耐受抗原呈递细胞的制作方法

专利名称：耐受抗原呈递细胞的制作方法
技术领域：
本发明属于移植领域。具体地说，本发明属于预防移植排斥领域。本发明通过给予移植受体耐受抗移植物T细胞的抗原呈递细胞来达到此目的。
背景技术：
哺乳动物免疫系统在保护个体免受感染性因子感染和预防肿瘤生长中起着重要作用。然而，同样的免疫系统能产生例如排斥来自无关供体的细胞、组织和器官移植物等不需要的效应。此外，免疫系统会发生功能障碍并导致在被称为自身免疫的过程中破坏个体自身组织。
免疫抑制药为不良免疫应答这一难题提供了解决办法，但是它们并不是选择性靶向免疫应答。使用这类药物导致对适当应答和不需要的应答两者的系统抑制，能导致对感染和肿瘤控制失败。然而，随着对免疫应答作用机制的深入了解，特异性消除不需要的免疫应答已成为医药学上的目标[1]。
T淋巴细胞(T细胞)以多种途径控制免疫应答，这些途径成为诱导免疫不应答或免疫耐受的靶[2]。已发现T细胞上的一系列表面分子靶向它们天然存在的配体或来自这些配体的合成肽，并观察到它们对T细胞应答的效应[3，4]。然而，它们的功能与免疫抑制药类似，如果没有进一步干预的话，它们并不靶向特异性T细胞。
已清楚T细胞应答通常在体内受到严格控制，据认为另一细胞群体很可能行使这种控制功能。在这一方面已对树突细胞(DC)进行了深入研究[5-9]。众所周知，DC在许多免疫应答中具有的最重要功能之一就是能够独特地既刺激又耐受T细胞。DC能通过胞吞作用(大胞饮作用、吞噬作用和网格蛋白介导的胞吞作用)摄取并加工抗原，从而将从主要组织相容性复合体(MHC)抗原而来的肽呈递给T细胞[10]。当T细胞受体(TCR)识别其在MHC上的特异性肽时，这被称为信号1。该信号单独不足以激活T细胞，而且当单独使用该信号时，由于诱导无反应性而显示出耐受原性。在炎性刺激物存在下，DC可以成熟并且正调节其表面的共同刺激分子，所述分子与T细胞表面的它们的配体相互作用，因而提供能激活T细胞的信号2。然而，决定DC是激活还是耐受原性的准确特征目前正在研究之中。
看来一个决定性特征是DC的成熟状态。尽管成熟DC具有激活T细胞所需的所有表面分子，因为它们能够将抗原呈递给TCR，而且提供必要的共同刺激信号/激活信号，但是未成熟DC表面仅具有通常是低水平的抗原呈递分子。因此，未成熟DC不能激活T细胞[11]。然而，成熟状态并不总是免疫原性的可靠指标，因为具有成熟表型的DC已显示出诱导T细胞经历激活诱导的细胞死亡[12]，因而诱导耐受性。
也已经按照多种多样的DC亚型和谱系说明了DC在免疫调节中的作用。DC的表型标记和功能可用来将DC分为不同组群[13]，例如，骨髓DC和淋巴DC。已按照各自的亚型描述了免疫原性DC和耐受原性DC的实例[14]。
因为耐受原性DC的准确特征和表型尚不清楚，所以已经进行了一些努力，以在耐受性诱导中使用不同类型的DC。
源自外周血单核细胞(PBMC)中的前体的未成熟DC的制备方法描述于参考文献15和16，所述未成熟DC可以用来诱导耐受性。然而，该方法有些缺点。具体地说，这些DC在常规条件下可以成熟为完全免疫原性细胞。因此，在体内、特别是在受体的炎症部位成熟机会高。此外，原代细胞的遗传操作困难，它们也可能成熟为完全免疫原性细胞。另外，因为耐受原性细胞必须与供体组织匹配，这种诱导耐受性的方法需要分别从每个供体的PBMC中的前体制备DC，使成本昂贵。
将所得细胞进行耐受性诱导以便进行移植的一个关键目标是使它们与供体组织匹配。胚胎干(ES)细胞能分化成各种各样的细胞和组织，所以ES细胞能分化成用于移植的细胞而且也能分化成与供体匹配的耐受原性细胞。因此，来自干细胞的DC前体可以进行操作以制备耐受原性DC或者免疫原性DC。从小鼠ES细胞制备DC的方法描述于参考文献17和18。这些方法可用来制备免疫刺激性DC，所述DC可以通过与脂多糖在体外培养而成熟。实际上，这些源自ES细胞的树突细胞诱导从纯化T细胞到与所述DC细胞单元型相同的其它细胞的强烈的同种异体移植应答。因此，这些DC不能用于诱导对同种异体移植的耐受性。
诱导抗原特异性耐受性的另一方法是通过使用某些细胞表面受体激动剂，以中止抗原呈递细胞(如DC)的成熟[19，20]。因为该方法需要从每个待移植个体或患有自身免疫病的个体分别制备耐受原性APC，所以成本将是昂贵的。此外，有可能逆转对APC成熟的抑制(例如当不再供应激动剂时)，这将给患者带来严重后果，因为耐受原性APC将成为免疫原性细胞，因而导致移植排斥或自身免疫病。
一种类似方法描述于参考文献21，但该方法基于使用寡-DNA诱饵(decoys)以隐蔽NF-κB。然而，如上所述，该方法令人不满意，因为如果给DC供应的寡-DNA耗尽的话，就可能发生逆转。
参考文献22和23描述了使用药物抑制DC成熟并给予免疫毒素以减少受体T细胞群体数量，来诱导对移植物的耐受性。虽然可证明该方法能有效降低对移植物的免疫应答，但它也会给患者带来非常危险的后果，因为它不是抗原特异性的。系统性免疫抑制将使患者对继发性感染和癌症非常敏感。
最后，使用TNFα和其它炎性介质从源自细胞单采法的单核细胞产生DC的方法描述于参考文献24和25。然而，因为该方法可能产生免疫原性DC，所以不太可能用于诱导移植耐受性。
