专利名称：免疫佐剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫佐剂。
背景技术：
结核菌素很久以来一直被用作检测结核菌感染史的试剂，或是作为牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG(以下称为BCG)给药后的转阳检查用试剂。有报告证实，如果使用结核菌素中的蛋白成分经硫酸铵沉淀法精制后所得到的精制结核菌素，即使将其对人体反复给药，在结核菌素皮肤试验中虽然多少总会显示出一些增强效应(Singh，D.etal.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.2001，Sep 15；164(6)962-4)，但却不至于发生过激的皮肤炎症反应，是极为安全的。
本发明者们发现，将已经固体化或微粒化的肿瘤组织与至少一种细胞因子或与细胞因子诱导剂一起进行体内给药，就能够有效地诱导针对肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应(PCT/JP00/00692)。在这同时还发现，将精制结核菌素作为常规免疫佐剂在保持可溶状态下一起给药，可以诱导产生更为强烈的针对肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应(PCT/JP00/0692)。故此，结核菌素的成分也可以用作免疫佐剂，但缺点是由于结核菌素成分为可溶性物质，所以它会扩散而从给药部位迅速消失。
另外有报告指出，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)培养过滤液中的成分在溶解状态下只有微弱的佐剂活性，但通过与聚苯乙烯键合可以激活T细胞反应(Wilkinson，K.A.，et al.，J.Immunol.Methods，2351-9，2000)。就是说，如果将溶解状态下的佐剂固定在不溶性佐剂载体上，那么它就不会快速扩散消失，显示出强的佐剂活性。当然，由于此固定化物中的聚苯乙烯微粒虽然被抗原提呈细胞吞噬，但是在细胞内不分解而还继续留在体内，所以成为机体所不希望的塑料。
作为解决上述问题的办法，上述文献中也引用了使细菌的培养过滤液中的成分与生物降解性合成高分子的微粒键合的方法(Vordermeier，H.M.，et al.，Vaccine，13，1576-1582，1995；Ertl，H.C.，et al.，Vaccine，14，879-885，1996；Jones D.H.，et al.，J.Biotechnology，44，29-36，1996；Venkataprasad，N.，et al.，Vaccine，17，1814-1819，1999)。但是，文中所记载的合成高分子聚(DL-丙交酯-共乙交酯)(PLG)分解时产生乳酸，造成分解部位环境酸化，也是机体所不希望发生的情况。
如上所述，就肿瘤免疫学领域而言，人们希望得到的是固体状、具有生物降解性且没有上述所不希望发生的作用的佐剂。而就现有技术而言，如果先使含有复杂多样的肿瘤抗原的肿瘤组织或肿瘤细胞在同型动物个体体内进行物理变性、然后再将免疫佐剂向该变性组织中给药的情况下，还没有一种免疫佐剂能够有效地激发针对存活的该肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应。
发明内容
如上所述，结核菌素在溶解状态下只具有微弱的佐剂活性，但即使反复对人体给药也还是极为安全的。本发明的课题是希望提供采用结核菌素且能够在避免发生机体所不希望的状态的同时有效地发挥强佐剂活性的免疫佐剂。
