专利名称：稳定的白蛋白制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定性极其优良的白蛋白制剂。进而详细地是涉及稳定性、安全性优良的、分馏人体血清白蛋白、基因重组人体血清白蛋白等的白蛋白制剂。
背景技术：
白蛋白制剂是对于急性低白蛋白血病和难以管理的慢性低白蛋白的疾病，通过其补充来改善病态的药剂。具体地是广泛用于改善出血性及外伤性休克时的循环血浆量的校正或浮肿、肝硬变、肾病症候群等各种疾病，是近代医疗不可缺少的医药品(PeterT.Jr.，The Plasma Proteins，Academic Press，New York，133-81(1975).，Rosenorer VM.，Rothschild MA.，Albumin Structure，Function and Uses，(1977))。
以往人体血清白蛋白制剂的制造是通过分馏从人体采取的血液，用各种的精制手段精制得到的含白蛋白水溶液而进行的。作为精制手段，已知有乙醇分馏法、PEG分馏法、硫铵分馏法、将阴离子交换体和69℃、10小时加热处理组合的方法(日本发明专利公开1990-191226号公报)、阴离子交换体处理、阳离子交换体处理和60℃、10小时加热处理组合的方法(日本发明专利公开1991-17123号公报、日本发明专利公开1995-330626号公报)等。另一方面，近年对白蛋白确立了再结合(基因重组)的大量生产技术，不用献血就可在工厂大量生产人白蛋白。(临床分子医学、1、939(1993))
在白蛋白制剂的制造(特别是分馏人体血清白蛋白的制造)中，为了除去有害而热不稳定的病毒，防止混入蛋白质等，例如使用低温杀菌法(60℃、10小时)等的杀菌方法。对于低温杀菌法，在人体血清白蛋白中加入N-乙酰基色氨酸、辛酸钠(BallouGA.，Boyer PD.，Luck JM.，Lum FG.，J.Biol.Chem.，153，589-605(1944)，Scatchard G，Strong LE.，Hughes WL.Jr.，AshWorthJN.，Sparrow AH.，J Clin.Invest.，24，571-679(1945)，Boyer PD.，Lum FG.，Ballou GA.，Luch JM.，Rice RG.，J.Biol.Chem.，162，181-198(1946))，但是，N-乙酰基色氨酸存在有脑内疾病等副作用的问题。
因此，要求开发出不混合存在病毒和夹杂蛋白质，没有副作用的危险性、安全，且经过长时间也没有外观变化和含量降低，可稳定保存的白蛋白制剂。
发明内容
在这样的背景下，本发明者们发现N-乙酰基蛋氨酸可发挥稳定白蛋白的优良效果，进而，发现通过与中链脂肪酸共存，还具有优良的抑制凝聚效果。基于这样的见解，进行各种研究的结果，完成本发明。
即，本发明涉及以下发明。
(1)稳定的白蛋白制剂，其特征是含有中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物；(2)上述1所述的白蛋白制剂，其中，中链脂肪酸是碳数6～12的直链状饱和脂肪酸；(3)上述1所述的白蛋白制剂，其中，含硫氨基酸是具有可以烷基化、也可以二硫键化的巯基的氨基酸；(4)上述1所述的白蛋白制剂，其中，含硫氨基酸衍生物是N-酰基化的含硫氨基酸衍生物；(5)上述1所述的白蛋白制剂，其中，中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物的总添加量是相对于白蛋白约为1倍到20倍摩尔量；(6)上述1所述的白蛋白制剂，其中，白蛋白是基因重组人体血清白蛋白；(7)白蛋白制剂用稳定剂，其是由中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物组成；(8)白蛋白制剂的稳定方法，其特征是混合中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物。
本发明制剂中，作为有效成分的白蛋白，可使用分馏人体血清白蛋白和基因重组人体血清白蛋白等。白蛋白制剂通常使用白蛋白含量约5重量/容量％～约25重量/容量％的溶液。作为溶解白蛋白的溶剂，可举出水(注射用水)、生理食盐水、作为医药品可给药的磷酸盐等的缓冲液等。
添加在本发明制剂的中链脂肪酸，例如可举出碳数6～12的脂肪酸、优选的是碳数6～12的直链状饱和脂肪酸。优选的具体例子可举出辛酸、壬酸、癸酸、十一碳烷酸、十二碳烷酸等。作为中链脂肪酸的盐可举出碱基盐，例如钠盐、钾盐等的碱金属盐。其中，最优选的是辛酸钠。
