专利名称：血管化增强的移植构造物的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于基质组分的血管化增强的组织移植物以及它们修复患病或受损组织的用途。更具体而言，本发明涉及血管化增强的组织移植物，它包括已经用内皮细胞和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种的基质组分，从而提高组织移植构造物的修复能力。
背景技术：
和概述本发明涉及一种用于修复受损或患病组织的组织移植构造物，它包括用内皮细胞和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种的基质组分。本发明所用的基质组分选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原。所述基质组分优选包括高度保守的胶原、糖蛋白、蛋白聚糖、和糖胺聚糖。本发明所用的基质组分来源于温血脊椎动物的组织。
按照本发明制备的组织移植构造物基本上是无细胞的基质，提供类似体内基质环境的良好细胞生长基质。基质组分的天然组成和构型提供了一种独特的细胞生长基质，它可促进体外细胞附着和增殖，并在体内植入移植构造物时诱导组织重塑。
作为组织移植材料，肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原可诱导内源性组织在植入到宿主中后生长(即，移植材料诱导重塑)。当用于这类应用中时，组织移植构造物似乎不仅作为被移植构造物替换的组织的生长或再生长的基质起作用，而且可促进或诱导内源性组织的这种生长或再生长。这些移植材料以可植入片的形式或可注射的流体或凝胶形式使用，从而诱导内源性组织的再生长。
本发明涉及组织移植构造物，它包括选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，此外还包括加入的内皮细胞和至少一种附加的预选的外源性细胞群。本发明还涉及增强组织移植构造物体内血管化的方法。血管化提高的组织移植构造物是在将组织移植构造物植入或注射到宿主中前，通过用内皮细胞或内皮细胞前体(例如，祖细胞或干细胞)和至少一种附加的预选或预定的细胞类型体外接种基质组分而制备的。
其中一个实施方案提供一种用于修复患病或受损组织的组织移植构造物。所述组织移植构造物包括选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，加入的内皮细胞，和至少一种附加的预选的外源性细胞群。
在另一实施方案中，提供血管化的组织移植构造物用于修复患病或受损组织。所述组织移植构造物包括选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，加入的内皮细胞，和至少一种附加的预选的外源性细胞群，其中所述内皮细胞已经在基质组分上培养过一段时间，这段时间足够体外形成血管或血管样结构。
在另一实施方案中，提供一种用于增强组织移植构造物体内血管化的方法。该方法包括用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群体外接种选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，从而形成移植构造物，然后将移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位的步骤。
在另一实施方案中，提供一种用于增强组织移植构造物体内血管化的方法。该方法包括用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群体外接种选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，体外培养内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构或成分的形成，然后将移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位的步骤。
在这些方法实施方案的任何一个中，可用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分，也可在用内皮细胞接种基质组分前，用附加的预选的细胞群接种基质组分，或用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时或近乎同时接种基质组分。
可将内皮细胞在基质组分上体外培养一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成，或将内皮细胞在基质培养物上培养一段时间，这段时间足够在没有体外形成血管或血管样结构的情况下，使内皮细胞扩增(即，使内皮细胞分裂至少一次)。可选择性地，可在内皮细胞没有扩增的情况下植入移植构造物。在这些实施方案的任何一个中，在植入移植构造物前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增(即，允许发展经过至少一个细胞分裂周期)。
在另一实施方案中，提供一种制备用于修复患病或受损组织的组织移植构造物的方法。该方法包括用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，从而形成移植构造物的步骤。该方法还可进一步包括在基质组分上体外培养内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成。