本发明的目的是提供具有移植物特异性(即非系统性)耐受原性的树突细胞，所述细胞天生不会将共同刺激信号2呈递给T细胞，所述细胞能够进行遗传操作，所述细胞容易与移植组织匹配，所述细胞不必与每个患者分别匹配，所述细胞不会逆转为免疫原性状态，所述细胞容易获得，而且所述细胞是非致瘤性细胞。

发明内容
本发明人已经发现，有可能制备一种抗原呈递细胞(APC)，所述细胞可将抗原呈递给T细胞(从而提供信号1)，但不能提供共同刺激信号2。本发明基于令人吃惊的发现，即可能制备不能成熟的树突细胞。这些细胞能够将信号1提供给T细胞，但不能提供共同刺激信号2。因此，由永不成熟树突细胞刺激的T细胞成为无反应性细胞，因此所述树突细胞是耐受原性细胞，而不是免疫原性细胞。通过提供与移植组织单元型匹配的耐受原性细胞，因而去除了抗移植物T细胞。
本发明的耐受原性细胞本发明提供未成熟且不能成熟的树突细胞。
与天然未成熟树突细胞不同，与参考文献11和17中描述的树突细胞相反，本发明的树突细胞当受到诸如下列炎性介质刺激时不能成熟脂多糖(LPS)、组织坏死因子α(TNF-α)、植物凝集素(PHA)或伴刀豆凝集素A(ConA)。它们能够将抗原呈递给T细胞，因而提供信号1，但是它们不能提供共同刺激信号2，因为它们仍然是未成熟状态。
本发明也提供能够将信号1传递给T细胞(抗原呈递)的树突细胞，但无论它们是处于静止期或是当受到炎性介质刺激时，都不能将信号2提供给T细胞。
本发明也提供具有以下特点的树突细胞(a)能够将抗原呈递给T细胞；(b)是CD40-ve、CD80-ve和CD86-ve，且(c)当受到炎性介质刺激时依然是CD40-ve、CD80-ve和CD86-ve。
CD40、CD80和CD86是共同刺激分子。因此，本发明细胞是耐受原性细胞而非免疫原性细胞。它们能够在体外和体内诱导T细胞对同种抗原的耐受性。
所述细胞最好是MHC-II+ve。MHC-II的表达使所述细胞能耐受CD4T细胞(辅助T细胞)，甚至在低水平时也是如此。所述细胞可以是MHC-I+ve或者MHC-I-ve。当需要耐受CD80T细胞(细胞毒性T细胞)时，MHC-I的表达仅仅是特异性必须的。细胞精确的MHC-I和MHC-II表型以及表达的必要水平取决于所需耐受性的类型，但对所述细胞总体要求是它们能够将抗原呈递给T细胞。
本发明的细胞最好是CD34-ve，即它们不是造血干细胞。
所述细胞可以是CD11c-ve。CD11c是一种整联蛋白，所述蛋白显示在成熟树突细胞表面并在与补体级联的iC3b蛋白结合中起作用。CD11c-ve细胞不能通过结合iC3b激活补体级联，因而有利地缓解炎症反应。
所述细胞可以是CD14-ve。CD14是LPS受体，因而CD14-ve细胞不能被这种炎性介质刺激。
本发明的细胞可以具有或者不具有以下标记表型之一CD1d-ve、CD54+ve、CD95-ve、CD11b+ve、CD8α+ve。
“ve”是指所讨论的蛋白在细胞中并未以足够高的水平表达以使其功能通过该细胞表现出来(例如CD40-ve细胞不表现出CD40-介导的共同刺激表型)。表达可以完全缺失(例如当基因剔除时)，但这不总是必要的，例如在表达足够低时(例如在背景或基础水平上未检出)就不必要，因为不表现出蛋白的功能。测定表达水平的一种方法是进行FACS分析，其中“-ve”通常指本发明的细胞在抗标记抗体(例如抗CD40、抗CD80、抗CD86等)存在下以及不存在抗体的情况下(例如参见图2)没有显著性信号差异。
相反，“+ve”是指所讨论的蛋白在细胞中的表达水平使其功能通过该细胞表现出来(例如T细胞能与MHC-II+ve细胞相互作用)。表达水平可以比野生型树突细胞低、与之相同或高。″+ve″是指抗标记抗体存在/不存在产生经FACS分析的显著性信号变化(例如≥1/2log)。
本发明的细胞最好不是无限增殖细胞(即它们不能在培养中无限繁殖)。本发明的细胞最好是非致瘤性细胞，而且具有正常核型。
本发明的细胞最好是人类细胞。
本发明的细胞可以是克隆细胞。
本发明的细胞可以是骨髓树突细胞或淋巴树突细胞。
本发明的细胞最好是稳定的，意即它们不能回复到未分化状态，也不能进一步分化成免疫原性树突细胞。这样的变化将是危险的，因为如果没有致使受体免疫系统对移植物耐受的话，免疫原性细胞将接触抗原并因此非常迅速地排斥移植组织。同样，细胞最好是不能回复到可成熟状态，而且它们的耐受原性不需要外源性分子(例如激动剂或寡-DNA)的存在。与参考文献19、20和21的树突细胞相比，这是一个关键性的优点。
因此，本发明的细胞最好不包含(i)包含一个或多个NF-κB结合位点的单链或双链寡脱氧核苷酸(例如每条链由25个或更少的核苷酸组成)；和/或(ii)CD36激动剂、CD51激动剂或血小板反应蛋白受体激动剂。
本发明的细胞最好具有胞吞能力。它们也可具有吞噬能力。本发明的细胞最好在胞吞或吞噬过程中不能正调节II类MHC的表达。
本发明的细胞最好在体外培养中能存活至少4周(例如至少6周、至少8周或更长时间)。
本发明的细胞最好在体外从干细胞例如ES细胞分化而来。因此，本发明提供一种在体外从干细胞(最好是从ES细胞)分化而来的耐受原性树突细胞。
本发明的细胞可以以多种方式制备。最常规方式是通过加入合适生长因子，以引起培养中干细胞分化而制备它们，但也可以通过阻止树突细胞成熟关键性蛋白的功能性表达而制备它们(例如通过遗传操作、通过反义、通过使用拮抗剂等)。
