专利名称：纯化的细胞因子抑制因子的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及调节免疫系统的生物因子和方法。本发明具体地涉及基本上纯化的细胞因子抑制因子、其纯化的方法和使用其调节免疫系统，特别是指向减少炎症的方法。
背景技术：
生物因于，例如辅酶、辅助因子、维生素等，在生物转化过程中扮演重要的角色。通常在完整细胞中它们的生产量很少(1×10-5-1×10-60)。然而从正常细胞中确定这些生物因子的存在并随后将其分离和纯化是很困难的项目。
已经开发了超免疫的蛋并且已经显示这种蛋包含过量产生的抗体和产生如在美国专利No.6,420,337中所列出的某些生物因子。确定到底什么生物因子存在于蛋中是很困难的，而使用超免疫的方法则似乎能变得更容易些。超免疫法通过将多价的细菌抗原注射到目标动物内而实现。已经发现在这些超免疫的动物的蛋中存在的生物因子的量增加了，但是增加的量不大于一个数量级。因此，在超免疫的蛋中生物因子的小的滴度使得生物因子的定位和其后的纯化变得很困难。因而，需要有效的方法来识别、分离、纯化或另外生产这类生物因子。
细胞因子正常的免疫系统处于促炎和抗炎细胞的平衡中并且精细地调节分子以促进正常的宿主免疫防御而不破坏宿主的组织。一旦该精细调节的平衡受到扰乱，非特异的刺激和活化可导致产生和释放具有强大破坏力的免疫分子和炎症性分子的量增加。因此，过量生产促炎细胞因子或在错误的生物前后关系中细胞因子的生产与致死和广泛范围内的疾病，例如疟疾、相关败血症、风湿性关节炎、炎症性肠病、癌症和AIDS等的病理学。
细胞因子是通过结合特异的细胞受体在自分泌/旁分泌方式中起作用的多潜能多肽。它们的分泌在确定免疫应答的持续时间和强度中是重要的。例如在小鼠中，CD4+T辅助细胞(Th)克隆的不同亚型分泌传统上被称作Th1和Th2的细胞因子。Th1细胞产生白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)并促进细胞的免疫应答。Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10并且支持分泌免疫球蛋白的细胞的活化。在炎症过程中，例如IL-1β、IL-2、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞因子在炎症位点被释放。这些细胞因子具有多向性效应并能介导与炎症相关的多种症状。
关键的细胞因子，TNF-α，亦被称为恶液质素，是由157个氨基酸组成的17KD的蛋白质并且主要通过单核细胞和活性巨噬细胞产生。TNF-α已经显示具有杀肿瘤的活性和对大部分主要的器官系统具有多种生理学效应。在中枢神经系统中，TNF-α与发烧、厌食和垂体激素释放的变化有关。在心血管系统中，TNF-α在休克、急性呼吸窘迫和毛细血管渗漏综合症(前凝血)中起作用。TNF-α在肾的急性肾小管坏死和肾炎以及胃肠系统的局部缺血、结肠炎和肝坏死的过程中起作用。它也是与炎症过程有关的关键的细胞因子。
炎症的病症是经多重致病的过程发展的，其中包括一些关键的分子。例如，TNF-α、IL-1β、白细胞介素-2(IL-2)和前列腺素E2(PGE2)是炎症发展中主要的作用者。炎症可导致疾病状态，例如风湿性关节炎、脓毒性关节炎和幼发性的骨关节炎。
TNF-α主要通过T细胞应答炎症性的刺激而产生。TNF-α是炎症和免疫功能的有效旁泌性内分泌的中间物，并且它调节内皮细胞的功能。例如，可从患有活性风湿性关节炎的患者的血清和滑液中检测到高浓度的TNF-α，并且推测TNF-α在风湿性关节炎的发病机理中起主要的作用。
IL-1β涉及多种生物途径，并且是能通过只需触发每个细胞的1或2个受体而诱导其效果的显著有效的分子。作为信号剂，IL-1β在极低的浓度就有效，即使是在飞摩尔的范围内也有效。IL-1β是第一个由于诱导发烧、增强淋巴细胞应答和刺激急性阶段应答而被注意的。在对感染的应答中炎症反应的诱导主要归因于IL-1β发出的信号。
另一个T细胞衍生的细胞因子，IL～2，诱导多种细胞的生长、分化和功能性活化。例如，IL-2促进T-和B-细胞的生长和分化、通过B细胞的免疫球蛋白的分泌、NK细胞的生长和活性以及其他细胞因子的产生。IL-2也在与免疫细胞的生长和增殖相关的许多炎性过程中发挥重要的功能。
前列腺素E2(PGE2)前列腺素E2(PGE2)是在遍及体内的许多细胞中发现的″主要的前列腺素″。它是主要的花生四烯酸代谢物并且在调节血管的渗透势和与体温、疼痛、免疫抑制和炎症有关的通常病症中扮演重要角色。PGE2是慢性炎性疾病状态的炎症性途径中的主要成分。
有多种酶决定着PGE2的产生，并且几种相同的酶产生其他的前列腺素、血栓烷和炎症性的中间物。例如，PGE2分别通过环加氧酶的组成性表达的形式和可诱导的形式COX-1和COX-2而产生的。当细胞暴露于某些促细胞分裂剂(例如LPS)或细胞因子(IL-1)，提供了细胞因子信号和PGE2生产之间的联系时，COX-2是剧烈上调的。
因为TNF-α、IL-1β、IL-2和PGE2是关键的炎症性调节剂，它们在炎症发展的过程中起决定性的作用。
脂多糖(LPS)类似物各类脂多糖(LPS)类似物在体外和体内干扰细胞因子的表达。例如，固体脂类纳颗粒(SLN)与鼠的腹膜巨噬细胞孵育致使产生IL-6的浓度依赖性下降。然而，TNF-α和IL-12不受抑制。合成的脂类A类似物SDZ MRL 953防止内毒素休克和细菌感染，正如其中对20个癌症患者用剂量逐步增加的SDZ MRL 953静脉内治疗，然后静脉注射施用内毒素的研究所显示的。用脂类A类似物预处理显著地减少了TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6和G-CSF的释放，暗示了在病危的患者中用SDZ MRL 953预处理可有助于防止革兰氏阴性败血症的并发症。
LPS诱导的TNF-α的产生可在巨噬细胞和人单核细胞和原单核的U937细胞中受到抑制。单糖的脂类A类似物，例如DY-9973能抑制U937细胞中LPS-诱导的TNF-α和IL-1β mRNA的表达。相反，DY-9973不抑制U937细胞中IL-1β-诱导的TNF-α的产生。因此，例如DY-9973的单糖脂类A类似物可抑制LPS-诱导的巨噬细胞的活化并减少LPS的致死毒性。此外，早期的内毒素耐受性是通过抗LPS感染的无毒的LPS衍生物单磷酰基脂类A(MPL)而诱导的。
除脂类类似物外，抗LPS的抗体可发挥中和剂的作用，防止LPS感染。脂类A的单克隆抗体抑制脂类A和来自多种革兰氏阴性细菌的LPS在鼠的腹膜巨噬细胞中诱导TNF-α(36-67％)和IL-1(30-98％)的能力。这些MAb也抑制小鼠中脂类A诱导的TNF-α(87％)。
LPS类似物也上调细胞因子的表达。不同的脂类A类似物(DT-5461a)诱导鼠巨噬细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6和GM-CSF。此外，DT-5461a在细胞中通过转录的增强而增加多种细胞因子的产生。