在这些实施方案的任何一个中，至少一种附加的细胞群包括未角化或角化的上皮细胞群或选自成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多-潜能祖细胞(例如，干细胞)、周细胞和成骨细胞的中胚层来源的细胞群。在各种实施方案中，可用内皮细胞和一种或多种这些附加的细胞类型接种基质组分(即，可用内皮细胞和这些附加的细胞类型的一种、两种、三种等接种基质组分)。
附图简述
图1提供描述本发明移植构造物的可选的制备方法的流程图。
发明详述本发明涉及一种组织移植构造物，它包括选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，而且还包括加入的内皮细胞和至少一种附加的预选的外源性细胞群。所述基质组分是用内皮细胞和预选的外源性细胞群接种的，并用于修复患病或受损组织。按照本发明，“受损组织”是指受到损害的、撕裂的、切断的组织，或已经手术除去或以其它方式从需要修复的部位失去的组织(例如，先天缺乏或畸形)。
所述基质组分可从来源于肝基底膜及其提取物和水解产物的胞外基质组分制备。然而，所述基质组分还可从其它工程化的组织制备形成，例如，分离的基底膜层，或从可商业得到的已加工胶原组分、或纯化的胶原组分制备。用于本发明的可商业得到的已加工胶原组分的例子是MATRIGEL、ALLODERM、INTEGRA、APPLIGRAF、DERMAGRAFT、和PERI-GUARD。MATRIGEL基底膜基质(BectonDickinson)是肿瘤-衍生的基底膜组分，其是Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤的可溶性基底膜提取物，胶凝化形成重构的基底膜。ALLODERM(Life Cell，Inc.)是来源于已被加工除去细胞的尸体真皮的组分。INTEGRA(Integra Life Sciences)是牛胶原和硫酸软骨素的无细胞真皮组分。APPLIGRAF(Novartis)是已经用人成纤维细胞和其它细胞和非细胞组分接种的含合成聚乳酸的组分，DERMAGRAFT是Vicryl筛骨架上人成纤维细胞的同种异体真皮移植物。PERI-GUARD(Bio-Vascular，Inc.)是从化学交联的牛心包制备的组分。纯化和已加工的胶原还可通过本领域已知的技术生产。(见，例如，美国专利6,127,143、5,814,328、5,108,424、和4,883,864)。
用于本发明的内皮细胞可来源于任何类型的内皮细胞群，包括大血管、微血管、动脉、和静脉内皮细胞。不论是成熟的内皮细胞(例如，从器官或血管采集的)还是内皮细胞前体(例如，祖细胞或干细胞)都可用于本发明。此外，内皮细胞可从幼年或老年动物中采集，但优选从幼年动物采集的内皮细胞。
在其中一个实施方案中，附加的预选的外源性细胞群可包括未-角化或角化的上皮细胞群或选自成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多-潜能祖细胞、周细胞、成骨细胞、和任何其它适宜细胞类型的中胚层来源的细胞群。
与基质组分和内皮细胞组合的附加的预选的外源性细胞群可以所要修复组织的细胞类型为基础选择。例如，如果要修复皮肤，预选的外源性细胞群可以是未角化的上皮细胞或如果要修复心脏组织，则预选的外源性细胞群可以是心肌细胞。在另一实施方案中，使用从待治疗患者中分离的自体细胞接种基质组分。
在其中一个实施方案中，与基质组分和内皮细胞组合的至少一种附加的预选的细胞群包括能够分化成平滑肌细胞的平滑肌细胞和/或祖细胞。有利地，平滑肌细胞和/或平滑肌祖细胞可促进(连同内皮细胞)血管或血管样结构在移植构造物中的形成。在另一实施方案中，附加的细胞类型可连同内皮细胞、平滑肌细胞、和/或平滑肌祖细胞一起加入。
在另一实施方案中，至少一种附加的预选的外源性细胞群包括多-潜能祖细胞群。基质组分可诱导这些多-潜能祖细胞分化成帮助受损组织修复的细胞。有利地，可将用内皮细胞群和多-潜能祖细胞群接种的基质组分植入到体内多个不同的部位，且祖细胞将分化成对特殊环境较为适宜的细胞类型。例如，包括内皮细胞和多-潜能祖细胞的组分在腱或韧带部位的植入可导致移植构造物重塑成腱或韧带。
和使用与单独的内皮细胞组合的单独的基质组分，或与除内皮细胞外的细胞类型组合的单独的基质组分作为治疗剂相比，基质组分、内皮细胞、和附加的预选的外源性细胞群的组合所提供的组织移植构造物在体外和/或体内显示出令人吃惊的提高的血管化，从而产生提高的伤口愈合能力和更好的组织功能恢复。
在各实施方案中，可在用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分，也可在用内皮细胞接种基质组分前，用附加的预选的细胞群接种基质组分，或可用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时或近乎同时接种基质组分(见图1的各种举例性实施方案)。
在其中一个这样的实施方案中，可用内皮细胞接种基质组分，并在将所述构造物植入到受影响的区域之前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成。可在用内皮细胞接种基质组分后以及在将移植构造物体内植入前的任何时间，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分。因此，根据植入移植构造物前在基质组分上培养预选细胞群的时间的不同，在将移植构造物植入到受影响的区域前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增(即，允许发展经过至少一个细胞分裂周期)。