本发明者们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现结核菌素经制成缓释型制剂就可以得到高的佐剂活性。同时本发明者们还发现，在结核菌素缓释化的同时，白蛋白与肝素混合后经凝聚形成沉淀时，结核菌素蛋白被包埋到此沉淀中形成不溶性微粒，而且将此不溶性微粒与抗原以及可溶性的精制结核菌素一起体内给药时有很强的防癌作用，而对热变性后的体内肿瘤组织用药可以诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。本发明就是以这些发现为依据完成的。
换而言之，本发明可以提供免疫佐剂，提供含有下列物质(a)可溶性蛋白(除了结核菌素中所含可溶性蛋白以外)；以及(b)粘多糖经凝聚形成的沉淀，还有与该沉淀一起沉淀出来的(c)结核菌素中所含可溶性蛋白的免疫佐剂。
本发明优选的是，成分(a)的可溶性蛋白为白蛋白、成分(b)的粘多糖为肝素的上述免疫佐剂；沉淀物通过蛋白分子间交联剂而交联的上述免疫佐剂；以及上述成分(c)为结核菌素中所含可溶性蛋白与具有抗原性的可溶性蛋白的组合的上述免疫佐剂；具有抗原性的该可溶性蛋白为肿瘤组织、肿瘤细胞、肿瘤细胞成分和/或肿瘤抗原多肽的上述免疫佐剂。
从其他方面来说，本发明可以提供免疫佐剂，此免疫佐剂包含(c)结核菌素中所含可溶性蛋白和(d)不溶性蛋白分子，且由于上述成分(c)和(d)通过蛋白分子间交联剂交联而呈不溶性微粒状。本发明优选不溶性蛋白分子为胶原蛋白的上述免疫佐剂。
再从另一方面来说，本发明还可以提供，通过与抗原混合后再对包括人在内的哺乳动物体内给药来诱导针对该抗原的全身性免疫反应的上述免疫佐剂；该抗原为肿瘤组织、肿瘤细胞、肿瘤细胞成分和/或肿瘤抗原多肽的上述免疫佐剂。
本发明还可以提供含有上述免疫佐剂的肿瘤疫苗。本发明优选的有，通过对物理方法变性后的肿瘤组织内给药来诱导抗肿瘤免疫反应的上述肿瘤疫苗；物理方法为选自微波照射、射频凝固法、冷冻凝固法、电刀加热法、热水注入、醇注入、栓塞法、放射线照射、激光照射和超声波破坏中的方法的上述肿瘤疫苗；通过在体外与免疫活性细胞混合后给药从而在体内激发免疫反应的上述肿瘤疫苗；免疫活性细胞为选自树突细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞中的细胞的上述肿瘤疫苗；通过先在体外与免疫活性细胞以及抗原混合后再来给药的上述肿瘤疫苗。
另外，本发明还提供包括将上述免疫佐剂对包括人在内的哺乳动物给药的步骤的全身性免疫反应的诱导方法；包括将上述肿瘤疫苗对经物理方法变性的肿瘤组织内给药的步骤的肿瘤的治疗方法；包括将上述肿瘤疫苗对经物理方法变性的肿瘤组织内给药的步骤的诱导抗肿瘤免疫反应的方法；以及先将上述肿瘤疫苗和免疫活性细胞在体外混合然后再对包括人在内的哺乳动物体内给药从而刺激体内免疫反应的方法。
附图简要说明
图1是显示本发明的肿瘤疫苗产生的肝癌增殖抑制效果的图。虚线表示累积存活率(空白对照组)，实线表示累积存活率(微粒化结核菌素疫苗给药组)，细密虚线为阳性对照组。
图2是显示对微波凝固后的肿瘤组织内给药的本发明肿瘤疫苗产生的防肿瘤复发效果图。
具体实施例方式
本发明的免疫佐剂的特征是含有下列物质a)可溶性蛋白(除了结核菌素中所含的可溶性蛋白以外)；以及b)粘多糖(但它是和上述(a)的可溶性蛋白经凝聚会形成沉淀的粘多糖)经凝聚形成的沉淀，还含有与该沉淀一起沉淀出来的c)结核菌素中所含可溶性蛋白。