超免疫的蛋鸟纲类的多个属，例如家鸡(gallus domesticus)、火鸡和鸭，在血和蛋中针对引起鸟类疾病的免疫原以及针对其他免疫原产生抗体。例如，LeBacq-Verheyden等人(Immunology 27683(974))和Leslie，G.A.等人(J.Med.1301337(1969))已经定量分析了鸡的免疫球蛋白。Polson等人(Immunological Communications9495-514(1980))用几种蛋白质和蛋白质的天然混合物免疫母鸡，并在蛋的蛋黄中检测到了IgY抗体。Fertel等人(Biochemical andBiophysical Research Communications 10210281033(1981))用前列腺素免疫母鸡并且在蛋的蛋黄中检测到了抗体。Jensenius等人(Journal of Immunological Methods 4663-68(1981))提供了分离蛋黄IgG用于免疫诊断的方法。Poison等人(Immunological Communications 9475-493(1980))描述了从用多种植物病毒免疫的母鸡的蛋黄中分离的抗体。
美国专利No.4,357,272公开了来源于超免疫母鸡的蛋的蛋黄的抗体的分离。抗体反应通过重复注射来源于植物病毒、人IgG、破伤风抗毒素、蛇抗毒血清和Serameba的免疫原而引发。
美国专利No.4,550,019公开了从蛋黄分离母鸡中产生的抗体，其中该母鸡用具有至少30,000的分子量或颗粒重量的免疫原超免疫。用于超免疫鸡的免疫原选自植物病毒、人免疫球蛋白、破伤风毒素和蛇毒。
美国专利No.4,748,018公开了被动免疫哺乳动物的方法，包括肠道外施用从已经用相应的抗原免疫的鸟类的蛋获得的纯化抗体，并且其中该哺乳动物已经获得免疫至蛋的免疫性。
美国专利No.5,772,999公开了通过给受试个体施用超免疫的蛋和/或乳或其部份来预防、阻止或减缓受试个体中慢性胃肠机能紊乱或非类固醇的抗炎药诱导的(NSAID诱导的)胃肠损害的方法。
美国专利No.6,420,337公开了从用免疫原混合物超免疫的鸟类的蛋中分离的生物因子。该生物因子已经被纯化和测序并且已经被确定能活化某些促炎的细胞因子，因此被称为细胞因子的活化因子。
欧洲专利申请No.99967649.7公开了也从用免疫原混合物超免疫的鸟类的蛋获得的抗炎组合物。该抗炎的组合物已经从蛋中部分地纯化出来并且已证明在治疗和预防炎症中是有效的。
已经有报道不饱和脂肪酸，例如ω-3和-6脂肪酸(天然存在于蛋黄中)在抗炎的过程中扮演重要角色。最近，许多研究者已经集中关注富集ω-3和-6脂肪酸的鱼油的抗炎效果。这些研究显示实际上Ω脂肪酸在关节炎的预防中是有效的。然而该研究没有阐明或提出Ω脂肪酸对促炎细胞因子或一般的细胞因子的效果的任何证明。
Ω脂肪酸的一些特性是它们部分地可溶于水，它们在210-230nm处具有最大吸光率以及由于它们的结构是长链脂肪酸，它们的熔点通常很低(-49℃至13.4℃)。
还没有文献报道蛋黄磷脂抑制促炎细胞因子和/或PGE2的合成。也没有报道蛋黄包含可以起与LPS竞争的作用而抑制促炎细胞因子和PGE2的合成的任何已知的脂多糖类似物(LPS类似物)。
本发明的关键在于本发明人发现了天然存在于蛋中并且能够抑制促炎细胞因子和PGE2合成的新因子。
发明概述本发明涉及包含基本上纯化的细胞因子抑制因子的组合物，其中细胞因子抑制因子具有小于6,000Da的分子量；天然存在于鸟类的蛋的蛋黄的脂类组分中；具有在205nm波长处的最大紫外吸光率；是非蛋白质来源的物质；具有大约39℃-42℃的熔点；以及抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1-β(IL-1β)和白细胞介素-2(IL-2)的RNA转录。
本发明进一步涉及生产纯化的细胞因子抑制因子的方法，包括从蛋黄的水溶性组分(WSF)中分离不溶于水的组分(WIF)；将该不溶于水的组分分离成中性脂类组分和极性脂类组分；通过高效液相色谱法将该极性脂类组分纯化成为细胞因子抑制因子组分。
最后，本发明涉及调节动物免疫系统的方法，包括给动物施用包含细胞因子抑制因子的组合物。
附图简述
图1是PL-100乙醇提取物的HPLC色谱。
图2是显示体外分析中LPS刺激对TNF-α和IL-β的影响的数字化图象。
图3是显示体外分析中超免疫蛋的脂类对LPS刺激的TNF-α和IL-β的抑制效果的数字化图象。
图4是显示体外研究中超免疫蛋的脂类的丙酮提取物和乙醇提取物对LPS刺激的IL-2的影响的数字化图象。
图5是显示体外分析中超免疫蛋的脂类的乙醇提取物的HPLC纯化级分对LPS刺激的TNF-α和IL-1β的影响的数字化图象。
图6显示在胶原诱导的关节炎的大鼠模型研究中超免疫蛋黄和脱脂的蛋黄对胶原诱导的关节炎的影响。
发明详述本发明一般地涉及新的细胞因子抑制因子(CIF)，包含细胞因子(CIF)的组合物和使用该组合物调节免疫系统的方法。本发明的组合物可以包括包含纯化的CIF的组合物，和/或本发明的组合物可以是包含CIF的天然食品，以及优选包括例如通过选择过程或通过浓缩级分的生产而富含CIF的天然食品或其组分。这种天然食品包括超免疫的蛋制品，包括富集CIF的超免疫的蛋制品的组分。本发明者已经发现新的CIF抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达，并且下调前列腺素E2(PGE2)的合成。因此，本发明的CIF通常通过调节这些细胞因子的表述和产生或受这些细胞因子作用的细胞而调节(即，调控)免疫系统。此外，因为TNF-α、IL-1β和IL-2一般被认为是促炎细胞因子，本发明的CIF可用于治疗其中对免疫应答和应答促炎细胞因子的细胞的抑制是所期望的病症，包括但不限于一般的关节炎，以及更具体地，变形性关节炎、脓毒性关节炎和幼发性的骨关节炎。正如所预期的，CIF在治疗和/或预防大多数炎性病症或应答中是有效的，例如大多数在TNF-α、-1β和/或IL-2的一点或另一点上涉及的这种病症或应答。
本发明的CIF是在超免疫的蛋制品中产生和/或增强的成分。所施用的优选通过注射到产蛋动物中以诱导免疫应答，并产生包含本发明的细胞因子抑制因子的超免疫蛋产品的优选免疫原混合物，并不要求包含已知通过活化特定的细胞因子或通过诱导能引发特定的细胞因子的因子的生产而调节免疫系统的特异性免疫原。因此，令人惊奇地在从用多价疫苗免疫的动物中获得的超免疫蛋产品中发现这种细胞因子的抑制因子，其中可预料到当给受试个体施用该多价疫苗时，其在免疫系统的调节中是有效的。
关于这种新的细胞因子抑制因子的某些特性已经被确定(参见实施例3)。最初，细胞因子抑制因子(CIF)位于蛋的蛋黄的脂类组分中。因为它存在于脂类组分中，因此CIF是非蛋白质来源的。通过对蛋的脂类组分的基本认识，已经确定CIF的大小为小于6000道尔顿。这些新的因子的吸光率也已经被研究并且已确定CIF的最大波长吸光率是在205nm。已发现熔点在大约39℃-42℃的范围内。最后，如上所述以及如这些应用中所描述的大量细节，CIF抑制某些细胞因子。特别地，CIF至少抑制下列促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1-β(IL-1β)和白细胞介素-2(IL-2)。最后，本发明的基本上纯化的CIF也抑制前列腺素E2(PGE2)的生物合成。
在本发明前，都不知道产蛋动物的超免疫将导致本发明的新的细胞因子抑制因子的产生，其中该细胞因子抑制因子将具有上述特性并且能够调节细胞因子的产生以及动物中免疫系统细胞的分化。就本发明者所知，在本发明前，在此所描述的细胞因子抑制因子(CIF)从未被鉴定、纯化或表征。
定义除非另有说明，下列定义贯穿适用于本申请术语″超免疫″指暴露于一种或多种免疫原(例如，抗原)使得免疫应答得到提高并且保持上述天然的来暴露状态。
术语″免疫原″指能诱导体液抗体和/或细胞介导的免疫应答而不带来免疫耐受性的物质。该术语表示能够刺激免疫应答以及与其产物例如抗体反应。