可选择性地，可在用内皮细胞接种基质组分后，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，且可在植入移植物前，在基质组分上培养内皮细胞，使内皮细胞扩增，而不会诱导血管或血管样结构或成分的形成。在该实施方案中，根据植入移植构造物前在基质组分上培养预选细胞群时间的不同，在将移植构造物植入到受影响的区域前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增。
在另一实施方案中，可在用内皮细胞接种基质组分后，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，且在内皮细胞或附加的预选的外源性细胞群没有扩增的情况下，稍后即植入基质组分。
在选择性实施方案中，可用附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，并在植入移植构造物前，在基质组分上培养预选的细胞群，从而使预选的细胞群扩增(即，使细胞分裂至少一次)。在该实施方案中，可在用预选细胞群接种基质组分后以及体内植入移植物前的任何时间，用内皮细胞接种基质组分。因此，根据植入移植物前在基质组分上培养内皮细胞时间的不同，在将移植构造物植入到受影响的区域前，内皮细胞可扩增或没有扩增。如果内皮细胞扩增，内皮细胞的扩增可包括或不包括血管或血管样结构的形成。
在另一实施方案中，可在用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分前，用内皮细胞接种基质组分，且在内皮细胞或附加的预选的外源性细胞群没有扩增的情况下，稍后即植入移植物。
在另一实施方案中，可用内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群同时或近乎同时接种基质组分。在该实施方案中，可在基质组分上培养内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群，从而使两个细胞群扩增，或在两个细胞群没有扩增的情况下植入移植物。如果内皮细胞扩增，则内皮细胞的扩增可包括或不包括血管或血管样结构的形成。
选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分可有利地提供一种生理环境，支持在基质组分上体外培养的细胞的增殖和分化。因此，可将细胞接种在基质组分上，并按下面所述使用本领域那些普通技术人员已知的标准细胞培养技术培养，从而生产用于植入到需要它的宿主中的组织移植物。
选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分提供支持细胞生长的基质的能力可在植入到宿主中前，提供使内皮细胞群和/或附加的预选的外源性细胞群扩增的机会。如果内皮细胞扩增，则这种扩增可在植入前导致血管或血管样结构的形成(即，移植构造物的体外潜在的血管化)，从而在植入移植构造物后，立即提高移植物的伤口愈合能力。植入移植构造物前的血管或血管样结构的形成或，可选择性地，植入移植构造物前的内皮细胞扩增可提高植入后的移植物的伤口愈合能力，如通过促进在移植构造物表面上生长的细胞的分化和迁移，并通过促进细胞在移植构造物内的增殖而实现。
植入前，在基质组分上培养加入的内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群的实施方案中，细胞是在有利于细胞生长的条件下，在基质组分上培养的。所培养的细胞可与基质组分直接或间接接触(例如，流体连通)。有利于细胞生长的条件是环境条件，如无菌技术、温度(例如，约37℃)和营养供给，这些对于在目前组织和细胞培养所接受的过程下进行的细胞生长而言，被认为是最佳的。虽然最佳培养条件取决于特定的细胞类型，但细胞生长条件通常是本领域熟知的。
本发明的基质组分可以各种形式被用作移植材料，并在植入移植构造物前，用于体外培养内皮细胞和其它细胞类型。这些形式包括片样构型、凝胶形式、流化组分(例如，通过粉碎或消化组织)、和提取物，用于加入本领域-认可的细胞/组织培养基。基质组分或其成分可提供用于细胞粘附的表面和/或可诱导分化和/或增殖。在组织/细胞培养应用中使用之前，优选将基质组分灭菌，然而，如果细胞培养基中包含抗生素的话，也可使用未灭菌的组分。
在其中一个实施方案中，植入移植构造物前，在有利于细胞增殖以用于细胞培养的条件下，在肝基底膜组织片上直接接种细胞。这种组织的多孔性使细胞营养物在基质中扩散。因此，细胞可被接种在肝基底膜任一侧上并培养。
在植入移植构造物前接种在基质组分上的内皮细胞和/或附加的预选的外源性细胞群可在有营养物，包括矿物质、氨基酸、糖、肽、蛋白、或糖蛋白、如层连蛋白和纤连蛋白、和/或生长因子如表皮生长因子、血管内皮细胞-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子样分子、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子、或其它血清生长因子存在的条件下生长。在其中一个实施方案中，流化或粉末形式的基质组分可用于补充标准细胞培养基，从而提高支持并诱导细胞体外增殖的能力，并诱导体内重塑。在有可商业得到的细胞培养液体培养基(含血清或不含血清)存在的条件下，使细胞在基质组分上生长。
在其中一个实施方案中，与基质组分和内皮细胞组合的至少一种附加的预选的细胞群可以是平滑肌细胞和/或能够分化成平滑肌细胞的祖细胞，从而促进(连同内皮细胞)血管或血管样结构在移植构造物中形成。已知用肝素酶处理平滑肌细胞可诱导增殖细胞的表型改变性质。因此，在用内皮细胞和至少一种预选的外源性细胞群，包括平滑肌细胞群和/或平滑肌细胞祖细胞群接种基质组分的实施方案中，肝素酶可包括在细胞培养基中。例如，来源于肝素鞘氨醇杆菌的4个单位/ml的肝素酶可短时间(例如，6小时)包含在培养基中或可持续存在于培养基中。