分化方法本发明提供从干细胞制备耐受抗原呈递细胞的方法，其中所述方法包括在一种或多种导致干细胞分化成耐受原性细胞的细胞因子存在下培养所述干细胞的步骤。然后可以从培养基中回收所述耐受原性细胞。
本发明方法中所用的干细胞可以是任何全能干细胞或多能干细胞，特别是能够产生造血谱系的干细胞。多能细胞具有发育成源自三种主要生殖细胞层的任何细胞的能力。成体干细胞、胎盘干细胞、胎儿干细胞和脐带血干细胞都可以使用，但是优选的干细胞是ES细胞。本发明包括使用胚胎癌(EC)细胞或胚生殖(EG)细胞[例如26]。
获得这些干细胞以及在用于本发明方法之前保存它们(例如以未分化状态)的方法是众所周知的。
ES细胞是可以从体外培养的无限繁殖的胚胎中分离的细胞。ES细胞是多能细胞，意即它们具有在体内产生包括成年动物在内的所有细胞类型的能力。鼠ES细胞[例如参考文献27]和人ES细胞[例如参考文献28和29]容易获得，它们的未分化生长的条件是众所周知的[例如参考文献30-40]。一些ES细胞更确切的是指多能细胞而不是全能细胞，因为它们不能形成某些细胞类型，特别是滋养层，但是已有报道从人ES细胞形成滋养层[41]。
按照本发明，最好使用人干细胞、特别是人ES细胞，以保证与人类患者的相容性。然而，当治疗非人类患者时，可以使用源自其它生物(例如源自非人类的灵长类或鼠类)的干细胞。非人类干细胞也可以结合用于异种移植的技术用于人类。
虽然与鼠ES细胞相比，人ES细胞的生长和分化的知识尚未达到相同水平，但也已取得成就[例如参考文献39-44]，例如关于怎样从不同祖先(例如人造血干细胞)得到具有诱导耐受性潜力的造血谱系细胞的知识[例如参考文献13和45-49]。
所述干细胞最好是人ES细胞系，所述细胞系按照于2001年8月9日由布什总统签署的标准概要是符合美国联邦基金会(US federalfunding)的要求。更优选的干细胞是一种得自NIH人类胚胎干细胞登记处(NIH Human Embryonic Stem Cell Registry)的干细胞。
所述人ES细胞可以是HES-1或HES-2[50]。
在分化前，最好将ES细胞以未分化状态保存在含有合适抑制因子(例如源自鼠ES细胞的白血病抑制因子(LIF))的培养基中。
最好将细胞以未分化状态保存在预胶化培养瓶中(例如含有0.1％明胶)。这样，本发明的方法就能避免使用饲养细胞，因此，与参考文献18不同，在分化前ES细胞培养中最好不要使用饲养层。
一般来说，干细胞在分化成耐受原性细胞前可以发育成胚状体(EB)。EB自身是不能成为耐受原性的。EB是当ES细胞、EG细胞或EC细胞在悬浮培养基中生长时(例如当覆盖在阻止细胞贴壁的非黏附表面时)形成的细胞聚集体。它们在液体悬浮培养基中自然发育，不需要任何特别的细胞因子存在。在本领域中已广泛鉴别出EB并可以从人[例如参考文献42和55-59]和鼠细胞进行常规生产[例如参考文献51-54]。如果起始的干细胞是贴壁培养的，它们可以通过使用机械解聚、酶处理(例如使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶等)和/或金属离子螯合剂(例如EDTA、EGTA)等方法在形成EB之前从组织培养表面解聚。为了使分化过程最佳化，EB最好是自由漂浮的。
在细胞因子存在下的分化过程中，细胞(与EB不同)最好是保持贴壁培养状态(例如在塑料表面)。贴壁后，EB产生向外迁移的基质细胞集落。培养7-10天后，本发明的耐受原性细胞围绕外围发育，可以以约90％的纯度收获所述细胞。
与参考文献18不同，EB分化期间最好不要使用饲养层。可以采用预胶化培养瓶(例如含0.1％明胶)来替代。其优点是避免培养基中存在不确定因子。
一般来说，可向培养EB或保存EB的培养基中加入细胞因子。优选的细胞因子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。它可与一种或多种其它细胞因子(例如白细胞介素-3(IL-3)、TNF-α、FLT3-配体)联合使用，但后面这三种细胞因子单独都不足以导致所需要的分化。本发明的方法可以任选在没有IL-3存在下、没有TNF-α存在下和/或没有FLT3-配体存在下进行。培养基最好是缺乏诸如FLT-3配体(‘Flt3-L’)和TNF-α等化合物，先前已报道这两种组分对可成熟树突细胞的产生有利。
培养基中GM-CSF的浓度范围一般为5-100ng/ml例如10-50ng/ml、20-30ng/ml或约25ng/ml。加入至多达6ng/ml剂量的IL-3看起来并不影响耐受原性细胞的发育，但可能稍微增加所产细胞的得率。
可以得到GM-CSF的不同形式和衍生物并可用于本发明。例如，它可以从血中纯化，可以重组表达[例如60，61]，或可以从分泌GM-CSF的细胞培养上清液中纯化。另外，可以通过含有分泌它们的细胞的培养基提供所述细胞因子。最好是向培养基中加入纯化的重组细胞因子。
细胞因子最好来自与所述干细胞相同的物种(例如用人GM-CSF与人干细胞)。
所述培养基可含有血清或不含血清。如果采用无血清培养基，最好采用血清替代物。
成熟蛋白功能表达的抑制本发明的培养方法产生不能成熟的树突细胞。虽然优选所述培养方法，但通过其它抑制或阻止信号2蛋白(例如CD40、CD80(B7-1)和CD86(B7-2))功能性表达的方法也可达到同样效应。