术语″组合衍生的免疫原″指经由组合合成的方式在免疫原间产生分子多样性的方法。
术语″生物工程的免疫原″指通过基因克隆技术和遗传操作或化学合成的方法获得的免疫原。
术语″基因疫苗″指一般通过重组技术生产并可引发免疫应答的核酸疫苗。
术语″蛋″或″蛋制品″各自指任何全蛋(食用的、超免疫的或相反)或由其衍生的任何产品或组分。
术语″食用蛋″或″食用蛋制品″各自指从没有保持在超免疫状态的产蛋动物获得的全蛋或由其衍生的任何产品或组分。
术语″超免疫的蛋″或″超免疫的蛋制品″各自指从蛋获得的全蛋或由全蛋衍生的任何产品或组分。
术语″细胞因子抑制因子″或″CIF″一般用来指处于纯化的任何阶段的(例如，包括作为蛋的成分、作为蛋的基本上纯的脂类级分或作为高度纯化的蛋脂类级分)并且具有在此所描述的细胞因子抑制因子的生物化学、物理、结构和/或功能性特征的本发明的生物因子。
术语″基本上纯的细胞因子抑制因子″指已经至少被纯化到实施例2中所阐述的水平的细胞因子的抑制因子。
术语″超常水平″指超过在没有保持在超免疫状态的产蛋动物的蛋中测定的水平。
术语″免疫调节的蛋″或″免疫调节的蛋制品″指包含在此所公开的细胞因子活化因子的蛋或蛋的组分。
术语″免疫应答″一般指细胞介导的应答或细胞的免疫应答(即通过包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞的免疫系统的细胞介导的免疫应答)和/或体液免疫应答(即抗体介导的免疫应答)。
术语″动物″指动物界的任何种属。优选的要根据本发明免疫的动物包括脊椎动物类、鸟纲的任何动物，其中鸟纲包括但不限于鸡、火鸡和鸭。根据本发明优选要治疗的动物包括脊椎动物类、鸟纲和哺乳纲的任何动物，其中哺乳纲包括但不限于灵长目、啮齿类、家畜和家养的宠物。家畜包括食用的或生产有用产品的哺乳动物(例如用于生产羊毛的羊)。优选被保护不遭受疾病或病症的哺乳动物包括人类、狗、猫、小鼠、大鼠、羊、牛、马和猪，特别优选人类。
术语″目标动物″指被施用免疫原性的混合物的动物。
术语″受试动物″指被施用本发明的包含CIF的组合物的动物，其中组合物包括包含纯化的CIF，或通过该目标动物生产的CIF富集的蛋或蛋制品的组合物。受试动物还可以被称为患者。
关于本发明CIF的短语″生物活性的″或″生物活性″指CIF的任何功能活性，以及一般的天然存在的CIF的功能活性。特别地，关于CIF的生物活性优选指CIF能够下调(抑制、减少、降低、遏止)包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和/或白细胞介素-2(IL-2)在内的细胞因子的表达。注意到在此所详述的天然存在的CIF可下调TNF-α、IL-1β和IL-2中每一个的表达。CIF生物活性还可包括下调(抑制、降低、遏止)前列腺素E2表达的能力。CIF的生物活性还可包括但不限于，CIF与受体、蛋白质、DNA、碳水化物组分或脂类组分结合从而导致或促进上述相同的生物活性中的一种的能力。
术语″最大波长吸收率″指对单个的波长反射能力不同的化合物在紫外线和可见光谱区对电磁辐射的吸收率。该辐射吸收是由于当低能轨道上的电子被激发到高能轨道上时辐射束能量的差减而造成的。该吸收率取决于辐射的波长和化合物的结构。最高吸收的波长是待测试化合物的最大波长吸收率。
术语″调节″或该术语的派生词，指从一种状态变化、调节或改变到另一种状态，以及包括在任何可测量的特征中可测量的或可观察到的增减，和/或从一种特征变化到另一个不同的特征。
短语″药物学上可接受的载体″指药物学上可接受的赋形剂、制剂和/或药物学上可接受的递送载体，其中该递述载体适于将本发明的组合物施用于适合的体外、来自体内或体内的位点。药物学上可接受的载体可以使本发明的组合物以任何适于使用的合适形式生产/提供，包括但不限于液体、气雾剂、胶囊、片剂、丸剂、粉剂、凝胶和颗粒剂。一些药物学上可接受的载体包括细胞、膜、脂类制剂(包括当对患者给药时原位形成固体或凝胶的液体)、抗体制剂、食品(例如任何可食用的产品或制品)和重组病毒。优选的载体也是可生物降解的(即可生物腐蚀的)。
″药物学上可接受的赋形剂″包括特运或帮助转运，但不特异地将组合物导向细胞的赋形剂或制剂(在此也指非靶向载体)。药物学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于水、磷酸盐缓冲的盐水、林格溶液、右旋糖溶液、含血清的溶液、Hank′s溶液、其他的生理平衡水溶液、油、酯和乙二醇。水性载体可包含例如通过提高化学稳定性和等渗性而要求接近受试者的生理状况的适合的辅助物质。适合的辅助物质包括例如，醋酸钠、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙及其他用于生产磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和碳酸氢盐缓冲液的物质。辅助物质还可以包括防腐剂，例如乙基汞硫代水杨酸钠或邻甲酚、甲醛溶液和苯甲醇。
″控释载体″是一类能够以控制的方式将本发明的组合物释放到患者或培养物中的药物学上可接受的载体。控释制剂包括处于控释载体中的本发明的化合物(例如CIF组合物、抗体或模拟物)。适合的控释载体包括但不限于生物相容的聚合物、其他的聚合物基质、胶囊、微囊剂、微粒、丸剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球和透过皮肤的递送系统。
″药物学上可接受的递送载体″是能够将本发明的组合物递送到靶位点的药物学上可接受的载体。优选的药物学上可接受的递送载体能够将组合物导向(即指向、有选择地递送)到靶位点。″靶位点″指患者中需要将组合物递送至此的位点。例如，靶位点可以是通过直接注入或使用人造和天然的包含脂类的递送载体(例如，脂质体)、抗体、病毒载体或其他包括核糖酶的递送载体而被靶向的任何细胞或组织。天然包含脂类的递送载体包括细胞和细胞膜。人造的包含脂类的递送载体包括脂质体和胶束。
术语″给药″指给受试个体提供物质的任何方法(例如，将物质导入受试个体)，包括活体内或活体外给药。活体内给药的方法包括但不限于，静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、冠状静脉内给药、动脉内给药(例如，导入颈动脉)、皮下给药、透过皮肤递送、气管内给药、皮下给药、关节内给药、心室内给药、吸入(例如，气雾剂)、脑部、鼻部、口部、眼部、肺部给药、导管注入、通过栓剂和直接注入到组织中。
术语″治疗效益″未必指治愈特定的疾病或病症，而是优选包括一个可以包括疾病或病症的减轻、疾病或病症的消除、与疾病或病症相关的症状的减缓、由原发病或病症的发生而引起的继发症或病症的预防或缓和，和/或疾病或病症的预防。
关于疾病或病症的术语″保护″指减少疾病的症状；减少疾病的发生，和/或降低疾病的严重度。保护患者或受试个体指当给患者服药时，本发明的组合物能够预防疾病的发生和/或治愈或减轻疾病的症状、标志或成因。因而为了保护患者不得疾病，包括预防疾病发生(预防性治疗)和治疗患病的患者(治疗性治疗)。
术语″预防″指减少和/或消除疾病的发展，或消除疾病的发作(预防性治疗)。
术语″治疗″指延迟、减少或完全预防疾病症状的发作(包括疼痛)和/或疾病的发病起源，或如果存在，该症状被改善或完全消除。例如，CIF组合物治疗关节炎，不仅是通过抑制人类和其他哺乳动物中疾病的症状，而且是通过作为预防剂抑制接受者中疾病的出现。
