疫苗组合物的制作方法

专利名称：疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及奈瑟氏球菌(Neisserial)免疫原性组合物和疫苗，它们的制备方法以及这种组合物在药物中的用途。更具体而言，它涉及包括抗原组合的疫苗组合物，正如在保护测定法或血清杀菌测定法中所测量的那样，其具有可使本发明的疫苗引发令人惊讶的良好免疫反应的性质。
背景细菌中的奈瑟氏球菌菌株是很多人类病变的病原体，因此需要研制出可抗这些病原体的有效疫苗。特别是，淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)所引起的病变可通过接种疫苗而治疗。
淋病奈瑟氏球菌是淋病的病原体，淋病是全世界所报道的最常见的性传播疾病之一，据估计每年有六千两百万个病例发病(Gerbase等人，1998 Lancet 351；(Suppl 3)2-4)。淋病的临床表现包括泌尿生殖道、咽喉或直肠粘膜炎症以及新生儿眼睛感染。妇女淋球菌(gonococcal)感染上升可导致不孕、子宫外妊娠、慢性盆腔炎和输卵管-卵巢脓肿形成。败血症、关节炎、心内膜炎和脑膜炎均与并发性淋病有关。
大量淋球菌菌株对抗生素产生耐药性导致发病率以及与淋病有关的并发症增加。用抗生素治疗淋病的吸引人的替代方案是利用接种疫苗而预防淋病。目前还没有抗淋病奈瑟氏球菌感染的疫苗。
脑膜炎奈瑟氏球菌是一种重要的病原体，特别是在儿童和年轻人中。败血症和脑膜炎是侵入性脑膜炎球菌病(IMD)的最严重威胁生命的形式。这种疾病由于其较高的发病率和死亡率已经成为全世界的健康问题。
根据荚膜多糖的抗原差异，已经鉴定出了13种脑膜炎奈瑟氏球菌血清组，最普遍的是A、B和C，它们导致全世界90％的该疾病。血清组B是欧洲、美国和拉丁美洲几个国家中脑膜炎球菌病的最普遍原因。
已经研制出了基于血清组A、C、W和Y的荚膜多糖的疫苗，它们表现出可控制脑膜炎球菌病的暴发(Peltola等人，1985 Pediatrics76；91-96)。然而，血清组B的免疫原性较差，且仅主要诱导IgM同种型的短暂抗体反应(Ala’Aldeen D和Cartwright K1996，J.Infect.33；153-157)。因此，目前还没有能够抗导致绝大多数温带国家中大多数该疾病的血清组B脑膜炎球菌的广泛有效的疫苗。尤为严重的是血清型B疾病在欧洲、澳洲和美洲的发生率日益增加，主要是在5岁以下的儿童中。抗血清组B脑膜炎球菌的疫苗的研制提出了一个特有的困难，即由于多糖荚膜与人神经细胞粘着分子的免疫学相似性导致其免疫原性较差。将疫苗生产的方案集中于脑膜炎球菌外膜的表面外露结构，但却被菌株之间这些抗原的显著变异所阻碍。
进一步的研究采用由外膜小泡构成的疫苗，其包括很多构成细菌膜正常内含物的蛋白。这些的其中之一是抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B和C的VA-MENGOC-BCCuban疫苗(Rodriguez等人，1999Mem Inst.Oswaldo Cruz，Rio de Janeiro 94；433-440)。设计这种疫苗用来抗古巴的侵入性脑膜炎球菌病，这种病不能通过使用荚膜多糖AC疫苗进行的接种程序而被消除。流行的血清组是B和C，且VA-MENGOC-BC疫苗已经可以成功控制暴发，据估计该疫苗抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株的效能为83％(Sierra等人，1990 In Neisseria，WalterGruyter，Berlin，m.Atchman等人(eds)p 129-134，Sierra等人，1991，NIPH Ann 14；195-210)。该疫苗可有效抗特异性暴发，然而所引发的免疫反应不能抗脑膜炎奈瑟氏球菌的其它菌株。
随后在拉丁美洲，在由同源和异源血清组B脑膜炎球菌菌株引起的流行病过程中进行的功效研究已在年龄稍大的儿童和成人中表现出一些功效，但它的有效性在感染危险最大的、年龄较小的儿童中明显偏低(Milagres等人，1994，Infect.Immun.62；4419-4424)。这种疫苗在具有多菌株地方病的国家，如UK效果怎样还不肯定。对抗异源菌株的免疫原性的研究仅证实了有限的交叉反应性血清杀菌活性，特别是在婴儿中(Tappero等人，1999，JAMA 281；1520-1527)。
第二种外膜小泡疫苗是在挪威，使用在斯堪的纳维亚流行的那些普遍血清型B分离物研制的(Fredriksen等人，1991，NIPH Ann，14；67-80)。该疫苗已在临床试验中进行了测试，并发现29个月后，它具有57％的保护功效(Bjune等人，1991，Lancet，338；1093-1096)。
然而，外膜小泡在疫苗中的使用与某些问题有关。例如，OMV包括有毒的脂多糖且它们可包括免疫显性抗原，这些抗原或者是菌株特异性的，或者是可变表达的。已经描述过的几个方法都可用于克服外膜小泡制品疫苗的一些问题。WO01/09350描述了例如通过降低毒性并修饰外膜小泡上存在的抗原而解决某些问题的方法。
WO01/52885描述了把外膜小泡与其它抗原组合在一起的可能性且包括了超过2,000种潜在的奈瑟氏球菌蛋白列表，从该列表可推测研制出对更宽血清型范围都具有功效的疫苗。
目前所用的抗-脑膜炎球菌疫苗存在着多种问题。基于蛋白的外膜疫苗倾向于特异性且仅对少数菌株有效。多糖疫苗也是次最优的，这是因为它们倾向于引发较差且短暂的免疫反应，特别是对血清组B(Lepow等人1986；Peltola 1998，Pediatrics 76；91-96)。
奈瑟氏球菌感染提出了一个重要的保健问题，即对淋病奈瑟氏球菌而言，还没有可用的疫苗，或对脑膜炎奈瑟氏球菌而言，仅有有限的抗异源菌株的功效和能力的疫苗。显然需要研制抗奈瑟氏球菌感染更好的疫苗，它们能够改善目前所用疫苗的功效并抗更大范围的菌株。
附图描述

图1.-对由tbpA和hsf表达被上调的重组脑膜炎奈瑟氏球菌菌株制备的OMV中的TbpA和Hsf的检测。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析(4-20％梯度凝胶)分离OMV制品(10μg)。
图2.-在大肠杆菌(E.coli)中产生的重组Hsf过客(passenger)结构域的检测，10μg纯化的Hsf过客蛋白(第2和3道)通过12％SDS-PAGE凝胶上分离，并与分子量标记(第1道)相比较。
图3.-Hap过客纯度的分析，这是通过(A)考马斯染色，(B)银染，(C)抗-His5蛋白质印迹和(D)抗-大肠杆菌检测的。10μg纯化抗原是在4-20％丙烯酰胺梯度凝胶上通过SDS-PAGE分离的。
图4.-从脑膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20分离的FrpA和FrpC蛋白共有的序列相似性区。(A)脑膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20RTX蛋白FrpA和FrpC的结构域组成。(B)从脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76获得的FrpA/C扩增产物。
图5.-重组Frp23(具有23个重复单位的FrpA/C保守区)抗原在大肠杆菌中的表达。用对照载体(pET24d)或重组构建体(分别为Frp3、Frp13和Frp23)转化的大肠杆菌BL21DE3的非诱导(NI)和诱导(I)的总细胞提取物的SDS-PAGE分析。用考马斯蓝(A)将凝胶染色或将凝胶转移到硝化纤维素上并用抗-His6小鼠血清进行免疫检测。
图6.-在大肠杆菌中表达的FHAB2/3rd片段的优选DNA序列。
图7.-来源于诱导大肠杆菌B121DE3提取物的重组FHAB2/3rd的纯化。(A)纯化过程中的主要步骤。(B)对在纯化过程不同步骤采样的蛋白级分进行的SDS-PAGE分析。
图8.-针对脑膜炎奈瑟氏球菌的FHAB2/3rd、Hap、Hap过客结构域、Hsf和Hsf过客结构域抗原的抗-血清的粘附阻断活性。
图9.-表示Hsf、TbpA和NspA在来源于不同脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的外膜小泡制品中的表达水平的考马斯蓝染色凝胶。第1道-分子量标记；第2道-从荚膜多糖被下调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第3道-从荚膜多糖和PorA被下调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第4道-从荚膜多糖和PorA被下调且NspA被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第5道-从荚膜多糖和PorA被下调且Hsf被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第6道-从荚膜多糖和PorA被下调且TbpA被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第7道-从荚膜多糖和PorA被下调且TbpA和Hsf被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第8道-从荚膜多糖和PorA被下调且TbpA和NspA被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡。
详述本发明公开了奈瑟氏球菌抗原的特定组合，当它们组合在一起时，可使疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效令人惊讶地提高。
奈瑟氏球菌感染要经历若干不同的阶段。例如，脑膜炎球菌的生活周期包括鼻咽定居、粘膜附着、进入血流、在血液中增殖、诱导中毒性休克、穿过血/脑屏障并在脑脊液和/或脑脊膜中增殖。细菌表面上的不同分子参与感染周期的不同阶段。通过使用有效量参与奈瑟氏球菌感染的不同过程特定抗原的组合产生免疫反应，可获得具有令人吃惊的较高功效的奈瑟氏球菌疫苗。
具体而言，来源于不同种类的特定抗原的组合可引发针对感染多个阶段的免疫反应，在这些不同种类的特定抗原中，有些参与附着到宿主细胞，有些参与铁的获得，有些是自体转运蛋白而有些是毒素。抗原的这种组合可令人吃惊地提高(优选协同提高)疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效，其中以最佳方式通过免疫反应针对细菌的不止一个功能。
疫苗的功效可通过多种测定法评价。在动物模型中进行的保护测定法是本领域熟知的。此外，血清杀菌测定法(SBA)是最普遍认可的免疫学标记，以评价脑膜炎球菌疫苗的功效(Perkins等人，J Infect Dis.1998，177683-691)。
抗原的某些组合(例如，某些自体转运蛋白和某些铁获得蛋白的组合)可导致动物模型测定法中的保护提高和/或协同产生更高的SBA效价。不希望受到理论的束缚，抗原的这种协同组合可通过抗原组合所产生免疫反应的许多特性实现。抗原本身在奈瑟氏球菌细胞上通常是表面外露的，倾向于保守且未以最佳杀菌反应所需的充足量存在于表面细胞上，该最佳杀菌反应由单独抗该抗原引起的抗体产生。将本发明抗原组合起来生产的制剂可导致杀菌抗体的有利组合，这些杀菌抗体与奈瑟氏球菌细胞的相互作用超出了临界阈值。在这种临界水平下，足量性质良好的抗体与细菌表面结合，从而通过补体有效杀死细菌并因此见到更高水平的杀菌作用。
因为血清杀菌测定法(SBA)可密切反映疫苗候选物的功效，因此通过抗原组合获得的良好SBA效价可很好地表征包括该抗原组合的疫苗的保护功效。本发明涉及分离的或与另一抗原共同富含于混合物中的两种抗原组合的用途。当组合在一起时，这种抗原组合有利地相互作用，且优选协同引发杀菌活性更高的免疫反应(正如在血清杀菌测定法或SBA中所测量的那样)，且优选高于由抗原单独引发的加成反应，更优选高于由至少1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9个因子，最优选由至少10个因子引发的加成反应。
本发明的其它优点在于免疫原性组合物中来源于不同蛋白家族的本发明抗原组合可抗更大范围的菌株。
本发明涉及包括很多(两种或多种)蛋白的免疫原性组合物，所述蛋白选自至少两个不同种类的蛋白，它们在奈瑟氏球菌中具有不同的功能。这种蛋白种类的例子是粘附素、自体转运蛋白、毒素、整合外膜蛋白和Fe获得蛋白。本发明的疫苗组合在抗同源奈瑟氏球菌菌株(衍生抗原的菌株)且还优选在抗异源奈瑟氏球菌菌株的疫苗功效方面显示出令人吃惊的提高。
本发明提供免疫原性组合物，它包括至少或恰好两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同的抗原，这些抗原选自下列至少或恰好两个、三个、四个或全部五个选自下述种类的抗原·至少一种奈瑟氏球菌粘附素；·至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白；·至少一种奈瑟氏球菌毒素；·至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白；·至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选外膜蛋白，特别是整合外膜蛋白)。
优选，本发明提供包括至少或恰好两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同奈瑟氏球菌抗原的免疫原性组合物。最优选这些抗原选自下列的至少或恰好两组、三组、四组或五组选自下述蛋白·选自FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB 0995、NMB 1119和NadA的至少一种奈瑟氏球菌粘附素；·选自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白；·选自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种奈瑟氏球菌毒素；·选自TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28(GNA2132)、Sibp、NMB0964、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrB和P2086(XthA)的至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白；或·选自PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MltA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA(GNA1946)、NMB1124、NMB1162、NMB1220、NMB1313、NMB1953、HtrA和PldA的至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白，优选外膜蛋白，优选整合外膜蛋白。
本发明的抗原都是分离的，即它们被人工改变。优选，它们被纯化至某种程度，最优选超过40、50、60、70、80、90、95或99％纯度(与本发明免疫原性组合物的其它组分组合前)。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌粘附素和至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白且任选包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌Fe获得蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌粘附素和至少一种奈瑟氏球菌毒素且任选包括奈瑟氏球菌自体转运蛋白、奈瑟氏球菌Fe获得蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌粘附素和至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白且任选包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌自体转运蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌粘附素和至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)且任选包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌Fe获得蛋白或奈瑟氏球菌自体转运蛋白。优选所述抗原选自上述抗原。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白和至少一种奈瑟氏球菌毒素且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌Fe获得蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白和至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌毒素或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白和至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌Fe获得蛋白或奈瑟氏球菌毒素。优选所述抗原选自上述抗原。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌毒素和至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自体转运蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌毒素和至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自体转运蛋白或奈瑟氏球菌毒素。优选所述抗原选自上述抗原。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白和至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自体转运蛋白或奈瑟氏球菌毒素。优选所述抗原选自上述抗原。
优选在本发明的免疫原性组合物中提供全部5组抗原。
当具体提到蛋白时，优选是天然、全长的蛋白及其天然变体(即，从奈瑟氏球菌，优选脑膜炎球菌菌株获得的天然蛋白)，它还可包括其抗原性片段(特别是在亚单位疫苗中)。这些是含有或包括从蛋白氨基酸序列上连续获取的至少10个氨基酸，优选20个氨基酸，更优选30个氨基酸，更优选40个氨基酸或最优选50个氨基酸的片段(此处常常具体描述的)。此外，抗原性片段是指与抗奈瑟氏球菌全长蛋白产生的抗体或通过用奈瑟氏球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体进行免疫反应的片段。抗原性片段还包括当以有效剂量施用时，可针对奈瑟氏球菌感染引发保护性免疫反应的片段，更优选它可防止脑膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌感染，最优选它可防止脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B感染。
本发明还包括本发明奈瑟氏球菌蛋白的重组融合蛋白，或其片段。这些可将不同的奈瑟氏球菌蛋白或其片段组合在同一多肽中。可选择性地，本发明还包括奈瑟氏球菌蛋白或其片段的个体融合蛋白，即具有异源序列，如T-细胞表位或纯化标记的供给者，例如β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)、附加表位如FLAG、myc标记、聚组氨酸、或病毒表面蛋白如流感病毒血细胞凝集素、破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197的融合蛋白。
本发明的抗原NMB参照符号是指可从www.neisseria.org访问的序列参照符号。
1.粘附素粘附素包括FhaB(WO98/02547)、NadA(J.Exp.Med(2002)1951445；NMB1994)、也可称作NhhA的Hsf(NMB0992)(WO99/31132)、Hap(NMB1985)(WO99/55873)、NspA(WO96/29412)、MafA(NMB0652)和MafB(NMB0643)(Annu Rev Cell Dev Biol.16；423-457(2000)；Nature Biotech20；914-921(2002))、Omp26(NMB0181)、NMB0315、NMB0995、NMB1119和PilC(Mol.Microbiol.1997，23；879-892)。这些是参与奈瑟氏球菌与宿主细胞表面结合的蛋白。Hsf是粘附素的其中一个例子，同时也是自体转运蛋白。因此本发明的免疫原性组合物可包括Hsf与其它自体转运蛋白的组合，其中Hsf发挥其粘附素的作用。这些粘附素可来源于脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本发明还包括来源于奈瑟氏球菌的其它粘附素。
FhaB此抗原已在WO98/02547SEQ ID NO38(核苷酸3083-9025)中描述-还可参见NMB0497。本发明人已经发现FhaB在诱导单独的抗-粘附抗体方面特别有效，且特别是与本发明其它抗原组合时。虽然可使用全长FhaB，本发明人已经发现特定的C-末端截短物至少令人惊讶地有效且优选甚至在对交叉-菌株的作用方面更有效。已经有利地显示出这种截短物更易克隆。本发明的FhaB截短物通常与FhaB分子的N-末端三分之二，优选位于1200-1600位置、更优选1300-1500位置、最优选1430-1440位置的新的C-末端相对应。具体的实施方案在1433或1436处具有C-末端。因此，本发明的这种FhaB截短物和包括这种截短物的疫苗是本发明的独立方面而且是本发明组合免疫原性组合物的组分。N-末端还可被截短达10、20、30、40或50个氨基酸。
2.自体转运蛋白自体转运蛋白通常由信号序列、过客结构域和用于附着外膜的锚定结构域组成。自体转运蛋白的例子包括Hsf(WO99/31132)(NMB0992)、HMW、Hia(van Ulsen等人，Immunol.Med.Microbiol.200132；53-64)、Hap(NMB1985)(WO99/55873；van Ulsen等人，Immunol.Med.Microbiol.200132；53-64)、UspA、UspA2、NadA(NMB1994)(Comanducci等人，J.Exp.Med.2002195；1445-1454)、AspA(Infection and Immunity2002，70(8)；4447-4461；NMB1029)、Aida-1样蛋白、SSh-2和Tsh。NadA(J.Exp.Med(2002)1951445)是自体转运蛋白的另一个例子，同时也是粘附素。本发明的免疫原性组合物因此包括NadA与粘附素的组合，其中NadA作为自体转运蛋白发挥作用。这些蛋白可来源于脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本发明还包括来源于奈瑟氏球菌的其它自体转运蛋白。
