专利名称：水龙骨属提取物的新型治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种水龙骨属提取物的新型治疗剂，特别是治疗纤维化病症。
背景技术：
组织纤维化是以细胞外基质(主要是胶原蛋白和纤维结合蛋白)过度表达和纤维原细胞增生为特征的慢性病症。
近来，人们发现，转化生长因子β(TGF-β)涉及所有的纤维化病症，并且TGF-β独立诱导了病症ECM蛋白的表达。例如硬皮症、肝纤维化、骨髓纤维化、心脏纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、胰纤维化、肾纤维化、杜普伊特伦氏病、或者佩罗尼氏病可以引证为纤维化疾病。
佩罗尼氏病的历史、病因学及其流行病学均不为人所知。遗传因子、创伤因子、高动脉压、和/或先天因子均可以作为佩罗尼氏病的发病因子。
临床发现，在佩罗尼氏病患者阴茎的白膜中有纤维状物质生成，并且在病症初期产生疼痛的疤斑。在阴茎勃起的过程中，病斑造成阴茎的内弯曲，病症晚期会使性生活困难或者妨碍性生活。在某些情况下，临床症状还包括勃起时阴茎丧失刚性。
据报道，与其它纤维化病症相同，TFG-β也涉及佩罗尼氏病，在佩罗尼氏病患者体内此蛋白含量升高。此外，常规的佩罗尼氏病还与其它纤维化疾病相关联，主要是杜普伊特伦氏病或者佩吉特氏病。
对纤维化疾病新型治疗方法的寻找集中在可以抑制转化生长因子(TFG-β)的产物上，此蛋白可以诱导ECM蛋白的合成。然而，参照生命体内病斑的临床改善或者胶原蛋白减少获得的结果，TFG-β减少在生命体外研究与动物模型之间没有明显的关联性。
EL-Sakka等人(J Uro 1999 Jun；161(16)1980-3)公开了，秋水仙素降低了通过在其阴茎上注射TGF-β患有佩罗尼氏病鼠的TGF-β表达。
然而，Reinhart等人(Dtsch Z Verdau Stoffwechselkr 1986；46(5)257-75)公开了，使用秋水仙素治疗肝脏纤维化疾病时，对于纤维化程度改善、恶化或者没有变化的三种情况，获得了相同的几率。
对于佩罗尼氏病症，Kadioglu等人(Int Impot Res.2000 Jun；12(3)169-75)公开了，60位佩罗尼氏病患者经过10个月秋水仙素治疗，30％患者阴茎内弯曲症状得到改善，22％患者病情恶化，48％患者没有变化。
当前，由于其在生命体外具有抑制TGF-β的活性(Ralph etal，the treatment of Peyroni’s disease with Tamoxifen.BrJ Urol.1992，70684-651)，三苯氧胺是佩罗尼氏病的一种治疗剂。然而，三苯氧胺的临床效果很差。因此，Teloken C等人(TheTamoxifen versus placebo in the treatment of Peyronies diseases，JUrol.1999 Dec；162(6)2003-5)公开了，在可比临床实验中，三苯氧胺与空白对照剂之间的测定结果相似。
减少病斑的其它方法包括向海绵体内注射多种药剂，例如干扰素α-2b、戊脉安、或者类皮质激素。此用药线路会给患者带来痛苦，因此，此药物的施用必须由有资格的人员完成。上述药物的施用会造成副作用干扰素会造成发烧、不适和mialgia；将类皮质激素在病斑内施用，会产生坏疽；口服用药的三苯氧胺会降低患者的性欲望和eyaculate。
现有技术中已经公开，水龙骨属提取物具有不同的药用活性。EP-0503.208、ES-2.088.770、EP1172111和EP1172111的现有技术公开了水龙骨属提取物的不同药用活性。所述药用活性可以概括为免疫活性和控制不同细胞因子的数目；控制粘着分子；抑制神经变性疾病的活化；抗炎活性和产生胶原蛋白的活性。
因此，最接近的现有技术公开了水龙骨属提取物的产生胶原蛋白活性，及其在以缺乏胶原蛋白为特征病理中的应用。
EP-503.208公开了，水龙骨属提取物具有刺激成纤维细胞的活性，以及合成前胶原蛋白的活性。
