如酶、激素、细胞因子(例如干扰素或白介素)、生长因子(例如FGF-1至FGF-23之任一种)等的基因。而且，可以表达标记物基因，例如lacZ或绿荧光蛋白。当然，可以通过本发明的方法制备(稳定)任何以上病毒的突变体或变体形式，并可以制备这些病毒的重组体、杂合体、嵌合体等形式。本文的许多讨论涉及腺病毒制剂。但是，本领域技术人员将认识到，任何适宜的病毒均可以通过本文所述的方法稳定，特别是空气传播病毒。确定特定的病毒是否可以被本发明的洗涤剂稳定的方法是常规的。典型的测量病毒浓度或活性的测定法在本文其它部分有述。
本文所用的术语“稳定腺病毒”指稳定包含单一类型的腺病毒或多种类型的包含单一腺病毒颗粒和任何数目的颗粒的腺病毒的制剂。
任何适宜的病毒浓度均可以由本发明的方法稳定。例如，腺病毒的浓度范围可以为约1×108病毒颗粒/ml至约1×1013病毒颗粒/ml。具有不同纯度的病毒可以由本发明的方法稳定。例如，它们可以为中等纯化的制剂至高度纯化的制剂，如通过色谱法和膜分离步骤，例如超滤步骤制备的病毒。本发明特别适于稳定高度纯化的病毒制剂，例如接近均一的纯度为约99.9％的制剂(例如其具有小于0.1％的蛋白质污染物)。除非被稳定，否则这些高度纯化的制剂在保存期间快速损失侵染性。例如，已观察到在室温下保存16小时之后从玻璃自动进样瓶(例如RP-HPLC或SEC-HPLC)中的高度纯化的腺病毒回收仅为约71％，在2小时后仅为约60％，其通过HPLC分析测量。不希望拘泥于理论，认为该损失至少部分是由病毒颗粒吸附在自动进样瓶壁上导致的。
病毒可以通过任何不同的方案得到稳定。例如，可以在融化之前、期间或之后将本发明的洗涤剂加入腺病毒的液体制剂中；或者可以将其加入冷冻腺病毒的容器中；或者可以将其加入液体制剂中，然后将该液体制剂冻干。
测量病毒量(质量、浓度)的方法是惯常和常规的。对于腺病毒，例如，可以通过例如HPLC测定病毒颗粒的量(例如通过测定衣壳蛋白，如六位体的量)，或者可以通过颗粒计数测定来确定病毒颗粒的数目。这些测量检测可用(可测定)病毒体(viral mass)的量，例如没有吸附在其停留的容器的壁上的病毒的量。例如，参见实施例2，其例示使用RP-HPLC测量病毒浓度。通过测定和比较两种或更多种不同衣壳组分的量，还可以确定病毒粒子是否完整。HPLC测量可以检测可以影响例如病毒的免疫原性、生物分布(biodistribution)等的衣壳蛋白分子的变化(例如氧化、脱酰胺等)。
测定病毒活性(例如生存力和/或侵染性)的方法也是惯常和常规的。对于腺病毒，例如，可以用细胞病理效应(CPE)、终点稀释(EPD)、或者噬斑形成测定来测量感染颗粒的数目，或者可以使用FACS分析，例如与FITC标记的抗.五位体(外壳蛋白)抗体缀合。例如，参见Mittereder等人(1996).J.Virology70，7498。这些测量检测可用(可测定)病毒侵染性，例如没有吸附到其它病毒粒子或它们停留的容器的壁上的传染性病毒粒子的量。例如，参见实施例2，其例示使用终点稀释来测量病毒侵染性。在表达转基因的重组腺病毒的情况下，腺病毒的活性与转基因的表达量有关，因此可以通过定量所表达的转基因的量或活性来测量活性。
可以在任何不同的时间点测量病毒浓度或活性。例如，在将病毒组合物转移到容器中之后，可能最初快速损失病毒浓度或活性(可能是病毒粘附到器壁上的结果)，然后在一段时间内较慢损失。本领域技术人员可以在选择进行测定的适宜的时间，这取决于所研究的变量。
本发明还包括包含有效量的病毒，如腺病毒的药物组合物。“有效量”在此意指有效地实现治疗效果的量。例如包含CF基因的重组腺病毒的有效量是在给予囊性纤维化病患者时有效地减少该疾病的症状的量。
本发明的药物组合物含有任何不同的常规药学可接受的载体。在优选的实施方案中，该药物组合物为液体形式，虽然它们也可以是固体(例如冻干)形式。本发明的药物组合物包含无菌水(例如用于注射的USP级水)和任选的常规缓冲剂，例如PBS，其pH为约6.5-7.5，优选为约7，其浓度为约0.1X-4X，或者Tris，其pH为约7-8，优选约7.5，且其浓度为约0.05M-0.1M。也可以使用其它在中性pH下有效的缓冲液，如柠檬酸盐缓冲液。本发明的组合物还任选包含盐(例如MgCl2，其浓度为约1-5mM，优选为约2mM)，和/或用于调节克分子渗透压浓度/重量克分子渗透浓度的试剂，例如蔗糖，其浓度为约1-8％，优选为约2％(±10％)(wt/vol)。
在最优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含约5×107-5×1011颗粒/ml的腺病毒，优选重组腺病毒，约0.05％(vol/vol)的吐温20，约2mM MgCl2和约2％(wt/vol)蔗糖，其在1X PBS中，其pH为约6.95。任选地，特别是在药物组合物的形式时，本发明的组合物可以含有一种或多种其它常规的药学可接受的赋形剂或稳定剂。
本发明的配方在任何不同的容器，例如玻璃或塑料容器，如由任何不同的塑料材料，如聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯制成的小瓶或注射器(例如包含硅树脂内涂层的Hypak注射器)，或者玻璃，如棕色或白色硼硅酸盐HPLC小瓶中时是稳定的。