HsfHsf具有与自体转运蛋白共用的结构。例如，来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的Hsf由氨基酸1-51组成的单一序列、表面外露且包括可变区(氨基酸52-106、121-124、191-210和230-234)的成熟蛋白(氨基酸52-479)氨基末端的头区、颈区(氨基酸480-509)、疏水的α-螺旋区(氨基酸518-529)和其中4个跨膜链跨越外膜的锚定结构域(氨基酸539-591)。
虽然全长Hsf可用于本发明的免疫原性组合物中，但是各种Hsf截短物和缺失物也可有利地使用，这取决于疫苗的类型。
当Hsf用于亚单位疫苗中时，优选使用可溶性过客结构域的一部分；例如氨基酸52-479的完全结构域，最优选其保守部分，例如氨基酸134-479的特别有利的序列。Hsf的优选形式可被截短，以缺失在WO01/55182中公开的蛋白可变区。优选的变体可包括在WO01/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。在N或C末端的任何一端或两端，上述序列和下面描述的那些可被伸展或截短达1、3、5、7、10或15个氨基酸。
Hsf的优选片段因此包括Hsf的整个头区，优选包含氨基酸52-473。Hsf的其它优选片段包括表面外露的头区，它包括一个或多个下列氨基酸序列52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440和469-479。
当Hsf存在于外膜小泡制品中时，它可被表达为全长蛋白或优选被表达为由氨基酸1-51和134-591的融合体组成的有利变体(产生氨基酸序列134-C末端的成熟外膜蛋白)。Hsf的优选形式可被截短，从而缺失WO01/55182中公开的蛋白可变区。优选的变体可包括在WO01/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。优选第一和第二个可变区缺失。优选的变体是使氨基酸序列52-237或54-237之间的残基缺失，更优选使氨基酸52-133或55-133之间的残基缺失。所述成熟蛋白可缺少信号肽。
Hap对来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的Hap-样蛋白进行的计算机分析显示出至少3个结构域。以来源于菌株H44/76的Hap-样序列为例，包含氨基酸1-42的结构域1编码自体转运蛋白家族特征性的sec依赖性信号肽，包含氨基酸43-950的结构域2编码很可能表面外露且易进入免疫系统的过客结构域，包含残基951-C末端(1457)的结构域3被预测编码可能装配成桶-样结构且被锚定在外膜中的β-链。因为结构域2可能是表面外露、良好保守的(在所有试验菌株中超过80％)且可作为亚单位抗原在大肠杆菌中产生，因此它代表了目标疫苗候选物。因为结构域2和3很可能是表面外露且良好保守的(Pizza等人，(2000)，Science 2871816-1820)，因此它们代表了目标疫苗候选物。结构域2被称作过客结构域。
本发明的免疫原性组合物可包括全长Hap蛋白，优选被掺入到OMV制品中。本发明的免疫原性组合物还可包括Hap的过客结构域，在菌株H44/76中，其由氨基酸残基43-950组成。Hap的这一片段可特别有利地用于本发明的亚单位组合物中。在N或C末端的任何一端或两端，Hap过客结构域的上述序列可被伸展或截短达1、3、5、7、10、15、20、25、或30个氨基酸。
3.铁获得蛋白铁获得蛋白包括TbpA(NMB0461)(WO92/03467，US5912336，WO93/06861和EP586266)、TbpB(NMB0460)(WO93/06861和EP586266)、LbpA(NMB1540)(Med Microbiol(1999) 321117)、LbpB(NMB1541)(WO/99/09176)、HpuA(U73112.2)(Mol Microbiol.1997，23；737-749)、HpuB(NC.003116.1)(Mol Microbiol.1997，23；737-749)、也被称作XthA的P2086(NMB 0399)(13thInternational Pathogenic Neisseria Conference 2002)、FbpA(NMB0634)、FbpB、BfrA(NMB1207)、BfrB(NMB1206)、也被称作GNA2132的Lipo28(NMB2132)、Sibp(NMB1882)、HmbR、HemH、Bcp(NMB0750)、Iron(III)ABC转运蛋白-通透酶蛋白(Tettelin等人，Science 287；1809-1815 2000)、Iron(III)ABC转运蛋白-周质(Tettelin等人，Science 287；1809-1815 2000)、TonB依赖性受体(NMB0964和NMB0293)(Tettelin等人，Science 287；1809-1815 2000)和转铁蛋白结合蛋白相关蛋白(Tettelin等人，Science 287；1809-1815 2000)。这些蛋白可来源于脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本发明还包括来源于奈瑟氏球菌的其它铁获得蛋白。
TbpATbpA与TbpB相互作用在奈瑟氏球菌外膜上形成蛋白复合体，其结合转铁蛋白。在结构上，TbpA包括具有TonB箱的胞内N-末端结构域和活塞结构域，该活塞结构域为多个由短胞内环和较长的胞外环连接的跨膜β链。
已经区别了TbpB的两个家族，它们分别具有较高的分子量和较低的分子量。TbpB的高和低分子量形式与TbpA的不同家族结合，可以同源性为基础区别该不同家族。尽管它们的分子量相似，但还是将它们称作高分子量和低分子量家族，这是因为它们与TbpB的高或低分子量形式结合(Rokbi等人，FEMS Microbiol.Lett.100；51，1993)。术语TbpA(高)和TbpA(低)用于表示TbpA的这两种形式，且与TbpB相似。本发明的免疫原性组合物可包括来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、Y和W-135的TbpA和TbpB以及来源于包括淋病奈瑟氏球菌在内的其它细菌的铁获得蛋白。转铁蛋白结合蛋白TbpA和TbpB已经被分别称作Tbp1和Tbp2(Cornelissen等人，Infection andImmunity 65；822，1997)。
TbpA包括若干不同的区。例如，就来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的TbpA而言，氨基末端的186个氨基酸形成内部球状结构域，22个β链跨越膜，形成β桶结构。这些是由短胞内环和较大的胞外环连接的。胞外环2、3和5具有最高程度的序列变异性且环5是表面外露的。环5和4参与配体结合。
TbpA的优选片段包括TbpA的胞外环。使用来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的TbpA序列，这些环与环1的氨基酸200-202、环2的氨基酸226-303、环3的氨基酸348-395、环4的氨基酸438-471、环5的氨基酸512-576、环6的氨基酸609-625、环7的氨基酸661-671、环8的氨基酸707-723、环9的氨基酸769-790、环10的氨基酸814-844和环11的氨基酸872-903相对应。在序列对比后，在其它Tbp蛋白中的相应序列也可构成优选片段。最优选的片段可包括构成Tbp的环2、环3、环4或环5的氨基酸序列。
当本发明的免疫原性组合物包括TbpA时，它优选同时包括TbpA(高)和TbpA(低)。
虽然优选TbpA存在于OMV疫苗中，但它也可以是亚单位疫苗的一部分。例如，可被引入到本发明免疫原性组合物中的分离的铁获得蛋白也是本领域熟知的(WO00/25811)。它们可在细菌宿主中表达，使用洗涤剂提取(例如2％Elugent)并通过亲和层析或使用本领域熟知的标准柱层析技术纯化(Oakhill等人，Biochem J.2002 364；613-6)。
当TbpA存在于OMV疫苗中时，它的表达可通过此处讨论的基因技术上调，或可优选通过亲代菌株在下述铁有限条件下生长而被上调。该方法还可导致可变铁-调节蛋白，特别是FrpB的上调，其可变为免疫显性的且它因此可按下面所述有利地下调这种蛋白(特别是FrpB)的表达(且优选使编码这种蛋白的基因缺失)，以确保本发明的免疫原性组合物引发抗存在于大范围奈瑟氏球菌菌株中的抗原的免疫反应。它优选具有存在于免疫原性组合物中的TbpA(高)和TbpA(低)，且优选这是通过将来源于表达TbpA可选择形式的两种菌株的OMV混合获得的。
4.毒素毒素包括FrpA(NMB0585；NMB1405)、FrpA/C(见下面的定义)、FrpC(NMB1415；NMB1405)(WO92/01460)、NM-ADPRT(NMB1343)(13thInternational Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani等人，p135)、VapD(NMB1753)、脂多糖(LPS；也被称作脂低聚糖或LOS)免疫型L2和LPS免疫型L3。FrpA和FrpC所含的区在这两个蛋白之间是保守的且所述蛋白的优选片段是含有该保守片段的多肽，优选含有FrpA/C序列的氨基酸227-1004。这些抗原可来源于脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本发明还包括来源于奈瑟氏球菌的其它毒素。
在可选择性的实施方案中，毒素可包括参与毒性调节的抗原，例如在脂多糖合成中起作用的OstA。
FrpA和FrpC
脑膜炎奈瑟氏球菌编码两种RTX蛋白，它们被称作FrpA和FrpC，是在铁有限条件下分泌的(Thompson等人，(1993)J.Bacteriol.175811-818；Thompson等人，(1993)Infect.Immun.612906-2911)。RTX(重复毒素)蛋白家族在靠近它们的C-末端处共有下列一致序列的一系列9个氨基酸重复单位Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly(Asn/Asp)Asp Xaa(LXGGXGN/DDX)。大肠杆菌HlyA中的重复单位被认为是Ca2+结合的位点。正如在图4中所描绘的，脑膜炎球菌FrpA和FrpC蛋白，正如在菌株FAM20中所表征的，在它们的中心和C-末端区共有广泛的氨基酸相似性但在N-末端的相似性(如果有的话)非常有限。此外，由于9个氨基酸基序的重复(在FrpA中重复13次、在FrpC中重复43次)，在FrpA和FrpC之间保守的区显示出某些多态性。
本发明的免疫原性组合物可包括全长FrpA和/或FrpC或优选，含有在FrpA和FrpC之间保守的序列的片段。所述保守序列是由9个氨基酸的重复单位构成的。本发明的免疫原性组合物优选包括多于3个重复单位、多于10个重复单位、多于13个重复单位、多于20个重复单位或多于23个重复单位。
这种截短物具有较之全长分子更有利的性质且包含这种抗原并被掺入到本发明的免疫原性组合物中的疫苗形成本发明的独立方面。
在FrpA和FrpC之间保守的序列被命名为FrpA/C，且当FrpA或FrpC形成本发明免疫原性组合物的组分时，可有利地使用FrpA/C。FrpA序列的氨基酸277-1004是优选的保守区。在N或C末端的任何一端或两端，上述序列可被伸展或截短达1、3、5、7、10、15、20、25、或30个氨基酸。
LPSLPS(脂多糖，也被称作LOS-脂低聚糖)是奈瑟氏球菌外膜上的内毒素。已知LPS的多糖部分可诱导杀菌抗体。
LPS低聚糖部分内的异质性在不同的奈瑟氏球菌菌株之间产生结构和抗原多样性(Griffiss等人，Inf.Immun.1987；551792-1800)。这已被用于将脑膜炎球菌菌株细分成12个免疫型(Scholtan等人，J Med Microbiol 1994，41236-243)。免疫型L3、L7和L9在免疫学方面是相同的且在结构上是相似的(或甚至是相同的)并因此已被命名为L3、7、9(或，为了本说明书的目的，统称为“L3”)。脑膜炎球菌LPS L3、7、9(L3)、L2和L5可通过唾液酸化，或通过加入胞苷5′-一磷酸-N-乙酰基神经氨酸而被修饰。虽然L2、L4和L6 LPS在免疫学方面是可区别的，但它们在结构上相似，且在此处提到L2时，L4或L6在本发明的范围内可被任选替代。见M.P.Jennings等人，Microbiology 1999，145，3013-3021和Mol Microbiol 2002，43931-43，其中进一步举例说明了LPS的结构和异质性。
当LPS，优选脑膜炎球菌LPS包括在本发明的疫苗中时，优选且有利地存在免疫型L2和L3之一或两者。LPS优选存在于外膜小泡中(优选用低百分比的洗涤剂，更优选0-0.5％、0.02-0.4％、0.04-0.3％、0.06-0.2％、0.08-0.15％或0.1％，最优选脱氧胆酸盐[DOC]提取小泡时)，还可以是亚单位疫苗的一部分。LPS可使用熟知的过程，包括热水-苯酚过程分离(Wesphal和Jann Meth.Carbo.Chem.5；83-911965)。还可见Galanos等人，Eur J Biochem 9245-249，和Wu等人，1987，Anal Bio Chem 160281-289。LPS可简单使用或与T-细胞表位的来源，如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM-197或OMV外膜蛋白缀合使用。使分离的LOS缀合的技术也是已知的(见，例如，EP941738，其引入此处作为参考)。
当LOS(特别是本发明的LOS)存在于泡制剂中时，优选通过使LOS与也存在于泡制剂上的一种或多种外膜蛋白(例如，脑膜炎球菌中的PorA或PorB)缀合的方法使LOS原位缀合。
该方法可有利地提高泡制剂内LOS抗原的稳定性和/或免疫原性(提供T-细胞帮助)和/或抗原性-因此以其保护性最强的构象为非T-依赖性低聚糖免疫原提供T-细胞帮助-如在其天然环境中的、脑膜炎球菌外膜表面上的LOS。此外，LOS在泡内的缀合可导致LOS解毒(脂类A部分被稳定埋藏在外膜中，因此很少引起毒性)。因此，这里提到的从htrB-或msbB-突变体中分离泡，或通过向组合物中加入多粘菌素B的无毒肽功能性等价物的解毒方法(见WO93/14115、WO95/03327、Velucchi等人，(1997)J Endotoxin Res 41-12，和EP976402，多粘菌素B的无毒肽功能性等价物的进一步描述-特别是(序列KTKCKFLKKC，其中2个半胱氨酸形成二硫键)肽SAEP2的使用)可能并不是必需的(但其可被加入到组合中用于增加安全性)。因此，本发明人已经发现包括泡的组合物可形成用于治疗或预防由衍生泡的生物所引起疾病的疫苗基础，其中存在于泡中的LOS已以泡内模式与同时存在于泡中的外膜蛋白缀合，其中这种疫苗基本上是无毒的且能够诱导抗其天然环境中的LOS的T-依赖性杀菌反应。
本发明因此进一步提供这种泡内LOS缀合的脑膜炎球菌泡制品。
这种泡制品是否可从正极讨论的细菌(见WO01/09350)中被分离出来，然后经过已知的缀合化学过程使LOS低聚糖部分上的基团(例如，NH2或COOH)与泡外膜蛋白上的基团(例如，NH2或COOH)缀合还在讨论。可使用利用戊二醛、甲醛、或戊二醛/甲醛混合物的交联技术，但优选使用选择性更强的化学过程如EDAC或EDAC/NHS(J.V.Staros，R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediatedcoupling reactions.Analytical chemistry 156220-222(1986)；和Bioconjugates Techniques.Greg T.Hermanson(1996)pp173-176)。可使用的、能够在LOS与蛋白分子之间生成共价键的其它缀合化学过程或处理在EP941738中描述。
优选泡制品在没有荚膜多糖存在的条件下缀合。所述泡可从不(按照下面所述天然地或经由突变)产生荚膜多糖的菌株中分离，或可从绝大多数且优选全部污染荚膜多糖中纯化。以这种方式，泡内LOS缀合反应更加有效。
优选存在于泡中的超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或95％的LOS是交联的/缀合的。
泡内缀合应优选整合下列方法的1、2或全部3个步骤缀合pH应大于pH7.0，优选大于或等于pH7.5(最优选在pH9下)；在反应过程中应当维持1-5％、优选2-4％、最优选约3％蔗糖的条件；在缀合反应中应当将NaCl降到最低，优选0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、且最优选根本不存在。所有这些方法特征可确保在整个缀合过程中泡均保持稳定且保持在溶液中。
EDAC/NHS缀合方法是泡内缀合的优选方法。EDAC/NHS优于甲醛，甲醛可交联至非常高的程度，由此不利地影响滤过率。EDAC与羧酸(如LOS中的KDO)反应，产生活性酯中间体。在有胺亲核试剂(如外膜蛋白，如PorB中的赖氨酸)存在的条件下，酰胺键是用异脲副产物的释放形成的。然而，EDAC-介导的反应的效能可通过Sulfo-NHS酯中间体的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的时间比EDAC单独与羧酸盐反应形成的活性酯要长。因此，更高产率酰胺键的形成可使用这种两阶段方法实现。EDAC/NHS缀合在J.V.Staros，R.W.Wright和D.M.Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide ofwater-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions.Analytical chemistry 156220-222(1986)；和BioconjugatesTechniques.Greg T.Hermanson(1996)pp 173-176中讨论。优选在反应中使用0.01-5mg EDAC/mg泡、更优选0.05-1mg EDAC/mg泡。所用EDAC的量取决于存在于样品中的LOS量，而其又依次取决于用于提取泡的脱氧胆酸盐(DOC)％。在低％DOC(例如，0.1％)下，使用较大用量的EDAC(1mg/mg及以上)，然而在高％DOC(例如0.5％)下，使用较小用量的EDAC(0.025-0.1mg/mg)以避免太多泡间交联。
因此本发明的方法优选是用于产生泡内缀合LOS(优选脑膜炎球菌)的方法，该方法包括在有EDAC/NHS存在、pH7.0-pH9.0(优选约pH7.5)、1-5％(优选约3％)蔗糖、且任选在基本上没有NaCl(如上所述)的条件下使泡缀合，并分离反应混合物中缀合泡的步骤。
所述反应随后使用抗-LOS(例如，抗-L2或抗-L3)mAb在反应混合物的蛋白质分离凝胶上进行，其显示随着反应时间的进行，泡中LOS的比例增大，LOS的分子量增加。
使用这种技术可回收的泡产率99％。
人们发现EDAC是一种极好的泡内交联剂，这是因为它可使LOS与OMP充分交联，用于提高LOS T-依赖性免疫原性，但不会使它交联至非常高的程度而导致如滤过率较差、聚集和泡间交联的问题发生。所产生的泡的形态学与未缀合的泡相似(利用电子显微镜)。此外，上述方案可避免发生过度交联(其可降低天然存在于泡表面上的保护性OMP，例如TbpA或Hsf的免疫原性)。
优选衍生泡的脑膜炎球菌是不能产生荚膜多糖的突变株(例如，下述突变株的其中一种，特别是siaD-)。还优选可有效抗脑膜炎球菌病的免疫原性组合物同时包含L2和L3泡，其中L2和L3 LOS均与泡外膜蛋白缀合。此外，优选泡内缀合泡中的LOS结构与从lgtB-脑膜炎球菌菌株衍生的一致(如下所述)。最优选免疫原性组合物包括泡内缀合的泡来源于不能产生荚膜多糖且是lgtB-的突变脑膜炎球菌菌株；包含来源于不能产生荚膜多糖的突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3泡；包含来源于lgtB-突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3泡；或最优选包含来源于不能产生荚膜多糖且是lgtB-的突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3泡。
可用于本发明的一般L3脑膜炎球菌菌株是H44/76menB菌株。一般的L2菌株是B16B6 menB菌株或39E脑膜炎球菌C型菌株。
如上所述，本发明的泡已通过缀合作用被解毒至一定程度，且无需进一步解毒，然而进一步的解毒方法可用于增加安全性，例如，使用来源于htrB-或msbB-脑膜炎球菌菌株的泡或向泡组合物中加入多粘菌素B的无毒肽功能性等价物[与脂类A具有较高亲和性的分子](优选SEAP2)(如上所述)。
在上述方法中，提供脑膜炎球菌泡及含有泡的免疫原性组合物，其具有重要的抗原LOS，该抗原基本上无毒，没有自身免疫性问题，具有T-依赖性特征，存在于其天然环境中，且能够诱导抗超过90％脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体反应(在L2+L3组合物的情况下)。
优选泡内LOS缀合应整合下列方法的1、2、或全部3个步骤缀合pH应大于pH7.0，优选大于或等于pH7.5(最优选在pH9下)；在反应过程中应当维持1-5％、优选2-4％、最优选约3％蔗糖的条件；在缀合反应中应当将NaCl降到最低，优选0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、且最优选根本不存在。所有这些方法特征可确保在整个缀合过程中泡保持稳定且保持于溶液中。
虽然可通过各种技术和化学过程使LOS与外膜蛋白在泡内缀合，但EDAC/NHS缀合方法是泡内缀合的优选方法。EDAC/NHS优于甲醛，甲醛可交联至非常高的程度，由此对滤过率有不利的影响。EDAC与羧酸反应，产生活性酯中间体。在有胺亲核试剂存在的条件下，酰胺键是用异脲副产物的释放形成的。然而，EDAC-介导的反应的效能可通过Sulfo-NHS酯中间体的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的时间比EDAC单独与羧酸盐反应形成的活性酯要长。因此，更高产率酰胺键的形成可使用这种两阶段方法实现。EDAC/NHS缀合在J.V.Staros，R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediatedcoupling reactions.Analytical chemistry 156220-222(1986)；和Bioconjugates Techniques.Greg T.Hermanson(1996)pp173-176中讨论。