术语″疾病″指任何偏离哺乳动物的标准健康的状态，包括存在病征的状态，以及其中已经发生偏离(例如感染、基因突变、遗传缺陷等)但症状尚不明显的状况。
术语″一个″或″一种″实体指一个或多个实体。因而，该术语″一个″(或″一种″)，″一种或多种″和″至少一个″在此可互换。
术语″包含″、″包括″和″具有″可互换使用。
超免疫虽然优选本发明的组合物纯化自超免疫的蛋，然而也考虑该细胞因子抑制因子可纯化自食用蛋。用于使产蛋动物处于免疫增强状态，并可将从其所得到的超免疫蛋或蛋制品给受试个体服药的优选方法的详细说明在美国专利No.5,772,999中公开，该专利在此全部引入作为参考。简而言之，下列是用于使产蛋动物处于免疫增强状态，以用于纯化CIF或产生CIF-富集的食品而给受试个体服用的方法的实例。可以理解这种方法可如上所述进行改变以选择或筛选增强的CIF的生产。通常，超免疫方法包括下列步骤1.选择一种或多种抗原。
2.通过初级免疫在产蛋动物中引发免疫应答。
3.施用合适剂量抗原的增强疫苗以诱导和保持超免疫状态。
4.从保持在超免疫状态的产蛋动物收集和处理蛋以生产超免疫蛋制品。
步骤1可使用任何抗原或抗原的组合。该抗原可以是细菌的、病毒的、原生动物的、真菌的、细胞的或任何产蛋动物的免疫系统将对其作出应答的其他物质。该步骤中的关键点是该抗原必须能够在产蛋动物中诱导免疫和超免疫状态。一种优选的疫苗是被称为PL-100疫苗的多价细菌抗原的混合物。PL-100疫苗中包括的细菌列在美国专利No.5,772,999的表1中。
步骤2该疫苗可以是杀死的或活的减毒疫苗，并且可通过引发免疫应答的任何方法给药。优选通过肌肉注射施用抗原而完成免疫。鸟类中优选用于注射的肌肉是胸部肌肉。剂量优选为0.5-5毫克抗原疫苗。其他可以使用的给药方法包括静脉注射、腹膜内注射、直肠栓剂或口服。当将DNA技术用于超免疫方法时，可要求小得多的数量，一般为1-100微克。可通过免疫学领域中技术人员公知的许多方法确定该疫苗是否已经在产蛋动物中引发免疫应答。这些方法的实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、检验针对刺激性抗原的抗体存在的测试，和设计用于评估宿主的免疫细胞对抗原应答的能力的测试。通常，用疫苗免疫后出现蛋抗体表示有免疫应答。诱导免疫应答所必需的抗原的最小剂量取决于所使用的疫苗接种方法，包括所使用抗原的类型以及用作宿主的产蛋动物的类型。
步骤3超免疫状态优选以固定的时间间隔通过合适剂量的重复增强给药来诱导并保持。时间间隔优选为两星期的间隔，并持续六个月的时间。然而，增强给药必须不会导致免疫耐受性。有可能使用其他超免疫保持方法或方法的组合，像例如，用于初级免疫的肌肉注射和用于增强注射的静脉注射。其它方法包括同时施用微囊包封的抗原和液体的抗原，或者用于初级免疫的肌肉注射，和经微囊包封的方式通过口服或非肠胃给药而增强剂量。初级免疫和超免疫的几种组合是本领域的技术人员公知的。
步骤4超免疫的蛋可经过加工而施用于受试个体或用于多种方法的纯化。这些方法包括制备基本上独立包含超免疫的蛋制品的组合物(例如，在胶囊中)和将超免疫的蛋制品掺入给受试个体服用的食品中，或按照在本文别处所描述的用于细胞因子抑制因子的纯化方法。
细胞因子抑制因子的纯化本发明的细胞因子抑制因子可使用溶剂萃取和正相HPLC技术从蛋中分离和基本上纯化(参见实施例1和2)。体外细胞因子表达的研究和生物测定数据已经都示范了具有生物活性的细胞因子抑制因子的纯化。
优选地，蛋黄脂类是使用溶剂萃取从超免疫的蛋中提取的。随后通过选择性溶剂提取法从中性脂类级分中分离磷脂级分。该磷脂级分包含多重免疫调节剂，并且体外抑制例如TNF-α、IL-1β、IL-2和PGE2的促炎分子。
本发明的细胞因子抑制因子存在于在超免疫的蛋黄的磷脂级分内。该磷脂级分抑制细胞因子的mRNA，正如通过比较分析已经用细胞因子刺激剂脂多糖(LPS)处理的细胞中的mRNA转录本所显示的那样，并且该活性是由于细胞因子抑制因子的作用而引起的。
单核细胞在正常生长的状况下产生最小量的TNFα和IL-1β。然而，细胞的细胞因子mRNA的表达通过用LPS处理而被诱导至较高的水平。正如下面的实施例中所显示的，通过LPS刺激细胞增强了细胞因子的表达。增强的细胞因子的表达随后受到超免疫的蛋黄磷脂级分的抑制。从细胞中除去附加的LPS，结果是，TNFα和IL-1β的mRNA通过蛋黄磷脂级分而被从细胞中除去。因此，该磷脂级分包含至少一种细胞因子抑制因子。下面呈现的结果证明蛋黄磷脂级分不与LPS反应并且它的效果抵消了LPS对细胞因子表达的诱导作用。蛋黄磷脂级分特异性地抑制细胞因子mRNA的转录。
如下面实施例所具体阐述的，经LPS对单核细胞(人和小鼠)中促炎调节剂的诱导而检验了4种促炎调节剂TNFα、IL-1β、IL-2和PGE2。测量了细胞因子在mRNA水平上的表达以及PGE2在蛋白水平上的生产。蛋黄磷脂级分抑制了TNF-α、IL-1β、IL-2和PGE2的表达。
蛋黄磷脂级分的提取优选地，本发明的细胞因子抑制因子基本上是从超免疫的鸟类的全蛋、蛋黄或蛋黄的脂类组分纯化的。在纯化过程中，蛋黄最终经受溶剂萃取。溶剂萃取可应用于蛋黄本身或蛋黄的任何其他形式，像例如，喷雾干燥后的蛋黄。可使用不同的溶剂来达到该目的。例如己烷的非极性溶剂，对于除去蛋黄中的中性脂类或蛋黄的脂类组分是有用的。随后，例如甲醇和乙醇的极性溶剂，对提取磷脂组分是有用的。备选地，有几种溶剂适于多种提取方法，例如丙酮和氯仿。可根据方法、规模扩大和适用规则的要求和最优化来选择多种溶剂以用于纯化应用。
另一个分离和纯化本发明的细胞因子抑制因子的方法是通过超临界流体萃取法(SFE)。SFE除去来自蛋黄脂类的包含例如三酸甘油酯和胆固醇的中性脂类的中性脂类级分。中性脂类构成总的蛋黄脂类的大约70％。例如，超临界态的二氧化碳提取法可以是用于除去蛋黄的大部分胆固醇和脂肪而不破坏磷脂组分的功能的有效方法。磷脂在经二氧化碳的SFE期间不被除去，并且二氧化碳可有利于保持乳化特性。然而磷脂可通过其他溶剂例如丙烷提取。
给药在其他实施方案中，本发明的组合物可包括纯化的、重组的、化学合成的、基本上纯化的或任何其他富集形式的CIF。为了给药，任何合适形式的CIF可与任何合适的药物学上可接受的载体联合给药。根据本发明合适的药物学上可接受的载体包括如上所述的药物学上可接受的赋形剂、控释载体和药物学上可接受的递送载体。组合物可以是任何适合于递送的形式，包括但不限于液体、气雾剂、胶囊、片剂、丸剂、粉剂、凝胶和颗粒剂。尤其适合于非肠胃给药的CIF制剂包括无菌的水溶液或非水性的溶液、悬浮液或乳浊液。非水性溶剂或载体的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。
在固体剂型中，CIF蛋白质可以与例如蔗糖、乳糖或淀粉的至少一种惰性稀释剂混合。这种剂型还可以如常规所实行的包含除惰性稀释剂之外的另外物质。就胶囊、片剂和丸剂而言，剂型还可包含缓冲剂、pH-敏感的聚合物或任何其他一般在食物和药物工业中用于包封组合物的缓慢释放的胶囊包封剂(即控释载体)或任何其他的控释制剂。还可以用肠溶衣制备片剂和丸剂。
用于口服的细胞因子抑制因子的液体剂型包括药物学上可接受的乳状液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂，其中包含通常用于制药领域的惰性稀释剂。除惰性稀释剂外，组合物还可以包括润湿剂、乳化剂和悬浮剂以及甜味剂。