作为含硫氨基酸或其衍生物，可举出具有可烷基化，也可二聚体化(二硫键)的巯基(SH基)的氨基酸。含硫氨基酸可举出在1～3个分子中具有硫原子的氨基酸。其优选的具体例子，例如是半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸等。作为含硫氨基酸的衍生物，可举出N-酰基体、优选的是例如N-甲酰基、N-乙酰基、N-丙酰基、N-丁酰基等的N-(1～6的烷酰基)体、更优选的是N-乙酰基体。其中，最优选的是N-乙酰基蛋氨酸。
在本发明制剂中，中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物的总添加量，相对于白蛋白，优选的是从等摩尔量左右到20倍摩尔量。含硫氨基酸或其衍生物中链脂肪酸或其盐的添加摩尔比是0.1～10∶1、优选的是0.5～2∶1。中链脂肪酸或其盐及含硫氨基酸或其衍生物，也可分别1种或不少于2种地适宜混合使用。
本发明制剂，根据需要也可适量添加在药理上可容许的着色剂、稳定剂、防腐剂、稀释剂、pH调节剂(例如碱性氨基酸、酸性氨基酸、盐酸、醋酸、苹果酸、氢氧化钠等)、渗透压调节剂(例如氯化钠、氯化钾、葡糖酸钾、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钙、葡糖酸钙、柠檬酸等的电解质等)、表面活性剂(例如非离子性表面活性剂等)等。
本发明制剂的溶液的pH值，根据需要加入pH调节剂，调整到5～7.5左右、优选的是p6.5～7.4左右。本发明制剂，根据需要也可含有白蛋白以外的生理活性物质。例如，也可加入糖类(例如葡萄糖、果糖等的单糖类、麦芽糖等的二糖类、山梨糖醇、木糖醇等的糖醇类)。
本发明制剂可用于出血性及外伤性休克时的循环血浆量的调节和浮肿的改善、肝硬化、肾病症候群等的治疗。给药量，通常作为成人每1次白蛋白，约5g～约12.5g。本发明制剂的给药量根据病态而不同，也可分成1日1次或2～4次左右给药。
本发明制剂几乎没有副作用，是低毒性而且安全的，可用自身公知的方法对于人或哺乳动物(例如羊、马、牛等)皮下或静脉给药。
本发明制剂，可通过将中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物和白蛋白水溶液(作为医药品可给予的磷酸盐等的缓冲液、注射用水或生理食盐水等)均匀混合溶解，接着将混合溶液通过制剂处理进行制造，例如点滴制剂、注射剂等的适宜非经口给药的剂型。
作为原料使用的中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物及白蛋白，可按照公知方法或自身公知的方法进行制造。
作为保存制造的制剂的容器，例如可使用玻璃管瓶或聚丙烯、聚乙烯等的塑料容器。本发明的白蛋白制剂，可填充到上述容器等中，进行密闭、灭菌(60℃/10小时)。
本发明制剂，显示了即使进行加热灭菌处理，或者长期保存，外观变化也少，含量的变化几乎没有的优良的稳定性。
图1是表示代替实验例2的未改性聚丙烯酰胺凝胶电泳的图的代用照片。图2是表示代替实验例3的未改性聚丙烯酰胺凝胶电泳的图的代用照片。图3是表示实验例4的HPLC色谱图。图4是表示实验例5的根据氧化的HSA中的羰基含量图。
实施发明的最佳方式以下，用实施例、实验例具体地说明本发明，但不受这些的限制。
实施例1将基因重组人体血清白蛋白(以下将人体血清白蛋白简称HSA或白蛋白)溶解在生理食盐水中配制25w/v％HSA生理食盐水溶液500ml。在其中作为稳定化剂添加辛酸钠1662mg和N-乙酰基蛋氨酸1912.5mg溶解后，在50ml管瓶中各分注HSA生理食盐水溶液50ml进行密封。
实施例2将从血液分馏的HSA溶解在生理食盐水中，配制25w/v％HSA生理食盐水溶液500ml。在其中作为稳定剂添加辛酸钠1662mg和N-乙酰基蛋氨酸1912.5mg溶解后，在50ml管瓶中各分注HSA生理食盐水溶液50ml进行密封。
实验例1(1)供试药剂的配制按照Chen的方法(Chen RF，J.Biol.Chem.，242，173-181(1967))对基因重组HSA进行脱脂。进而透析后，进行冷冻干燥，用于以下的所有实验。
在HSA100μM(1/15mM磷酸缓冲液、pH7.4)中添加各种药剂，配制以下的供试药剂。