因此本发明的方法优选是用于产生泡内缀合LOS(优选脑膜炎球菌)的方法，该方法包括在有EDAC/NHS存在、pH7.0-pH9.0(优选约pH7.5)的pH、1-5％(优选约3％)蔗糖、且任选基本上没有NaCl(如上所述)的条件下使泡缀合，以及从反应混合物中分离缀合泡的步骤。
所述反应随后使用抗-LOS(例如，抗-L2或抗-L3)mAb在反应混合物的分离凝胶上进行，其显示随着反应时间的进行，泡中LOS的比例增大，LOS的分子量增加。
使用这种技术可回收的泡产率99％。
人们发现EDAC是一种极好的泡内交联剂，这是因为它可使LOS与OMP充分交联，用于提高LOS T-依赖性免疫原性，但不会使它交联至非常高的程度而导致如滤过率较差和泡间交联的问题发生。此外，应当避免过度交联，从而避免天然存在于泡表面上的保护性OMP，例如Tbp免疫原性的任何降低。
5.整合外膜蛋白奈瑟氏球菌蛋白的其它种类也可以是包括在本发明奈瑟氏球菌疫苗中的候选物，且能够以令人吃惊的有效方式与其它抗原组合。膜相关蛋白、特别是整合膜蛋白且最有利地是外膜蛋白，特别是整合外膜蛋白可用于本发明的组合物中。这种蛋白的例子是也被称作OmplA的PldA(NMB 0464)(WO00/15801)，其是奈瑟氏球菌磷脂酶外膜蛋白。其它例子是TspA(NMB0341)(Infect.Immun.1999，67；3533-3541)和TspB(T-细胞刺激蛋白)(WO00/03003；NMB1548、NMB1628或NMB1747)。其它例子包括PilQ(NMB1812)(WO99/61620)、也被称作D15-的OMP85(NMB0182)(WO00/23593)、NspA(U52066)(WO96/29412)、FhaC(NMB0496或NMB1780)、PorB(NMB2039)(Mol.Biol.Evol.12363-370，1995)、HpuB(NC.003116.1)、TdfH(NMB1497)(Microbiology 2001，147；1277-1290)、OstA(NMB0280)、也被称作GNA33和Lipo30的MltA(NMB0033)、HtrA(NMB0532；WO99/55872)、HimD(NMB1302)、HisD(NMB1581)、GNA1870(NMB1870)、HlpA(NMB1946)、NMB1124、NMB1162、NMB1220、NMB1313、NMB1953、HtrA、TbpA(NMB0461)(WO92/03467)(还可见上面的铁获得蛋白)和LbpA(NMB1541)。
OMP85本发明的免疫原性组合物可包括全长OMP85，优选作为OMV制品的一部分。OMP85的片段也可用于本发明的免疫原性组合物中，特别是，优选将由氨基酸残基1-475或50-475组成的OMP85表面外露结构域掺入到本发明免疫原性组合物的亚单位组分中。在N或C末端的任何一端或两端，OMP85的表面外露结构域的上述序列可被伸展或截短达1、3、5、7、10、15、20、25、或30个氨基酸。优选删除OMP85片段的信号序列。
OstAOstA可在脂多糖的合成中发挥作用且可被认为是毒性调节剂。OstA可选择性地包括在毒素类中，其中毒素种类被扩大至包括毒性调节剂以及毒素。
免疫原性组合物免疫原性组合物是包括至少一种抗原的组合物，当给予宿主时，所述抗原能够产生免疫反应。优选，这种免疫原性制品能够产生抗奈瑟氏球菌，优选抗脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌感染的保护性免疫反应。
本发明涉及包括至少两种抗原的免疫原性组合物，其优选可引发协同杀菌、保护性或粘附阻断反应的一种或多种。
本发明的SBA杀菌测定法这种协同反应可通过由抗原组合引发的SBA来表征，抗原组合引发的SBA较之由每个抗原单独引发的SBA要高至少50％、2倍、3倍、优选4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍且最优选10倍。优选SBA是相对于衍生抗原的同源性菌株测量的，且优选是相对于一组异源性菌株测量的。(见下面代表性小组，例如属于A-4聚簇的BZ10(B:2b:P1.2)；属于ET-37复合体的B16B6(B:2a:P1.2)；和H44/76(B:15:P1.7，16))。SBA是最普遍认可的免疫学标记，可评价脑膜炎球菌疫苗的功效(Perkins等人，J Infect Dis.1998，177683-691)。令人满意的SBA可通过任何已知方法测定。SBA可利用从动物模型或人类受试者获得的血清进行(见实施例17-20)。
用人血清进行SBA的优选方法如下。在第一次接种前、第二次接种后2个月和第三次接种后1个月(1年中进行3次接种是一般的人类初次接种程序，例如在第0、2和4个月或第0、1、或6个月时给予)采集血液样品。这种人类初次接种程序可对1岁以下的婴儿进行(例如，与Hib接种同时进行)，或也可给2-4岁的儿童或青少年接种以测试这种初次接种程序的SBA。如果适合，可在初次接种后6-12个月以及激发剂量后1个月再次采集血液样品。
如果在(初次接种程序的)第三支疫苗给药后一个月(在2-4岁儿童或青少年中，但优选在生命第一年的婴儿中)，抗衍生本发明抗原的脑膜炎球菌菌株的SBA(抗体稀释度)效价(与接种前效价相比)增加4倍的受试者百分比超过30％、优选超过40％、更优选超过50％、最优选超过60％受试者，那么对于具有同源杀菌活性的抗原或泡制品而言，SBA是令人满意的。
当然，如果它也可相对于衍生它的脑膜炎球菌菌株引发令人满意的SBA的话，则具有异源杀菌活性的抗原或泡制品也可构成具有同源杀菌活性的泡制品。
如果在(初次接种程序的)第三支疫苗给药后一个月(在2-4岁儿童或青少年中，但优选在生命第一年的婴儿中)，抗脑膜炎球菌3种异源菌株的SBA(抗体稀释度)效价(与接种前效价相比)增加4倍的受试者百分比超过20％、优选超过30％、更优选超过35％、最优选超过40％受试者，那么对于具有异源杀菌活性的抗原或泡制品而言，SBA是令人满意的。这种试验是具有异源杀菌活性的抗原或泡制品是否可诱导抗各种脑膜炎球菌菌株的交叉杀菌抗体的良好表征。所述三种异源菌株应当优选具有彼此不同且优选与制备或衍生具有异源杀菌活性的抗原或泡制品的菌株不同的电泳型(ET)-复合体或多基因座序列分型(MLST)模式(见Maiden等人，PNAS USA 1998，953140-5)。本领域技术人员应当能够很容易地测定具有不同ET-复合体的三种菌株，其可反映在脑膜炎球菌之间，特别是脑膜炎球菌B型菌株之间观察到的基因多样性，这些菌株被认为是重要疾病负担的原因和/或代表认可的MenB剧毒谱系(见Maiden等人，见上)。例如，可使用的三种菌株是下列属于A-4聚簇的BZ10(B:2b:P1.2)；属于ET-37复合体的B16B6(B:2a:P1.2)；和属于ET-5复合体的H44/76(B:15:P1.7，16)，或属于同一ET/聚簇的任何其它菌株。这种菌株可用于测试从例如属于ET-S复合体的脑膜炎球菌菌株CU385(B:4:P1.15)制备或衍生的、具有异源杀菌活性的抗原或泡制品。可使用的其它样品菌株来源于谱系3流行性克隆(例如，NZ124[B:4:P1.7，4])。另一ET-37菌株是NGP165(B:2a:P1.2)。
测量SBA活性的方法是本领域已知的。例如，可使用的方法在WO99/09176的实施例10C中描述。在一般情况中，所试验的菌株培养物是在生长的对数期(优选在铁缺失的条件中-通过向生长培养基中加入铁螯合剂如EDDA)生长的。可将其悬浮在具有BSA的培养基(如具有0.3％BSA的Hanks培养基)中，以便获得调至约20000CFU/ml的试验细胞悬浮液。一系列反应混合物可通过将一系列2倍稀释的试验血清(优选在56℃热灭活30分钟)[例如，50μl/孔体积]和20000CFU/ml试验的脑膜炎球菌菌株悬浮液(例如，25μl/孔体积)混合而制备。应培养(例如，37℃15分钟)并振摇(例如，210rpm)反应小瓶。此外，终反应混合物[例如，100μl体积]还可包含补体源[如，25％终体积的预试幼兔血清]，并按照上面所述培养[例如，37℃60分]。无菌的聚苯乙烯U-底96-孔微量滴定平板可用于该测定法。可使用多道移液器从每个孔中采集等分试样[例如，10μl]，滴在Mueller-Hinton琼脂平板(优选含有1％Isovitalex和1％热灭活的马血清)上并培养(例如，在37℃、5％CO2中培养18小时)。优选，单独的菌落高达80CFU/等分试样。将下列三种试验样品用作对照缓冲液+细菌+补体；缓冲液+细菌+灭活补体；血清+细菌+灭活补体。SBA效价可使用程序直接计算，该程序可对数据进行加工从而得到稀释度的测量值，该测量值与通过回归计算得到的50％细胞死亡相对应。
动物保护测定法可选择性地，协同反应可通过抗原组合在动物保护测定法中的功效而表征。例如，可使用实施例12或13中描述的测定法。优选，与单独使用抗原，特别是抗原的次优剂量相比，通过抗原组合而得到保护的动物数量明显增加。
用于防止淋病奈瑟氏球菌感染的成功疫苗可能需要不止一个下列要素血清和/或粘膜抗体的产生以促进补体介导的淋球菌死亡，和/或通过白细胞如多形核白细胞提高吞噬作用并杀死微生物，和/或防止淋球菌附着于宿主组织；诱导细胞介导的免疫反应，它们也可参与保护。
本发明泡淋病疫苗制品功效的提高可通过分析诱导的血清和/或粘膜抗体免疫反应来评价，它们具有抗粘附和/或调理性和/或杀菌活性，如其他人所述(McChesney D等人，Infect.Immun.361006，1982；Boslego J等人Efficacy trial of a purified gonococclpilus vaccine，in Program and Abstracts of the 24thInterscience Conference on Antimicrobial Agents andChemotherapy，Washington，American Society for Microbiology，1984；Siegel M等人，J.Infect.Dis145300，1982；de la Pas，Microbiology，141(Pt4)913-20，1995)。
近来描述了由淋病奈瑟氏球菌所致的生殖器感染小鼠模型(Plante M，J.Infect.Dis.，182848-55，2000)。本发明泡淋病疫苗功效的提高还可通过其防止或降低淋病奈瑟氏球菌在这种小鼠感染模型中定居的能力而评价。
粘附阻断测定法可选择性地，协同反应可通过抗原组合在粘附阻断测定法中的功效而表征。例如，可使用实施例11中描述的测定法。优选与使用抗单独抗原产生的抗血清，特别是次优剂量的抗体相比，由抗抗原组合产生的抗血清诱导的阻断程度显著提高。
亚单位组合物本发明的免疫原性组合物可以是一种亚单位组合物。亚单位组合物是在将组分混合形成抗原性组合物之前，其中组分已经被分离并纯化到至少50％、优选至少60％、70％、80％、90％纯度的组合物。
本发明的免疫原性亚单位组合物优选包括选自下列的至少2种抗原FhaB、PilC、Hsf、Hap、NadA、OMP85、IgA蛋白酶、AspA、AspA的过客结构域、Hsf的过客结构域、Hap的过客结构域、FrpA、FrpC、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、TspA、TspB、PldA、PilQ、FhaC、NspA、和LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。
亚单位组合物可以是水溶性蛋白的水溶液。它们可包含洗涤剂、优选非-离子、两性离子或离子洗涤剂，以便使抗原的疏水部分溶解。它们可包含脂类，这样就可形成脂质体结构，使抗原以跨越脂膜的结构呈递。
外膜泡制品脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B(menB)分泌足量的外膜泡从而使得能够以工业规模制造它们。外膜泡还可经由用洗涤剂提取细菌细胞的方法制备(见例如，EP11243)。
本发明的免疫原性组合物还可包括具有至少两种抗原的外膜小泡制品，所述抗原已被上调，或者被重组上调或通过其它方式被上调，包括在铁-缺失条件下生长。在这种外膜小泡制品中被上调的抗原的例子包括NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、AspA、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafB和PldA。这种制品还可任选包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。
来源于奈瑟氏球菌菌株的泡制品的制备可通过本领域技术人员熟知的任何方法获得。优选使用在EP301992、US5,597,572、EP11243或US4,271,147、Frederikson等人(NIPH Annals ，1467-80)、Zollinger等人，(J.Clin.Invest. ，63836-848)、Saunders等人，(Infect.Immun. ，67113-119)、Drabick等人(Vaccine ，18160-172)或WO01/09350(实施例8)中公开的方法。通常，使用洗涤剂，优选脱氧胆酸盐提取OMV，且核酸被任选酶促除去。纯化是通过超速离心后，任选接着进行大小排阻层析实现的。如果包括本发明2种或多种不同的泡，则它们可在单一容器中组合形成本发明的多价制品(虽然制品也被认为是多价的，如果本发明的不同泡是处于单独容器中的单独组合物，但它们是在同一时间[由同一医师]给予宿主的]。OMV制品通常是通过0.2μm滤器过滤而灭菌的，且优选贮存在蔗糖溶液(例如3％)中，该蔗糖溶液已知可使泡制品溶解。
蛋白在外膜小泡制品内的上调可通过将基因的附加拷贝插入到衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中而获得。可选择性地，可将衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中的基因启动子交换成较强的启动子。这种技术在WO01/09350中描述。与从未修饰的脑膜炎奈瑟氏球菌(例如菌株H44/76)衍生的OMV中存在的蛋白水平相比，蛋白的上调将导致OMV中存在的蛋白水平更高。优选所述水平要高1.5、2、3、4、5、7、10或20倍。
当LPS是OMV中的附加抗原时，使用低浓度提取洗涤剂(例如，脱氧胆酸盐或DOC)的方案可优选用于OMV制备方法中，以便保持高水平的结合LPS而特别除去有毒的结合较差的LPS。所用DOC的浓度优选0-0.5％DOC、0.02-0.4％DOC、0.04-0.3％DOC，更优选0.06％-0.2％DOC或0.08-0.15％DOC，最优选约或准确的0.1％DOC。
“强的启动子序列”是指增加编码目标抗原的基因转录的调节控制元件。
“上调表达”是指相对于未修饰(即天然存在的)泡而言，可提高目标抗原表达的任何方式。应当了解‘上调’的量取决于特定的目标抗原，但不会超出破坏泡的膜完整性的量。抗原的上调是指较之未修饰的泡高至少10％的表达。优选高至少50％。更优选高至少100％(2倍)。最优选高3、4、5、7、10、20倍。可选择性地或附加地，上调表达是指就代谢或营养变化而言表达是非-条件性的，特别是在TbpA、TbpB、LbpA和LbpB的情况下。优选当从在铁有限条件中生长的细菌中衍生泡时，评价表达水平(例如在有铁螯合剂存在的条件下)。
又为了清楚的目的，术语‘将细菌菌株进行改造以产生较少所述抗原’或下调是指相对于未修饰的(即天然存在的泡)而言，优选通过缺失使目标抗原表达(或功能性基因产物的表达)降低的任何方式，这样表达较之未修饰的泡要低至少10％。优选低至少50％且最优选完全缺乏。如果下调蛋白是酶或功能性蛋白，则下调可通过引入一次或多次突变而获得，导致酶或功能活性降低10％、20％、50％、80％或优选100％。
调节奈瑟氏球菌蛋白表达所需的改造步骤可以以本领域技术人员已知的各种方式进行。例如，可插入序列(例如，启动子或开放阅读框)，并通过转座子插入技术破坏启动子/基因。例如，上调基因的表达时，可经由转座子将强启动子插入到基因起始密码子的直到2kb上游(更优选200-600bp上游，最优选约400bp上游)。还可利用点突变或缺失(特别是对基因的下调表达而言)。
然而，这种方法可能相当不稳定或不确定，且因此优选改造步骤是经由同源重组事件进行。优选，该事件发生在细菌染色体上至少30个核苷酸的序列(诱重组区)和在菌株内转化的载体上至少30个核苷酸的序列(第二诱重组区)之间。优选该区是40-1000个核苷酸，更优选100-800个核苷酸，最优选500个核苷酸。这些诱重组区应当足够相似，这样它们就能够在十分严格的条件下彼此杂交。
用于进行此处所述基因修饰事件的方法(如通过重组事件将基因上调或下调并将其它基因序列引入到奈瑟氏球菌基因组中)在WO01/09350中描述。可在奈瑟氏球菌中被整合的一般强启动子是porA、porB、lgtF、Opa、p110、lst、和hpuAB。PorA和PorB是优选的组成型强启动子。已经确定了PorB启动子活性包含在与PorB起始密码子上游的核苷酸1-250相对应的片段中。
通过在铁有限培养基中生长而上调抗原的表达本发明外膜小泡制品中某些抗原的上调优选通过分离在铁有限条件下生长的奈瑟氏球菌亲代菌株中的外膜小泡而实现。培养基中低浓度的铁将导致参与铁获得的蛋白表达增加，包括TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB和P2086。这些蛋白的表达由此被上调而无需重组修饰所涉及的基因，例如通过插入较强的启动子或插入基因的附加拷贝。本发明还包括通过在铁有限培养基中生长而上调铁获得蛋白，其中所述基因也已被重组修饰。
铁有限是通过向培养基中加入铁螯合剂而实现的。适宜的铁螯合剂包括2，2-双吡啶，EDDHA(乙二胺-二(o-羟基苯乙酸)和Desferal(甲磺酸去铁胺，Sigma)。Desferal是优选的铁螯合剂且以10-100μM、优选25-75μM、更优选50-70μM、最优选60μM的浓度加入到培养基中。培养基的铁内含物主要来源于酵母提取物和大豆胨组分，且存在的用量可根据批次而变化。因此，在不同批的培养基中，不同浓度的Desferal对于获得铁获得蛋白的上调是最佳的。本领域技术人员应当能够很容易地测定最佳浓度。在基础条件下，应向培养基中加入充足的铁螯合剂，从而上调所需铁-调节蛋白的表达，但也不能过量而不利地影响细菌的生长。
优选将通过在铁有限条件下生长的铁获得蛋白的上调与其它抗原的重组上调组合，从而获得本发明的外膜小泡。
可变和非-保护性免疫显性抗原的下调/除去在细菌菌株中，很多表面抗原都是可变的且因此只能抗一组有限的紧密相关的菌株。本发明一方面涉及本发明的外膜小泡，其中其它蛋白的表达减少，或优选编码可变表面蛋白的基因缺失。这种缺失导致产生泡的细菌菌株当以疫苗形式给药时，抗各种菌株交叉反应性的潜能更强，这是由于保守蛋白(留存在外膜上)对接种者的免疫系统施加了更强的影响。可在本发明泡免疫原性组合物中被下调的奈瑟氏球菌中这种可变抗原的例子包括PorA、PorB、Opa。
可被下调或切断的其它类型基因是在体内可被细菌很容易地接通(表达)或切断的基因。因为由这种基因编码的外膜蛋白并不总是存在于细菌上，因此这种蛋白在泡制品中的存在还可由于上述原因而对疫苗有效性有害。下调或缺失的优选例子是奈瑟氏球菌Opc蛋白。由含Opc的泡疫苗诱导的抗-Opc免疫性仅具有有限的保护能力，这是因为感染生物很容易变为Opc-。
例如，这些可变或非-保护基因的表达可被下调，或最终被切断。如此则具有将免疫系统集中于更好抗原上的优点，所述抗原仅少量存在于泡外表面上。下调还指表面外露的，上述外膜蛋白的可变免疫显性环可被改变或缺失，从而产生免疫显性较低的外膜蛋白。
下调表达的方法在WO01/09350中公开。在本发明的泡免疫原性组合物中被下调的优选蛋白组合包括PorA与OpA、PorA与OpC、OpA与OpC、PorA与OpA与OpC。
已知有4种不同的Opa基因存在于脑膜炎球菌基因组(Aho等人，1991 Mol.Microbiol.51429-37)中，因此当提到Opa的表达被下调时，它是指优选存在于脑膜炎球菌中的1、2、3或(优选)全部4种基因都被下调。这种下调通常可按照WO01/09350所述基因工程进行或通过查找很容易发现的、天然的、稳定的脑膜炎球菌菌株而进行，它们自Opa基因座的表达较低或没有。这种菌株可使用Poolman等人(1985J.Med.Micro.19203-209)描述的技术发现，其中Opa-细胞具有与表达Opa的细胞不同的表型，这可通过在平板上或显微镜下观察细胞外观而见到。一旦找到，在进行发酵以使Opa缺失后，通过在细胞内含物上进行蛋白质印迹而显示出该菌株是稳定的Opa-。
当外膜小泡中某些抗原的上调是通过在铁有限条件下生长而实现的时，可变蛋白FrpB(Microbiology 142；3269-3274，(1996)；J.Bacteriol.181；2895-2901(1999))也可被上调。本发明人已经发现，按照WO01/09350所述通过下调全部蛋白的表达或通过使FrpB可变区缺失而在这些环境下下调FrpB表达是有利的。如此可确保由免疫原性组合物引发的免疫反应针对存在于大范围菌株中的抗原。在本发明的泡免疫原性组合物中，FrpB的下调优选与PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC、PorA和OpA和OpC的下调组合。
在本发明可选择性的实施方案中，外膜小泡中的FrpB被下调，所述外膜小泡是从不是在铁有限条件下生长的奈瑟氏球菌菌株制备的。
LPS解毒本发明免疫原性组合物中的泡可经由WO01/09350公开的LPS解毒方法解毒。本发明LPS解毒的具体方法包括使WO01/09350中公开的htrB和/或msbB酶被下调/缺失。奈瑟氏球菌的msbB和htrB基因还分别被称作1pxL1和lpxL2(WO00/26384)且这些基因的缺失突变是通过失去一个仲酰基链的msbB-突变LOS和失去两个仲酰基链的htrB-突变LOS而从表型方面表征的。WO93/14155和WO95/03327描述了可用于本发明组合物中的多粘菌素B的无毒肽功能性等价物。
这种方法优选与泡提取方法组合，泡提取方法包括使用低水平的DOC、优选0-0.3％DOC、更优选0.05％-0.2％DOC、最优选约或准确的0.1％DOC。
LPS解毒的其它方法包括如上所述向泡制品中加入多粘菌素B的无毒肽功能性等价物(优选SAEP2)。
交叉反应性多糖将细菌外膜泡从有荚膜的革兰氏阴性菌中分离出来常常导致荚膜多糖的共-纯化。在某些情况下，这种“污染”材料可显示有用，这是因为多糖可提高由其它泡组分产生的免疫反应。然而在其它情况下，污染性多糖材料在细菌泡制品中的存在可证明对泡在疫苗中的应用有害。例如，已经显示出至少在脑膜炎奈瑟氏球菌的情况下，血清组B荚膜多糖不会带来保护免疫性且很容易在人类中诱导不利的自身免疫反应。因此，可将本发明的外膜小泡从细菌菌株中分离出来用于泡的生产，其已被改造成没有荚膜多糖。这样一来泡即适用于人类。这种泡制品的特别优选的例子是来源于没有荚膜多糖的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的泡制品。