在一个实施方案中，组合物是食品的形式。在该实施方案的一个方面，免疫调节的蛋或其任何CIF-富集的组分被掺入到营养增补剂中。优选的制备蛋或其任何组分以掺入营养增补剂的方法包括将蛋干燥成为粉剂。尽管已知有多种干燥蛋的方法，但是喷雾干燥是优选的方法。喷雾干燥蛋的方法是本领域公知的。这种干燥的蛋粉可以仅作为普通的蛋粉被摄取，或以例如蛋白质粉末、能量构成饮料、蛋白质补充物以及任何其他营养的、运动相关产品的形式掺入饮料而被摄取。此外，蛋粉可用于烘烤混合物、能量棒、糖果、饼干等。蛋加工的其他实例包括制备煎蛋卷、温和或剧烈煮沸蛋、烘焙蛋或如果需要，蛋可以被生吃或被加工为去壳蛋。本发明的免疫调节的蛋制品的优选组分包括但不限于去壳蛋蛋黄、蛋黄粉和/或所述超免疫的蛋制品的脂类组分。
本发明的组合物可递送(即给药)给细胞培养物(例如在细胞因子分析中)或经任何合适的方法递送给患者。这种方法的选择将随所施用或递送的化合物(即，纯化的级分、蛋白质、核酸、模拟物)的类型、递送方式(即试管内、活体内、活体外)以及通过化合物或组合物的施用/递送所要达到的目的而变化。根据本发明，有效给药的方法(即以有效的方式施用组合物)包括适合的剂量参数和导致组合物递送至所需位点(即至所需细胞)和/或导致受试个体中免疫应答的调节的给药方式。优选地，本发明的组合物通过调节受试动物的免疫系统的任何方式给受试个体服药。
给药途经包括活体内、试管内和活体外的途经。活体内途径包括但不限于口部的、鼻部的、气管内注入的、吸入的、透过皮肤的、直肠的、导管注入的、经栓剂的、直接注入到组织中和非肠胃的途径。优选的非肠胃途径可包括但不限于皮下的、皮内的、静脉内的、肌肉内的和腹膜内的途径。在本发明的一个实施方案中，将本发明的包含CIF组分、蛋白质、抗体、模拟物或核酸分子的组合物，经非肠胃的途径给药。静脉内的、腹膜内的、皮内的、皮下的和肌肉内的给药可使用本领域标准的方法进行。气雾剂(吸入)递送也可以使用本领域标准的方法进行(参见，例如，Stribling等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA18911277-11281，1992，它在此全部引入作为参考)。在另一个实施方案中，本发明的包括CIF组分的组合物是口服给药。口部的递送可通过将本发明的组合物复合到能够在动物肠道内经受消化酶降解的载体上进行。已注意到本发明的CIF组分是特别耐消化酶的，因此上述的载体也许无关轻重。上述载体的实例包括例如本领域已知的塑料胶囊或片剂。上述途径可包括使用如上所述的药物学上可接受的载体。活体外指在患者体外完成部分调控步骤，例如通过用包括编码根据本发明的蛋白质的该酸序列的重组分子在一定条件下转染从患者中移出的细胞群，以使得重组分子随后被转染的细胞表达，并且将该转染细胞返回到患者中。将组合物在试管内和活体外施用于宿主细胞的培养物的途径可通过包括但不限于转染、转化、电穿孔、微注射、脂质转染法、吸附法、原生质体融合、使用蛋白质载体剂、使用离子载体剂、使用细胞渗透化的去污剂以及将化合物在培养物中与靶细胞简单混合(例如，结合)的方法而进行。
在一个实施方案中，对本发明的免疫调节的蛋或其级分进行处理以生产超免疫的蛋产品，该产品随后被施用于受试动物。在一个实施方案中，通过直接将蛋或其任何衍生物喂饲给受试动物而进行给药。重要的是注意到蛋是无毒且安全的天然食品成分。类似地，另一个实施方案中，优选以随后可施用于动物的方式制备(例如配制)基本上纯化的细胞因子抑制因子。
当调节免疫系统时，本发明的组合物优选在抑制细胞因子(即，TNF-α、IL-1β、IL2和/或PGE2)表达，优选细胞因子的抑制和免疫的调节中，以免疫有效的量被施用于受试个体。治疗的持续时间和强度将取决于特定的受试个体和受试个体的病况，以及它是否存在以及如果存在，受试个体中病症的进展。该组合物也以任何能治疗和/或预防病症和病症的症状的量提供。
例如，在施用免疫调节的蛋或由其生产的产品的情况下，每日的量的范围是少于一个到几个完整的超免疫的蛋(或超免疫的蛋制品，其中包含相当于小于一个到几个完整的超免疫的蛋)，可根据病症的特定状况给受试个体施用。更多有效的级分可通过在此所描述的方法以及本领域已知的其他方法分离和浓缩。关于对受试个体施用免疫调节的蛋或蛋产品，已经确定给予受试个体的超免疫蛋或蛋产品的优选剂量范围是每千克受试个体的重量100毫克-10克。
关于本发明的分离的细胞因子抑制因子，包括基本上纯化的CIF、重组的CIF和/或化学合成的CIF，已经确定基本上纯化的组合物的剂量范围是每千克受试个体的重量1纳克-400毫克。在优选的实施方案中，优选的剂量范围是每千克受试个体的重量大约0.01微克-100毫克。在另一个实施方案中，蛋白质或抗体的给药量是每千克患者的体重大约0.1∶g-大约10mg，以及更优选是每千克患者的体重大约0.1∶g-大约100∶g。
对本领域的技术人员显而易见的是，给患者用药的剂量取决于给药的目的(例如，炎症状况的程度和个别患者对治疗的反应)。因此，合适的剂量数包括需要在动物中调节免疫应答或预期可通过下调促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-2)和/或通过下调PGE2而治疗或预防的调节疾病或病症所需要的任何数量都在本发明的范围内。在活体内有效的剂量参数可使用本领域的标准方法确定。这类方法包括例如确定存活率、副作用(即毒性)、确定细胞的和体液的免疫应答效果、和/或对与该免疫应答效果相关的状况的影响。
本发明的一个实施方案提供用于在动物中调节免疫应答的方法。该实施方案包括对动物施用如上所述的包含本发明的基本上纯化的细胞因子抑制因子的组合物的步骤。在优选的实施方案中，该组合物包含如上所述的药物学上可接受的载体。在该实施方案中，本发明的组合物可用作免疫系统的局部或全身的刺激物。它也可预防和/或治疗局部和全身的细菌感染并且可用作一般的抗癌剂。它还可以用特异的递送试剂如组织特异性抗体标记，以便通过静脉途径递送到细菌感染或肿瘤形成的特异性位点。它还可以与商业上可得到的特异的脂质体或递送载体混合，以便通过细胞的细胞质和核膜递送从而促进在RNA水平上对TNF-α、IL-1β和/或IL-6表达的抑制。给药的合适方式，包括优选的途径和剂量如上所述。优选地，以通过增加TNF-α、IL-1β、IL-2和/或PGE2的表达而适于调节免疫应答的途径和剂量给动物施用本发明的组合物。
本发明的优越特性可通过参考下列举例说明本发明的实施例而现察到。这些实施例是为说明的目的提供的，而并不意味着限制本发明的范围。
实施例实施例1PL-100蛋黄脂类的分级分离使用通过将冰醋酸(0.44ml)、醋酸钠(3.06g)和氯化钠(5.26g)溶解于1,300ml超纯水中而制备的缓冲液将PL-100蛋脱脂。该缓冲液具有大约5.0的pH值。将蛋物质(100g喷雾干燥的蛋或200ml带壳的蛋)加入该缓冲液中并且通过在室温下于24,000rpm混合5分钟而进一步将该蛋混合物均质化。将均质化的蛋混合物于4℃搅拌4小时以提供最大的溶解度。将辛酸(15ml)加入该蛋混合物中并且通过在室温下于24,000rpm混合3分钟而均质化。然后于室温放置该蛋混合物2小时，以供分离阶段用。然后将絮凝物和泡沫与水相混合并且在室温下于2,190×g离心10分钟。使用40微米孔率的滤纸过滤上清液，将该滤液冷冻干燥。收集包含脂类和不溶于水的蛋白的颗粒用于进一步的脂类提取。该组分称为水不溶性的组分(WIF)。