本发明的药物组合物可以用于不同的治疗应用。例如，表达治疗转基因的重组腺病毒可以用于基因疗法，其中该转基因取代缺陷基因，提供增强的免疫反应等。
图1例示吐温20稳定在2-8℃下，在玻璃或塑料容器中温育的腺病毒组合物，其通过侵染性测定来测量。
图2例示吐温20稳定在2-8℃下，在玻璃或塑料容器中温育的腺病毒组合物，其通过HPLC来测量。
图3例示吐温20稳定在-70℃下，在玻璃或塑料容器中温育的腺病毒组合物，其通过侵染性测定来测量。
图4例示吐温20稳定在-70℃下，在玻璃或塑料容器中温育的腺病毒组合物，其通过HPLC来测量。
图5例示吐温20稳定在-20℃下，在玻璃或塑料容器中温育的腺病毒组合物，其通过侵染性测定来测量。
图6例示吐温20稳定在-20℃下，在玻璃或塑料容器中温育的腺病毒组合物，其通过HPLC测量。
不用进一步的详尽细节，相信本领域技术人员利用前述的说明，可以充分地应用本发明。因此，以下优选的具体实施方案仅是例示性的，而不以任何方式对其余内容进行限制。
在前述和以下实施例中，所有的温度以摄氏度为单位不经校对描述，且所有的份和百分比按重量计，除非另外指出。
实施例实施例1-测试不同试剂稳定腺病毒组合物的能力腺病毒，例如5型腺病毒，在注射到RP-HPLC柱上时分解成它们的蛋白质，且蛋白质在用乙腈/TFA进行梯度洗脱时分离。获得特征性蛋白质指纹图谱，其用于腺病毒生产方案中的一些步骤的定量和纯度分析。但是，除非被稳定，已观察到病毒蛋白峰的收率是可变的，并随着样品在自动进样管中保留的时间而降低。
为研究这种现象，将高度纯化的腺病毒样品在自动进样系统中保存数小时，然后将其注射到HPLC柱中。除非被稳定，通过常规RP-HPLC或SEC-HPLC测定而测量的病毒蛋白峰的积分面积，(例如在六位体峰下)，在样品于室温或4℃下在自动进样系统中保存数小时时随时间减少。例如，在室温下保存1.6小时后回收仅为约70％，而在2小时后仅为约60％。证明损失至少部分是由于病毒结合到表面(自动进样管壁)上导致的；这种结合有时由病毒聚集体(与其它病毒结合的病毒)沉淀的介导。
加入几种试剂，以力图抵消这些吸附过程，并测试它们稳定该组合物的能力。在自动进样管中将样品温育任何期望的时间，例如约1-20小时。如果需要的话，在期望的时间点，例如在测定期间的等距离时间点进行测定。Plurmic、Brij 58和吐温20是所测试的试剂。
用Brij 58和吐温20进行进一步的实验，以确定例如，改变HPLC保存小瓶的类型、保存温度和洗涤剂浓度(范围为0-0.1％，vol/vol)的效果。还评价了在存在洗涤剂的情况下冷冻的病毒样品的作用。Brij58和吐温20的最佳浓度各自为约0.05％(vol/vol)。在0.1％下，两种洗涤剂似乎均导致病毒部分破坏。吐温20允许冷冻病毒并且比Brij58更好地定量从HPLC小瓶中的回收。0.05％吐温20的加入在融解病毒样品之后在自动进样器中提供大于16小时的稳定性。
实施例2-在不同条件下测试吐温20在2-8℃、-20℃或-70℃下，在玻璃或塑料容器(例如小瓶或注射器)中培养腺病毒组合物达1个月(2-8℃)或14个月(-20℃和-70℃)。定期通过终点稀释或通过RP HPLC分析测定等分试样。典型实验的结果如图1-6所示，并在本文其他部分讨论。在所有测试条件下，与不存在吐温20的情况相比，在存在吐温20的情况下温育样品时获得更高的病毒稳定性。
实施例3-在其它条件下测试吐温20如实施例2所述进行测试，但还测试其它参数，如吐温20的最佳浓度，在室温(约20-25℃)和37℃下温育，温育更长的时间(例如达约2-3年或更多年)。结果证实，在室温和更长的温育时间下，吐温20有效地稳定腺病毒组合物。
根据前面的描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的必要特征，并且可以在不背离本发明的构思和范围的情况下改变和修正本发明以使其适于不同的应用和条件。
不用进一步的详尽细节，相信本领域技术人员利用前述的说明，可以充分地应用本发明。因此，前述优选的具体实施方案仅是例示性的，而不以任何方式对其余内容进行限制。
上述的所有申请、专利和出版物的全部内容均引入本文作参考。
本发明的方面包括用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)部分的非离子洗涤剂；用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合
R-O(CH2CH2O)X-HI其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基，其任选被一个或多个羧基、脲、卤素、羟基或胺，或者被1-3个环取代，所述环可以是芳香或环烷基，还可以为杂环，且该环可以任选被一个或多个烷基、羟基、胺、卤素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′如上述的R；用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-HI其中X为4-30，而R为(CH3)(CH2)Y-，其中Y为10-15， 其中R为CaH(2a+1)CO2-，a为10-70，