作为上述(a)可溶性蛋白和(b)粘多糖的组合，只要是两者在本领域公知的条件下经凝聚可以形成沉淀的均可，没有特别的限制。关于凝聚，如美国专利第5,759,582号说明书中记载了其详细的技术说明，但此处对这个用语的解释不作任何意义上的限制，而必须作最为广义的理解。可以优选(a)可溶性蛋白为白蛋白而(b)粘多糖为肝素，但(a)可溶性蛋白和(b)粘多糖的组合并不仅限于上述组合。结核菌素中所含可溶性蛋白可以使用如精制结核菌素的总蛋白，除此以外也可以使用按常规方法由结核菌素配制而成的可溶性蛋白的全部或其中一部分。通过搅拌上述3种成分，成分(a)和成分(b)凝聚形成沉淀，同时成分(c)被该沉淀包埋后一起沉淀下来形成沉淀物。
(c)结核菌素中所含可溶性蛋白与(a)可溶性蛋白的比例没有特别的限制，只要是可以让(a)可溶性蛋白和(b)粘多糖发生凝聚的范围，任何比例都可以。举例来说，如果可溶性蛋白用pH值为2.5的2.5％人血清白蛋白溶液的话，则粘多糖用大约5mg/ml的市售肝素溶液，在600μl粘多糖中添加2.5μg结核菌素的可溶性蛋白并使之溶解，然后一边搅拌此混合物一边滴入上述人血清白蛋白溶液使其容量比不断变为1/1.75、1/1.5、1/1.25、1/1，使其通过凝聚形成微粒。将此混悬液进行离心，定量测定其上清液的蛋白质含量，优选使混合后的蛋白质几乎全部被包埋至微粒中的容量比。当然，成分(a)到(c)的比例或凝聚的条件等都可以由本领域技术人员作适当选择。得到的沉淀中所含微粒的粒径一般在1μm以下，但并不局限于一定的大小。
得到的沉淀以微粒状沉淀为优选，可以直接用来作为免疫佐剂使用，但也可以根据需要用蒸馏水清洗沉淀。另外为了使沉淀稳定，也可以通过蛋白分子间交联剂使其形成交联，从而形成不溶性微粒。蛋白交联剂的种类没有特别的限制，可以按照常规的方法使用常规的交联剂。比如，将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺制成20mg/ml的水溶液，用旋涡混合器一边混合一边加入使其最终浓度达0.8～1.5mg/ml，然后室温下静置15分钟，这时沉淀中的蛋白质分子间就形成了十分稳定的交联。当然交联的形成并不仅限于上述特定条件或特定蛋白分子间交联剂。按上述方法得到的免疫佐剂优选经过交联处理的免疫佐剂，它即使用水清洗也不溶解，适合用作本发明的免疫佐剂。
本发明其他方面的优选还有，将具有抗原性的可溶性蛋白和结核菌素中所含可溶性蛋白进行混合后，用此混合物代替上述(c)，采取与上述操作同样的方法来得到沉淀物，就可以制备得到含有具抗原性的可溶性蛋白和具佐剂活性的结核菌素可溶性蛋白的免疫佐剂。
另外，本发明还可以提供含有经蛋白分子间交联剂交联的结核菌素中所含可溶性蛋白以及不溶性蛋白分子的不溶性微粒状免疫佐剂。不溶性蛋白分子可以使用具生物降解性的不溶性蛋白分子。比如，可以使用胶原蛋白，但也不是仅限于此，只要是可在机体内分解，任何不溶性蛋白分子均可。蛋白分子间交联剂的种类没有特别的限制，按照常规的方法使用本领域公知的交联剂即可。比如，可以使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺等。微粒的粒径一般优选1μm以下，但并没有特定的大小限制。
本发明的免疫佐剂可以用作普通的免疫佐剂。将其单纯与抗原混合后对人体或动物体内给药，可以诱导对该抗原的全身性免疫反应。如果该抗原为肿瘤组织、肿瘤细胞、肿瘤细胞成分和/或肿瘤抗原多肽的情况下，就可以用作为肿瘤疫苗。例如，将从患者体内分离出来并固定化的癌细胞与本发明的免疫佐剂混合后对患者皮内注射给药，这时患者体内可以诱导产生针对该癌细胞的抗肿瘤免疫反应。当然本发明的免疫佐剂的使用方法并不仅限于上述这些内容，只要是常规使用免疫佐剂的情况下的任何方法均可。