蛋脂类可从水不溶性的部份(WIF)通过上述酸提取法，或从作为源材料的去壳蛋蛋黄提取。为了蛋脂类的溶剂萃取，将800克的液体蛋黄或WIF颗粒与1,000ml丙酮在密封瓶中混合。通过3次用丙酮剧烈混合或于24,000rpm混合3分钟而提取中性脂类，例如三酸甘油酯和胆固醇。该丙酮提取物通过40微米的Whatman折叠滤纸过滤。将不溶于丙酮的残余颗粒/滤纸上的丙酮提取物残余物进一步与1,000ml甲醇混合，萃取极性脂类和细胞因子抑制因子三次，每次3分钟。通过在5磅/平方英寸(PSI)的减压下于50℃使用旋转蒸发器蒸发而除去甲醇。提取物中痕量的甲醇和水通过冻干法被除去。干燥的甲醇提取物以黄色糊剂贮存于-20℃。为了进一步的使用，该甲醇提取物部份可溶于甲醇、乙醇、二氯甲烷和氯仿并且部分地溶于水。备选地，可用乙醇替代根据上述方法提取蛋脂类中的甲醇。
蛋的成分可根据各种溶剂中的溶解度而得到分离。蛋黄包含大约62％的脂类和30％的蛋白质。在脂类组分中，大部分为甘油三酯的中性脂类是总脂类中的重要组分，构成总脂类的大约65％。中性脂类是非极性的并高度可溶于烃熔剂例如己烷或苯。然而它们在多数极性溶剂中是完全不溶的。
相反，磷脂构成总脂类的大约30％或全部蛋黄质量的18％。磷脂作为磷酸酯化的胆碱或乙醇胺分子的结果产物是很有极性的，并因此容易地通过极性溶剂例如甲醇和乙醇而被提取。
在液体蛋黄和干蛋黄粉中通过溶剂萃取的磷脂提取物的产率是蛋黄质量的大约10％(参见表1)。一些磷脂被提取而一些则在丙酮提取过程中被丢弃，因为丙酮具有适度的极性，而且它可提取一部分含有中性脂类的磷脂。磷脂的产率可使用非极性溶剂例如己烷以提取中性脂类而得以增加。
表1.蛋磷脂的甲醇提取蛋黄1磷脂的产率(％)2PL-100喷雾干燥的完整蛋 3.3PL-100喷雾干燥的蛋黄8.0SPAFAS3喷雾干燥的蛋黄 10.4PL-100带壳的完整蛋 4.8PL-100带壳蛋的蛋黄 12.41全蛋和蛋黄分别包含34％和51％的干重。
2带壳蛋的甲醇提取物的产率用全部带壳蛋的干重计算。
3SPAFAS蛋是未免疫的蛋。
实施例2HPLC纯化来自实施例1中所描述的提取方法中的极性或磷脂提取物，可使用正相的HPLC被进一步纯化为CIF级分。HPLC色谱(参见图1)显示磷脂级分的5个组分。在这5个组分中，2个组分在体外特别有效地抑制TNF-α和IL-1β的表达。
HPLC分离在正相的HPLC柱(25×2.12cm Zorbax PRO 1/150CN)上，于Americhrome HPLC系统中进行。使用4种溶剂进行分离溶剂A是99.50％的庚烷加0.05％的乙醇；溶剂B是94％的庚烷加6％的乙醇；溶剂C是90％的庚烷加10％的乙醇；以及溶剂D是100％的乙醇。
为了分离，将大约4.0-4.5克的磷脂提取物溶于150ml的溶剂A，并且经0.2μm孔率的薄膜过滤以除去不溶的物质。获得澄清的黄色溶液。
然后使用HPLC将该澄清黄色溶液分离。柱上的多级梯度是溶剂A(0-2分钟)、溶剂B(2.01-18.0分钟)、溶剂C(18.01-30.0分钟)、溶剂D(30.01-40.0分钟)以及溶剂A(40.01-60.0分钟)。由此收集如图1所示的5个馏分。检测波长是254nm，并且馏分1(F1)和5(F5)显示最高的检测读取。经过多次注入而进行HPLC分离，并收集馏分库。溶剂通过使用旋转蒸发器蒸发而除去。
所述的HPLC分离提高了细胞因子抑制因子(CIF)的纯度。每一馏分具有不同强度的黄色。如图1中的色谱所显示的，磷脂组分中的大部分物质被分离成馏分1(F1)和5(F5)，而馏分2-4(F2、F3和F4)是更加高度纯化的物质。
实施例3细胞因子抑制因子的表征基本纯化到上述实施例2中阐明的水平的细胞因子抑制因子(CIF)，被进一步表征以确定特异性的特性。简而言之，进行下列基础研究并确定相关的特征。
基本上纯化的细胞因子抑制因子的最大波长通过装有ShimadzuHPLC二极管阵列检波器的分光光度计测量，并且确定为205nm。
基本上纯化的细胞因子抑制因子(CIF)的熔点通过将冷的CIF放入不断增温的温水浴中以视觉观察而测量，并且确定为在39℃-42℃的范围内。
基本上纯化的CIF的分子量根据现有的研究数据而估算。本领域中已知蛋黄的磷脂部份中的大部分化合物是小分子(200-6,000道尔顿)。
基本上纯化的CIF部份的溶解度通过在室温下将100mg的CIF加入1.0ml的溶剂而测量。溶解度通过视觉观察而验证。
最终确定CIF不可能是蛋白质，因为蛋白质不溶于甲醇、乙醇和/或氯仿。
实施例4试管内细胞因子的抑制细胞因子抑制分析是通过培养人单核细胞THP1，随后通过RT-PCR方法测量细胞因子mRNA的表达而进行的。整个分析包括4个步骤细胞因子抑制、RNA提取、cDNA合成和PCR反应。
体外细胞因子的抑制为了进行细胞因子抑制分析，以大约1×105个细胞的浓度将THP1细胞培养在含有LPS(通常为0.2μg/ml)的10mLRPMI 1640培养基中以诱导细胞中的细胞因子。同时也将细胞与蛋黄脂类级分(5μg/ml)于37℃培养4小时。收获细胞并且与750ml的Trizol(GIBCO BRL)混合。
RNA的提取将该细胞混合物在室温下孵育10分钟后，加入250μl氯仿并且进一步用手剧烈摇动混合物20秒。将该混合物在室温下放置10分钟并且于12,000×g离心5分钟。小心地将上部的澄清水层移入新的微离心管中，并且加入500μl的异丙醇。将RNA混合物在室温下孵育10分钟后在室温下于12,000×g离心。将包含RNA的沉淀颗粒用1.0ml冷的70％的乙醇洗涤，并随后在室温下于12,000×g离心5分钟。将RNA溶于40μl的无菌蒸馏水(无RNase)，通过温和地涡旋混合，并且将盖子打开于65℃孵育以蒸发除去剩余的70％乙醇。通过将1.0μl加载到1×TBE电泳缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上，以用Hind III酶消化的λDNA作为标准RNA来检验RNA的质量。最终，使用含10μl金色核酸凝胶染色剂(分子探针)的100mL 1×TBE缓冲液染色将RNA20分钟并且在紫外线下显现凝胶。
CDNA的合成将10μl的RNA样品和1.0μl的Oligo dT引物加入PCR试管。于65℃孵育RNA10分钟，然后在室温下于PCR仪中孵育2分钟。离心PCR试管以使样品旋转至底部并且将8μl的主要混合物加入试管。主要混合物包含1.0μl的核糖核酸酶抑制剂、4μl的5×RT缓冲液、1.0μl 100mM的dNTPs、1.0μl 80mM的焦磷酸钠和1.0μl的AMV逆转录酶。在PCR仪中于42℃孵育试管1小时，然后于95℃孵育2分钟。在简短的旋转试管后，加入1.0μl 0.5M的EDTA，pH8.0和20μl的酚-氯仿，并且样品通过涡旋混合，然后旋转2-3分钟。上部的水层被移入新的试管(大约18μl)，加入20μl乙酸铵和125μl异丙醇。通过涡旋10秒来搅拌样品并且在干冰/乙醇浆(-20℃)中孵育1小时。通过将该试管在室温下于12,000×g旋转10分钟，弃去上清液并且用1ml 70％的乙醇洗涤沉淀颗粒。在室温下于12,000×g旋转RNA混合物5分钟，并且除去乙醇。
PCR反应开始使用GAPDH引物以确保cDNA水平在所有的样品中是相同的。100μl PCR反应混合物包含10×PCR缓冲液(Gibco BRL，无MgCl2)、2.5μM dNTP(Gibco BRL)、3.0μl MgCl2、2.0ml每种细胞因子的引物组、1.0μl Taq DNA聚合酶和63μl无菌的PCR水(Gibco BRL)。将1.0μl的cDNA和4.0μl的无菌蒸馏水加入各个PCR试管。PCR反应按照标准程序设置。