另外，FR2.479.690公开了，在治疗缺乏胶原蛋白的骨运动原系统疾病中水龙骨科提取物的应用。因此，该文章显示，水龙骨属提取物增加了胶原蛋白的合成，并且生成的胶原蛋白更具耐久性。
发明概述本发明解决的问题是实现对纤维化疾病的有效药理治疗，例如硬皮症、肺纤维化、肾纤维化、动脉粥样硬化、胰纤维化、心脏纤维化、肝纤维化、骨髓纤维化、杜普伊特伦氏病、特别是佩罗尼氏病，其中所述病理是以细胞外基质(ECM)过度表达为特征的。
如权利要求1所述，发明者提供的方案是水龙骨属提取物的应用。
发明者已经发现，水龙骨属提取物在生命体外以剂量依赖的方式抑制纤维蛋白与纤维结合蛋白的合成。此种能力同样在生命体内得到了证实；水龙骨属提取物减少了佩罗尼氏病(一种以阴茎中纤维结合蛋白为特征的纤维化疾病)患者的胶原纤维病斑。
水龙骨属提取物所解决的另一个问题是，所述提取物降低了转化生长因子β的表达。如权利要求2所述，此蛋白涉及所有的纤维化病症。此外，与三苯氧胺(控制TGF-β的参照药物)造成的TGF-β减少相比，生命体内由水龙骨属提取物造成的TGF-β减少更加显著。
如技术人员所公知，以水龙骨属提取物用药不产生任何副作用，从而避免了采用抗细胞因子疗法产生的副作用。
在优选的具体实施方式
中，水龙骨属提取物用药解决的问题是改善了与佩罗尼氏病有关的临床参数，如权利要求3所述，它们是水龙骨提取物口服用药后，阴茎白膜中纤维化的病斑数量减少，性行为过程中的疼痛减轻，阴茎内弯曲程度减弱，患者的心理获得了改善。佩罗尼氏病患者经过水龙骨属提取物治疗获得的临床效果优于其它药剂产生的治疗效果。
如权利要求9所述，口服用药解决了与注射入佩罗尼氏病斑用药有关的各种问题上述注射用药必须由技术人员完成，且用药过程给患者带来了痛苦。
在
具体实施例方式
中，采用电介常数大于20的极性溶剂提取，获得水龙骨属提取物。如权利要求4、5、6、和7所述，具体地讲，使用水提取获得水龙骨属提取物，更具体地讲，使用水从水龙骨属leucotomos中提取，获得提取物。
为了以参数形式描述本发明提取物，权利要求8显示了提取物中出现的化合物。
发明详述水龙骨属提取物是使用极性溶剂提取获得的，极性溶剂指的是电介常数大于20的溶剂。根据物化手册(54aEdition 1973)下表中列出了一些溶剂的电介常数。
在优选实施方式中，水龙骨属提取物可以通过水提取和蒸发溶剂获得。
此外，还可以使用本领域技术人员所公知和现有技术中公开的其它操作方法，提纯水龙骨属提取物，或者改进其提取物的产量。因此，这些操作方法不会对本发明提取物带来任何其它益处。这些操作方法包括优化植物的干燥条件；溶剂组合；将植物材料去脂；添加防腐剂；添加抗菌剂；添加有利于保存和改善操作的载体；采用超临界流体状态的溶剂提取；优化植物材料采集的时间；采用色谱法提纯；采用活性碳或者其它材料吸附的方式提纯。
在经所在国家官方授权的情况下，本发明所述植物材料是在危地马拉的Montes Mataque地区采集的。
植物种类的分类是由其命名者决定的，因此，根据分类法可以使用不同的名称。
所用植物材料的分类是学名Phlebodium aureum(林内乌斯)亚属Phlebodium属水龙骨属科水龙骨科此外，还存在其它可接受的同义名，例如，Polypodiumaureum(林内乌斯)或者Polypodium leucotomos(Poiret)和其它品种Polypodium aerolatum、Phlebodium aerolatum、Polypodiumaureum var、Aerolatum或者Pleopeltis aurea。
因此，“水龙骨属”指的是水龙骨属内的所有蕨类。
在优选实施方式中，将Polypodium leucotomos(Poiret)的根茎干燥再用水提取，其中根茎与水的比率是1∶10。为了减少微生物的含量，采用膜过滤提取物。低压去除溶剂，得到含水量大约25％的提取物。为了避免微生物污染并且有利于操作，可以向提取物中加入载体(淀粉、乳糖、硬脂酸镁)。以含有120mg干燥水提取物的一次剂量形式将稳定的提取物包裹在胶囊中。