这可通过使用修饰的泡产生菌株实现，其中荚膜生物合成和/或输出所需的基因已损坏。编码荚膜多糖生物合成或输出的基因的灭活可通过(优选使用上述同源重组技术)使控制区、编码区或两者突变(点突变、缺失或插入)，或通过降低这种基因酶功能的任何其它方式而实现。此外，荚膜生物合成基因的灭活还可通过反义过量表达或转座子诱变而实现。优选方法是使多糖生物合成及输出所需的脑膜炎奈瑟氏球菌Lps基因的一部分或全部缺失。就该目的而言，置换质粒pMF121(在Frosh等人，1990，Mol.Microbiol.41215-1218中所述)可用于传递使cpsCAD(+galE)基因聚簇缺失的突变。
已经对抗L3或L2 LPS所产生抗体的安全性产生了疑问，这是由于与存在于人鞘糖脂中的乳-N-neotetraose低聚糖基团(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-)相似的结构的存在。尽管已经有很多人安全接种了脱氧胆酸盐提取的含有残余量L3LPS的小泡疫苗(G.Bjune等人，Lancet(1991)，338，1093-1096；GVG.Sierra等人，NIPH ann(1991)，14，195-210)，LOS糖末端部分的缺失可有利地防止与存在于人组织表面的结构的任何交叉反应。在优选实施方案中，lgtB基因的灭活产生中间体LPS结构，其中缺少末端半乳糖残基和唾液酸(突变留下L2和L3LOS中的4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-结构)。这种中间体可在L3和L2LPS菌株中获得。LPS的可选择性且不太优选的(短的)版本可通过关闭lgtE基因获得。LPS的其它选择性且不太优选的版本可通过关闭lgtA基因获得。如果选择这种lgtA-突变，优选还可关闭lgtC表达从而防止形成非免疫原性L1免疫型。
LgtB-突变体是最优选的，这是因为本发明人已经发现这是用于解决安全性问题同时仍然保留可诱导杀菌抗体反应的LPS保护性低聚糖表位的最佳截短。
因此，还包含L2或L3制品(纯化的或在分离的泡中)的本发明免疫原性组合物或脑膜炎球菌泡制品通常有利地来源于奈瑟氏球菌菌株(优选脑膜炎球菌)，它们已被基因工程改造成永久性下调来源于lgtB、lgtA或lgtE基因的功能性基因产物的表达，优选通过切断基因，最优选通过使基因启动子和/或开放阅读框的全部或一部分缺失。
当本发明上述免疫原性组合物来源于脑膜炎球菌B菌株时，还优选除去荚膜多糖(其还包含人—样糖结构)。虽然可将很多基因切断以实现此目的，但本发明人有利地显示优选已将泡产生菌株进行基因工程改造以永久下调siaD基因的功能性基因产物的表达(即，下调α-2-8聚唾液酸转移酶的活性)，优选通过切断基因，最优选通过使基因启动子和/或开放阅读框的全部或一部分缺失。这种灭活在WO01/09350中描述。siaD(也被称作synD)突变是多种突变中最有利的，可除去荚膜多糖的人-相似表位，这是因为突变中仅有一种对LOS保护性表位的生物合成没有作用，因此在最终使用LOS作为保护性抗原的方法中是有利的，且对细菌生长的作用最小。因此本发明的优选方面是上述泡免疫原性制品，其来源于lgtE-siaD-、lgtA-siaD-或优选lgtB-siaD-脑膜炎球菌B突变株。所述菌株本身是本发明的另一方面。
虽然由于上述原因siaD-突变是优选的，但也可使用切断脑膜炎球菌B荚膜多糖合成的其它突变。因此，可将泡产生菌株进行基因工程改造以永久下调来源于下列一种或多种基因的功能性基因产物的表达ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(相当于synX和siaA)、synB(相当于siaB)或synC(相当于siaC)基因，优选通过切断基因，最优选通过使基因启动子和/或开放阅读框的全部或一部分缺失。lgtE-突变可与这些突变的一种或多种组合。优选lgtB-突变与这些突变的一种或多种组合。因此本发明另一方面是上述泡免疫原性制品，其来源于脑膜炎球菌B的这种组合突变株。所述菌株本身是本发明的另一方面。
含有各种lgt基因，包括lgtB和lgtE的奈瑟氏球菌基因座及其序列是本领域已知的(见M.P.Jennings等人，Microbiology 1999，145，3013-3021和其中引证的参考文献，以及J.Exp.Med.1802181-2190 )。
当把全长(未-截短的)LOS用于终产品中时，希望LOS没有被唾液酸化(因为这种LOS可产生抗绝大多数危险的、侵入性脑膜炎球菌B菌株的免疫反应，所述菌株也未被唾液酸化)。在这种情况下，使用具有缺失synA(相当于synX和siaA)、synB(相当于siaB)或synC(相当于siaC)基因的荚膜阴性菌株是有利的，这是因为这种突变也可导致menB LOS不能被唾液酸化。
在泡制品中，特别是在用低浓度DOC提取的制品中，可使用LPS作为本发明免疫原性组合物中的抗原。然而，可有利地将lgtE、lgtA(特别是与lgtC组合)、或优选lgtB基因/基因产物的酶功能下调/缺失/灭活，以便除去人样乳-N-neotetraose结构。包含用于生物合成LPS低聚糖结构的lgt基因的奈瑟氏球菌基因座(及其序列)是本领域已知的(Jennings等人，Microbiology 1999 1453013-3021和其中引证的参考文献，以及J.Exp.Med.1802181-2190 )。优选lgtB(或功能性基因产物)被下调/缺失，这是因为它可留下完整的LPS保护性表位。
在本发明的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B泡制品中，siaD和lgtB的下调/缺失是优选的，(虽然，在脑膜炎球菌B泡产生菌株中也可使用lgtB-与ctrA-、ctrB-、ctrC-、ctrD-、synA-(相当于synX-和siaA-)、synB-(相当于siaB-)或synC-(相当于siaC-)中任何一个的组合)，得到具有最佳安全性和LPS保护性表位保留的泡制品。
本发明的另一方面是上述泡免疫原性制品，其来源于脑膜炎球菌B的这种组合突变株。所述菌株本身是本发明的另一方面。
本发明的免疫原性组合物可包括至少1、2、3、4或5种不同的外膜小泡制品。当包括两种或多种OMV制品时，本发明至少一个抗原在各OMV中被上调。这种OMV制品可来源于相同种类和血清组的奈瑟氏球菌菌株或优选来源于不同种类、血清组、血清型、亚血清型或免疫型的奈瑟氏球菌菌株。例如，免疫原性组合物可包括一种或多种外膜小泡制品，其含有免疫型L2的LPS和含有免疫型L3的LPS的一种或多种外膜小泡制品。L2或L3OMV制品优选来源于稳定的菌株，其在LPS低聚糖合成基因座具有最小的相变异性。
与亚单位组合物组合的外膜小泡本发明的免疫原性组合物还可包括亚单位组合物和外膜小泡。有若干抗原由于它们的溶解性而特别适于包括在亚单位组合物中。这种蛋白的例子包括FhaB、NspA、Hsf的过客结构域、Hap的过客结构域、AspA的过客结构域、AspA、OMP85、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilQ。外膜小泡制品具有选自下列的至少一种不同抗原，其在外膜小泡中已被重组上调NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、NadA、TspA、TspB、PilC、PilQ、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafB和PldA；且任选包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。
本发明具体的免疫原性组合物在下列具体组合中，当抗原组合存在于泡中时，这种抗原组合应如上所述被上调。
本发明特别优选的实施方案包括自体转运蛋白和铁获得蛋白，更优选Hsf和TbpA(高)和/或TbpA(低)。这种免疫原性组合物可优选进一步包括OMP85、FrpA、FrpC、LbpA、LbpB、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TspA、NadA、TspB、PilQ、FhaC、NspA、PldA、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaB、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、VapD和Hap中的至少一种。所有上述免疫原性组合物还可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。
本发明的另一优选实施方案包括Hsf和选自下列的至少一种其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、Hap、AspA、IgA蛋白酶、OMP85、NspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaC、NadA、PldA、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB。所有上述免疫原性组合物还可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括Hsf和OMP85(任选与Hap、FrpA或LbpB的一个或多个)；Hsf和Hap(任选与FrpA、LbpB或OMP85的一个或多个)；Hsf和FrpA(任选与Hap、LbpB或OMP85的一个或多个)；Hsf和LbpB(任选与Hap、OMP85或FrpA的一个或多个)。由于Hsf既是粘附素又是自体转运蛋白，因此特别优选的组合包括Hsf、OMP85、TbpA、LPS免疫型L2和/或L3，优选在多价泡制品中，其具有所提供的所有5组抗原的成员。优选TbpA(低)和TbpA(高)均存在。
本发明的另一免疫原性组合物包括FhaB和选自下列的至少一种其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TdfH、PorB、PldA、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA和TspB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括FhaB和Hsf(任选与OMP85、LbpB、Hap或FrpA的一个或多个)；FhaB和OMP85(任选与LbpB、Hap或FrpA的一个或多个)；FhaB和LbpB(任选与Hap或FrpA的一个或多个)；FhaB和Hap(任选与FrpA)。优选组合包括FhaB、LbpB、Hsf(作为OMP)和FrpA，其具有所提供的全部5组抗原的成员。
本发明的另一免疫原性组合物包括NspA和选自下列的至少一种其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、SIBp、NMB0964、NMB0293、Hap、OMP85、PilQ、AspA、IgA蛋白酶、NadA、PldA、Hsf、Hap、TspA、TspB、TdfH、PorB、和LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括NspA和Hsf(任选与OMP85、Hap、LbpA或TbpA的一个或多个)；NspA和OMP85(任选与Hap、LbpA或TbpA的一个或多个)；NspA和Hap(任选与LbpA或TbpA的一个或多个)；NspA和LbpA(任选与TbpA)。特别优选的组合包括NspA、Hsf、TbpA、LPS免疫型L2和/或L3，优选在多价泡制品中，其具有所提供的全部5组抗原的成员。优选TbpA(低)和TbpA(高)均存在。
本发明没有要求保护具有WO00/25811中所公开的抗原的个别组合的免疫原性组合物。优选，如果它们的抗原内含物仅由转铁蛋白结合蛋白和NspA组成(或在泡疫苗中，上调的或富聚的抗原内含物仅由转铁蛋白结合蛋白和NspA组成)，则这类免疫原性组合物或疫苗不包括在本发明内，然而可包括由NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)组成或包括NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)的特定抗原(或上调的抗原)组合。任选地，没有要求保护包括转铁蛋白结合蛋白和NspA的组合(亚单位)或上调(泡)的组合物或疫苗。
本发明另一免疫原性组合物包括NadA和选自下列的至少一种其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、OMP85、NspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、HpuA、HpuB、AspA、IgA蛋白酶、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。
本发明另一免疫原性组合物包括TbpA(低)和选自下列的至少一种抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、IgA蛋白酶、NspA、HpuA、HpuB、Hap、OMP85、NspA(当与TbpA(高)组合时)、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、AspA、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和haB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括TbpA(低)和Hsf和LbpA；TbpA(低)和OMP85(任选与LbpA和Hap之一或两者)；TbpA(低)和LbpA和Hap。
本发明另一免疫原性组合物包括TbpA(高)和选自下列的至少一种其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、Hap、OMP85、NspA(当与TbpA(低)组合)、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、MafA、MafB、AspA、IgA蛋白酶、PldA、FhaB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括TbpA(高)和Hsf和LbpA；TbpA(高)和OMP85(任选与LbpA和Hap之一或两者)；TbpA(高)和LbpA和Hap。
本发明另一免疫原性组合物包括LbpA和选自下列的至少一个其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、TbpB、Hap、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA、MafB、IgA蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH、PorB和FhaB以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括LbpA和Hsf(任选与Hap)。
本发明另一免疫原性组合物包括LbpB和选自下列的至少一个其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpA、TbpB、Hap、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA、MafB、IgA蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括LbpB和Hsf(任选与OMP85、Hap或FrpA的一个或多个)；LbpB和OMP85(任选与Hap或FrpA的一个或多个)；LbpB和Hap(任选与FrpA)。
本发明另一免疫原性组合物包括OMP85和选自下列的至少一个其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、IgA蛋白酶、AspA、Hsf、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、PilQ、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括OMP85和Hsf(任选与LbpA或NspA的一个或多个)；OMP85和LbpA(任选与Hap和NspA的一个或多个)；OMP85和Hap(任选与NspA)。
本发明另一免疫原性组合物包括Hap和选自下列的至少一个其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、NspA、IgA蛋白酶、AspA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。
本发明另一免疫原性组合物包括FrpA和选自下列的至少一个其它抗原LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。
本发明另一免疫原性组合物包括FrpC和选自下列的至少一个其它抗原LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。
本发明另一免疫原性组合物包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者以及选自下列的至少一个其它抗原LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB。
本发明免疫原性组合物中的优选抗原组合包括如下组合，该组合包含铁获得蛋白、自体转运蛋白和FhaB；铁获得蛋白、自体转运蛋白和PilC；铁获得蛋白、自体转运蛋白和NadA；铁获得蛋白、自体转运蛋白和FrpA；铁获得蛋白、自体转运蛋白和PilQ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和TspA；铁获得蛋白、自体转运蛋白和TspB；铁获得蛋白、自体转运蛋白和NspA；铁获得蛋白、自体转运蛋白和FrpC；更优选包含铁获得蛋白、自体转运蛋白和Hap；铁获得蛋白、自体转运蛋白和FrpA/C；铁获得蛋白、自体转运蛋白和LbpB；铁获得蛋白、自体转运蛋白和OMP85(D15)。最优选，掺入OMP85(D15)作为外膜小泡制品的一部分。
包含LPS的本发明免疫原性组合物优选具有与T-辅助细胞表位来源，优选蛋白缀合的LPS，且就OMV中的LPS而言，优选外膜蛋白。特别优选的实施方案包括已经与OMP在外膜小泡制品中(如上所述)原位(优选泡内)缀合的LPS。
本发明的免疫原性组合物可包括来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、Y、W-135或淋病奈瑟氏球菌的抗原(蛋白、LPS和多糖)。
优选本发明的免疫原性组合物或疫苗不由WO00/71725第3页第18行-第52页第2行表中所列的SEQ ID的特定组合和/或WO00/71725中实施例1-11描述的任何单个组合组成和/或含有这些组合。
优选，本发明不要求保护WO01/52885中公开的个别组合。
其它组合本发明的免疫原性组合物还可包括细菌荚膜多糖或低聚糖。荚膜多糖或低聚糖可来源于下列一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、Y、和/或W-135、流感嗜血杆菌b(Haemophilus influenzae b)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、A组链球菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcas aureus)和表皮葡萄球菌(Stapylocoaus epidermidis)。
本发明另一方面是含有本发明抗原性组合物和其它抗原的疫苗组合物，其可有利地用于抗某些疾病状况，包括与病毒或革兰氏阳性菌有关的那些。
在其中一个优选组合中，本发明的抗原性组合物是用下列脑膜炎球菌荚膜多糖或低聚糖的1、2、3或优选全部4种配制的，其可以是简单的或与蛋白载体A、C、Y或W-135缀合的。优选本发明的免疫原性组合物是用A和C；或C；或C和Y配制的。这种含有源自脑膜炎奈瑟氏球菌，优选血清组B的蛋白的疫苗可被有利地用作通用的脑膜炎球菌疫苗。
在另一优选实施方案中，本发明的抗原性组合物，优选用简单或缀合的脑膜炎球菌荚膜多糖或低聚糖A、C、Y或W-135的1、2、3或全部4种配制(如上所述)的，是用缀合的流感嗜血杆菌b荚膜多糖或低聚糖，和/或一种或多种简单或缀合的肺炎球菌荚膜多糖或低聚糖配制的。任选地，所述疫苗还可包括一种或多种蛋白抗原，它们可保护宿主免受肺炎链球菌感染。这种疫苗可被有利地用作通用脑膜炎疫苗。
在又一优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物是用来源于脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌b、肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌、金黄色脓葡萄球菌或表皮葡萄球菌中一种或多种的荚膜多糖或低聚糖配制的。肺炎球菌的荚膜多糖抗原优选选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最优选选自1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。进一步优选的实施方案包括流感嗜血杆菌的PRP荚膜多糖。进一步优选实施方案包括金黄色葡萄球菌的5型、8型或336荚膜多糖。进一步优选实施方案包括表皮葡萄球菌的I型、II型或III型荚膜多糖。进一步优选实施方案包括B组链球菌的Ia型、Ic型、II型或III型荚膜多糖。进一步优选实施方案包括A组链球菌的荚膜多糖，优选还包括至少一种M蛋白且更优选多种类型的M蛋白。
本发明这种荚膜多糖可与载体蛋白如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)非-缀合或缀合。所述多糖缀合物可通过任何已知的偶联技术制备。例如，可经由硫醚键使多糖偶联。这种缀合方法依靠用1-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶鎓(CDAP)活化多糖而形成氰酸酯。活化多糖可因此与载体蛋白上的氨基直接偶联或经由间隔基团偶联。优选，使用包括形成硫醚键的杂络合化学过程使氰酸酯与己二胺偶联，使氨基-衍生的多糖与载体蛋白偶联。这种缀合物在PCT公开申请WO93/15760Uniformed Services University中描述。
缀合物还可通过如US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)中描述的直接还原胺化方法制备。其它方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。其它方法包括通过碳二亚胺缩合使己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖与蛋白载体偶联(Chu C.等人，Infect.Immunity，1983 245 256)。当包括低聚糖时，优选使它们缀合在一起。