还已知作为细胞的亚汇合单层被接种在基质上的平滑肌细胞经历与分裂能力相关的表型改变。如果将平滑肌细胞与内皮细胞的汇合单层共同培养，则表型改变被抑制。因此，在用内皮细胞和至少一种预选的外源性细胞群，包括平滑肌细胞群和/或平滑肌细胞祖细胞群接种基质组分的实施方案中，可将加入的内皮细胞接种在基质组分上，从而使细胞与基质组分粘附作为细胞的亚汇合单层。在另一实施方案中，可将内皮细胞、平滑肌细胞、和/或平滑肌祖细胞接种在基质组分上，这样细胞就可与基质组分粘附作为细胞的亚汇合单层。
在其中一个实施方案中，所要求保护的包括基质组分、加入的内皮细胞、和附加的预选的外源性细胞群的组合物可被包封在生物适合性基质中，用于植入到宿主中。包封的基质可被构造成使营养物扩散至包封的细胞，同时使包封细胞的产物从包封的细胞扩散至宿主细胞。用于包封活细胞的适宜的生物相容性聚合物是本领域那些技术人员已知的。例如，聚赖氨酸/藻酸盐包封过程先前已经由F.Lim和A.Sun(Science，Vol.210，pp.908-910)描述。事实上，按照本发明，肝基底膜本身可被有利地用于包封基质上的细胞，作为人工器官植入。
在其中一个实施方案中，提供一种用于增强组织移植构造物体内血管化的方法。该方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群体外接种选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，从而形成移植构造物，并将移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位。在该方法的其中一个实施方案中，可用内皮细胞接种基质组分，并在将所述构造物植入到受影响区域中前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成。在用内皮细胞接种移植物后且在体内植入移植物前的任何时间，可用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分。因此，根据植入移植构造物前在基质组分上培养预选细胞群的时间的不同，在将移植构造物植入到受影响区域中前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增。
可选择性地，可在用内皮细胞接种基质组分后，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，并在植入移植物前，在基质组分上培养内皮细胞，从而使内皮细胞扩增而不会诱导血管或血管样结构的形成。在该实施方案中，根据植入移植构造物前在基质组分上培养内皮细胞的时间的不同，在将移植构造物植入到受影响区域中前，附加的预选的细胞群可扩增或没有扩增。
在另一实施方案中，可在用内皮细胞接种基质组分后，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，且随后即植入移植物，而内皮细胞或附加的预选的外源性细胞群没有扩增。
在本方法的选择性实施方案中，可用附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，并在植入移植构造物前，在基质组分上培养预选的细胞群，从而使预选的细胞群扩增。在该实施方案中，可在用预选细胞群接种基质组分后且体内植入移植物前的任何时间，用内皮细胞接种基质组分。因此，根据植入移植物前通过在基质组分上培养细胞而使内皮细胞扩增的时间的不同，在将移植构造物植入到受影响区域之前，内皮细胞可能扩增或没有扩增。如果内皮细胞扩增，则内皮细胞的扩增可能包括或不包括血管或血管样结构的形成。
在另一实施方案中，可在用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分后，用内皮细胞接种基质组分，且可随后即植入移植物，而内皮细胞或附加的预选的外源性细胞群没有扩增。
在另一实施方案中，可用内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群同时或近乎同时接种基质组分。在该实施方案中，可在基质组分上培养内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群，从而使两种细胞群扩增，或可在两种细胞群没有扩增的情况下植入移植物。如果内皮细胞扩增，则内皮细胞的扩增可包括或不包括血管或血管样结构的形成。
本发明还提供一种用于修复患病或受损组织的血管化组织移植构造物。血管化移植构造物包括选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，而且还包括加入的内皮细胞，和至少一种附加的预选的外源性细胞群，其中已经在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够体外形成血管或血管样结构。
在另一实施方案中，提供一种增强组织移植构造物体内血管化的方法。该方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，在基质组分上体外培养内皮细胞和附加的细胞群一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成，并将移植构造物植入到需要修复部位的脊椎中。