其中R为CH3，X为55，Y为29，而Z为55(普朗尼克F68)，或者R为CH3，X为98，Y为67，而Z为98(普朗尼克F127)， 其中R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚苯基，而X为9-10(TritonX-100，NP-40)，或者R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚环己基，而X为9-10(还原的Triton X-100)，用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-HI其中R为(CH3)(CH2)Y-，而其中X为23，而Y为12(Brij 35)，或者X为20，而Y为12(Brij 58)， 其中R为R＝C11H23CO2-(吐温20)；上述的方法，其中该洗涤剂为聚山梨醇酯20(吐温20)，其中该腺病毒为重组腺病毒，其中该腺病毒为适于基因治疗的重组腺病毒，其中该洗涤剂的浓度为0.005％-0.1％(vol/vol)，其中该洗涤剂的浓度为0.05-0.08％(vol/vol)，或者其中该洗涤剂的浓度为0.05％(vol/vol)；药物组合物，其包含由本发明的方法制备的稳定腺病毒组合物和至少一种药学可接受的载体；药物组合物，其包含a)腺病毒，b)稳定有效量的本发明的非离子洗涤剂；和c)至少一种药学可接受的载体；其中该腺病毒为重组腺病毒，其中该腺病毒为适于基因治疗的重组腺病毒，其中该洗涤剂的浓度为0.005％-0.1％(vol/vol)，或0.05-0.08％(vol/vol)，或0.05％(vol/vol)；本发明的药物组合物，其中该腺病毒为适于基因治疗的重组腺病毒，该洗涤剂是浓度为0.05％(vol/vol)的吐温20，而该药学可接受的载体包含2mM MgCl2和2％蔗糖(wt/vol)，以及优选的无菌水。
其它方面包括用于稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)部分的非离子洗涤剂；用于稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-HI其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基，其任选被一个或多个羧基、脲、卤素、羟基或胺，或者被1-3个环取代，所述环可以是芳香或环烷基，还可以为杂环，且该环任选被一个或多个烷基、羟基、胺、卤素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′如上述的R；
用于稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-HI其中X为4-30，而R为(CH3)(CH2)Y-，其中Y为10-15， 其中R为CaH(2a+1)CO2-，a为10-70， 其中R为CH3，X为55，Y为29，而Z为55(普朗尼克F68)，或者R为CH3，X为98，Y为67，而Z为98(普朗尼克F127)， 其中R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚苯基，而X为9-10(TritonX-100，NP-40)，或者R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚环己基，而X为9-10(还原的Triton X-100)；用于稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-HI其中R为(CH3)(CH2)Y-，而其中X为23，而Y为12(Brij 35)，或者X为20，而Y为12(Brij 58)， 其中R为R＝C11H23CO2-(吐温20)；
上述的方法，其中该洗涤剂为聚山梨醇酯20(吐温20)，或者0.005％-0.1％(vol/vol)；药物组合物，其包含由本发明的方法制备的稳定的空气传播病毒和至少一种药学可接受的载体；包含空气传播病毒的药物组合物，其包含a)所述病毒，b)稳定有效量的本发明的非离子洗涤剂；和c)至少一种药学可接受的载体；其中该洗涤剂的浓度为0.005％-0.1％(vol/vol)。
本发明的另一方面是用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，其改进在于向该组合物中加入稳定有效量的本发明的非离子洗涤剂；包含空气传播病毒，或者优选腺病毒，和稳定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)部分的非离子洗涤剂的组合物；在其它优选的方面，这种组合物包含式I-IV的非离子洗涤剂，或者关于本发明的其它组合物所述的其它次要方面。
权利要求
1.用于稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′为如上述的R。