优选的肺炎球菌蛋白抗原是在肺炎球菌外表面上暴露的那些肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌至少部分生活周期内能够由宿主免疫系统识别)，或是由肺炎球菌分泌或释放的蛋白。最优选，所述蛋白是毒素、粘附素、2-组分信号转导蛋白、或肺炎链球菌的脂蛋白，或其片段。特别优选的蛋白包括，但不限于肺炎球菌溶血素(优选通过化学处理或突变解毒)[Mitchell等人，Nucleic Acids Res.1990年7月11日18(13)4010“Comparison of pneumolysin genes and proteinsfrom Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.”，Mitchell等人，Biochim Biophys Acta 1989年1月23日；1007(1)67-72，“Expression of the pneumolysin gene in Escherichiacolirapid purification and biological properties.”，WO96/05859(A.Cyanamid)、WO90/06951(Paton等人)、WO99/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失变体(US5804193-Briles等人)；PspC及其跨膜缺失变体(WO97/09994-Briles等人)；PsaA及其跨膜缺失变体(Berry和Paton，Infect Immun 1996年12月；64(12)5255-62，“Sequence heterogeneity of PsaA，a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence ofStreptococcuspneumoniae”)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜缺失变体；CbpA及其跨膜缺失变体(WO97/41151、WO99/51266)；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(Infect.Immun.1996 643544)；HSP70(WO96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato等人，FEMS Microbiol Lett 1998，164207-14)；M样蛋白(EP0837130)和粘附素18627(EP0834568)。进一步优选的肺炎球菌蛋白抗原是WO98/18931中公开的那些，特别是WO98/18930和PCT/US99/30390中选择的那些。
本发明的免疫原性组合物/疫苗还可任选包括由其它革兰氏阴性菌，例如粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)或流感嗜血杆菌制备的外膜小泡制品。
粘膜炎莫拉氏菌泡制品本发明的免疫原性组合物还可包括来源于粘膜炎莫拉氏菌的OMV制品。如WO01/09350所述，基因工程改造的OMV制品可来源于粘膜炎莫拉氏菌。优选将下列基因(编码保护性抗原)的一种或多种上调OMP106(WO97/41731和WO96/34960)、HasR(PCT/EP99/03824)、PilQ(PCT/EP99/03823)、OMP85(PCT/EP00/01468)、lipo06(GB9917977.2)、lipo10(GB9918208.1)、lipo11(GB9918302.2)、lipo18(GB9918038.2)、P6(PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB(Helminen ME等人，(1993)Infect.Immun.612003-2010)、D15(PCT/EP99/03822)、Omp1A1(PCT/EP99/06781)、Hly3(PCT/EP99/03257)、LbpA和LbpB(WO98/55606)、TbpA和TbpB(WO97/13785和WO97/32980)、OmpE、UspA1和UspA2(WO93/03761)、和Omp21。作为可被异源引入到其他革兰氏阴性菌中的基因，它们也是优选的。
优选将下列基因的一个或多个下调CopB、OMP106、OmpBl、TbpA、TbpB、LbpA、和LbpB。
优选将下列基因的一个或多个下调htrB、msbB和lpxK。
优选将下列基因的一个或多个上调pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。
流感嗜血杆菌泡制品本发明的免疫原性组合物还可包括来源于流感嗜血杆菌的OMV制品。如WO01/09350所述，基因工程改造的OMV制品可来源于流感嗜血杆菌。优选将下列基因(编码保护性抗原)的一个或多个上调D15(WO94/12641)、P6(EP281673)、TbpA(WO96/40929、WO95/13370)、TbpB(WO96/40929；WO95/13370)、P2、P5(WO94/26304)、OMP26(WO97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47、和Hif(该操纵子中的所有基因均应被上调以将菌毛蛋白上调)。作为可被异源引入到其他革兰氏阴性菌中的基因，它们也是优选的。
优选将下列基因的一个或多个下调P2、P5、Hif、IgAl-蛋白酶、HgpA、HgpB、HMW1、HMW2、Hxu、htrB、msbB和1pxK。
优选将下列基因的一个或多个上调pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。
本发明的免疫原性组合物/疫苗还可任选包括抗白喉、破伤风和百日咳鲍特氏菌(Bordetella pertussis)感染中一种或多种的抗原。百日咳鲍特氏菌组分可被杀死，无论是全细胞百日咳鲍特氏菌(Pw)还是无细胞的百日咳鲍特氏菌(Pa)，其包含来源于PT、FHA和69kDapertactin的至少一种抗原(优选2或所有3种)。通常，提供抗白喉和破伤风保护的抗原是白喉类毒素和破伤风类毒素。类毒素是化学灭活的毒素或通过引入点突变而灭活的毒素。
免疫原性组合物/疫苗还可任选地包括一种或多种保护宿主免受非-分型(non-typeable)流感嗜血杆菌、RSV感染的抗原和/或一种或多种可保护宿主免受流感病毒感染的抗原。这种疫苗可有利地用作通用中耳炎疫苗。
优选的非分型流感嗜血杆菌蛋白抗原包括丝束蛋白(US5766608)和含有来自丝束蛋白的肽的融合蛋白(例如，LB1融合蛋白)(US5843464-Ohio State Research Foundation)、OMP26、P6、蛋白D、TbpA、TbpB、Hia、Hmw1、Hmw2、Hap、和D15。
优选的流感病毒抗原包括完整的、活的或灭活的病毒、脱落流感病毒，其在卵或MDCK细胞中生长，或非洲绿猴肾细胞株系细胞或完整的流感病毒体(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所述)或其纯化或重组蛋白，如HA、NP、NA、或M蛋白、或其组合。
优选的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。
本发明的免疫原性组合物可包括粘膜炎莫拉氏菌蛋白，包括TbpA(WO97/13785；WO99/52947)、TbpB(WO97/13785；WO99/52947；Mathers等人，FEMS Immunol Med Microbiol 1997 19；231-236；Myers等人Infect Immun 1998 66；4183-4192)、LbpA、LbpB(Du等人，Infect Immun 1998 66；3656-3665)、UspA1、UspA2(Aebi等人，Infect Immun.1997 65；4367-4377)、OMP106(US6214981)、Ton-B依赖性受体(WO00/78968)、CopB(Sethi等人，Infect.Immun.199765；3666-3671)、和HasR受体(WO00/78968)；流感嗜血杆菌的蛋白包括HMW(St Geme等人，Infect Immun 1998 66；364-368)、Hia(St Geme等人，J.Bacteriol.2000 182；6005-6013)、Tbp1(WO96/40929；WO95/13370)、Tbp2(WO96/40929；WO95/13370；Gray-Owen等人，Infect Immun 1995 63；1201-1210)、LbpA、LbpB(Schryvers等人，1989，29121-130)、HasR、Ton B-依赖性受体(Fleishmann等人，Science 1995 269；496-512)、血红蛋白-结合蛋白、HhuA(Cope等人，Infect Immun 2000 68；4092-4101)、HgpA(Maciver等人，Infect Immun 1996 64；3703-3712)、HgbA、HgbB和HgbC(Jin等人，Infect Immun 1996 64；3134-3141)、HxuA(Cope等人，Mol Microbiol 1994 13；863-873)、HxuC(Cope等人，InfectImmun 2001 69；2353-2363)；来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白，包括Tbp1、Tbp2、FbpA、FbpB、BfrA、BfrB(Tettelin等人，Science 2000287；1809-1815)、LbpA、LbpB和HmbR。
疫苗制剂本发明的优选实施方案是还可含有药学上可接受赋形剂或载体的本发明免疫原性组合物的疫苗制剂。
来源于上述任何一种修饰菌株的外膜小泡制品的制备可通过本领域技术人员熟知的任何一种方法实现。优选使用EP 301992、US5,597,572、EP 11243或US 4,271,147中公开的方法。更优选使用WO01/09350中描述的方法。
疫苗制品通常在疫苗设计中描述(“The subunit and adjuvantapproach”(eds Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)Plenum PressNew York)。
本发明的疫苗制剂中可向本发明的抗原性组合物施加佐剂。适宜的佐剂包括铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但还可以是钙盐(特别是碳酸钙)、铁盐或锌盐，或可以是酰化酪氨酸或酰化糖，阳离子或阴离子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。
可使用的适宜Thl佐剂系统包括单磷酰基脂类A，特别是3-脱-O-酰化单磷酰基脂类A和单磷酰基脂类A、优选3-脱-O-酰化单磷酰基脂类A(3D-MPL)与铝盐(优选磷酸铝)的组合。增强的系统包括单磷酰基脂类A和皂苷衍生物的组合，特别是WO94/00153中公开的QS21与3D-MPL的组合，或如WO96/33739中公开的反应原性较低的组合物，其中用胆固醇猝灭QS21。WO95/17210中描述了特别有效的、包含QS213D-MPL和生育酚的水包油乳液的佐剂，且其是优选的制剂。
所述疫苗可包括皂苷，更优选QS21。它还可包括水包油乳液和生育酚。含有寡核苷酸的未甲基化的CpG(WO96/02555)是TH1反应的优选诱导剂，且适用于本发明。
本发明的疫苗制品可用于保护或治疗易感染的哺乳动物，其中经由全身或粘膜途径给予所述疫苗。这些给药可包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经由粘膜给予口腔/消化、呼吸、泌尿生殖道。因此本发明其中一个方面是使人类宿主免疫而抗革兰氏阴性菌感染所引起的疾病的方法，该方法包括给予所述宿主免疫保护剂量的本发明OMV制品。
选择每个疫苗剂型中的抗原量，其可诱导免疫保护反应且没有一般疫苗的明显的副作用。这种量可根据所用的特定免疫原以及如何提供而变化。通常预期每个剂型包含1-100μg蛋白抗原或OMV制品，优选5-50μg，且最一般5-25μg。
特定疫苗的最佳用量可通过标准研究确定，该标准研究包括观察受试者中的适宜免疫反应。初次接种后，受试者可接受一次或若干次适当间隔的加强免疫。
本发明的疫苗优选是免疫保护性且无毒的，并适于儿童和青少年使用。
给儿科使用时，它是指小于4岁的儿童。
免疫保护性是指令人满意地满足上述SBA和/或动物保护模型和/或粘附阻断测定法。
无毒是指通过熟知的LAL和热原性测定法测量，疫苗中的内毒素活性水平不大于令人满意的水平。
本发明的多核苷酸“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA，单链和双链区混合的DNA，单链和双链的RNA，单链和双链区混合的RNA，包含单链或，更通常双链或单链与双链区混合的DNA和RNA的杂交分子。此外“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或同时包含RNA与DNA的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，和具有由于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和特殊碱基如肌苷。已经对DNA和RNA进行了各种修饰；因此，“多核苷酸”包括一般天然存在的多核苷酸的化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特征性的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还包括相对较短的多核苷酸，通常被称作寡核苷酸。
本发明另一方面涉及免疫/疫苗制剂，其包含一种或多种多核苷酸。这种技术是本领域已知的，见，例如Wolff等人，Science(1990)2471465-8。
这种疫苗包含编码与上述本发明蛋白组合相对应的多种蛋白的一种或多种多核苷酸。
来源于这种多核苷酸的蛋白的表达将受到真核启动子的控制，该启动子能够驱动在哺乳动物细胞内表达。此外所述多核苷酸可包含编码其它抗原的序列。可驱动表达的真核启动子的例子包括来源于病毒的病毒启动子，包括腺病毒启动子、逆转录病毒启动子。可选择性地，哺乳动物启动子可用于驱动表达。
本发明其它方面本发明另一方面包括用于治疗或预防奈瑟氏球菌病的方法，包括在宿主需要时，给予其保护剂量(或有效量)的本发明疫苗。脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、Y或W135和/或淋病奈瑟氏球菌感染可被有利地预防或治疗。
本发明还包括本发明疫苗在制备用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染的药物中的用途。此外奈瑟氏球菌感染包括由脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、Y、W-135和/或淋病奈瑟氏球菌引起的感染。
本发明另一方面是可衍生本发明外膜小泡(如上所述，具有本发明重组上调的至少两种蛋白)的基因工程改造的奈瑟氏球菌菌株。这种奈瑟氏球菌菌株可以是脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌。
所述菌株还可被改造(如上所述)以下调其它奈瑟氏球菌蛋白的表达，包括LgtB、LgtE、SiaD、OpC、OpA、PorA、FrpB、msbB和HtrB中1、2、3、4、5、6、7或8个的表达。用于下调的优选组合包括至少LgtB和SiaD的下调(优选缺失)、至少PorA和OpC的下调、至少PorA和OpA的下调以及至少PorA、OpA和OpC的下调。
本发明另一方面是制备本发明免疫原性组合物或疫苗的方法。这些方法包括将至少两种来源于奈瑟氏球菌的分离抗原或蛋白混合在一起的步骤，其可以以来源于本发明奈瑟氏球菌菌株的泡形式存在，从而制备本发明的免疫原性组合物，另一制备本发明疫苗的方法包括将本发明的免疫原性组合物与药学上可接受的载体组合的步骤。
也包括在本发明中的制备本发明免疫原性组合物的方法包括分离奈瑟氏球菌培养物中的外膜小泡的步骤。这种方法可包括将至少两种外膜小泡制品混合的又一步骤，优选其中至少一种外膜小泡制品包含免疫型L2的LPS且至少一种外膜小泡制品包含免疫型L3的LPS。本发明还包括这种方法，其中所述外膜小泡制品是通过用0-0.5％浓度的DOC提取而分离的。0.3％-0.5％浓度的DOC用于将LPS含量减到最小。在OMV制品中，其中LPS作为抗原是保守的，0-0.3％、优选0.05％-0.2％、最优选约0.1％浓度的DOC用于提取。
血影细胞或被杀死的全细胞疫苗本发明人预期对泡制品和疫苗的上述改进可很容易地扩展至血影细胞或被杀死的全细胞制品和疫苗(具有相同的优点)。可从其制备泡制品的本发明修饰的革兰氏阴性菌菌株还可用于制备血影细胞和被杀死的全细胞制品。从革兰氏阴性菌菌株制备血影制品(具有完整外膜的空细胞)是本领域熟知的(见例如WO92/01791)。杀死全细胞以制备用于疫苗中的灭活细胞制品的方法也是熟知的。术语‘泡[或OMV]制品’和‘泡[或OMV]疫苗’以及本文献所描述的方法因此，因本发明目的起见，可分别应用于本发明的术语‘血影制品’和‘血影疫苗’和‘被杀死的全细胞制品’和‘被杀死的全细胞疫苗’。
抗体和被动免疫本发明另一方面是制备用于预防或治疗奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用本发明疫苗使受体免疫并分离受体中免疫球蛋白的步骤。通过该方法制备的免疫球蛋白是本方面的另一方面。包含本发明免疫球蛋白以及药学上可接受载体的药物组合物是本发明的另一方面，其可制备用于治疗或预防奈瑟氏球菌病的药物。用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染的方法是本发明的另一方面，该方法包括给予患者有效量的本发明的药物制品。
用于多克隆抗体产生的接种物通常是通过将抗原性组合物分散在适于人类使用的生理学耐受的稀释剂，如生理盐水或其它佐剂中，从而形成含水组合物而制备的。将免疫刺激量的接种物给予哺乳动物，然后使接种的哺乳动物维持一段时，这段时间足以使抗原性组合物诱导保护性抗体。
可通过熟知的技术，如亲和层析分离抗体至所需的程度(Harlow和Lane Antibodies；a laboratory manual 1988)。
抗体可包括来源于通常使用的各种动物，例如，山羊、灵长类动物、驴、猪、马、豚鼠、大鼠或人的抗血清制品。给所述动物抽血并回收血清。
按照本发明生产的免疫球蛋白可包括完整的抗体、抗体片段或亚片段。抗体可以是任何种类，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的完整免疫球蛋白，嵌合抗体或对本发明两种或多种抗原具有双重特异性的杂交抗体。它们还可以是片段，例如F(ab′)2、Fab’、Fab、Fv等，包括杂交片段。免疫球蛋白还包括天然的、合成的或基因工程改造的蛋白，它们可通过与特异性抗原结合形成复合体而像抗体一样发挥作用。
可将本发明的疫苗给予受体，然后受体作为免疫球蛋白的来源发挥作用，该免疫球蛋白是在应答特异性疫苗的攻击时产生的。然后经由常规的血浆分离方法从如此治疗过的受试者所捐献的血浆中获得超免疫球蛋白。将所述超免疫球蛋白给予另一受试者，从而产生抗或治疗奈瑟氏球菌感染的抗性。本发明的超免疫球蛋白特别用于治疗或预防儿童、无免疫应答个体或在需要治疗对而个体在应答接种免疫时没时间产生抗体的奈瑟氏球菌病。本发明另一方面是一种药物组合物，它包含对本发明免疫原性组合物至少两种组分具有反应性的两种或多种单克隆抗体(或其片段；优选人或人源化的)，该药物组合物可用于治疗或预防革兰氏阴性菌，优选奈瑟氏球菌，更优选脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌，最优选脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B所引起的感染。
这种药物组合物包括单克隆抗体，它们可以是任何种类，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的完整免疫球蛋白，嵌合抗体或对本发明两种或多种抗原具有特异性的杂交抗体。它们还可以是片段，例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等，包括杂交片段。
制备单克隆抗体的方法是本领域熟知的，且包括脾细胞与骨髓瘤细胞的融合体(Kohler和Milstein 1975 Nature 256；495；Antibodies-a laboratory manual Harlow and Lane 1988)。可选择性地，单克隆Fv片段可通过筛选适宜的噬菌体展示库而获得(Vaughan TJ等人，1998 Nature Biotechnology 16；535)。利用已知方法，单克隆抗体可以是人源化的或部分人源化的。
本专利说明书中引证的所有参考文献或专利申请均引入此处作为参考。
本发明人指出此处每个例子中的术语“包括(comprising)”、“包括(comprise)”和“包括(comprises)”可分别任选用“由的组成(consisting of)”、“由的组成(consist of)”和“由的组成(consists of)”替代。
本发明的工业应用方法除非另有详细描述，下面的实施例是使用本领域那些技术人员熟知且常规的标准技术进行的。实施例仅是举例说明，而不是对本发明的限制。
实施例1构建用于外膜小泡制品中的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的方法WO01/09350提供用于制备外膜小泡并处理衍生外膜小泡的细菌菌株的详细方法。当外膜小泡保留有脂蛋白如TbpB或脂多糖时，优选使用低水平或不使用脱氧胆酸盐的分离方法。
实施例2Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表达PorA的重组脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株中的上调如WO01/09350实施例中所述，在某些国家，PorA在外膜小泡中的存在可能是有利的，且可增强重组改良泡的疫苗功效。在下列实施例中，我们使用修饰的pCMK(+)载体上调Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表达PorA的菌株中的表达。原始的pCMK(+)载体包括在表达lac1q的大肠杆菌宿主中被抑制，但在脑膜炎奈瑟氏球菌中是转录活性的嵌合porA/lacO启动子。在修饰的pCMK(+)中，天然的porA启动子用于驱动hsf基因的转录。编码Hsf的基因是使用下表中提供的HSF01-NdeI和HSF 02-NheI寡核苷酸引物进行PCR扩增的。由于HSF01-NdeI引物的序列，所表达Hsf蛋白的5’末端包括两个甲硫氨酸残基。PCR扩增所用的条件是由供应商描述的那些(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。热循环如下25次(94℃1分钟，48℃1分钟，72℃3分钟)和1次(72℃10分钟，4℃直到回收)。随后在pCMK(+)送递载体相应限制位点中克隆相应的扩增子。在该重组质粒中，即所设计的pCMK(+)-Hsf中，我们通过重组PCR策略使存在于嵌合porA/lacO启动子中的lacO缺失。pCMK(+)-Hsf质粒被用作模板以使下列2个单独的DNA片段PCR扩增-片段1包括porA5’诱重组区，卡那霉素抗性基因和porA启动子。所用的寡核苷酸引物RP1(SacII)和RP2在下表中提供。RP1引物与紧在lac操纵子上游的序列同源。