另外，通过物理方法使患者体内的肿瘤组织变性，然后将本发明的免疫佐剂对此组织内给药，以此也可以诱导针对患者体内依然存活的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应。肿瘤组织的物理变性的方法没有特别的限制，可以采用如微波照射、射频凝固法、冷冻凝固法、电刀加热、热水注入、醇注入、栓塞法、放射线照射、激光照射、超声波破坏等方法。当然也并不仅限于这些方法，只要是可以诱导肿瘤组织内的肿瘤细胞发生细胞凋亡，任何方法都可以。也可以将2种以上物理方法适当组合在一起使用。
例如，通过对肿瘤组织进行微波照射，使其加热凝固，再将本发明的免疫佐剂对此凝固组织内给药，就可以诱导发生针对该肿瘤组织内部或其周边依然存活的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应。同时也优选在本发明的免疫佐剂给药的同时进行结核菌素溶液给药。当然本发明的免疫佐剂的给药方法并不仅限于上述方式，只要是可以使本发明的免疫佐剂与变性肿瘤组织中所含肿瘤抗原一起被摄取至聚集到该变性肿瘤组织中的抗原提呈细胞、或者形成本发明的免疫佐剂能够直接刺激到抗原提呈细胞的环境，任何方法均可采用。
另外，可以先将本发明的免疫佐剂与免疫活性细胞在体外混合后再对患者体内给药，从而激发体内免疫反应。此免疫活性细胞可以优选使用树突细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和/或自然杀伤细胞等，但并不仅限于这些。
另外，本发明还可以提供含有上述免疫佐剂作为有效成分的疫苗。此疫苗给药的时候，也可以同时与免疫活性细胞混合使用。还可以与作为抗原的肿瘤组织和/或肿瘤细胞混合后使用，这样得到的疫苗给患此肿瘤的患者使用可以治疗肿瘤。
实施例以下结合实施例对本发明进行详细说明，但本发明的范围并不仅限于以下这些实施例。在本实施例中，有时将制备的本发明的免疫佐剂称为微粒化结核菌素(或其他类似用语)。
例1本发明的肿瘤疫苗的肝癌增殖抑制效果A.材料和方法1.免疫佐剂的制备1)25％人血清白蛋白溶液(HAS，Baxter Albumac，Bacter)用无菌水稀释至2.5％，用4N的HCl调至pH2.5。
2)预先将此2.5％人血清白蛋白溶液与肝素溶液(ノボ·ヘパリン注1000，1000单位/ml，约7.69mg/ml以下，安万特医药株式会社)以各种比例混合，确定肝素溶液的最恰当的混合比例。所谓最恰当的混合比例，就是最开始用一定的混合比例制成微粒，以2500rpm(1300g)的速度进行15分钟离心，再用蛋白质分析试剂盒1(日本BioRadLaboratories，东京)定量其上清液的蛋白质含量，如果混合后的蛋白质有99.9％以上被包埋入微粒，那么这时就是最恰当的混合比例。
3)将结核菌素(日本BCG制造株式会社，一般诊断用精制结核菌素(PPD)1人份，标准品0.25μg当量)混悬于注射用肝素溶液中，一边用旋涡混合器搅和，一边按事先确定好的比例滴入2.5％的人血清白蛋白溶液。
4)以4300rpm(1300g)的速度进行15分钟的离心，用无菌蒸馏水清洗2次，再混悬于无菌蒸馏水中。
5)将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液(EDC，Sigma公司，溶于水中成为浓度为20mg/ml的溶液)一边用旋涡混合器搅拌一边添加，使其最终浓度变成0.8～1.5mg/ml，然后在室温下静置15分钟。