①HSA100μM溶液②HSA100μM+辛酸钠500μM的溶液③HSA100μM+N-乙酰基蛋氨酸500μM的溶液④HSA100μM+N-乙酰基蛋氨酸500μM+辛酸钠500μM的溶液(2)测定方法从这些供试药剂①～④的差示扫描热量分析(DSC)测定算出热转移温度Tm值及转移焓变化ΔHcal，从热力学观点评价稳定化效果。在热力学上，热转移温度(Tm)上升时，意味着其供试药剂的稳定性增加。另外，若转移焓变化ΔHcal增加时，表示其供试药剂的稳定性增加。
在表1中表示了供试药剂①～④的热转移温度(Tm)及转移焓变化ΔHcal的值。这些值是从HSA溶液的DSC温度记录图中解析出的。
差示扫描热量测定法(DSC法)DSC是使用MicroCal社制MC-2差示扫描热量计测定的。将测定条件表示如下。
扫描速度1K/min白蛋白浓度100μM溶剂1/15M磷酸缓冲液(pH7.4)热变性的可逆性是将初次测定后的白蛋白溶液冷却后，再加热确认的。其结果表明，若加热到85℃以下，白蛋白不引起不可逆的变性，引起可逆的热转移。得到的温度记录图是使用非线形拟合计算法(Using Origin Tmscientific plotting software)进行拟合(fitting)。其结果，使用得到的过剩热容量曲线下面积，进行如下的解析。
转移焓变化ΔHcal＝∫Cex dTCxe表示过剩热容量。
(3)结果如表1表明，添加了各种药剂的溶液，比不添加HSA溶液都增加热转移温度(Tm)。通过添加辛酸钠，白蛋白的Tm上升约7℃，显示提高了对于热的稳定性。
另外，即使单独添加N-乙酰基蛋氨酸，Tm和增加转移焓变化ΔHcal也稍微提高。
添加了辛酸钠和N-乙酰基蛋氨酸的溶液成为白蛋白更有秩序的立体结构状态，是比天然(native)状态更稳定的状态。
表1
实验例2(1)供试药剂的配制配制HSA的24μM磷酸缓冲溶液(67mM pH7.4)，向其中添加各种药剂以便配制成24、72、120μM的浓度的供试药剂①～④，研究添加药剂的浓度对于稳定化效果的影响。
①HSA24μM②HSA24μM+辛酸钠③HSA24μM+N-乙酰基蛋氨酸④HSA24μM+N-乙酰基蛋氨酸+辛酸钠(2)测定方法通过NATIVE-PAGE评价60℃/30分钟的加热灭菌的热稳定性。
NATIVE-PAGENATIVE-PAGE使用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶，按照Davis法进行。对于蛋白质的染色使用库玛基普利利安特蓝-R-250。
作为分子量标记使用下述的蛋白质。
使用α-甲状腺球蛋白(M.W.669000)、铁蛋白(M.W.443000)、乳酸脱氢酶(M.W.139850)、牛血清白蛋白(M.W.66267)、胰蛋白酶抑制剂(M.W.20110)。
(3)结果将NATIVE-PAGE的结果表示在图1中。在60℃下加热处理30分钟后，供试药剂①(不添加药剂)确认大量的凝聚物。另一方面，对于供试药剂②(含有辛酸钠)、供试药剂③(含有N-乙酰基蛋氨酸)或者供试药剂④(含有辛酸钠和N-乙酰基蛋氨酸)，确认凝聚物被抑制的效果。另外，这些对于浓度的依存性，从泳动图形表明，在加入与白蛋白等摩尔的药剂时，几乎没有看到凝聚物抑制效果，但在加入3倍量(72μM)时，看到明显的凝聚物被抑制效果，进而对于加入5倍量(120μM)时，看到显著的凝聚物被抑制的效果。
实验例3使用辛酸钠以外的中链脂肪酸，对于热的凝聚物抑制效果进行研究(图2电泳)。测定试样使用对于HAS 24μM磷酸缓冲溶液(67mM pH7.4)添加5倍量(120μM)的各种脂肪酸的。
其结果，对于比辛酸钠碳链短的己酸(C6)、庚酸(C7)，稍微看到凝聚物抑制效果，对于具有不低于辛酸钠的碳链的脂肪酸，可看到显著的抑制效果。
实验例4(1)供试药剂的配制配制HSA的24μM磷酸缓冲溶液(67mM pH7.4)，以120μM的浓度添加各种药剂的供试药剂，并按如下进行配制，对于供试药剂5ml添加2，2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(以下，称为AAPH)(1级、和光纯药制)，使其最终浓度成为10μM。
①HSA②HSA+辛酸钠③HSA+辛酸钠+N-乙酰基蛋氨酸(2)HSA的巯基型和非巯基型的存在比率的测定用高速液体色谱法(以下称HPLC)测定HSA的巯基型和非巯基型的存在比率(巯基分率)。