对提取物进行色谱分析(十八烷基硅烷涂布色谱柱，5微米；流动相(3％磷酸∶水∶乙腈/25∶72∶3)；UV210nm下测定)，显示出苹果酸、柠檬酸、延胡索酸、奎尼酸和乳酸。为了达到分析的目的，这些酸作为提取物的标记物。
在纤维化疾病的药物研究中，人体皮肤成纤维细胞培养物是适合的模型，也就是，病状是以细胞外基质(ECM)的过度表达为特征的。
在37℃含有氚化脯氨酸(3H-谱氨酸)的条件下培养24小时，水龙骨属提取物以剂量依赖方式在1、10、50、100、500ug/ml浓度下抑制胶原蛋白的合成。浓度为50ug/ml的水龙骨属提取物抑制胶原蛋白的合成，其数值仅为对照值的40％。
水龙骨属提取物在生命体外抑制了纤维结合蛋白的合成，其叶提取物与根茎提取物都可以抑制纤维结合蛋白的合成。在水龙骨属提取物存在下培养成纤维细胞并进行免疫测定后，水龙骨属提取物以剂量依赖的方式抑制了成纤维细胞的合成，其数值达到对照的40％。
除了具有在生命体外抑制ECM合成的活性以外，水龙骨属提取物还在生命体内表现出具有抑制ECM合成的活性。将水龙骨属提取物对佩罗尼氏病患者生命体内用药后，患者阴茎胶原蛋白病斑的数量减少了，TFG-β表达也降低了。
针对34位佩罗尼氏病患者6个月的临床实验表明，水龙骨组的临床改善与心理改进优于三苯氧胺组。所得的结果差别显著。
测定的结果如下
采用水龙骨属提取物治疗后，所得的结果优于kadioglu等人公开的结果(Int.J Impot Res.2000Jun；12(3)169-75)。这些作者说明，使用秋水仙素治疗10个月的佩罗尼氏病患者中，30％的患者阴茎内弯得到改善，48％保持不变，22％病情恶化。
采用每隔8小时口服720mg水龙骨属提取物，治疗水龙骨组的患者。
采用每隔24小时口服20mg三苯氧胺，治疗三苯氧胺组的患者。
两组中患者的年龄相似。
通过身体检查与阴茎ecography确定病斑数量。
通过照片确定阴茎的内弯曲程度。
与初始数值相比，经过处理后水龙骨组中TGF-β生成量降低了22％，而三苯氧胺组中只降低了5％。
与初始数值相比，经过处理后水龙骨组中IL-10生成量降低了17％，而三苯氧胺组中降低了79％。
治疗后，67％的水龙骨组患者表示满意，而三苯氧胺组只有45％。
附图详述
图1.由水龙骨属提取物产生的对胶原蛋白合成的抑制每一个值表示的是4个平行实验的平均值。并且表示出标准偏差。
图2.由水龙骨属提取物产生的对纤维结合蛋白合成的抑制每一个值表示的是3个平行实验的平均值。并且表示出标准偏差。
图3.由水龙骨属提取物产生的对纤维结合蛋白合成的抑制每一个值表示的是3个平行实验的平均值。并且表示出标准偏差。
具体实施例方式实施例1.水龙骨属提取物对细胞外基质的影响水龙骨属提取物先用提取48小时，再用膜过滤，接着，低压下去除溶剂，然后，再次溶解在生理浆液中，最后冷冻干燥，获得水龙骨属提取物。提取物可以溶解在PBS中，再生后使用。
细胞培养从外科材料获得成纤维细胞。将皮肤断片放入4℃的RPMI1640介质和2％(双倍用量)的青霉素和链霉素溶液，预培养2小时。去除脂肪组织后，将皮肤切成小片固定在胎牛血清(FCS)润湿的微孔中。在5％CO2气体环境下，将皮肤细胞培养在含有10％FCS和1％青霉素/链霉素溶液的RPMI1964介质中。此介质每周更新两次。成纤维细胞先在Tripsin与EDTA(0.05％/0.02％)溶液中培养，然后传代培养用于实验。仅使用第4-14代获得的细胞。
胶原蛋白的合成在组织培养的微量平板中获得人体皮肤的成纤维细胞。在每个微孔中将10,000个细胞种植在含有10％FCS和50μg/ml L-抗坏血酸的100μl RPMI介质中。在5％二氧化碳环境下培养24小时后，使用含有不同浓度水龙骨属提取物(1-1000μg/ml)和1μCi3H-脯氨酸的100ml新鲜介质更新介质。接着，培养24小时后，加入含有1％胃蛋白酶的100μl的1M冷乙酸提取胶原蛋白，4℃下将介质过夜培养。