例如，可以阻止编码信号2蛋白的基因表达。这可涉及剔除突变以除去或改变它们的编码序列和/或调节序列。采用诸如基因打靶技术可以得到合适的剔除突变。采用反义技术[例如参考文献62-65等]或采用RNAi[例如参考文献66-69]的RNA沉默也可阻止表达，虽然这些技术因其可回复的特性而不是优选方法。
作为替代方法，信号2蛋白的功能可以通过关键氨基酸残基突变而受抑制[例如参考文献70、71、72等]。
这些技术可以单独使用或联用。例如，可以通过剔除突变阻止CD40表达，可以通过反义技术阻止CD80表达，还可以通过突变抑制CD86。然而，一般来说，最好是永久性的阻止技术。
免疫治疗方法和免疫预防方法本发明提供抑制受体移植排斥的方法，其中将本发明树突细胞给予所述受体。
本发明也提供用作药物的本发明的树突细胞。
本发明也提供本发明的树突细胞在制备用于抑制受体移植排斥的药物中的用途。
本发明的细胞可以以纯形式给予患者或与其它种类的细胞一起给予。然而，最好不与无限增殖细胞、干细胞和/或成熟树突细胞或能够成熟的树突细胞一起给予。
本发明的细胞可以与其它活性药一起给予患者，例如一种或多种抗炎药、抗凝药和/或人血清白蛋白(优选重组的)，一般是在同一次注射中联用。
一般来说，将所述细胞通过注射(例如注射到血液中)给予所述受体。最好是静脉注射。肝门静脉是优选途径。因此，本发明提供盛有本发明细胞的注射器。
一般来说，所述细胞基本上以培养完毕后的形式给予患者。然而，在某些情况下，生产出来的所述细胞可经过处理后给予。例如，所述细胞可在给予之前经辐射处理，例如以保证所述细胞不能分裂。所述细胞可以在给予之前接触目标抗原。所述细胞可以在制备后保存起来(例如冷藏)待用。
所述细胞可以以有效增强移植耐受性的剂量给予。给予患者的细胞数量基于以下参数，包括受体体重、他们的免疫系统活性和所述细胞耐受原性功效。通常细胞数量约为每公斤体重106-108个细胞。
所述细胞可与药用载体一起给予。该载体可包括支持细胞活力的细胞培养基。一般来说，所述培养基是无血清的，以避免刺激受体的免疫应答。所述培养基最好无动物源性制品(例如BSA)。所述载体一般具有缓冲性和/或无热原。
本发明提供将移植物移植给受体的方法，其中所述方法涉及与所述移植物一起给予本发明的树突细胞。本发明也提供增强移植受体耐受性的方法，所述方法包括给予所述受体本发明的树突细胞。
所述树突细胞可在移植之前(即前耐受)给予或者与移植几乎同时给予。最好在移植之前给予(例如至少在1天前，优选至少3天前，一般至少5、6、7、8、9或10天前)。
本发明也提供保持移植耐受性的方法，其中所述方法涉及给予接受移植的患者本发明的树突细胞。它提供一种“增强的”耐受原性。
本发明也提供包含如下成分的药盒(a)本发明的耐受原性细胞和(b)用于移植到受体的组织移植物，其中(a)和(b)具有组织相容性单元型(例如HLA单元型)。
所述移植物可以是任何适于移植的组织、器官或细胞，例如心脏、肺、肾脏、肝脏、胰腺、胰岛、胰β-细胞或其它产生胰岛素的细胞、角膜、软骨、骨髓、神经组织等。它可以取自供体或可以一直在体外生长。移植物最好是来自干细胞并可在体外生长。
一般来说，所述树突细胞与所述移植物是组织相容性单元型(例如HLA单元型)。这使得所述树突细胞能致使受体仅对来自移植物的抗原耐受。这可以通过从相同干细胞获得树突细胞和移植物常规达到。也可以通过常规HLA配型达到。如果所述树突细胞与所述移植物不匹配，则它们必须提前接触移植物抗原。配型是有利的，因为有利于通过直接途径而不是间接途径将抗原呈递给T细胞。
所述树突细胞最好具有与所述受体完全不同的单元型。这降低了树突细胞致使受体对非自身抗原的耐受的风险，而受体对非自身抗原(例如病毒抗原)的耐受是危险的。然而，随着移植物和受体单元型间差异增加，对本发明树突细胞导致的强烈耐受原性的需求也增加了。对于任何给定的患者，理想的情况是这两者的需求达到平衡。
本发明的细胞可事先加载移植物抗原。
所述移植物和所述受体最好来自同一物种(即同种异体移植)，但是本发明也可用于移植物和受体来自不同物种(即异种移植)。当采用异种移植时，需要给予所述受体更多抗异种应答的药物。可以给予免疫抑制药，但最好是与诱导耐受性相容的药物(例如雷帕霉素，而不是环孢菌素)。
所述树突细胞和所述移植物最好分别来自同一物种。
可以采用本发明的耐受原性树突细胞在体外诱导同种异体T细胞对具有与所述耐受原性细胞相同单元型的其它细胞产生耐受(即不应答)。这可以通过将所述同种异体T细胞与所述耐受原性细胞温育例如3天或更长时间(例如至少4、5、6、7、8天或更长)来达到。当将这些同种异体T细胞从耐受原性细胞中分离出来(例如通过洗涤，然后静止过夜)，它们可以在体外和具有与所述耐受原性细胞相同单元型的细胞或组织放在一起。与先前没有接触具有与耐受原性细胞相同单元型的任何细胞的同种异体T细胞相比，或者与已经接触具有与耐受原性细胞相同单元型的细胞的同种异体T细胞相比，这些事先已经接触耐受原性细胞的同种异体T细胞是耐受性的，它们与来自其它两种情形的同种细胞相比没有显著增殖。
自身免疫除了用于抑制移植排斥之外，本发明的树突细胞还可以通过致使自身反应性T细胞产生耐受而用于治疗自身免疫病。
本发明提供抑制患者自身免疫反应的方法，其中将本发明的树突细胞给予所述患者。