本发明的基质组分可用最初较小的细胞群接种，它们可在植入前体外扩增。有利地，用内皮细胞接种可在基质组分上体外培养内皮细胞后，立即诱导移植物的血管化。此外，还可用平滑肌细胞或平滑肌细胞祖细胞或其它细胞类型，如成纤维细胞接种基质组分，从而促进血管化。
在该实施方案中，用内皮细胞接种基质组分，并在将所述构造物植入到患病区域中前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成。在用内皮细胞接种基质组分后且体内植入移植物前的任何时间，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分。因此，根据植入移植物前，在基质组分上培养预选细胞群时间的不同，在将移植构造物植入到受影响区域中前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增。
在选择性实施方案中，可用附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，并在植入移植构造物前，在基质组分上培养预选细胞群，从而使预选细胞群扩增。在该实施方案中，用预选细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。在该实施方案中，在将移植构造物植入到受影响区域中前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够使内皮细胞扩增形成血管或血管样结构。
在另一实施方案中，可用内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群同时或近乎同时接种基质组分。在该实施方案中，在植入移植物前，在基质组分上培养附加的预选的外源性细胞群和内皮细胞，从而使两种细胞群扩增。
还提供了一种制备用于修复患病或受损组织的组织移植构造物的方法。该方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，从而形成移植构造物。该方法还可包括在将移植构造物植入到受影响区域中前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够诱导血管或血管样结构形成。
所述基质组分可从肝基底膜(LBM)制造，该肝基底膜(LBM)是通过从脊椎动物肝脏组织的天然伴随的细胞成分中分离LBM而制备的。下面描述的制备技术提供一种胞外基质组分，它主要是由基本上没有任何细胞成分的LBM组成。
用于本发明基质组分中的基底膜通常是从自动物采集的肝脏组织制备的，所述动物被饲养用于肉食生产，包括，例如，猪、牛、和羊或其它脊椎动物。因此，用于本发明组分制备的肝脏组织的商业来源较为便宜。当LBM组分用于本发明的送递系统时，所述组分不会诱导不利的宿主免疫反应。
为了制备无细胞的LBM组分，用细胞解离溶液处理肝脏组织一段时间，这段时间足够从胞外成分释放肝脏组织的细胞成分，而基本上不会破坏胞外成分，并从胞外成分中分离细胞成分。通常所述细胞解离溶液包括离液剂或酶或两者。
制备LBM的第一步是将肝脏组织段切成片(例如，条或片)，从而增加肝脏组织的表面积-体积比。可将肝脏组织切成一系列均具有约50-约500微米、更优选约250-约300微米厚度的片。新采集的肝脏组织可使用标准的肉类切片机切片，或可将组织冷冻并用低温切片机切片。然后用溶液处理肝脏组织薄片，从相关的胞外基底膜基质中释放肝细胞成分。
可用含酶，例如，蛋白酶，如胰蛋白酶或胃蛋白酶的溶液处理肝脏组织。由于LBM的胶原结构和希望使膜结构在细胞解离过程中的降解最小，应将细胞解离所用的酶溶液中的胶原特异性酶活性减到最小。此外，通常还可用钙螯合剂或离液剂(例如，Triton X-100)处理肝脏组织。因此，肝脏组织是通过将组织的片或条混悬于含酶和离液剂的细胞解离溶液中而处理的。然而，细胞解离还可在没有用酶处理组织的情况下，使用钙螯合剂或离液剂进行。
细胞解离可通过在搅拌下将肝脏组织切片混悬于含有约0.05重量％-约2重量％、更优选约0.1重量％-约1重量％的蛋白酶溶液中进行，所述溶液还可任选含有离液剂或钙螯合剂，它们的用量可有效使细胞从基底膜的释放和分离达到最佳，且基本上不会降解膜基质。
使肝脏组织与细胞解离溶液接触一段时间，这段时间足够从基质中释放所有细胞后，用盐水冲洗所得LBM一次或多次，并任选以冷冻的水化状态或部分脱水的状态贮藏直到使用。细胞解离可能需要若干次处理以从基底膜中基本上释放出所有细胞。还可将所得LBM制剂进一步处理以除去或抑制任何残留的酶活性。例如，可将所得基底膜加热或用一种或多种蛋白酶抑制剂处理。
在另一实施方案中，可如下制备LBM。使用标准肉类切片机将新采集的肝脏组织切成一系列均具有约50-约2000微米厚度的片，或将组织冷冻并用肉类切片机或低温切片机切片。然后用例如去离子水、盐水、或缓冲溶液冲洗肝脏组织一次或多次，并任选以冷冻的水化状态或部分脱水的状态贮藏直到使用。例如，可用去离子水、生理盐水、或缓冲液冲洗肝脏的片或条3次共30分钟。然后例如使用筛滤去肝脏切片的冲洗溶液，且可在滤网上揉搓各肝脏切片，或用超声加快肝细胞的裂解并且机械解离肝基底膜中的肝细胞和肝细胞片段。
然后使肝脏组织薄片与含蛋白酶，如胰蛋白酶的溶液接触，从伴随的胞外基底膜基质释放肝细胞和其它成分。由于肝基底膜的胶原结构和希望使膜结构在细胞解离过程中的降解减到最小，应将蛋白酶消化步骤中所用的酶溶液中的胶原特异性酶活性减到最小。通常还可使肝脏组织与钙螯合剂如EDTA接触，同时进行蛋白酶处理。
在其中一个优选实施方案中，蛋白酶消化步骤是通过使肝脏组织切片与溶液接触而进行的，任选同时进行搅拌，所述溶液含有0.02重量％的胰蛋白酶和约0.05重量％浓度的EDTA。所述蛋白酶消化步骤优选同时进行加热，通常是在约37℃下。上述冲洗和机械解离步骤可在蛋白酶消化步骤后重复进行。