2.权利要求1的方法，其中所述空气传播病毒为腺病毒。
3.权利要求2的方法，其中该腺病毒为表达转基因的重组腺病毒。
4.权利要求1的方法，其中该非离子洗涤剂为Brij洗涤剂、聚山梨醇酯(吐温)洗涤剂、普朗尼克分子或类似Triton的分子。
5.权利要求1的方法，其中浓度范围为约0.005％至约0.1％(vol/vol)。
6.权利要求5的方法，其中浓度范围为约0.05％至约0.08％(vol/vol)。
7.用于稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇部分的非离子洗涤剂。
8.权利要求7的方法，其中所述空气传播病毒为腺病毒。
9.权利要求7的方法，其中所述非离子洗涤剂具有式I或式II或式III或式IV所示的结构或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′为如上述的R。
10.权利要求9的方法，其中R被一个或多个羧基、脲、卤素、羟基、氨基或1-3个环取代，所述环可以为芳香或环烷基或者还可以为杂环。
11.权利要求10的方法，其中所述1-3个环被一个或多个烷基、羟基、氨基、卤素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代。
12.权利要求9的方法，其中，在式I中，R为(CH3)(CH2)Y-，其中Y为10-15；在式II中，R为CaH(2a+1)CO2-，其中a为10-70；在式III中，R为CH3，X为55，Y为29，而Z＝55，或者R为CH3，X为98，Y为67，而Z为98；或者在式IV中，R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚苯基，而X为9-10，或者R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚环己基，而X为9-10。
13.权利要求12的方法，其中在式I中，R为(CH3)(CH2)Y-，X为23，而Y为12，或者R为(CH3)(CH2)Y-，X为20，而Y为12。
14.权利要求12的方法，其中在式II中，R为C11H23CO2-。
15.用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)部分的非离子洗涤剂。
16.用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′为如上述的R。
17.权利要求16的方法，其中所述烷基被一个或多个羧基、脲、卤素、羟基或胺，或者被1-3个环取代，所述环可以是芳香或环烷基或者还可以是杂环。
18.权利要求17的方法，其中所述1-3个环可以被一个或多个烷基、羟基、胺、卤素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代。
19.用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为(CH3)(CH2)Y-，其中Y为10-15， 其中R为CaH(2a+1)CO2-，a为10-70， 其中R为CH3，X为55，Y为29，而Z为55，或者R为CH3，X为98，Y为67，而Z为98， 其中R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚苯基，而X为9-10，或者R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚环己基，而X为9-10。
20.用于稳定包含腺病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中R为(CH3)(CH2)Y-，而其中X为23，而Y为12，或者X为20，而Y为12， 其中R为R＝C11H23CO2-。
21.用于稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′为如上述的R，浓度范围为约0.005％至约0.1％(vol/vol)。
22.权利要求21的方法，其中所述烷基被一个或多个羧基、脲、卤素、羟基或胺，或者被1-3个环取代，所述环可以是芳香或环烷基或者还可以是杂环。
23.权利要求22的方法，其中所述1-3个环可以被一个或多个烷基、羟基、胺、卤素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代。
24.用于稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为(CH3)(CH2)Y-，其中Y为10-15， 其中R为CaH(2a+1)CO2-，a为10-70， 其中R为CH3，X为55，Y为29，而Z为55，或者R为CH3，X为98，Y为67，而Z为98， 其中R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚苯基，而X为9-10，或者R′为(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A为亚环己基，而X为9-10。