本发明也提供本发明的树突细胞在制备用于抑制自身免疫反应的药物中的用途。
通用的给药方法和手段如上所述用于免疫治疗方法和免疫预防方法。然而，主要差异是所述树突细胞源自所述自身免疫患者的干细胞。
用于本发明方法的干细胞的遗传操作在用于本发明的方法之前，可以先对干细胞进行遗传操作。同样，也可以在完成本发明的方法之后，对所述干细胞的分化细胞进行遗传操作。
例如，可以对细胞进行遗传操作以编码启动所述干细胞分化成树突细胞的多肽(例如转录因子)。
这种多肽的表达可以受到控制以使其在所述干细胞中出现，或使其在所述干细胞的分化细胞中出现(例如在胚状体中)。这可能涉及内源基因的激活和/或外源基因的导入。
同样，可对细胞进行遗传操作使其表达不足或不表达多肽(例如转录因子)，所述多肽促进远离耐受原性表型的分化或者抑制耐受原性表型的发生。例如，能够将基因剔除，或者用反义或RNA沉默技术来抑制基因。
可以对细胞进行遗传操作以表达或过量表达表面蛋白，所述蛋白负调节免疫应答(例如Fas-配体、CTLA-4-配体或Notch-配体)。这可进一步增强所述树突细胞的非免疫原性。
可以对细胞进行遗传操作，使之不表达表面蛋白和/或分泌型蛋白或者使这些蛋白表达不足，所述蛋白启动T细胞活化，例如CD40、CD80或CD86。这可进一步增强所述树突细胞的非免疫原性。这通常通过采用剔除技术来实现，但是也已有文献[73]很好地描述了各种用于阻止所述基因的表达或活性的其它方法。
对细胞可以进行遗传操作以包含“自杀基因”。这提供了选择性杀伤细胞(例如可制备用于移植疗法的细胞的未分化干细胞，或者源自所述干细胞的所有(分化或未分化)细胞)的方法，该方法是作为故障自动保险机制，能在移植后摧毁所述细胞。自杀基因编码蛋白产物，所述蛋白产物对细胞功能没有显著的直接效应，但能通过将其它无毒物质(通常称为前体药物)转变成有毒代谢物而带来毒性。自杀基因技术已发展成为一项使癌细胞对化疗更敏感的技术，而且也成为逆转病毒基因疗法的安全特征。本领域已经知道一些自杀基因和前体药物组合[例如参考文献74]，包括HSV胸苷激酶+更昔洛韦或阿昔洛韦；大肠杆菌(E.coli)胞苷脱氨酶+5-氟胞苷；大肠杆菌硝基还原酶+CB1954等。自杀基因最好处于未分化干细胞或移植不需要的其它细胞(例如肿瘤或致瘤细胞)中表达的启动子的控制下，在这种情况下，可以采用不影响分化细胞的合适的前体药物将未分化细胞从培养物中除去。合适的启动子包括编码Oct3/4[75]、Oct6[76]、Rex-1[77]和Genesis[78]等的基因的启动子。为了用作故障自动保险机制以选择性杀伤患者的移植物(例如当发现受体的移植物有害时)，然而，所述自杀基因一般是处于组成型启动子的控制下，虽然组织特异性或诱导型启动子也可使用。
可以对细胞进行遗传操作以插入适于谱系选择的标记，所述谱系选择是一项特异性选择所需细胞类型例如基于事先插入的重组构建体的技术，其中包含一个与选择性标记相连的组织特异性启动子。
合适的基因启动子包括但不限于发育重要因子(例如CD11b)和树突细胞典型蛋白(例如CD83)。合适的选择标记基因包括但不限于药物选择基因(例如G418抗性基因neo、hygro、puro、zeo、bsd、HPRT)，可见的标记例如荧光蛋白(例如GFP、DsRed)和容易通过自动细胞分选技术选择的基因(例如编码细胞表面抗原的基因)。
可以对所述干细胞进行遗传操作以编码针对所需耐受性的抗原。所述抗原可以表达、加工并呈递，因而本发明的耐受原性细胞是识别该抗原的无反应性T细胞。
上述遗传操作可以单独使用、或两种联用或多种联用。
所述干细胞的遗传操作可通过随机整合到基因组中而进行，或者最好是通过基因打靶。作为替代方法，当合适时，可采用附加型保持载体(例如质粒)进行操作。包括人ES细胞在内的ES细胞转染[59]是众所周知的。
为了随机整合，可以将编码相关多肽的载体导入所述干细胞中。采用包含与编码相关多肽的DNA有效连接的基因启动子的表达载体，通常可表达。编码所述多肽的DNA可以是cDNA、基因组序列或两者的混合物。所述启动子可以指导组成型或诱导型表达，并且可以是组织特异性的。组成型启动子的实例包括来自磷酸甘油酸激酶(PGK)的启动子、来自延伸因子1α(EF1α)的启动子、来自β-肌动蛋白的启动子或来自SV40的启动子。诱导型基因启动子的实例包括由嵌合反式激活蛋白组成的系统，所述蛋白响应药物或配体(例如米非司酮、四环素、多西环素、蜕皮素、FK1012或雷帕霉素)，可逆结合表达构建体的启动子区。所述启动子最好源自PGK基因。
一个加入随机整合到基因组的重组构建体的替代方法是通过同源重组在原位准确改变基因，这称为“基因打靶”。这个方法通过在导入的DNA和染色体DNA间的同源重组，准确预测基因修饰。基因打靶可用于在培养细胞(最常见的是胚胎干细胞)中插入、置换、重排或去除选中的DNA序列[例如参考文献79]。在某些情况下，基因打靶最好只是在随机位点导入表达载体，因为可以事先预测遗传修饰以避免降低所得细胞的治疗价值的任何有害效应(例如癌基因转化)。
通过修饰或置换所述基因的天然启动子或其它调节区，基因打靶可用于达到目标基因的组成型或诱导型表达。例如，一个基因启动子可以被一个组成型或诱导型启动子(例如PGK)置换，或者指导组成型表达的元件可以被加入到邻接所述内源基因启动子。通过基因打靶获得这些修饰的方法(包括在ES细胞中)在本领域是众所周知的。