一旦PCR完成，就向各个试管加入50μl的氯仿。将在盖子紧闭的情况下涡旋并且于12,000×g离心1分钟。将上面的水层转移到新标记的试管中。此后，取15μl的各个样品加样到在1×TBE电泳缓冲液中的1.5％琼脂糖凝胶中，让细胞因子DNA在凝胶中泳动，以100bp的标准梯作为对照。使用含10μl金色核酸凝胶染色剂的100ml 1×TBE缓冲液(分子探针)将凝胶染色20分钟并且在紫外线检测器下目测。
结果LPS刺激人单核细胞产生TNFα和IL-1β(6)。该结果对我们的研究是恒定的。LPS诱导THP1细胞表达两个细胞因子(图2)。TNFα的最大诱导量是约0.2mg/ml培养基。在培养基中高浓度的LPS与低浓度的LPS一样显示弱的诱导。LPS能在极低的浓度(0.008mg/ml)下诱导IL-1β，表明IL-1β是对LPS诱导应答更敏感的细胞因子。
通过使用LPS诱导分析，确定人单核细胞中TNFα、IL-1β和IL-2的表达受蛋黄磷脂部份的抑制。当细胞与0.2mg/ml的LPS和蛋黄磷脂部份一起孵育时，细胞的TNFα和IL-1β显示完全被抑制(图3)。细胞因子的抑制也通过改良的用以证实受蛋黄磷脂部份的特异性抑制的测定而确定。在该测定中，细胞与0.2mg/ml的LPS一起孵育以诱导TNFα和IL-1β。孵育2小时后，通过洗涤细胞而除去培养基中的LPS。然后将细胞与蛋黄磷脂部份再孵育2小时。一致地，TNFα和IL-1β都完全地受到抑制。相反，细胞与LPS孵育2小时但未添加蛋黄磷脂部份则显示TNFα和IL-1β的高度表达。
实施例5IL-2的抑制还发现另一个促炎细胞因子IL-2受到蛋黄脂类部份的抑制。IL-2受到丙酮提取物和乙醇提取物部分地抑制(图4)。由于中性脂类的不纯组合物，丙酮提取物可在溶剂萃取期间与磷脂部份的某些部分混合。通过相同的测定，蛋黄磷脂部份不显示对细胞中IL-6、IL-12和TGFβ的表达有任何影响。
实施例6PGE2生物合成的抑制在小鼠单核细胞巨噬细胞中蛋黄脂类部份对PGE2生物合成的抑制效果。
实验许多细胞类型能够同时表达COX-1和COX-2；其它的表达其中一个。用于这些分析的RAW 264.7细胞表达环加氧酶的两个同工型(在我们的实验室通过免疫荧光分析证明)。该分析从RAW 264.7单层细胞经由促有丝分裂的(LpS)刺激COX-2的诱导过夜开始。然后将单细胞层在37℃暴露于测试制品(例如吲哚美辛)30分钟，并随后给该体系提供外源的花生四烯酸。COX1和COX2(以及PGE2特异性合成酶)将外源的花生四烯酸转化为PGE2。然后通过商品化的EIA系统将培养基中的前列腺素E2定量。当从包含测试制品的培养基中回收的PGE2比从单独的培养基中回收的PGE2少时，该状况是标记的抑制。还不能推导存在于这些分析中的PGE2生物合成抑制的特定机制，并且需要进一步的研究。
分析方法将5×106的细胞接种在DMEM培养基中并在37℃，5％CO2的恒温箱中培养过夜。在第1天接种的细胞生长大约24小时后(通常铺满90-100％)；以无菌方式轻轻滗出生长培养基并且弃去。用移液管将10ml无菌的PBSA相对于非生长面温和地转移到培养瓶中；并且洗涤细胞两次。将包含LPS(2ng/ml)的10ml DMEM加入测试的培养瓶中。培养瓶被置于37℃，5％CO2的恒温箱中16小时过夜。
在开始暴露于LPS后16小时，无菌地除去生长培养基(抽吸)并且丢弃。用移液管将10ml无菌的PBSA相对于非生长面温和地吸入培养瓶中；并且洗涤细胞两次。在存在2ml PBSA、2ml阳性对照药或2ml蛋黄脂类样品(1.0mg/ml)时于37℃培养细胞。培养30分钟后，向每个培养瓶中加入222μl 300μM的花生四烯酸。在存在30μM的花生四烯酸时于37℃再培养细胞15分钟。培养15分钟后，向培养瓶的内容物中加入50μl 1mg/ml的吲哚美辛以终止反应。将培养瓶中的所有液体收集到适当标记的聚丙烯试管中。
用商品化的ELISA试剂盒(Amersham RPN222)在室温下按照标准方法分析前列腺素E2。
结果在该模型中PGE2的生物合成受到各种NSAID，例如吲哚美辛、阿斯匹林和布洛芬的抑制(数据未显示)。已有报道3种NSAID是对COX-1和COX-2酶的非选择性的抑制剂。它们被认为是非特异性的药，并且在大多数情况下，它们在临床用于治疗病人时产生副作用。
在我们的研究中，细胞中PGE2的生物合成受到蛋黄部份不同水平的抑制(表2)。在原料中，蛋黄被证明对PGE2的生物合成的抑制作用比全蛋更强。然而蛋黄和全蛋的抑制效力与脂类部份相比是相对较低的(平均17％)。蛋黄脂类的丙酮提取物和甲醇提取物分别将PGE2的生物合成抑制到31％和54％。相反，两个蛋白质浓缩的级分水溶性的蛋白质(滤液)和不溶于水的蛋白质(残留物)显示对细胞中的PGE2生物合成没有抑制作用。提示蛋黄对PGE2生物合成的活性抑制剂位于磷脂组分，并且有可能该活性成分是不溶于水的非肽类分子。这些分子可能是与抑制细胞因子表达的活性成分不同的独特分子。表明蛋黄磷脂部份具有抑制不同促炎分子的多重调节剂。
表2.试管内PL-100蛋的组分对PGE2生物合成的抑制喷雾干燥的 新鲜的组分 全蛋 蛋黄 全蛋 蛋黄平均开始的蛋 -3 30 21 18 17滤液 -5 -2 13 -6 0丙酮提取物16 82 -19 43 31MeOH提取物48 61 55 52 54残留物-11 12 -21 0 -61.n＝52.数字表示了试管内PGE2生物合成的抑制％。
3.在测试的细胞培养物中蛋组分的浓度是1.0mg/ml培养基。
实施例7胶原诱导的关节炎模型在大鼠胶原诱导的关节炎模型中PL-100蛋黄的抗炎效果的测定。
实验在大鼠中诱导和评估胶原诱导的关节炎的方法根据Trentham等人于1977(8)发展的方法。在大鼠中在启动类型II的胶原诱导的关节炎前和在诱导16天后，将PL-100蛋黄和脱脂部份给大鼠喂饲7天。从Charles River-VAF+获得总共30个Sprague-Dawley(VAF+)，6-8周年龄(约125g)的雌性大鼠。测试3组大鼠(每组10个大鼠)。它们的对照为(水强饲法)、3.5ml 5％的蛋黄溶液和3.5ml 5％的脱脂蛋黄部份。用样品隔日填喂大鼠。第二天将溶液储存于4℃直到使用。2天后，弃去多余的溶液。在皮内免疫后的第10天开始并且在此后的每日直到21天，临床评价大鼠(盲性地)的爪红斑(0-4+)和爪肿胀(0-4+)。在第21天，杀死所有的大鼠并放血。
结果超免疫的蛋黄抑制胶原诱导的关节炎模型中测试大鼠大约40％的爪红斑和爪肿胀(图6)。与蛋黄部份相比，脱脂蛋黄和对照样品显示对产生的损伤无效。即使在显示对炎症抑制的特异性作用的测试研究中缺乏蛋黄脂类组的实验，然而间接的结果也表明蛋黄磷脂部份包含消炎成分。
尽管在此参考具体的实施方案例证和描述了本发明，但是本发明不只局限于所显示的详细说明。更确切的，可在权利要求的范围及其等同的范围内以及在不背离本发明的情况下在细节上进行各种改变。
权利要求
1.包含基本上纯化的细胞因子抑制因子的组合物，其中该细胞因子抑制因子a)具有小于6,000Da的分子量；b)天然存在于鸟类蛋蛋黄的脂类组分中；c)在205nm处具有最大波长吸光率；d)是非蛋白质来源的物质；e)具有约39℃-42℃的熔点；和f)抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1-β(IL-1β)和白细胞介素-2(IL-2)的RNA转录。
2.权利要求1的组合物，其中所述的细胞因子抑制因子可溶于选自氯仿、乙醇和甲醇的溶剂中.