然后使肝脏切片与含有非-变性洗涤剂的溶液接触。该步骤优选在室温下进行，且任选同时进行搅拌。所述非-变性洗涤剂优选3％Triton X-100。上述冲洗步骤在使肝切片与非-变性洗涤剂接触以除去大多数(如果不是全部)非-变性洗涤剂后重复。根据需要可重复机械解离步骤。
用非-变性洗涤剂处理后，使肝脏切片与含变性洗涤剂的溶液接触。该步骤优选在室温下进行且任选同时进行搅拌。所述变性洗涤剂优选4％脱氧胆酸盐。然后按照上面所述充分冲洗LBM，以除去尽量多的残留的洗涤剂，并可贮藏LBM(例如，4℃下，在去离子水中)直到再次使用或可在纯化步骤后立即使用。
制备后，可按照美国专利US 5,275,826所述，采用与流化粘膜下层制备相似的方式将LBM流化，该文献的内容引入此处作为参考。LBM是通过撕、切、磨、剪切等粉碎的。虽然通过使肝基底膜混悬液在高速(高剪切)搅拌器中经过处理并脱水，如果需要，通过离心并倒出多余的水也可获得较好的结果，但优选以冷冻或冻干状态研磨肝基底膜。此外，可通过用蛋白酶，例如胶原酶和或其它适宜的酶，如聚糖酶，或其它可破坏基质结构成分的酶进行一段时间的酶消化而将粉碎的流化组织溶解，这段时间足够使组织溶解并形成基本上均匀的溶液。
用于本发明透皮或透粘膜药物送递的流化LBM的粘度可通过控制LBM成分的浓度和水化程度而操纵。可将粘度调节至25℃下的约2-约300,000cps。更高粘度的制剂，例如，凝胶可通过透析消化的物质，然后调节溶液的pH至约5.0-约9.0而从LBM消化溶液制备。
LBM还可以提取物的形式制备。简单的说，4℃下，搅拌下将LBM混悬于提取缓冲液中约24小时。然后在4℃下，以12,000xg离心提取混合物约30分钟并收集上清液。然后用提取缓冲液洗涤不溶性物质，并重复离心步骤，将洗涤液与原始上清液混合。用去离子水充分透析上清液(MWCO约3500)，以12,000xg离心透析液。上清液可立即使用或冷冻干燥贮藏。
粉末形式的LBM也可用于本发明中。粉末形式是通过在液氮下粉碎所述组织而产生0.1-1mm2大小的颗粒而制备的。然后将颗粒状组分冷冻干燥过夜并灭菌，形成固体、基本无水的颗粒状复合物。可选择性地，可通过将粉碎LBM的混悬液或溶液干燥而从流化的LBM形成粉末形式的LBM。在植入本发明的移植构造物前，粉末形式或流化形式或凝胶或提取物形式的LBM可用于体外培养内皮细胞和预选的细胞群。
MATRIGEL、ALLODERM、和INTEGRA、DERMAGRAFT、PERI-GUARD、和APPLIGRAF是可商业得到的已加工胶原组分。纯化和已加工的胶原组分还可通过本领域已知的方案制备。例如，见美国专利US 6,127,143、5,814,328、5,108,424、和4,883,864，它们引入此处作为参考。
实施例1肝基底膜组分的制备实验中所用的2mM EDTA缓冲的离液溶液140mM NaCl5mMKCl0.8mM MgSO40.4mM KH2HPO42mMEDTA25mM NaHCO3过程肝脏切片的制备用低温切片机将在-70℃冷冻的肝脏切成约50μ的厚度。然后使肝脏组织的切片经过酶处理(0.1％胰蛋白酶)，其中使用上述的离液溶液(2mM EDTA)。
将肝脏切片放在5个50ml的试管中，每个试管都含有25ml缓冲的酶处理溶液。在37℃的水浴中孵育肝脏组织1小时，同时轻轻振摇。室温下，采用搅拌/振摇，用PBS洗涤肝脏切片1小时。重复上述酶处理步骤3次。将冷冻组织切成1cm3，在液氮下用工业搅拌机粉碎成小于2mm2的颗粒并于使用前在-80℃贮藏。
肝基底膜提取物的制备用于这些研究的提取缓冲液包括4M胍和2M尿素，每个都是在50mMTris-HCl，pH7.4中制备的。4℃下，将粉末形式的肝基底膜混悬在适当的提取缓冲液(25％w/v)中，所述提取缓冲液包含均为1mM的苯甲基磺基氟化物、N-乙基马来酰亚胺、和苄脒(蛋白酶抑制剂)，用力搅拌24小时。然后在4℃下，12,000xg离心提取混合物30分钟，并收集上清液。在提取缓冲液中简单洗涤不溶性物质，离心，并将洗涤液与原始上清液混合。在Spectrapor管(MWCO 3500，Spectrum MedicalIndustries，Los Angeles，CA)中，用30个体积的去离子水充分透析上清液(72小时更换9次)。12,000xg离心透析液除去所有不溶性物质，立即使用上清液或冻干贮藏。
流化的肝基底膜的制备上述粉碎材料的部分消化是通过将5g粉末状组织加入到100ml含有溶于0.5M醋酸中的0.1％胃蛋白酶的溶液中，并在4℃下消化72小时而进行的。部分消化后，4℃下12,000rpm离心混悬液20分钟，弃去不溶性颗粒。4℃下，多次更换0.01M醋酸而透析上清液(MWCO3500)。通过向LBM水解产物中加入氯仿(5ml氯仿加入900ml 0.01M醋酸)而将溶液灭菌。额外更换两次无菌的0.01M醋酸而继续透析LBM，从而除去氯仿。然后将透析包的内含物无菌转移到无菌容器中。4℃下贮藏所得的流化组分。
肝基底膜凝胶组分的制备为了制备凝胶形式的LBM，将8ml流化LBM与1.2ml 10xPBS缓冲液(含5mg/L酚红的10x磷酸盐缓冲生理盐水)混合；加入0.04N HCl(约1.6ml)调节pH至6.6-7.4，然后加入0.05N Na0H(约1.2ml)，改变pH至＞8。用水将终体积调节至12ml。