也可在细胞中而不是干细胞中进行遗传操作，然后将遗传操作转移到干细胞(例如通过将细胞核转移到去核干细胞中)或转移到胚胎(例如通过将细胞核转移到去核卵母细胞中)中以产生干细胞。这两种方法间接得到经遗传操作的干细胞。
筛选分析本发明的细胞可以与野生型细胞相比较，以鉴别树突细胞成熟相关因子。例如，这两种细胞的mRNA群体可以用核酸阵列进行分析。
附图简述

图1显示源自ES细胞的本发明耐受原性细胞的相差图像。所述细胞是将EB与GM-CSF和IL-3一起放入6孔板10天后的耐受原性细胞聚簇。
图2显示采用对不同细胞标记的表面表达的单克隆抗体染色，对本发明耐受原性细胞表型的FACS分析结果。
图3显示本发明的耐受原性细胞不能成熟。通过FACS分析，显示耐受原性细胞与LPS或TNFα温育后MHC-II和B7-2(CD86)的表达水平的测定结果。
图4显示在两步分析中本发明的耐受原性细胞耐受同种异体T细胞的能力。
实施本发明的方式1)129/P2小鼠ES细胞的制备和保存从129/P2小鼠品系获得HM-1鼠胚胎干细胞[80]。组织培养瓶用0.1％明胶的PBS预包被，促使HM-1细胞贴壁，将它们保存在完全培养基(补充有10％热灭活胎牛血清(FCS)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、2mM非必需氨基酸和50μM 2-巯基乙醇的BHK-21培养基)中。为保持所述细胞处于未分化状态，向所述培养基中加入白血病抑制因子(LIF)。细胞保存在37℃、5％CO2的温箱中。
2)从HM-1产生耐受原性细胞当装有未分化的HM-1细胞的T25瓶长满后，将它们用胰蛋白酶轻微消化，这样出现细胞团块而不全是单细胞，在900rpm下洗涤2分钟，使细胞团块聚集在管底，小心除去上清液，轻轻将团块重悬浮于无LIF的5ml完全培养基中。将1.5-2×105细胞/细胞团块接种到装有10ml完全培养基的90mm细菌学塑料平皿中。在这样的条件下，所述HM-1细胞不能贴壁到所述细菌学塑料平皿上，而是保持悬浮状态，并继续增殖，形成胚状体。培养到第4天，所述EB成为肉眼可见的小球，到第10-12天，外观为囊状。细胞保存在37℃、5％CO2的温箱中。
在第4天，将所述EB转移到通用试管中，在6孔组织培养板中每孔加入60-80μl。每孔加入2ml补充有25ng/ml重组鼠GM-CSF和1000U/ml重组鼠IL-3的完全培养基。将细胞保存在37℃、5％CO2的温箱中。
在24小时培养中，所述EB贴壁到塑料上，分化细胞(主要是基质细胞)显示出生长，以辐射状向外迁移。到第4-5天耐受原性细胞团块开始出现，到第8-10天，所述团块足够大，可以收获耐受原性细胞(图1)。有些耐受原性细胞在塑料上紧密贴壁，但它们中的大多数只是轻微贴在源自EB的基质细胞下层。轻轻吸出即可收获，并通过70μm细胞滤器以除去不要的碎片。因为支持所述耐受原性细胞生长的基质层保持完整，可以重复收获所述耐受原性细胞4-5周。
3)在没有IL-3存在下从HM-1产生耐受原性细胞如上所述，得到EB并接种到6孔板，但所述培养基中不加入IL-3。在含有GM-CSF(不含IL-3)的培养基中以及含有GM-CSF和IL-3的培养基中产生所述耐受原性细胞的速率基本相同。在GM-CSF群体和GM-CSF/IL-3群体的表型上没有可检测的差异。
4)其它的细胞因子如上所述，可在GM-CSF存在下、任选与IL-3一起，培养ES细胞，获得耐受原性树突细胞。单独使用或联合使用其它重组细胞因子(TNF-α和Flt3-L)的检测结果如下

5)源自ES细胞的耐受原性细胞的特征5.1)表型耐受原性细胞源自如上所述的ES细胞，并使用一组单克隆抗体，通过流式细胞仪分析所述耐受原性细胞表面标记的表达(图2)。CD8α、CD11b、CD54(ICAM-1)、I类MHC和F4/80在所述耐受原性细胞表面高水平表达。在所述耐受原性细胞上观察到CD1d、CD11c、CD14、CD40、II类MHC、CD95(Fas-配体)、CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的低水平表达或不显著表达。认为CD11c是成熟树突细胞特异性标记，但决不会看到该分子的显著表达。F4/80的高表达表明本发明的细胞与巨噬细胞类似，但其形态和黏附特性显示它们不是巨噬细胞。B7-1、B7-2、CD40和II类MHC的低/不显著表达水平表明所述细胞是未成熟树突细胞。
因此，通过本文所用的鉴别方法，将本发明的细胞归类于未成熟树突细胞。
5.2)活性为了进一步表征所述耐受原性细胞，测试了它们的吞噬和胞吞能力。如上所述，从EB制备所述细胞。将所述细胞在完全RPMI(即补充了10％热灭活FCS、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、2mM非必需氨基酸和50μM 2-巯基乙醇的RPMI)中洗涤。将细胞重悬浮于含有或不含FITC-标记的乳胶珠(以测定吞噬作用)或者FITC-葡聚糖(以测定胞饮作用)的完全RPMI中，并在4℃或37℃分别保持2小时或30分钟。然后洗涤细胞，用PE-标记的抗MHC-II单克隆抗体染色并进行FACS分析。在37℃，所述细胞吞噬FITC-标记的乳胶珠，但在4℃却不吞噬，并且所述细胞正调节II类MHC。然而，当所述细胞在37℃胞吞FITC-葡聚糖，但在4℃却不胞吞时，比起细胞在4℃与FITC-葡聚糖保温或细胞在37℃与FITC-标记的乳胶珠或者FITC-葡聚糖保温来说，它们正调节II类MHC的程度并不会更高。典型的树突细胞如果在37℃胞吞FITC-葡聚糖，将正调节II类MHC，这进一步显示本发明的树突细胞不能成熟。