6)以4300rpm(1300g)的速度进行15分钟的离心，用无菌蒸馏水清洗6次，再混悬于无菌生理盐水中使其达到必要的浓度。这就制成了微粒化结核菌素混悬液。
2.肿瘤疫苗的小鼠肝癌增殖抑制效果的测定1)在直径10cm的塑料培养皿中培养肝癌细胞Hepa 1-6直至铺展，用3％的多聚甲醛溶液在室温下使其固定2小时。含钙、镁的Dulbecco磷酸盐缓冲生理盐水(PBS(+))充分清洗，再用70％的乙醇进行清洗灭菌，然后再用PBS(+)充分清洗。
2)按照每个培养皿10ml的量加入DMEM培养基，在37℃下温孵2天。
3)用PBS(+)充分清洗后，按照每个培养皿3ml的量加入聚L-赖氨酸溶液(25μg/ml)，温孵2小时。
4)用PBS(+)充分清洗后，用细胞刮将全部固定细胞刮下收集起来，混悬于PBS(+)中。
5)将相当于4个培养皿的细胞量的200μl放入Eppendrof管中，再添加结核菌素溶液100μl(0.25μg/100μl PBS(+))，温孵2小时。
6)添加微粒化结核菌素混悬液150μl(所含结核菌素浓度为3μg/ml)，再添加50μl的PBS(+)。于是得到微粒化结核菌素疫苗。与此同时，用5KE/ml的OK432(中外制药，ピシバニ一ル5KE)代替微粒化结核菌素和PBS(+)，用PBS(+)使其稀释10倍至200μl，将其加入Eppendrof管中，由此得到阳性对照组用疫苗。
7)用此微粒化结核菌素疫苗，对肝癌细胞Hepa 1-6的同型小鼠(C57L/J系，6-9周龄，雄性)9只按照每只50μl皮内注射给药。1周后重复此操作。空白对照组的9只小鼠只注射不含钙镁Dulbecco磷酸盐缓冲生理盐水(PBS(-))。同样，给阳性对照组注射上述6)中制成的阳性对照组用疫苗。
8)过1周后，右脚皮下注射Hepa 1-6细胞(1×107个/0.2ml PBS(-))。
9)在此激发后，按照上述1)至6)条同样操作，制成微粒化结核菌素疫苗(但是，制备此疫苗时所用的微粒化结核菌素所含结核菌素浓度为2μg/ml)，将其给每只小鼠皮内注射50μl。空白对照组的9只小鼠只注射PBS(-)。同样，给阳性对照组注射按上述6)制成的阳性对照组用疫苗。
10)然后测定皮下肝癌扩大后的小鼠的存活率。
B.结果结果如图1所示。这是空白对照组、微粒化结核菌素疫苗给药组、阳性对照组的Kaplan-Meyer曲线。微粒化结核菌素疫苗给药组具有统计学意义上的显著差异，比空白对照组的存活率高(对数秩检验log-rank test，p＜0.0001)，同时显示了比阳性对照组更好的抗肿瘤效果。
例2微粒化结核菌素对微波凝固后的肿瘤组织给药产生的防肿瘤复发效果A.材料和方法1.按照例1的第1.条制备微粒化结核菌素。
2.向C57BL/6小鼠(雌性，1组6只)的右脚皮下注射1×106个同型肺癌细胞(Lewis肺癌细胞株)，到第8日皮下肺癌组织基本上都达到75mm3的时候，进行戊巴比妥钠麻醉，切开近肺癌组织的皮肤，由此处向癌组织中插入Microtaze内窥镜检查用单球电极(E-24N，粒径2.4mm)。
3.将此电极连接在Microtaze(HSE-8M型，Azwell公司生产)上，用10W的功率微波照射3分钟，使得看上去癌组织完全热凝固了。
4.缝合伤口，到第10日将结核菌素溶液(精制结核菌素25ng溶于25μl生理盐水中)和混悬好的微粒化结核菌素(含有精制结核菌素50ng并混悬于5μl生理盐水中)注射至癌组织中。到第14日再次重复以上注射(a组)。对照组(b组)的小鼠只给以微波照射。同时设置不给以微波照射的对照组(c组)，还有用OK-432(1KE/25μl来代替微粒化结核菌素的组(d组)，以及用OK-432(1KE/25μl)来代替结核菌素溶液的组(e组)。