实施例2内皮细胞的生长肝基底膜是按照上面所述制备的。经由各种技术(γ射线照射、过乙酸等)灭菌后，将组织夹在聚丙烯框架内，产生平坦的表面区域(50mm2)用于细胞生长。将框架浸没在组织培养基中，使培养基营养物进入肝基底膜的表面。将内皮细胞和平滑肌细胞(3×104个细胞/组织切片)接种在肝基底膜上，然后放在37℃的5％CO2、95％空气的培养箱中。各个时间周期后，将接种的肝基底膜固定在10％中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并切片(6μm)。进行各种组织学和免疫组织化学染色过程，从而确定细胞生长特性。利用这些过程观察血管或血管样结构。
权利要求
1.一种用于修复患病或受损组织的具有血管样结构的组织移植构造物，所述组织移植构造物包括选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，加入的内皮细胞，及至少一种附加的预选的外源性细胞群，其中所述附加的细胞群可增强所述血管样结构在所述移植构造物中形成的开始。
2.根据权利要求1所述的移植构造物，其中所述至少一种附加的细胞群包括选自角化上皮细胞、未角化上皮细胞、和中胚层来源细胞的细胞群。
3.根据权利要求1所述的移植构造物，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞群。
4.根据权利要求1所述的移植构造物，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞祖细胞群。
5.根据权利要求1所述的移植构造物，其中所述至少一种附加的细胞群包括成纤维细胞。
6.根据权利要求1所述的移植构造物，它还包括肝素酶。
7.根据权利要求1所述的移植构造物，它还包括选自血管内皮细胞-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子样分子、转化生长因子β、和血清生长因子的生长因子。
8.根据权利要求1所述的移植构造物，其中用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分。
9.根据权利要求1所述的移植构造物，其中用附加的预选的细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。
10.根据权利要求1所述的移植构造物，其中用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时或近乎同时接种基质组分。
11.一种用于增强组织移植构造物的体内血管化的方法，所述方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群体外接种选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，以形成移植构造物，其中所述附加的细胞群可增强所述移植构造物血管化的开始；并将所述移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括选自角化上皮细胞、未角化上皮细胞、和中胚层-来源细胞的细胞群。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞群。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞祖细胞群。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括成纤维细胞群。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述移植构造物还包括肝素酶。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述移植构造物还包括选自血管内皮细胞-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子样分子、转化生长因子β、和血清生长因子的生长因子。
18.根据权利要求11所述的方法，进一步包括在所述基质组分上培养所述内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够在将所述移植构造物植入到脊椎动物中之前体外形成血管或血管样结构。
19.根据权利要求11所述的方法，其中用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分。
20.根据权利要求11所述的方法，其中用附加的预选的细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。
21.根据权利要求11所述的方法，其中用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时或近乎同时接种基质组分。
22.根据权利要求18所述的方法，其中用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分。
23.根据权利要求18所述的方法，其中用附加的预选的细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。
24.根据权利要求18所述的方法，其中用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时接种基质组分。
25.根据权利要求19、20或21任何一项所述的方法，其中在植入移植构造物前，内皮细胞或附加的预选的细胞群均没有扩增。
26.根据权利要求19、20或21任何一项所述的方法，进一步包括以下步骤在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够使内皮细胞在没有体外形成血管或血管样结构的情况下扩增，并在基质组分上培养附加的预选的细胞群一段时间，这段时间足够在将移植构造物植入到脊椎动物中之前，使附加的预选的细胞群扩增。