5.3)不能成熟本发明的树突细胞不能成熟的进一步证据是，它们甚至在高浓度的LPS(1-100μg/ml)、TNFα(25-200ng/ml)、PHA(1-100μg/ml)或ConA(1-100μg/ml)存在下不被诱导成熟。如上所述，从EB制备所述细胞并在含有或不含前述成熟诱导剂的完全RPMI中培养24小时或48小时。在此条件下，这些细胞不能正调节II类MHC或共同刺激分子B7-1和B7-2(图3)。因此，本发明的细胞在炎性介质存在下停留在未成熟状态。另外，在同种异体T细胞(例如来自CBA/Ca的H-2k小鼠)存在下5天后通过StemSepTM柱、用它们的鼠T细胞纯化混合物进行纯化，本发明的细胞仍然处于未成熟状态。这一行为表明它们是稳定的耐受原性细胞，可用于体内耐受策略。
5.4)耐受性的诱导本发明的细胞可用来在体外诱导同种异体T细胞对与所述耐受原性细胞相同单元型(H-2b)的其它细胞的耐受。如上所述，从EB制备树突细胞并在组织培养瓶里在完全RPMI中培养24小时。在此期间，所述树突细胞在塑料上贴壁。通过StemSepTM柱、使用它们的鼠T细胞纯化混合物纯化同种异体T细胞(例如从CBA/Ca的H-2k小鼠)，然后加入到树突细胞培养瓶中达7天。将所述同种异体T细胞从所述树突细胞中洗涤出来，静止过夜，在体外和来自与所述树突细胞相同单元型(H-2b)的129/sfv小鼠的脾细胞或胰岛放在一起。第6天，平皿中加入3H-胸苷并在第7天收获，以评价增殖水平。
事先接触本发明的树突细胞达7天的CBA/Ca T细胞，与事先没有接触具有与所述树突细胞相同单元型的任何细胞相比，或者与已经接触具有与所述树突细胞相同单元型的脾细胞的CBA/Ca T细胞相比，几乎没有增殖(图4)。H-2k受体的所述T细胞一般会攻击H-2b移植物，但H-2b树突细胞却能够预防这种攻击。因此，本发明的细胞是耐受原性的，而且能诱导抗原特异性耐受性。
无论它们的抗原特异性如何，在原代培养中接触所述耐受原性细胞的CBA/Ca T细胞不只是不反应的，其证据是它们至少仍能增殖以响应有丝分裂原(ConA)以及首次用于实验的从未接触所述耐受原性细胞的CBA/Ca T细胞。这表明诱导的耐受性是抗原特异性的，因此将保留宿主免疫系统的完整性例如对抗感染或癌细胞。
5.5)体内免疫原性本发明的细胞可以从20-35天的培养物中收获，然后静脉注射给具有与来自ES的细胞(H-2b)不同单元型(H-2k)的受体小鼠。这种在单元型上的差异预期会刺激所述受体小鼠的免疫应答。
作为对照，用来自H-2b小鼠的脾细胞注射同样的H-2k小鼠。同样，预期单元型的差异会刺激免疫应答。作为另一对照，另一组小鼠不注射细胞。
从零时(注射细胞)起在各个不同时间间隔，取出所述小鼠的脾脏，分离脾细胞。这些细胞含有所述小鼠所有主要免疫细胞的代表。这些细胞与来自H-2b小鼠的脾细胞一起培养，以观察所述注射细胞会刺激哪种类型的应答(回忆应答)。结果如下

因此，接受注射脾细胞的小鼠的回忆应答主要是产生干扰素γ(IFN-γ)，这与T细胞准确应答外来细胞是一致的。这将是组织排斥中所希望的应答类型。然而，接受本发明细胞的小鼠的回忆应答是产生白细胞介素10(IL-10)，这表明存在调节T细胞。如果已诱导了免疫耐受性，这是可以预期的。此外，仅当所述脾细胞与H-2k在体外培养时，可以观察到IL-10，这是抗原特异性的表现。
综上所述，这些结果表明静脉注射本发明的细胞，而不是脾细胞，诱导调节T细胞群体，说明免疫耐受性诱导。
6)从CBA ES细胞产生耐受原性细胞CBA鼠胚胎干细胞得自CBA小鼠品系[81]，并且按照上述用于HM-1细胞的方法保存。从CBA ES细胞得到耐受原性细胞的方法与用于HM-1细胞的方法类似。当装有未分化的HM-1细胞的T25瓶长满后，将它们用胰蛋白酶轻微消化，这样出现细胞团块而不全是单细胞，在900rpm下洗涤2分钟，使细胞团块聚集在管底，小心除去上清液，轻轻将团块重悬浮于无LIF的5ml完全培养基中。将1.5-2×105细胞/细胞团块接种到装有10ml完全培养基的90mm细菌学塑料平皿中。在这样的条件下，所述CBA ES细胞不能贴壁到所述细菌学塑料平皿上，而是保持悬浮状态，并继续增殖，形成EB。培养4-7天，这些小球成为肉眼可见，到10-14天，外观为囊状。细胞保存在37℃、5％CO2的温箱中。
在第4-7天，将所述EB转移到通用试管中，在6孔组织培养板中每孔加入60-80μl。每孔加入2ml补充有25ng/ml重组鼠GM-CSF以及补充或不补充1000U/ml重组鼠IL-3的完全培养基。将细胞保存在37℃、5％CO2的温箱中。