5.然后动态测定复发并肿胀起来的癌组织的大小(mm3)。
B.结果结果如图2所示。各点表示6只小鼠的肺癌组织大小的平均值。肺癌细胞移植后观察到第33天时，发现与b组、c组相比较，a组的肺癌组织复发得到了明显抑制。尤其是含有微粒化结核菌素和结核菌素溶液的a组，6只中没有1只复发，完全得到了抑制，而不含微粒化结核菌素的d组以及不含结核菌素溶液的e组在微波照射后，一旦缩小后再次生长起来的组织都是小的癌组织，与b组和c组相比癌增殖是得到了抑制，但6只中5只有复发(表1)。
表1肺癌细胞移植后的复发1组6只中发生肺癌复发的小鼠数量a微波照射+结核菌素溶液+微粒化结核菌素 0b微波照射 5c无微波照射 6d微波照射+OK-432+结核菌素溶液 5e微波照射+OK-432+微粒化结核菌素 5
工业实用性本发明的免疫佐剂能够在避免机体所不希望发生的状态的同时有效地发挥强的佐剂活性。
权利要求
1.免疫佐剂，含有a)可溶性蛋白(除了结核菌素中所含的可溶性蛋白以外)；和b)粘多糖(但它是和上述(a)的可溶性蛋白凝聚产生沉淀的粘多糖)经凝聚形成的沉淀，以及与该沉淀一起沉淀出来的c)结核菌素中所含可溶性蛋白。
2.如权利要求1记载的免疫佐剂，其中成分(a)的可溶性蛋白为白蛋白、成分(b)的粘多糖为肝素。
3.如权利要求1或2记载的免疫佐剂，其中沉淀物经蛋白分子间交联剂交联。
4.如权利要求1～3的任何一项记载的免疫佐剂，其中上述成分(c)为结核菌素所含可溶性蛋白和具抗原性的可溶性蛋白的组合。
5.如权利要求4记载的免疫佐剂，其中具有抗原性的可溶性蛋白为肿瘤组织、肿瘤细胞、肿瘤细胞成分和/或肿瘤抗原多肽。
6.免疫佐剂，含有c)结核菌素中所含可溶性蛋白；和d)不溶性蛋白分子且上述成分c)和d)通过蛋白分子间交联剂交联在一起的呈不溶性微粒状。
7.如权利要求6记载的免疫佐剂，其中不溶性蛋白分子为胶原蛋白。
8.如权利要求1～7任何一项记载的免疫佐剂，将其与抗原混合后对包括人在内的哺乳动物进行体内给药，用来诱导对该抗原的全身性免疫反应。
9.如权利要求8记载的免疫佐剂，其中该抗原为肿瘤组织、肿瘤细胞、肿瘤细胞成分和/或肿瘤抗原多肽。
10.含有如权利要求1～9任何一项记载的免疫佐剂的肿瘤疫苗。
11.如权利要求10记载的肿瘤疫苗，将其对通过物理方法变性后的肿瘤组织内进行给药，用来诱导抗肿瘤免疫反应。
12.如权利要求11记载的肿瘤疫苗，其中物理方法为选自微波照射、射频凝固法、冷冻凝固法、电刀加热法、注入热水、醇注入、栓塞法、放射线照射、激光照射和超声波破坏的方法。
13.如权利要求10～12任何一项记载的肿瘤疫苗，将其在体外与免疫活性细胞混合后再给药，用来刺激体内免疫反应。
14.如权利要求13记载的肿瘤疫苗，其中免疫活性细胞为选自树突细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞的细胞。
15.如权利要求13或14记载的肿瘤疫苗，将其在体外进一步与抗原混合后再给药。
全文摘要
本发明是能够在避免机体所不希望发生的情况的同时有效地发挥强大的佐剂活性的免疫佐剂，该免疫佐剂含有(a)可溶性蛋白(除了结核菌素中所含有的可溶性蛋白以外)、和(b)粘多糖经凝聚形成的沉淀，y以及含有与该沉淀一起沉淀出来的(c)结核菌素中所含可溶性蛋白。
文档编号A61K39/00GK1646159SQ0380865
公开日2005年7月27日 申请日期2003年4月15日 优先权日2002年4月18日
发明者大野忠夫, 内村英次, 黄岚, 匡铭 申请人:独立行政法人理化学研究所, 细胞医药股份有限公司