-片段2包括来源于porA基因的Shine-Dalgarno序列、hsf基因和porA3’重组区。所用的寡核苷酸引物RP3和RP4(ApaI)在下表中提供。RP3引物与紧在lac操纵子下游的序列同源。片段1的3’末端和片段2的5’末端具有48个碱基重叠。将各500ng PCR(1和2)用于使用引物RP1和RP4进行的终PCR反应。将所得的终扩增子亚克隆到用SacII和ApaI限制酶切的pSL1180载体中。使用QIAGEN maxiprep试剂盒大规模纯化修饰质粒pCMK(+)-Hsf，并将2μg该材料用于转化缺少功能性cps基因的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株。为了维持porA的表达，通过PCR和蛋白质印迹筛选方法的组合来选择单一交换产生的整合。将通过porA-特异性PCR和蛋白质印迹被证实为阳性的卡那霉素抗性克隆在-70℃以甘油原液贮存用于进一步的研究。将细菌(相当于约5.108个细菌)重悬浮于50μl PAGE-SDS缓冲液中，冷冻(-20℃)/沸腾(100℃)3次，然后通过PAGE-SDS电泳在12.5％凝胶上分离。Hsf的表达是在来源于NmB[Cps-，PorA+]或NmB[Cps-，PorA+，Hsf+]的全细胞细菌溶菌产物(WCBL)中检测的。考马斯染色可检测出Hsf表达的显著增加(相当于内源性Hsf水平)。该结果证实修饰pCMK(+)-Hsf载体是功能性的且可成功用于上调外膜蛋白的表达，不会消除主要PorA外膜蛋白抗原的产生。
这项工作中使用的寡核苷酸

实施例3利用启动子置换上调脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的tbpA基因实验的目的是用较强的porA启动子置换tbpA基因的内源性启动子区，以上调TbpA抗原的产生。就该目的而言，启动子置换质粒是用大肠杆菌克隆方法构建的。位于tbpA编码区列上游的DNA区(731bp)是在脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC 13090的私立Incyte PathoSeq数据库中发现的。该DNA包含编码TbpB抗原的序列。所述基因是在操纵子中组织的。TbpB基因将缺失并被CmR/porA启动子弹夹置换。就该目的而言，与tbpB基因的509bp5’侧翼区、2139bp的tbpB编码序列、87bp的基因间序列以及tbpA编码序列的前483个核苷酸相对应的3218bp的DNA片段是用含有吸收序列和NheI及HindIII限制位点(下划线)的寡核苷酸BAD16(5’-GGC CTAGCT AGCCGT CTG AAG CGA TTAGAG TTT CAA AAT TTA TTC-3’)和BAD17(5’-GGC CAAGCTTCA GAC GGCGTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3′’)从脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B基因组DNA扩增的。用High Pure Kit(Boerhinger Mannheim，德国)纯化该PCR片段并将其直接克隆到pGemT载体(Promega，美国)中。使该质粒进行循环PCR诱变(Jones和Winistofer(1992))以便(i)插入适宜的限制位点，使CmR/PorA启动子盒克隆和(ii)使209bp的tbpB 5’侧翼序列和tbpB编码序列缺失。循环PCR是用含有适宜限制位点XmaI、BglII和XhoI(下划线)的BAD18(5’-TCCCCC GGGAAG ATCTGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3’)和BAD19(5’-GGAAGA TCTCCGCTC GAGCAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATTTGT TCC G-3’)寡核苷酸进行的。CmR/PorA启动子弹夹是使用含有适宜限制位点XmaI、SpeI、BglII和XhoI(下划线)的引物BAD21(5’-GGAAGA TCTCCGCTC GAGACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’)和BAD20(5’-TCCCCC GGGAGA TCTCAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3’)，按照先前所述从pUC D15/Omp85质粒扩增的。将该PCR片段克隆到循环PCR质粒中。该质粒用于转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B[cps-]和[cps-porA-]菌株。通过在tbpA上游区中进行双重交换进行整合可将porA启动子直接插入到tbpA ATG的上游。
实施例4两种抗原TbpA和Hsf的表达被上调的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株的构建实验目的是同时上调TbpA和Hsf在同一脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株中的表达。TbpA的产生是通过用较强的porA启动子置换其内源性启动子区而被上调的(启动子置换)。在本文中，位于tbpA上游的tbpB基因缺失，且TbpB蛋白不再存在于外膜中。Hsf的表达是通过在porA基因座插入相应基因的第二个拷贝(同源重组)而被上调的(基因送递)。两种菌株已经在WO01/09350独立专利中描述。两种策略中所用的选择标记(CmR或KanR)可使两种整合到同一染色体中。
通过Qiagen Genomic尖端500-G方案从重组Nm.B cps-/TbpA+/PorA+菌株提取总基因组DNA。用DraIII限制酶限制酶切10μgDNA，并用于通过经典转化方案转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B。用于转化的细胞是重组NmB cps-/Hsf+/PorA+(通过1次交换到porA基因座中而进行的同源重组)或重组NmB cps-/Hsf+/PorA-(通过2次交换到porA基因座中而进行的等位基因交换/同源重组)。将它们平板接种在含200μg/ml卡那霉素的GC琼脂上过夜，在GC液体培养基10mMMgCl2中被稀释到DO650＝0.1，并在用力搅拌的条件下与10μg DraIII限制酶切的基因组DNA于37℃温育6小时。在含有200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培养基上选择由于双重交换事件(PCR筛选)产生的重组脑膜炎奈瑟氏球菌，并分析TbpA和Hsf在OMV制品中的表达。如图1所示，与从对照NmB cps-菌株制备的OMV相比，从TbpA/Hsf重组NmB菌株制备的OMV中的TbpA和Hsf产生显著增加。各蛋白在双重重组体中的过量表达水平可与在相应的单一重组体中获得的表达水平相比较。TbpA和Hsf的过量表达水平是在PorA+和PorA-菌株中比较的(没有给出数据)。这些数据共同证实了(i)TbpA和Hsf在脑膜炎奈瑟氏球菌中的表达可共同且相伴地被上调，且(ii)可获得富含TbpA和Hsf的重组泡并用于免疫。
实施例5两种抗原TbpA和NspA的表达被上调的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株的构建实验目的是同时上调TbpA和NspA在同一脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株中的表达。TbpA的产生是通过用较强的porA启动子置换其内源性启动子区而被上调的(启动子置换)。NspA的表达是通过在porA基因座插入相应基因的第二个拷贝(同源重组)而被上调的(基因送递)。两种菌株已经在独立专利WO01/09350描述。两种策略中所用的选择标记(CmR或KanR)可使两种整合到同一染色体中。
通过Qiagen Genomic尖端500-G方案从重组NmB cps-/TbpA+/PorA+菌株提取总基因组DNA。用AatII限制酶限制酶切10μgDNA，并用于通过经典转化方案转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B。用于转化的细胞是重组NmB cps-/NspA+/PorA+。将它们平板接种在含200μg/ml卡那霉素的GC琼脂上过夜，在GC液体培养基10mM MgCl2中被稀释到DO650＝0.1，并在用力搅拌的条件下与10μg AatII限制酶切的基因组DNA于37℃温育6小时。在含有200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培养基上选择由于双重交换事件(PCR筛选)产生的重组脑膜炎奈瑟氏球菌，并分析TbpA和NspA在OMV制品中的表达。与从对照NmB cps-菌株制备的OMV相比，从TbpA/NspA重组NmB菌株制备的OMV中的TbpA和NspA产生显著增加。各蛋白在双重重组体中的过量表达水平可与在相应的单一重组体中获得的表达水平相比较。这些数据共同证实了(i)TbpA和NspA在脑膜炎奈瑟氏球菌中的表达可共同且相伴地被上调，且(ii)可获得富含TbpA和NspA的重组泡并用于免疫。
实施例6两种抗原NspA和D15/Omp85的表达被上调的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株的构建实验的是同时上调NspA和D15/Omp85在同一脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株中的表达。D15/Omp85的产生是通过用较强的porA启动子置换其内源性启动子区而被上调的(启动子置换)。NspA的表达是通过在porA基因座插入相应基因的第二个拷贝(同源重组)而被上调的(基因送递)。两种菌株已经在独立专利WO01/09350中描述。两种策略中所用的选择标记(CmR或KanR)可使两种整合组合到同一染色体中。
通过Qiagen Genomic尖端500-G方案从重组NmB cps-/D15-Omp85/PorA+菌株提取总基因组DNA。用AatII限制酶限制酶切10μgDNA，并用于通过经典转化方案转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B。用于转化的细胞是重组NmB cps-/NspA+/PorA-。将它们平板接种在含200μg/ml卡那霉素的GC琼脂上过夜，在GC液体培养基，10mM MgCl2中被稀释到DO650＝0.1，并在用力搅拌的条件下与10μg AatII限制酶切的基因组DNA于37℃温育6小时。在含有200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培养基上选择由于双重交换事件(PCR筛选)产生的重组脑膜炎奈瑟氏球菌，并分析NspA和D15/Omp85在OMV制品中的表达。与从对照NmB cps-菌株制备的OMV相比，从NspA/D15-Omp85重组NmB菌株制备的OMV中的NspA和D15/Omp85产生显著增加。各蛋白在双重重组体中的过量表达水平可与在相应的单一重组体中获得的表达水平相比较。这些数据共同证实了(i)NspA和Omp85在脑膜炎奈瑟氏球菌中的表达可共同且相伴地被上调，且(ii)可获得富含NspA和Omp85的重组泡并用于免疫。
实施例7重组Hsf形式在大肠杆菌中的产生和纯化对来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的Hsf-样蛋白进行的计算机分析揭示了至少4个结构域。将来源于菌株H44/76的Hsf序列作为参考，包含氨基酸1-51的结构域1编码自体转运蛋白家族特征性的sec-依赖性信号肽，包含氨基酸52-473的结构域2编码很可能是表面外露的且易进入免疫系统的过客结构域，包含氨基酸474-534的结构域3编码蛋白低聚所需的推定卷曲螺旋结构域及绞链(颈部)区，包含残基535-C末端的结构域4被预测编码可能装配成桶-样结构且被锚定在外膜中的β-链(Henderson等人，(1998)，Trends Microbiol.6370-378；Hoiczyk等人，(2000)，EMBO 225989-5999)。因为结构域2和3很可能是表面外露的，且很好保守的(在所测试的所有菌株中超过80％；如Pizza等人，(2000)，Science 2871816-1820所述)，它们代表了目标疫苗候选物。就该目的而言，结构域2(被称作Hsf过客结构域)和结构域2+3(被称作Hsf颈部区+卷曲螺旋结构域)在大肠杆菌中表达并被纯化。编码氨基酸52-473(Hsf过客)和52-534(Hsfn+cc)的DNA片段是用加入末端RcaI(正向引物)和XhoI(反向引物)限制位点的寡核苷酸进行PCR扩增的。纯化的扩增子是用RcaI/XhoI在供应商建议的条件下消化的；且随后被克隆到pET24d(Novagen Inc.，MadisonWI)大肠杆菌表达载体的NcoI(与rcaI相容)/XhoI位点中。选择重组质粒并用于制备纯化重组质粒。进行表达研究时，将这些载体(pET-Hsfpas和pET-Hsf ncc)引入到大肠杆菌菌株B121DE3(Novagen)中，其中，T7聚合酶的基因受到异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可调节的lac启动子的控制。Novablue(DE3)[pET-24b/BASB029]大肠杆菌重组菌株的液体培养物(700ml)是在37℃搅拌下生长的，直到600nm的光密度(OD600)达到0.6。在该时间点，加入IPTG至1mM终浓度，使培养物再生长4小时。然后10,000rpm离心该培养物，将沉淀在-20℃冷冻至少10小时。融化后，在细胞溶解之前，22℃下，利用Rannie破裂器通过两种途径将沉淀(680ml培养物)重悬浮于pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液中30分钟。4℃下，15,000rpm(Beckman J2-HS离心机，JA-20转子)离心溶解的细胞30分钟使其成为沉淀。将上清液上样到在pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液中平衡的Q-琼脂糖快速流动柱(Pharmacia)上。流过后，用5倍柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液洗涤柱子。利用溶于pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液中的250mMNaCl溶液洗脱柱上的重组蛋白。收集抗原阳性级分，并相对于pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液透析过夜。然后将0.5M NaCl和20mM咪唑加入到透析样品中。然后将样品应用在Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen)上，该柱是在含500mM NaCl和pH7.0的20mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液中平衡的。流过后，用5倍柱体积含500mM NaCl和20mM咪唑的pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液洗涤柱子。用溶于pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液中的100mM咪唑溶液洗脱污染物。用溶于pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液中的250mM咪唑溶液洗脱重组蛋白。收集抗原阳性级别并相对于含150mMNaCl的pH6.8的10mM磷酸盐缓冲液透析。如图2所示，从柱上洗脱富聚的(据估计在CBB染色的SDS-PAGE中的纯度高于90％)Hsf-样过客蛋白，它们迁移到约47kDa(估计的相对分子量)处。该多肽对5-组氨酸基序产生的小鼠单克隆抗体是反应性的。这些数据共同表明Hsf过客及Hsf ncc基因可以以重组形式在大肠杆菌中表达并纯化。
实施例8重组Hap过客在大肠杆菌中的产生和纯化对来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的Hap-样蛋白进行的计算机分析揭示了至少3个结构域。将来源于菌株H44/76的Hap-样序列作为参考，包含氨基酸1-42的结构域1编码自体转运蛋白家族特征性的sec-依赖性信号肽，包含氨基酸43-950的结构域2编码很可能是表面外露的且易进入免疫系统的过客结构域，包含氨基酸951-C末端(1457)的结构域3被预测编码可能装配成桶-样结构且被锚定在外膜中的β-链。因为结构域2很可能是表面外露的，且很好保守的(在所测试的所有菌株中超过80％)并可能作为亚单位抗原在大肠杆菌中产生，所以它代表了目标疫苗候选物。因为结构域2和3很可能是表面外露的，且很好保守的(在所测试的所有菌株中超过80％；如Pizza等人，(2000)，Science 2871816-1820所述)，所以它们代表了目标疫苗候选物。就该目的而言，结构域2(被称作Hap过客结构域)在大肠杆菌中表达并被纯化。编码氨基酸43-950(Hap过客)的DNA片段是用加入末端NcoI(正向引物)和XhoI(反向引物)限制位点的寡核苷酸进行PCR扩增的。纯化的扩增子是用NcoI/XhoI在供应商建议的条件下消化的；且随后被克隆到pET24d(Novagen Inc.，Madison WI)大肠杆菌表达载体的NcoI/XhoI位点中。选择重组质粒并大规模纯化。进行表达研究时，将这些载体(pET-Hap pass)引入到大肠杆菌菌株B121DE3(Novagen)中，其中，T7聚合酶的基因受到异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可调节的lac启动子的控制。
在发酵罐中培养大肠杆菌BL21[pET-Hap pass]将主接种物的等分试样级分(100μl)在FEC013AA平板(大豆胨A3 20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、琼脂18g/L、蒸馏水加到1L)上扩散，并在37℃下生长20小时。收获菌苔并重悬浮于含0.9％NaCl的无菌水中。该溶液用于以批量模式在20L发酵罐中的FEC011AC培养基(大豆胨24g/L、酵母提取物48g/L、MgSO4/7H2O 0.5g/L、K2HPO42g/L、NaH2PO4/2H2O 0.45g/L、甘油(87％)40g和蒸馏水加到1L)上接种。维持温度(30℃)、pH(6.8，NaOH 25％/H3PO425％)、压力(500mbar)恒定，以20L/分换气。在这些条件中，通过调整搅拌速度(100-1000rpm)将溶解的氧压维持在20％。生长8小时后加入诱导物(IPTG、1mM)(OD＝27.8)。6小时(OD＝49.2)和16H30(OD＝48.6)后收集样品(6L)，离心收获生物量，并在-20℃贮存相应的颗粒状物。
Hap过客的纯化HAP过客是以批量模式自发酵罐纯化的。开发了纯化流程(见下面)。
细胞破裂后，在离心沉淀中回收到大量Hap过客。用8M尿素进行溶解。尽管有N-末端His-尾部，IMAC作为第一步是无效的，但第一步后仍在SP-XL阳离子交换器上进行。在该SP-琼脂糖-XL上，在线性NaCl(0-250mM)梯度的中点定量洗脱蛋白。IMAC是用Cu++-上样的螯合琼脂糖FF进行的，如同FHAb。该时间，与FHAb相反，IMAC显示重要的纯化因子。在SDS-PAGE上，IMAC之后HAP2/3似乎是纯的。然而在0-200mM咪唑梯度下，HAP2/3的峰非常宽，因此我们试图通过咪唑步骤(10mM-100mM)洗脱；然而就纯度而言，梯度模式似乎更有效。作为最后一步，我们试验了通过凝胶渗透作用进行尿素-精氨酸缓冲液交换，然而在这种情况下，蛋白有两个洗脱峰。这两个峰在SDS-PAGE上显示出可比较的分布；因此假设是由于HAP过客的部分重折叠。然后我们进行最后一步的经典透析用于缓冲液交换。SDS-PAGE分析显示终材料的良好纯度(见图3)。HAP过客纯度是通过WB抗-his进一步证实的。它由抗-大肠杆菌识别。分子量为96.1KD。
实施例9重组FrpA/C形式在大肠杆菌中的产生和纯化脑膜炎奈瑟氏球菌编码两种RTX蛋白，它们被称作FrpA和FrpC，是在铁有限条件下分泌的(Thompson等人，(1993)J.Bacteriol.175811-818；Thompson等人，(1993)Infect.Immun..612906-2911)。RTX(重复毒素)蛋白家族在靠近它们的C-末端处共有具有如下一致序列的一系列9个氨基酸的重复Leu Xaa Gly Gly XaaGly(Asn/Asp)AspXaa.(LXGGXGN/DDX)。大肠杆菌HlyA中的重复单位被认为是Ca2+结合位点。如图4所示，在菌株FAM20中表征的脑膜炎球菌FrpA和FrpC蛋白在它们的中心和C-末端区共有广泛的氨基酸相似性，但N-末端的氨基酸相似性非常有限(如果有的话)。此外，在FrpA和FrpC之间保守的区显示出某些多态性，这是由于9氨基酸基序的重复(在FrpA中13次，在FrpC中43次)。为了评价FrpA和FrpC的疫苗潜能，我们在大肠杆菌中重组生产了在FrpA和FrpC之间保守的蛋白区。就该目的而言，包括氨基酸277-1007的DNA片段(关于脑膜炎奈瑟氏球菌FAM20肽序列)是用正向引物FrpA-19(5’-CTCGAGACCATGGGCAAA TATCATGTCTACGACCCCCTCGC-3’)和反向引物FrpA-18(3’-GTG CATAGTGTCAGAGTTTTTGTCGACGTCGTAATTATAGACC-3’)从脑膜炎奈瑟氏球菌血清组BH44/76基因组进行PCR扩增的。获得分别为约1530bp(3个重复单位)、约2130bp(13个重复单位)和2732bp(23个重复单位)的3个扩增子并用NcoI和SalI限制性内切酶消化。然后将这些片段插入到pET24d的NcoI/XhoI(与SalI相容)位点中，并选择重组质粒(分别为pET-Frp3、pET-Frp13和pET-Frp23)用于转化大肠杆菌BL21DE3细胞。如图5所示，所有这3个构建体均可在诱导后产生重组FrpA/C保守结构域。此外，增加重复单位的数量可增加重组蛋白的溶解性，这是通过细胞分级分离分析测定的(没有给出数据)。