25.用于稳定包含空气传播病毒的组合物的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中R为(CH3)(CH2)Y-，而其中X为23，而Y为12，或者X为20，而Y为12， 其中R为R＝C11H23CO2-。
26.用于稳定包含空气传播病毒的组合物以减少病毒量或活性的损失的方法，所述方法包括向该组合物中加入稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′为如上述的R，其中在给定的时间内，在约2-8℃、室温、37℃、-20℃或-70℃下，病毒量或活性的损失与不存在所述非离子洗涤剂时的损失相比小于约30％。
27.权利要求26的方法，其中所述损失小于约10％。
28.权利要求27的方法，其中所述损失小于约5％。
29.权利要求28的方法，其中所述损失小于约2％。
30.药物组合物，其包含空气传播病毒和稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合，以及至少一种药学可接受的载体、盐或赋形剂R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′为如上述的R。
31.权利要求30的组合物，其中所述空气传播病毒为腺病毒。
32.权利要求30的组合物，其中该非离子洗涤剂为Brij洗涤剂、聚山梨醇酯(吐温)洗涤剂、普朗尼克分子或类似Triton的分子。
33.权利要求30的组合物，其中该非离子洗涤剂存在的浓度范围为约0.005％至约0.1％(vol/vol)。
34.权利要求33的组合物，其中该浓度范围为约0.05％至约0.08％(vol/vol)。
35.权利要求34的方法，其中该浓度为约0.05％(vol/vol)。
36.药物组合物，其包含腺病毒、浓度为约0.05％(vol/vol)的吐温20和包含2mM MgCl2、2％蔗糖(wt/vol)和水的药学可接受的载体。
37.药物组合物，其包含a)腺病毒，b)稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′为如上述的R；和c)至少一种药学可接受的载体。
38.权利要求37的组合物，其中该腺病毒为重组腺病毒。
39.权利要求37的组合物，其中该腺病毒为适于基因治疗的重组腺病毒。
40.权利要求37的组合物，其中该洗涤剂存在的浓度范围为0.005％-0.1％(vol/vol)。
41.权利要求15的方法，其中所述洗涤剂存在的浓度范围为0.005％-0.1％(vol/vol)。
42.权利要求15的方法，其中该腺病毒为重组腺病毒。
43.权利要求42的方法，其中该重组腺病毒适于基因治疗。
44.药物组合物，其包含由权利要求1的方法制备的稳定腺病毒组合物和至少一种药学可接受的载体。
45.药物组合物，其包含由权利要求1的方法制备的稳定腺病毒组合物和至少一种药学可接受的载体。
46.权利要求25的方法，其中该洗涤剂为聚山梨醇酯20(吐温20)。
47.权利要求7的方法，其中该洗涤剂的浓度为0.005％-0.1％(vol/vol)。
48.药物组合物，其包含a)空气传播病毒，b)稳定有效量的式I或式II或式III或式IV的非离子洗涤剂或它们的组合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X为4-30，而R为10-70个碳原子的直链或支链烷基， 其中R为具有10-70个碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上关于R定义， 其中R如上述，而X为5-100，Y为25-75，而Z为50-100， 其中X为5-15，环A为亚苯基或亚环己基，而R′为如上述的R；和c)至少一种药学可接受的载体。
49.权利要求48的组合物，其中该洗涤剂的浓度为0.005％-0.1％(vol/vol)。
50.权利要求1的方法，其中所述烷基被一个或多个羧基、脲、卤素、羟基或胺，或者被1-3个环取代，所述环可以是芳香或环烷基或者还可以是杂环。
51.权利要求49的方法，其中所述1-3个环可以被一个或多个烷基、羟基、胺、卤素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代。
全文摘要
本发明公开了通过向组合物中加入包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)的非离子洗涤剂而稳定包含空气传播病毒，特别是腺病毒，更特别是重组腺病毒的组合物的方法。本发明还公开了包含这些洗涤剂的适于基因疗法的腺病毒，特别是重组腺病毒的药物和其它组合物。
文档编号A61K48/00GK1617745SQ03802342
公开日2005年5月18日 申请日期2003年1月15日 优先权日2002年1月18日
发明者艾尔诺·蓬戈尔, 伊丽莎白·莱姆贝格 申请人:舍林股份公司