3.权利要求1的组合物，其中100mg的细胞因子抑制因子可溶解于1.0毫升的溶剂中。
4.权利要求1的组合物，其中所述的细胞因子抑制因子不溶于选自丙酮、DMSO、己烷、乙醚、植物油和水的溶剂中。
5.权利要求1的组合物，其中所述的细胞因子抑制因子抑制前列腺素E2(PGE2)的生物合成。
6.权利要求1的组合物，其中所述的细胞因子抑制因子在治疗关节炎中具有抗炎效果。
7.权利要求1的组合物，其中所述的组合物包含药物学上可接受的载体。
8.权利要求7的组合物，其中所述的药物学上可接受的载体选自水、磷酸盐缓冲的盐水溶液、林格溶液、右旋糖溶液、含血清的溶液、Hank’s溶液、其他生理平衡的水溶液、油、酯、乙二醇、生物相容的聚合物、聚合物基质、胶囊、微胶囊、微颗粒、丸剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球、细胞和细胞膜。
9.权利要求7的组合物，其中所述的药物学上可接受的载体是被选择用于富集所述的细胞因子抑制因子的超免疫的蛋的产物。
10.权利要求7的组合物，其中所述的药物学上可接受的载体是用至少一部分超免疫的蛋的产物生产的食品制品，其中与所述的超免疫的蛋的产物相比，所述的部份包含富集数量的所述细胞因子抑制因子。
11.权利要求7的组合物，其中所述的药物学上可接受的载体包含一部分超免疫的蛋的产物，其中与所述的超免疫的蛋的产物相比，所述的部分包含富集数量的所述细胞因子抑制因子。
12.权利要求11的组合物，其中所述的部份选自液体蛋黄、蛋黄粉和所述的超免疫的蛋的产物的水溶性组分。
13.权利要求7的组合物，其中所述的组合物以选自下列的剂型存在液体、气溶胶、胶囊、片剂、丸剂、粉剂、凝胶和颗粒剂。
14.权利要求7的组合物，其中所述的药物学上可接受的载体包括控释制剂。
15.通过包括下列步骤的方法生产的纯化的细胞因子抑制因子a)从蛋黄的水溶性组分(WSF)中分离不溶于水的部份(WIF)；b)将该不溶于水的组分分离成中性脂类级分和极性脂类级分；c)通过高效液相色谱将所述的极性脂类级分纯化成细胞因子抑制因子级分。
16.权利要求15的纯化的细胞因子抑制因子，其中在步骤b)中使用选自丙酮和己烷的有机溶剂提取中性脂类级分。
17.权利要求15的纯化的细胞因子抑制因子，其中在步骤b)中使用选自乙醇、氯仿和甲醇的有机溶剂提取极性脂类级分。
18.从包含蛋黄和蛋白的鸟类蛋中纯化细胞因子抑制因子的方法，该方法包括a)将所述的蛋分离成不溶于水的组分(WIF)和水溶性的组分(WSF)；b)从不溶于水的组分中提取极性脂类级分和；c)通过高效液相色谱将极性脂类级分纯化成细胞因子抑制因子组分。
19.权利要求18的方法，进一步包括从蛋的不溶于水的组分中提取中性脂类级分。
20.权利要求18的方法，其中步骤b)是通过超临界流体萃取进行的。
21.权利要求18的方法，它进一步包括从所述的蛋白分离蛋黄，其中在步骤a)中，将蛋黄分离成不溶于水的组分(WIF)和水溶性的组分(WSF)。
22.抑制动物中细胞因子表达的方法，包括对动物施用权利要求1的组合物。
23.权利要求22的方法，其中所述的细胞因子包括选自肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1-β(IL-1β)和白细胞介素-2(IL-2)的促炎细胞因子。
24.权利要求22的方法，其中所述的组合物包含药物学上可接受的载体。
25.权利要求24的方法，其中所述的药物学上可接受的载体选自水、磷酸盐缓冲的盐水溶液、林格溶液、右旋糖溶液、含血清溶液、Hank′s溶液、其他生理平衡水溶液、油、酯、乙二醇、生物相容的聚合物、聚合物基质、胶囊、微胶囊、微粒、丸剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球、细胞和细胞膜。
26.权利要求22的方法，其中所述的组合物通过选自口服、静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、皮下给药、透过皮肤输送、气管内给药、吸入、导管注入、通过栓剂和直接注入组织的途径给药。
27.权利要求22的方法，其中所述的组合物是以每千克所述动物的体重大约1纳克到约400毫克的所述细胞因子抑制因子的剂量给药的。
28.权利要求22的方法，其中施用所述的组合物，通过所述动物的细胞抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)或白细胞介素-6的表达。
29.权利要求22的方法，其中施用所述的组合物，通过所述动物的细胞下调前列腺素E2(PGE2)的合成。
30.权利要求22的方法，其中所述的动物是哺乳动物。
31.调节动物的免疫系统的方法，包括给动物施用包含细胞因子抑制因子的组合物，其中该细胞因子抑制因子a)具有小于6,000Da的分子量；b)天然存在于鸟类蛋的蛋黄的脂类组分中；c)在205nm处具有最大波长吸光率；d)是非蛋白质来源的物质；e)具有大约39℃-42℃的熔点；和f)抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1-β(IL-1β)和白细胞介素-2(IL-2)的RNA转录。
32.权利要求31的方法，其中所述的组合物是通过选自口服、静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、皮下给药、透过皮肤输送、气管内给药、吸入、导管注入、通过栓剂和直接注入组织的途径给药的。
33.权利要求31的方法，其中所述的组合物包括包含所述细胞因子抑制因子的食品。
34.权利要求31的方法，其中施用所述的组合物产生选自减少关节炎症状、减少与关节炎相关的炎症和防止关节炎的结果。
全文摘要
公开了包含具有某些特性的基本上纯的细胞因子抑制因子(CIF)的组合物，这些特性包括抑制促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF－α)、白细胞介素1－β(IL－1β)和白细胞介素－2(IL－2)的RNA转录的能力。也公开了基本上纯化的细胞因子抑制因子的方法和使用该组合物调节动物的免疫系统的方法。
文档编号A61K35/54GK1642562SQ03807137
公开日2005年7月20日 申请日期2003年2月11日 优先权日2002年2月11日
发明者S·耶尔, W·L·约翰逊, L·阮, S·C·罗斯, R·邢 申请人:阿基昂生命科学有限责任公司