包含23个九肽LXGGXGN/DDX重复的FrpA/C保守结构域(总计911aa)的纯化培养3.5升大肠杆菌B121DE3[pET-FRP23]并在OD达到0.6时，通过加入2mM IPTG而诱导4小时。离心收获细胞并将相应的沉淀压碎，离心澄清，并将相应的上清液上样在Ni2+-离子金属亲和柱上(Ni-NTA-琼脂糖，Qiagen GmBh)。咪唑用于洗脱，且最终通过相对于pH6.8的10mM磷酸钠、150mM NaCl进行广泛透析而被除去。
实施例10重组FHA形式在大肠杆菌中的产生和纯化截短的FhaB自脑膜炎奈瑟氏球菌克隆基因组DNA是用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒(Qiagen Gmbh)从脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株H44/76的1010个细胞中提取的。然后使该材料(1μg)经过聚合酶链反应DNA扩增，其中使用下列FhaB基因的特异性引物JKP5’AAT GGA ATA CAT ATG AAT AAA GGT TTA CATCGC ATT ATC3’和57JKP 5’CCA ACT AGT GTT TTT CGC TAC TTG GAG CTGT3’。得到编码所述蛋白前1433个N-末端氨基酸的约4200bp的DNA片段，用NdeI/SpeI限制性内切酶消化并使用标准分子生物学技术(Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Second Edition，EdsSambrook，Fritsch & Maniatis，Cold Spring Harbor press 1989)插入到pMG MCS的相应位点中(pMG衍生物，Proc Natl Acad Sci USA1985年1月；82(1)88-92)。克隆FhaB片段的DNA序列是用Big DyeCycle测序试剂盒(Perkin-Elmer)和ABI 373A/PRISM DNA测序仪测定的(见图1)。然后使重组pMG-FhaB质粒(1μg)经历聚合酶链反应DNA扩增，其中使用FhaB特异性引物(XJKP035’AATGGAATACATATGAATAAAGGTTTACATCGCATTATCTTTAG3’和XJKP57025’GGGGCCACTCGAGGTTTTTCGCTACTTGGAGCTGTTTCAG ATAGG3’)。获得4214bp的DNA片段，利用NdeI/XhoI限制性内切酶消化并使用标准分子生物学技术(Molecular Cloning，a Laboratory Manual，SecondEdition，EdsSambrook，Fritsch & Maniatis，Cold Spring Harborpress 1989)插入到pET-24b克隆/表达载体(Novagen)的相应位点中。含有截短FhaB(pET24b/FhaB2/3)的重组pET-24b的证实性测序是使用Big Dyes试剂盒(Applied biosystems)进行的并在由供应商描述的条件下，在ABI 373/A DNA测序仪上进行分析。所得核苷酸序列在图6中给出。
重组截短的FhaB蛋白在大肠杠杆菌中的表达和纯化pET24b/FhaB2/3克隆/表达载体的构建在上面描述。该载体携带从与6个组氨酸残基片段融合的菌株H44/76中分离出来的截短FhaB基因(在重组产品的C-末端)，其受到强噬菌体T7基因10启动子的控制。进行表达研究时，该载体被引入到大肠杆菌菌株Novablue(DE3)(Novagen)中，其中，T7聚合酶的基因受到异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可调节的lac启动子的控制。Novablue(DE3)[pET24b/FhaB2/3]大肠杆菌重组菌株的液体培养物(100ml)在37℃搅拌下生长，直到600nm(OD600)的光密度达到0.6。在该时间点，加入IPTG到1mM终浓度，并使培养物再生长4小时。然后10,000rpm离心培养物并将沉淀在-20℃冷冻至少10小时。融化后，25℃下将沉淀重悬浮于缓冲液A(6M盐酸胍、0.1M NaH2PO4、0.01MTris，pH8.0)中30分钟，3次通过针，并离心澄清(20000rpm，15分钟)。然后以1ml/分钟的流速将样品上样到Ni2+-上样的Hitrap柱(Pharmacia Biotech)上。流过之后，用40ml缓冲液B(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01M Trts，pH8.0)、40ml缓冲液C(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris，pH6.3)连续洗涤柱子。然后用30ml含有500mM咪唑的缓冲液D(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris，pH6.3)将柱上的重组蛋白FhaB2/3/His6洗脱下来，并收集3ml-大小的级分。如图7所示，从柱上洗脱下迁移到大约154kDa(估计的相对分子量)处的高度富聚的FhaB-2/3/His6蛋白。该多肽对5-组氨酸基序的小鼠单克隆抗体是反应性的。这些数据共同表明FhaB2/3可以以重组形式在大肠杆菌中表达并纯化。
用重组FhaB2/3/His给小鼠免疫将在大肠杆菌中表达的部分纯化的重组FhaB2/3/His6蛋白在第0、14和29天三次注射到Balb/C小鼠中(10只动物/组)。用大约5μg抗原以两种不同制剂通过皮下途径给动物注射或者吸附在100μgAlPO4上或在SBAS2乳液中配制(每个剂量的SB62乳液含5μg MPL和5μg QS21)。此外，还在实验中加入由仅用SBAS2乳液免疫的小鼠组成的阴性对照组。在第29天(II后15天)和第35(III后6天)给小鼠采血以检测特异性抗-FhaB抗体。通过对纯化重组FhaB2/3/His进行ELISA而测量混合血清(10只小鼠/组)的特异性抗-FhaB抗体。
实施例11抗FHA、Hap和Hsf抗原产生的小鼠和兔血清的粘附阻断活性与脑膜炎球菌FHAB-样、Hsf-样和Hap-样同源的蛋白先前已被描述为重要的毒性决定因素并介导百日咳鲍特氏菌(FHA)和流感嗜血杆菌(Hap和Hsf)的细菌粘附。已知与上皮和内皮细胞的粘附对于脑膜炎球菌的鼻咽定居和穿透血脑屏障而言至关重要。因此，阻碍脑膜炎球菌粘附提供了一种很有价值的方法，以控制脑膜炎球菌定居和感染。在这里我们测试了针对脑膜炎球菌FHAB2/3rd、Hap-样和Hsf-样抗原的抗-血清是否能够阻碍脑膜炎奈瑟氏球菌与内皮细胞的粘附。使用下列实验过程HUVEC粘附的抑制本研究中所用的脑膜炎球菌试验菌株是菌株NmA8013的无荚膜、无菌毛的Opa-和Opc-衍生物。37℃下，将脑膜炎球菌细胞(NmA8013衍生物的2.10E5集落形成单位(CFU))在由40μlRPMI、50μl胎牛血清和50μl血清组成的培养基中培养30分钟以测试粘附阻断性。然后将该混合物放在含人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)汇合单层的孔中，其中的培养基之前已被除去。在37℃、5％CO2下培养细菌和HUVEC细胞4小时。然后用新鲜的RPMI血清洗涤细胞单层3次，随后刮平板。然后连续稀释并将细胞溶解产物接种在GC平板上，测定与HUVEC相关的CFU。37℃培养平板48小时，以回收并使细胞相关脑膜炎球菌生长。
小鼠和兔血清的抗重组FHAB2/3rd、Hap和hsf抗原的粘附-阻断活性抗-FHA 2/3、抗-Hsf全长(WO99/58683中所述)和抗-Hap全长(WO99/55873)抗体，以及针对相应的Hsf和Hap过客结构域的抗-血清可阻碍脑膜炎球菌与内皮HUVEC细胞粘附。图8举例说明与单独的佐剂相比，由在AlPO4中配制的FHA2/3诱导的特异性抗体能够抑制脑膜炎奈瑟氏球菌B与HUVEC细胞粘附。与单独的SBAS2佐剂相比(没有抗原，4组)，抗-FHA2/3abs(SBAS2制剂)仍然是有效的，但效力低于AlPO4。单独的SBAS2佐剂(没有抗原)不能诱导可阻碍粘附的抗体。与4组相比，抗-Hap抗体(1组)可能具有轻微的抑制作用。在5组中，当试验抗-FHA2/3、抗-Hsf和抗-Hap抗体的混合物时，粘附的抑制强于单独的抗-FHA2/3，表明抗-Hap和抗-Hsf抗体产生了协同作用。在第二组抑制实验(图2)中，与阴性对照相比(3和4组)，针对抗OMV过量表达Hsf(作为候选蛋白)的特异性兔抗血清能够部分抑制脑膜炎奈瑟氏球菌B固定在内皮细胞上。该兔抗血清已被证实包含非常高的特异性抗-Hsf抗体效价。针对rec Hsf(Hsf过客和Hsf全长)的抗体也能够抑制细菌在HUVEC细胞上的粘附。用小鼠血清(5-6组)和用兔血清(激光扩展(laserextend))(7-8组)都是这样的。在该第二个实验中，证实了已经在第一个实验中测试的特异性抗-rec FHA2/3抗体(1组)具有非常高的抑制作用。这些结果表明这些特异性抗原(Hap、FHA2/3和Hsf)，无论分离的还是组合的，都是目标疫苗抗原。
实施例12在小鼠攻击模型中重组OMV的保护作用在Balb/C小鼠中评价在致命攻击后若干重组OMV的保护作用。这种活性免疫模型包括在通过皮下途径进行一系列免疫后，将来源于若干菌株的脑膜炎球菌(悬浮于缺铁TSB培养基中)腹膜内注射到成年Balb/C或OF1小鼠(6-8周大)中。用作外部铁来源的铁葡聚糖似乎是维持菌血症所必需的且导致感染动物死亡。虽然该小鼠IP模型已经显示出可有效评价毒力、免疫保护和铁在感染中的作用，但它们不会进入在人类菌血症和脑膜炎之前发生的咽运阶段。该模型已经用于筛选过量表达NspA、TbpA、或Hsf的若干OMV候选物。在下列实验中，在第0、14和28天，通过皮下途径用3(PV00N049)-5μg(PV00N035和PV00N043实验)过量表达Hsf、NspA或TbpA的rec OMV给Balb/C(近交)或OF1(远交)小鼠免疫接种3次OMV是在Al(OH)3(100μgAl(OH)3/动物)(PV00N035和PV00N043)或在AlPO4(100μg AlPO4/动物)上配制的。然后在第28天(II后14天)和第35天(III后7天)给所述动物采血，用于特异性Ab评价。第35天，在攻击前1小时，腹膜内注射10mg铁葡聚糖。用H44/76(B:15:P1.7，16)或CU-385(B:4:P1.19，15)菌株攻击，约1.10e7 CFU/动物(见准确攻击剂量结果的表)。使用CU-385菌株进行的异源菌株较之使用同源菌株更为严格。记录第1-5天的死亡率。之后的表1举例说明与较小扩展(lesser extend)中OMV porA(-)以及OMV porA(+)相比，使用OMV TbpA(+)(1/10和3/5的porA(-)与9/10和3/5的porA(+))、OMV NspA(+)(4/10和4/5)和OMVHsf(+)(3/10、2/10和3/5)观察到了更好的保护。这是我们在这三个实验中共同得到的观察结果。这些数据支持了在泡表面表达的TbpA、Hsf和NspA抗原对未来menB疫苗是重要的。
表1重组外膜小泡小鼠模型中的保护活性。该表概括了在3个实验过程中获得的结果(PV00N35、PV00N043和PV00N049)OMVs(泡)OMVs(泡)

NT没有测试实施例13在小鼠攻击模型中重组亚单位抗原的保护作用进行致死攻击后，在Balb/C小鼠中评价若干重组纯化蛋白的保护作用。这种活性免疫模型包括在通过皮下途径进行一系列免疫后，将来源于若干菌株的脑膜炎球菌(悬浮于缺铁的TSB培养基中)腹膜内注射到成年Balb/C或OF1小鼠(6-8周大)中。
用作外部铁来源的铁葡聚糖似乎是维持菌血症所必需的且导致感染动物死亡。虽然该小鼠IP模型已经显示出可有效评价毒力、免疫保护和铁在感染中的作用，但它们不会进入在人类菌血症和脑膜炎前发生的咽运阶段。该模型已经用于筛选若干menB亚单位疫苗候选物，如重组FrpC、TbpA、FHA2/3和Hap分子。
在该实验中，在第0、14和28天，通过皮下途径，在有10μg MPL(每只动物)存在时，用在AlPO4(100μg)上配制的5μg(PV00N050实验)这些蛋白给OF1(远交)小鼠免疫接种3次。
然后在第28天(II后14天)和第35天(III后7天)给所述动物采血，用于特异性Ab评价，同时在第35天攻击它们。攻击那天，在攻击前1小时，腹膜内注射10mg铁葡聚糖。用CU-385(B:4:P1.19，15)菌株进行攻击，在这种情况下其是异源的，事实上，除了TbpA序列来自B16B6菌株(B:2a:P1.2)之外，所述抗原序列均来自H44/76(B:15:P1.7，16)。
表2所列结果表明在该模型中，FrpC、TbpA、FHAB2/3rd、Hap诱导显著保护攻击之后，5只小鼠中有2-4只存活，而只使用佐剂仅仅1/5存活。除了一组之外，在所有组中，特异性抗体的效价均较高(特异性抗-TbpA效价适中)。所有这些数据支持了以亚单位抗原、分离或组合形式提供的FrpC、FrpA、FrpA/C保守结构域、TbpA、FHAB2/3rd、Hap可用于研制menB疫苗。
表2重组外膜小泡的小鼠模型中的保护活性。该表概括了在其中一个实验过程中获得的结果(PV00N050)。
亚单位抗原

实施例14表示疫苗抗原组合的协同作用的方法在检测疫苗候选物这种组合的协同作用方面，可单独或组合测试所得到的不同重组OMV(OMVs porA(+)rmp-LbpB、OMVsporA(-)TbpA(+)Hsf(+)、OMVs porA(-)TbpA(+)、OMysporA(-)NspA(+)、OMVs porA(-)Hsf(+)、OMVsporA(-)TbpA(+)NspA(+))以从统计学上确定最佳组合。这项工作还可用亚单位抗原的组合、以及亚单位抗原+重组OMV的组合进行。给32组5只OF1小鼠/组注射并测试小鼠模型中的血清杀菌和调理活性，主动和被动保护(如果需要使用次优量的各抗原)。如果组合免疫后所产生的保护水平高于各抗原的总和，则表示抗原组合的协同作用。
实施例15外膜小泡考马斯蓝染色的SDS-PAGE的Hsf和TbpA含量分析将15μg溶于外膜小泡制品中的蛋白在含有β-巯基乙醇的样品缓冲液中稀释，其中Hsf或TbpA或Hsf与TbpA两个被上调，并在95℃下加热10分钟。然后使样品通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶(Novex4-20％Tris-甘氨酸1.5mm 2Dwell SDS Page)，并在考马斯蓝中染色1小时，并通过若干次脱色洗涤而脱色。结果在图9中表示，其表明在来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜小泡制品中，Hsf和TbpA水平明显更高，其中它们的表达水平已得到提高。
实施例16Hsf和/或TbpA被上调的OMV的免疫原性在第0、21和28天，通过肌内途径用OMV给20只小鼠的组免疫3次。每次接种包括5μg(蛋白含量)在含MPL的AlPO4上配制的OMV。所述OMV来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76，其被改造成荚膜多糖和PorA被下调。比较其中的Hsf、TbpA、Hsf和TbpA两个被上调或均未被上调的OMV。在第41天，采集血液样品，通过ELISA或血清杀菌测定法进行分析。
检测抗Hsf抗体的ELISA4℃下，用100μl 1μg/ml溶于PBS中的特异性抗原覆盖96孔微量平板(Nunc，Maxisorb)过夜。用150mM NaCl 0.05％Tween 20洗涤后，在室温振摇下，用100μl 1％的PBS-BSA使平板饱和30分钟。在每个步骤之间(室温下振摇进行30分钟，并使用0.2％PBS-BSA作为稀释缓冲液)，通过用NaCl-Tween 20洗涤除去过量试剂。向每个微量孔中加入100μl稀释的血清样品。结合抗体是由生物素化的抗-小鼠Ig(Prosan)(1/2000)识别的。抗原-抗体复合体是通过与链霉抗生物素-生物素化的过氧化物酶缀合物(Amersham)(1/4000)温育而显示的。邻苯二胺/H2O2(4mg/10ml柠檬酸盐缓冲液0.1M pH4.5+5μl H2O2)用于显示测定。通过加入50μl 1N HCl而终止反应前，在黑暗中室温温育平板15分钟。阅读490nm处的吸光度。

上表所示结果表明抗Hsf的较高和相等的抗体效价是通过用其中Hsf或Hsf和TbpA两个均被上调的OMV免疫而提高的。事实上，在用单独的佐剂或其中Hsf或TbpA均未被上调或只有TbpA被上调的OMV接种后产生的血清中没有检测到抗Hsf的抗体。
实施例17抗Hsf和/或TbpA被上调的OMV产生的抗血清的血清杀菌活性在使用同源菌株H44/76或异源菌株Cu385的测定法中比较用OMV接种的小鼠抗血清的血清杀菌活性，其中OMV中的Hsf、TbpA、Hsf和TbpA两个被上调或未被上调。血清杀菌测定法已经显示出与保护作用的良好关联且因此是候选组合物在引发保护性免疫反应方面有效程度的良好指征。
在37℃+5％CO2下，在MH+1％Polyvitex+1％马血清培养皿上过夜培养脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B野生型菌株(H44/76菌株＝B:15 P1.7，16L3，7，9和CU385菌株＝B:4 P1.19，15 L3，7，9)。37℃振摇下，在补充了50μM Desferal(铁螯合剂)的液体TSB培养基中将它们传代培养3小时，以在470nm处达到约0.5的光密度。
56℃下，将混合或单独的血清灭活40分钟。在0.3％HBSS-BSA中1/100稀释血清样品，然后在50μl体积的圆底微量平板中连续稀释2倍(稀释8次)。
将适宜OD的细菌在0.3％HBSS-BSA中稀释，得到1.3 10e4CFU/ml。将37.5μl该稀释液加入到血清稀释液中，并在37℃振摇下培养微量平板15分钟。然后，将12.5μl兔补体加入到各孔中。37℃振摇培养1小时后，将微量平板放在冰上停止杀死。
使用倾斜方法，将每孔20μl涂在MH+1％Polyvitex+1％马血清培养皿中，37℃+CO2培养过夜。计算CFU和杀死的百分比。血清杀菌效价是达到≥50％杀死的最后稀释度。

与上表所示那些相似的结果是在两个其它相似的实验中获得的。
对同源菌株和异源的杀菌效价(GMT)显著增加是在用其中Hsf和TbpA被上调的OMV接种后见到的。通过比较，在用Hsf或TbpA上调的OMV接种的小鼠上测量的杀菌GMT与使用对照OMV接种小鼠获得的那些相似。
双重上调的益处还可很清楚地在产生显著水平杀菌抗体的小鼠百分比方面观察到(效价大于1/100)，特别是使用异源菌株的实验。
实施例18混合抗-Hsf和抗-TbpA血清对杀菌活性的作用在第0、21和28天，通过肌内途径用OMV给20只小鼠的组免疫3次。每次接种包括5μg(蛋白含量)在含MPL的AlPO4上配制的OMV。所述OMV来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76，其被改造成荚膜多糖和PorA被下调。用其中没有蛋白上调的对照OMV给其中一组小鼠免疫。在第二组中，Hsf表达被上调，在第三组中，TbpA表达被上调，在第四组中，Hsf和TbpA的表达均被上调。
混合血清，即或者使用同组小鼠的血清或混合从其中Hsf单独或TbpA单独被上调的组中分离的血清。测量各组混合血清的血清杀菌活性，结果在下表提供。

上表中的结果表明将抗-Hsf和抗-TbpA抗血清混合在一起可导致较之任何一种抗血清单独获得的更高的血清杀菌活性。协同作用似乎是由于抗Hsf和TbpA抗体的同时存在而获得的。
实施例19截短的Hsf蛋白可与TbpA协同组合一系列截短的Hsf构建体是用标准分子生物学方法制备的。这些包括编码包含Hsf信号序列的氨基酸1-54和Hsf氨基酸134-592的构建体(Tr1Hsf)。第二个截短的Hsf包括Hsf信号序列的氨基酸1-53，接着是Hsf的氨基酸238-592(Tr2Hsf)。将这两个截短的Hsf构建体和全长Hsf引入到脑膜炎奈瑟氏球菌B菌株MC58siaD-、Opc-、PorA中-这样它们的表达将被上调，且外膜小泡是用上述方法生产的。
外膜小泡制品吸附在Al(OH)3上，并在第0、21和28天注射到小鼠中。在第42天，给小鼠采血并制备血清。将所述血清与从用上调的TbpA OMV免疫的小鼠的血清混合，并按照上面所述进行血清杀菌测定。
结果

上表所示结果表明第一次截短(Tr1Hsf)可引发免疫反应，其能够与抗TbpA的抗血清组合产生较之使用全长Hsf更高的血清杀菌活性。然而，截短的程度十分重要，且在Tr2中产生的截短物与全长Hsf相比，具有有害作用。相对于所用的两种菌株，均可见到Tr1Hsf的杀菌活性提高。
实施例20抗TbpA、Hsf和第三种脑膜炎球菌蛋白抗体的血清杀菌活性将上述其中PorA和荚膜多糖被下调的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H66/76用作使用上述方汉上调TbpA和Hsf、LbpB、D15、PilQ或NspA的背景菌株。外膜小泡是从上述各菌株制备的。重组FHAb、FrpC、FrpA/C和Hap是用此前所述技术和本领域已知的技术制备的(如PCT/EP99/02766、WO92/01460和WO98/02547中所述)。
外膜小泡制品和重组蛋白吸附到Al(OH)3上，并在第0、21和28天注射到小鼠中。第42天，给小鼠采血并制备血清。将抗TbpA和Hsf上调的OMV的血清和来源于用含上调的LbpB、D15、PIlQ或NspA或重组FHAb、FrpC、FrpA/C或Hap的OMV接种的小鼠血清混合，并按照上面所述进行血清杀菌测定。
结果结果在下表中给出。在使用同源H44/76菌株的测定法中，除了FrpC之外，加入抗第三脑膜炎球菌抗原的抗体不会产生较之使用单独的抗TbpA和Hsf抗体所产生的更高的血清杀菌效价。
然而，抗第三种抗原抗体的加入在使用异源菌株的血清杀菌测定法中是有利的。抗D15(OMP85)、Hap、FrpA/C和LbpB的抗体可特别有效地增加抗CU385菌株的血清杀菌效价。

实施例21外膜小泡中的FrpB KO对它们在同源和异源菌株中引发杀菌免疫反应的能力的作用按照WO01/09350所述，使用0.1％DOC提取，将H44/76脑膜炎奈瑟氏球菌的两种菌株用于制备外膜小泡制品，这样LOS含量大约为20％。菌株B1733是siaD(-)、PorA(-)，具有Tr1 Hsf(实施例19)的上调且lgtB被敲除。菌株B1820 B1733是siaD(-)、PorA(-)，具有Tr1 Hsf的上调，且lgtB被敲除，FrpB也被敲除。两种菌株都是在补充了60μM Desferal的培养基中培养的，这样就可使铁调节的蛋白如LbpA/B和TbpA/B被上调。
泡制品吸附在Al(OH)3上，并在第0和21天，将5μg肌内注射到30只小鼠的组中。在第28天采集血液样品。
按照实施例17所述，在3种L3菌株(同源野生型菌株H44/76和两种异源L3菌株；NZ124和M97250687)上进行血清杀菌测定法。
结果

GMT表示SBA中的血清几何平均效价。
SC表示小鼠血清转变数(SBA效价＞1/100)。