27.根据权利要求19、20或21任何一项所述的方法，进一步包括在基质组分上培养内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够使内皮细胞在没有体外形成血管或血管样结构的情况下扩增。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述附加的预选的细胞群在植入移植构造物前没有扩增。
29.根据权利要求19、20或21任何一项所述的方法，进一步包括在基质组分上培养附加的预选的细胞群一段时间的步骤，这段时间足够在植入移植构造物前，使预选的细胞群扩增。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述内皮细胞在植入移植构造物前没有扩增。
31.根据权利要求22、23或24任何一项所述的方法，其中所述附加的预选的细胞群在植入移植构造物前扩增。
32.根据权利要求22、23或24任何一项所述的方法，其中所述附加的预选的细胞群在植入移植构造物前没有扩增。
33.一种制备用于修复患病或受损组织的具有血管样结构的组织移植构造物的方法，所述方法包括用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群体外接种选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分的步骤，其中所述附加的细胞群可增强所述血管样结构在所述移植构造物中形成的开始。
34.根据权利要求33所述的方法，进一步包括在将所述移植构造物植入到脊椎动物中之前，在所述基质组分上培养所述内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够体外形成血管或血管样结构。
35.一种用于增强移植构造物的体内血管化的方法，所述方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群体外接种选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，其中所述附加的细胞群可增强所述移植构造物血管化的开始；在所述基质组分上体外培养所述内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成；并将所述移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括选自角化上皮细胞、未角化上皮细胞、和中胚层-衍生细胞的细胞群。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞群。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞祖细胞群。
39.根据权利要求35所述的方法，其中用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分。
40.根据权利要求35所述的方法，其中用附加的预选的细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。
41.根据权利要求35所述的方法，其中用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时接种基质组分。
42.一种用于修复患病或受损组织的血管化组织移植构造物，所述组织移植构造物包括选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，加入的内皮细胞，以及至少一种附加的预选的外源性细胞群，其中所述内皮细胞已经在所述基质组分上培养过一段时间，这段时间足够体外形成血管或血管样结构，且其中所述附加的细胞群可增强所述移植构造物血管化的开始。
43.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或42任何一项所述的移植构造物，其中所述基质组分包括肝基底膜。
44.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或42任何一项所述的移植构造物，其中所述基质组分包括源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原。
45.一种治疗患者中患病或受损组织的方法，包括使用权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或42任何一项所述的组织移植构造物修复患病或受损组织。
全文摘要
提供一种用于修复患病或受损组织的组织移植构造物。所述组织移植构造物包括选自肝基底膜及其提取物和水解产物、和源于脊椎动物非粘膜下层来源的已加工胶原的基质组分，加入的内皮细胞，以及可增强血管样结构在移植物中形成开始的至少一种附加的预选的外源性细胞群。预选的细胞群可以是未－角化或角化的上皮细胞群或选自成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多－潜能祖细胞、周细胞、成骨细胞、和任何其它适宜细胞类型的中胚层来源的细胞群，优选以所修复组织为基础选择的细胞群。还提供了用于增强这些组织移植构造物的体内血管化和用于制备这些移植构造物的方法。
文档编号A61K35/34GK1665527SQ03815572
公开日2005年9月7日 申请日期2003年5月1日 优先权日2002年5月2日
发明者S·F·巴戴拉克 申请人:普渡研究基金会