用于巯基分率测定的HPLC是使用在具有梯度洗脱(gradient)装置的岛津LC-4A连接岛津SPD-2ASUV检测器及岛津C-R2AX数据处理装置的，试样的洗脱是使用从(A)0.05M三醋酸缓冲液(pH7.0)到(B)含有0.5M醋酸钠的0.05M三醋酸缓冲液(pH7.0)的30分钟间的直线梯度法，流速是0.5ml/min。用UV280nm在室温下进行试样的检测。
(3)结果将供试药剂①的HSA的HPLC色谱表示在图3中。在供试药剂①中看到巯基型的减少和非巯基型的增大。
HSA的巯基型和非巯基型的存在率的变化，即使添加辛酸钠也看不到变化。可是，对于供试药剂③(并用辛酸钠和N-乙酰基蛋氨酸)，这些存在率的变化明显地被抑制，确认抗氧化效果。因此，表明没有副作用的N-乙酰基蛋氨酸作为稳定化剂是适宜的。
实验例5对于HSA加入过剩量的氧化剂2，2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)，氧化HSA。进行一定时间氧化后，测定HSA羰基含量。从氧化时间和稳定剂的种类的关系对各种稳化剂的抗氧化作用进行评价(图4)。
表示氧化程度的羰基含量是按照Climent等的方法(记载在Climent I.，Thai L.，Levine RL.，Anal.Biochem.，182，226(1989))进行测定。是以羰基显色试剂Fluoresceinamine的各蛋白质的修饰量表示。
在N-乙酰基蛋氨酸中，与不添加的供试药剂比较，观察到羰基含量的明显地减少，明显得到了抗氧化作用。
实验例6使用生理食盐水将基因重组HSA配制25w/v％的500ml溶液，作为稳定化剂添加辛酸钠1662mg和N-乙酰基蛋氨酸1912.5mg的供试药剂，在管瓶内密封50ml。另外，使用生理食盐水将另外的不含稳定剂的基因重组HSA配制成25w/v％的浓度，在管瓶内密封50ml。
在60℃30分钟的灭菌条件下将这些试样进行加热处理后，对于异物的发生进行目视确认。其结果，未添加添加剂的试样，明显地看到由于热引起的白蛋白凝聚物生成，但添加稳化剂的试样完全没有看到异物。
产业上的可利用性本发明的稳定化的白蛋白制剂，没有副作用的危险性，安全且可长期稳定地保存。对于单独使用中链脂肪酸或其盐，虽然可看到对于热稳定性的效果，但白蛋白的抗氧化作用小，另外，对于仅添加含硫氨基酸或其衍生物，没有看到对于白蛋白的热稳定性的效果。因此，通过添加中链脂肪酸或其盐及含硫氨基酸或其衍生物的两方面，可得到相乘地优良的白蛋白稳定效果。
权利要求
1.一种稳定的白蛋白制剂，其特征是含有中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的白蛋白制剂，其中，中链脂肪酸是碳数6～12的直链状饱和脂肪酸。
3.根据权利要求1所述的白蛋白制剂，其中，含硫氨基酸是具有可以烷基化、也可以二硫键化的巯基的氨基酸。
4.根据权利要求1所述的白蛋白制剂，其中，含硫氨基酸衍生物是N-酰基化的含硫氨基酸衍生物。
5.根据权利要求1所述的白蛋白制剂，其中，中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物的总添加量是相对于白蛋白，约为1倍到20倍摩尔量。
6.根据权利要求1所述的白蛋白制剂，其中，白蛋白是基因重组人体血清白蛋白。
7.一种白蛋白制剂用稳定剂，其是由中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物组成的。
8.一种白蛋白制剂的稳定方法，其特征是混合中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物。
全文摘要
本发明提供一种稳定的白蛋白制剂，其中不含有病毒和夹杂蛋白质，没有副作用的危险性，安全，而且长时间内没有外观变化和含量的下降。其稳定的白蛋白制剂是通过将中链脂肪酸或其盐和含硫氨基酸或其衍生物和白蛋白水溶液(作为医药品可给药的磷酸盐等的缓冲液、注射用水或生理食盐水等)均匀混合溶解，接着将混合溶液制作成如点滴制剂、注射剂等的适于非经口的剂型而制造，另外，涉及白蛋白制剂的稳定方法。
文档编号A61K47/18GK1638788SQ03804779
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月28日 优先权日2002年2月28日
发明者小田切优树, 甲斐俊哉, 佐藤诚 申请人:尼普洛株式会社