在24小时的培养中，所述EB贴壁到塑料上，分化细胞(主要是基质细胞)显示出生长，以辐射状向外迁移。到第10-14天耐受原性细胞团块开始出现，到第21天，所述团块足够大，可以收获耐受原性细胞。有些耐受原性细胞在塑料上紧密贴壁，但它们中的大多数只是稍微贴在由EB而来的基质细胞的下层。轻轻吸出即可收获并通过70μm细胞滤器以除去不要的碎片。因为支持所述耐受原性细胞生长的基质层保持完整，可以重复收获所述耐受原性细胞达4-5周。
7)源自CBA ES细胞的耐受原性细胞的特征/表型使用一组单克隆抗体，通过流式细胞仪分析源自CBA ES细胞的耐受原性细胞表面标记的表达，以确定其表型。CD11b、CD54(ICAM-1)和F4/80在所述耐受原性细胞表面表达。在所述耐受原性细胞上观察到CD11c和MHC-II的低水平表达或不显著表达。
人们知道，以上仅通过实例描述了本发明，但只要仍然在本发明的范围和精神之内，就可以进行各种修改。
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权利要求
1.一种树突细胞，所述细胞是未成熟的且不能成熟。
2.一种树突细胞，所述细胞能够将抗原呈递给T细胞，所述细胞是CD40-ve、CD80-ve和CD86-ve，且当受到炎性介质刺激时所述细胞仍然是CD40-ve、CD80-ve、CD86-ve。
3.一种树突细胞，所述细胞可以将信号1传递给T细胞，但是所述细胞或者是处于静止状态或者当受到炎性介质刺激时均不能将信号2提供给所述T细胞。
4.一种在体外从ES细胞分化而来的耐受原性树突细胞。
5.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞不是无限增殖细胞。
6.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞具有正常核型。
7.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞是人类细胞。
8.一种可通过权利要求9-15中任一项的方法获得的细胞。
9.一种从干细胞制备耐受抗原呈递细胞的方法，其中所述方法包括在一种或多种导致所述干细胞分化成所述耐受原性细胞的细胞因子存在下培养所述干细胞的步骤。
10.权利要求9的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞。
11.权利要求9或权利要求10的方法，其中所述干细胞是人干细胞。
12.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述干细胞在分化成所述耐受原性细胞之前发育成胚状体。
13.权利要求9-12中任一项的方法，其中分化成所述耐受原性细胞发生在贴壁培养。
14.权利要求9-13中任一项的方法，其中不使用饲养层。
15.权利要求9-14中任一项的方法，其中所述细胞因子是GM-CSF。
16.权利要求1-8中任一项的细胞，所述细胞用作药物。
17.权利要求1-8中任一项的细胞在制备用于抑制自身免疫反应的药物中的用途。
18.权利要求1-8中任一项的细胞在制备用于抑制受体移植排斥的药物中的用途。
19.一种抑制受体移植排斥的方法，其中将权利要求1-8中任一项的细胞给予所述受体。
20.一种用于将移植物移植给受体的方法，其中所述方法还包括将权利要求1-8中任一项的细胞给予所述受体。
21.权利要求18-20中任一项的方法或用途，其中所述移植物是心脏、肺、肾脏、肝脏、胰腺、胰岛、胰β-细胞或其它产生胰岛素的细胞、角膜、骨髓或神经组织。
22.权利要求18-20中任一项的方法或用途，其中所述树突细胞与所述移植物是组织相容性的。
23.一种抑制患者自身免疫反应的方法，其中将权利要求1-8中任一项的细胞给予所述患者。
24.一种药盒，所述药盒包含(a)权利要求1-8中任一项的细胞和(b)用于移植到受体体内的组织移植物，其中(a)和(b)是组织相容性的。
25.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-8中任一项的细胞以及药用载体。
26.一种用于权利要求9-15中任一项的方法的干细胞，其中对所述干细胞进行了遗传操作。
27.权利要求26的干细胞，其中对所述干细胞进行了遗传操作以编码启动所述干细胞分化成树突细胞的多肽。
28.权利要求26的干细胞，其中对所述干细胞进行了遗传操作以表达或过量表达一种或多种负调节免疫应答的表面蛋白。
29.权利要求26的干细胞，其中对所述干细胞进行了遗传操作以不表达启动T细胞活化的表面蛋白和/或分泌型蛋白或者使所述蛋白表达不足。
30.权利要求26的干细胞，其中对所述干细胞进行了遗传操作以包含自杀基因。
31.权利要求26的干细胞，其中对所述干细胞进行了遗传操作以包含适于谱系选择的标记。
全文摘要
已经发现了可以制备不能成熟的树突细胞。这些细胞能将信号(1)提供给T细胞但不能提供共同刺激信号(2)。因此，受到永不成熟树突细胞刺激的T细胞无反应性，所以所述树突细胞是耐受原性的而不是免疫原性的。所述细胞通常是CD40
文档编号A61P37/06GK1656216SQ03811733
公开日2005年8月17日 申请日期2003年3月27日 优先权日2002年3月28日
发明者M·J·穆尔, A·J·莱斯曼, D·A·J·英尼斯 申请人:雷维维科公司