在4℃下完成下述步骤将微孔中的物质转移至3ml聚丙烯试管中；加入含有鼠皮肤胶原蛋白可溶盐的800ml的0.5M乙酸，用做稀释剂；在4000g下将试管离心20分钟；然后，将上清液转移至干净的试管中，并废弃沉淀物；再向0.5M乙酸中加入250μl的25ml氯化钠溶液，沉淀胶原蛋白；在4000g下离心试管2小时；接着，将沉淀物再次溶解在pH7.5并含有0.15摩尔氯化钠的0.05M Tris-HCl溶液中；再加入2ml的4.5M溶液沉淀胶原蛋白；2个小时后，在4000g下离心试管30分钟；废弃上清液，并使用2ml的2％乙醇清洗沉淀的胶原蛋白；在4000g下离心所得溶液30分钟；最后，将每种沉淀物溶解在250μl的0.5M乙酸中。将溶液转移至含有5-10ml闪烁溶液的闪烁小瓶中。按照Webster和Harvey所述的方法(生物化学分析96，220-224，1979)，在液体闪烁计数器中参照外部标准，测定其放射性。
纤维结合蛋白的合成在微孔平板中培养成纤维细胞，初始密度是20,000细胞/毫升，所用的介质是未含FCS的RPMI。
在5％二氧化碳环境37℃下培养细胞24小时。再更新介质。向培养物(1-1000μg/ml)中加入不同浓度的水龙骨属提取物。然后，使用含有1％牛血清蛋白(BSA)和土温20的PBS将细胞清洗3次。接着，使用水与丙酮(体积比为1∶1)溶液固定细胞30分钟，再如上所述清洗细胞3次。使用鼠产生的单克隆抗-纤维结合蛋白抗体(Sigma F-7384)培养细胞。清洗后，在37℃下使用羊产生的抗-鼠IgG(强特效性)-碱性磷酸酶抗体培养细胞1小时。再次，将细胞清洗3次，在黑暗中使用浓度为1mg/ml的磷酸p-硝基苯酯溶液，培养细胞15分钟。
然后，在200g下离心微量平板5分钟，再将100μl上清液转移到新的微量平板中。使用ELISA读数器，测定405nm处的吸光度。
结果水龙骨属提取物抑制胶原蛋白合成的效果所得结果如下
图1图解说明了上述结果。
水龙骨属提取物抑制纤维结合蛋白合成的效果3个平行实验所得的结果如下
从叶获得的水龙骨属提取物抑制纤维结合蛋白合成的效果。
3个平行实验所得的结果如下
图3图解说明了上述结果。
权利要求
1.水龙骨属提取物在制备治疗纤维化疾病药物组合物中的应用，纤维化疾病的举例有硬皮症、肺纤维化、动脉粥样硬化、骨髓纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、杜普伊特伦氏病、佩罗尼氏病。
2.权利要求1的水龙骨属提取物的应用，其特征在于所述提取物降低了转化生长因子β(TGF-β)的表达。
3.权利要求1和2的水龙骨属提取物的应用，其特征在于所述提取物至少减少了佩罗尼氏病患者阴茎的内弯曲程度，或者减少了其阴茎病斑的数量，减轻了其性交时的痛苦，或者使患者获得心理方面的改善。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求的水龙骨属提取物的应用，其中药用组合物含有通过电介常数大于20溶剂提取获得的水龙骨属提取物。
5.权利要求4的水龙骨属提取物的应用，其中药用组合物含有采用溶解水溶性化合物方式提取获得的提取物。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求的应用，其中提取物是从根茎获取的。
7.权利要求6的应用，其中提取物是从水龙骨属leucotomos(Poiret)获取的。
8.根据权利要求1-7中任一权利要求的应用，其特征在于提取物至少含有乳酸、延胡索酸、奎尼酸、柠檬酸或者苹果酸。
9.根据权利要求1-8中任一权利要求的应用，其特征在于药用组合物均口服用药。
全文摘要
本发明涉及一种水龙骨属提取物的新型治疗剂，特别是治疗纤维化病症。水龙骨属提取物在制备治疗纤维化疾病药物组合物中的应用，纤维化疾病的举例有硬皮症、肺纤维化、动脉粥样硬化、骨髓纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、杜普伊特伦氏病、佩罗尼氏病。
文档编号A61P13/12GK1678332SQ03818692
公开日2005年10月5日 申请日期2003年6月5日 优先权日2002年6月6日
发明者埃利塞奥·金塔尼丽亚·阿尔马格罗 申请人:核心制药技术公司