所述结果清楚地表明FrpB KO(B 1820)泡较之FrpB(+)泡(B1733)可诱导更好的异源交叉-杀菌反应。在菌株M97250687和NZ124中，SBA效价更高且血清转变小鼠的比例更高。当FrpB缺失时，同源性菌株的结果不是很好。这些数据表明FrpB驱动免疫反应，但因为该外膜蛋白是高度可变的，因此抗该蛋白的抗体仅能诱导杀死同源菌株。
权利要求
1.一种包括两种或多种不同抗原的免疫原性组合物，其中所述抗原选自下列种类中的至少两个a)至少一种奈瑟氏球菌粘附素；b)至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白；c)至少一种奈瑟氏球菌毒素；d)至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白；或e)至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白，优选整合外膜蛋白。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述抗原选自下列种类中的至少两个a)选自FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB 0995、NMB 1119和NadA的至少一种奈瑟氏球菌粘附素；b)选自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白；c)选自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种奈瑟氏球菌毒素；d)选自TbpA高、TbpA低、TbpB高、TbpB低、LbpA、LbpB、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、FbpA、BfrA、BfrB、Bcp、NMB 0964和NMB 0293的至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白；或e)选自PilQ、OMP 85、FhaC、NspA、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、HpuB、TspA、TspB、TdfH、PorB、HimD、HisD、GNA 1870、OstA、HlpA、MltA、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA和PldA的至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白，优选整合外膜蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其是亚单位组合物。
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，它包括选自FhaB、NspA、Hsf的过客结构域、Hap的过客结构域、OMP 85的表面外露结构域、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PldA、PilC、Lipo28以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少2种抗原。
5.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，它包括外膜小泡制品，其中所述抗原在外膜小泡中已被(优选重组)上调。
6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，它包括在外膜小泡中已被上调的选自下列的至少两种抗原NspA、Hsf、Hap、OMP 85、AspA、HpuA、HpuB、TspA、TspB、FhaC、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、NM-ADPRT、P2086、TdfH、PorB、MafA、MafB、HimD、HisD、GNA 1870、OstA、HlpA、MltA和PldA；且任选包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。
7.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，它包括具有一种或多种抗原的亚单位组合物，和具有在外膜小泡中已被上调的至少一种抗原的外膜小泡制品。
8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，它包括亚单位组合物和外膜小泡制品，其中所述亚单位组合物包括选自下列的至少一种抗原FhaB、NspA、Hsf的过客结构域、Hap的过客结构域、OMP 85的表面外露结构域、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilC、Lipo28，且所述外膜小泡制品具有在外膜小泡中已被重组上调的选自下列的至少一种不同抗原NspA、Hsf、Hap、OMP 85、AspA、HpuA、HpuB、TspA、TspB、FhaC、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、NM-ADPRT、P2086、TdfH、PorB、MafA、MafB、HimD、HisD、GNA 1870、OstA、HlpA、MltA和PLdA；且任选包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者，优选在外膜小泡制品内。
9.根据权利要求5-8所述的免疫原性组合物，它包括权利要求5或6的至少两种不同的外膜小泡制品。
10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中一种外膜小泡制品是免疫型L2且另一种外膜小泡制品是免疫型L3。
11.根据权利要求1、2、5、6、7、8、9或10所述的免疫原性组合物，其中选择Hsf和TbpA(高)。
12.根据权利要求1-2或5-11所述的免疫原性组合物，其中选择Hsf和TbpA(低)。
13.根据权利要求11或12所述的免疫原性组合物，其中还选择选自Hap、LbpB、OMP 85和FrpA的一种或多种的附加抗原。
14.根据权利要求11-13所述的免疫原性组合物，其中还选择LPS免疫型L2。
15.根据权利要求11-14所述的免疫原性组合物，其中还选择LPS免疫型L3。
16.根据权利要求1-15所述的免疫原性组合物，其中选择FhaB，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、NadA、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(低)、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、NspA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
17.根据权利要求1-16所述的免疫原性组合物，其中选择NspA，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、NadA、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(低)、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
18.根据权利要求1-17所述的免疫原性组合物，其中选择NadA，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(低)、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
19.根据权利要求1-18所述的免疫原性组合物，其中选择TbpA(低)，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
20.根据权利要求1-19所述的免疫原性组合物，其中选择TbpA(高)，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
21.根据权利要求1-20所述的免疫原性组合物，其中选择LbpB，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FfpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
22.根据权利要求1-21所述的免疫原性组合物，其中选择OMP85，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
23.根据权利要求1-22所述的免疫原性组合物，其中选择Hap，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
24.根据权利要求1-23所述的免疫原性组合物，其中选择Hsf，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
25.根据权利要求1-24所述的免疫原性组合物，其中选择FrpA，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
26.根据权利要求1-25所述的免疫原性组合物，其中选择FrpC，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者的至少一种其它抗原。
27.根据权利要求1-26所述的免疫原性组合物，其中选择LPS免疫型L2，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L3的至少一种其它抗原。
28.根据权利要求1-27所述的免疫原性组合物，其中选择LPS免疫型L3，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一种其它抗原。
29.根据权利要求1-28所述的免疫原性组合物，其中选择PilQ，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一种其它抗原。
30.根据权利要求1-29所述的免疫原性组合物，其中选择HlpA，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一种其它抗原。
31.根据权利要求1-30所述的免疫原性组合物，其中选择MltA，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一种其它抗原。
32.根据权利要求1-31所述的免疫原性组合物，其中选择GNA1870，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一种其它抗原。
33.根据权利要求1-32所述的免疫原性组合物，其中选择NM-ADPRT，以及选自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
34.根据权利要求1-33所述的免疫原性组合物，其中选择MafA，以及选自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
35.根据权利要求1-34所述的免疫原性组合物，其中选择MafB，以及选自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
36.根据权利要求1-35所述的免疫原性组合物，其中选择NMB0315，以及选自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
37.根据权利要求1-36所述的免疫原性组合物，其中选择NMB1119，以及选自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
38.根据权利要求1-37所述的免疫原性组合物，其中选择HisD，以及选自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
39.根据权利要求1-38所述的免疫原性组合物，其中选择LbpA，以及选自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
40.根据权利要求1-39所述的免疫原性组合物，其中选择NMB0995，以及选自PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
41.根据权利要求1-40所述的免疫原性组合物，其中选择Lipo28，以及选自PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
42.根据权利要求1-41所述的免疫原性组合物，其中选择HimD，以及选自PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
43.根据权利要求1-42所述的免疫原性组合物，其中选择NMB1313，以及选自PilC、MafB、Omp26、FhaC、PbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
44.根据权利要求1-43所述的免疫原性组合物，其中选择NMB1953，以及选自PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一种其它抗原。
45.根据权利要求5-44所述的免疫原性组合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主细胞已被工程改造以下调一种或多种1gtB或1gtE，优选前者的表达。
46.根据权利要求5-45所述的免疫原性组合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主细胞不能合成荚膜多糖且优选已被工程改造以下调一种或多种siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(相当于synX和siaA)或synB(相当于siaB)和synC(相当于siaC)，优选siaD的表达。
47.根据权利要求5-46所述的免疫原性组合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主细胞已被工程改造以下调一种或多种OpC、OpA或PorA，优选PorA的表达。
48.根据权利要求5-47所述的免疫原性组合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主细胞已被工程改造以下调FrpB的表达。
49.根据权利要求5-48所述的免疫原性组合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主细胞已被工程改造以下调msbB和/或htrB，优选msbB的表达。
50.根据权利要求5-49所述的免疫原性组合物，其中所述外膜小泡制品包括与外膜蛋白(OMP)缀合的LPS。
51.根据权利要求50所述的免疫原性组合物，其中LPS与OMP在外膜小泡制品中原位(优选泡内)缀合。
52.根据权利要求1-51所述的免疫原性组合物，它包括从脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)衍生的抗原，优选血清组B。
53.根据权利要求1-52所述的免疫原性组合物，它包括从淋病奈瑟氏球菌衍生的抗原。
54.根据权利要求1-52所述的免疫原性组合物，其中所有奈瑟氏球菌抗原均来源于脑膜炎奈瑟氏球菌，优选血清组B。
55.根据权利要求1-54所述的免疫原性组合物，它还包括一种或多种细菌荚膜多糖或低聚糖。
56.根据权利要求55所述的免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖或低聚糖来源于选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、Y和W-135，流感嗜血杆菌b(Haemophilus influenzae b)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，A组链球菌，B组链球菌，金黄色葡萄球菌(Staphylococcas aureus)和表皮葡萄球菌(Stapylocoausepidermidis)的细菌。
57.根据权利要求55-56所述的免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖或低聚糖与蛋白缀合。
58.根据权利要求1-57所述的免疫原性组合物，它包括佐剂。
59.根据权利要求58所述的免疫原性组合物，它包括铝盐，优选磷酸铝。
60.根据权利要求58或59所述的免疫原性组合物，它包括3D-MPL。
61.一种包括权利要求1-60的免疫原性组合物以及药学上可接受载体的疫苗。
62.一种包括一个或多个多核苷酸的疫苗，所述多核苷酸编码两种或多种不同的蛋白，它的表达由真核启动子驱动，其中所述蛋白选自下列种类中的至少两个a)选自FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119和NadA的至少一种奈瑟氏球菌粘附素；b)选自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白；c)选自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD和NM-ADPRT的至少一种奈瑟氏球菌毒素；d)选自TbpA高、TbpA低、TbpB高、TbpB低、LbpA、LbpB、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、FbpA、BfrA、BfrB、Bcp、NMB0964和NMB0293的至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白；或e)选自PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、HpuB、TspA、TspB、TdfH、PorB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、MltA、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA和PldA的至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白，优选整合外膜蛋白。
63.一种用于治疗或预防奈瑟氏球菌病的方法，包括在宿主需要时给予其保护剂量的权利要求61-62的疫苗。
64.根据权利要求63所述的方法，其中脑膜炎奈瑟氏球菌感染被预防或治疗。
65.根据权利要求63所述的方法，其中淋病奈瑟氏球菌感染被预防或治疗。
66.权利要求61-62的疫苗制备用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染的药物的用途。
67.根据权利要求66所述的用途，其中脑膜炎奈瑟氏球菌感染被预防或治疗。
68.根据权利要求66所述的用途，其中淋病奈瑟氏球菌感染被预防或治疗。
69.一种衍生权利要求5-60的外膜小泡制品的基因工程改造的奈瑟氏球菌菌株。
70.一种制备权利要求1-60的免疫原性组合物的方法，包括将至少两种来源于奈瑟氏球菌的抗原混合在一起的步骤。
71.一种制备权利要求5-60的免疫原性组合物的方法，包括分离奈瑟氏球菌培养物中的外膜小泡的步骤。
72.根据权利要求71所述的方法，还包括将至少两种外膜小泡制品混合的步骤。
73.根据权利要求72所述的方法，其中至少一种外膜小泡制品包括免疫型L2的LPS，以及至少一种外膜小泡制品包括免疫型L3的LPS。
74.根据权利要求71-73所述的方法，其中所述外膜小泡是通过用0-0.5％浓度的DOC提取而分离的。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述外膜小泡是通过用0.02％-0.4％、0.04％-0.3％、0.06％-0.2％、0.08％-0.15％或优选大约或准确的0.1％浓度的DOC提取而分离的。
76.一种制备权利要求61的疫苗的方法，包括将权利要求1-60的免疫原性组合物与药学上可接受的载体混合的步骤。
77.一种制备用于预防或治疗奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用权利要求61的疫苗使受体免疫，以及从受体中分离免疫球蛋白的步骤。
78.一种通过权利要求77的方法制备的免疫球蛋白。
79.一种药物组合物，其包括权利要求78的免疫球蛋白和药学上可接受载体。
80.一种用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染的方法，包括给予患者有效量的权利要求79的药物制品的步骤。
81.权利要求79的药物制品在制备用于治疗或预防奈瑟氏球菌病的药物的用途。
82.根据权利要求5-60所述的免疫原性组合物，它包括免疫型L2的脑膜炎球菌泡和免疫型L3的脑膜炎球菌泡。
83.根据权利要求82所述的免疫原性组合物，其中TbpA(高)在其中一个泡中被上调。
84.根据权利要求82或83所述的免疫原性组合物，其中TbpA(低)在其中一个泡中被上调。
85.根据权利要求82-84所述的免疫原性组合物，其中Hsf在其中一个泡中被上调。
86.根据权利要求82-85所述的免疫原性组合物，其中OMP85在其中一个泡中被上调。
87.根据权利要求82-86所述的免疫原性组合物，其中所述泡是从不能产生荚膜多糖，优选siaD-的脑膜炎球菌菌株中分离的。
88.根据权利要求82-87所述的免疫原性组合物，其中L2和/或L3LPS低聚糖结构被截短成与已经从1gtB-脑膜炎球菌菌株中分离出来的泡一致。
89.根据权利要求82-88所述的免疫原性组合物，其中所述泡是从下调msbB表达的脑膜炎球菌菌株中分离出来的。
90.根据权利要求82-89所述的免疫原性组合物，其中L2和/或L3LPS低聚糖部分与泡整合外膜蛋白泡内缀合。
91.根据权利要求82-89所述的免疫原性组合物，其中所述泡来源于下调一种或多种FrpB、PorA、Opa或Opc表达的脑膜炎球菌菌株。
全文摘要
本发明涉及用于治疗和预防奈瑟氏球菌病的免疫原性组合物和疫苗。本发明的免疫原性组合物含有选自包括粘附素、自体转运蛋白、毒素、铁获得蛋白和膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)在内的至少两个不同种类抗原的抗原组合。这种抗原组合能以抗奈瑟氏球菌生活周期不同方面的免疫反应为目标，产生更有效的免疫反应。
文档编号A61K39/102GK1674933SQ03818648
公开日2005年9月28日 申请日期2003年7月31日 优先权日2002年8月2日
发明者F·-X·J·贝尔泰, R·比曼斯, P·德诺埃, C·费龙, C·戈拉, J·普尔曼, V·魏南茨 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司