专利名称：鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗及其制备方法，属于医药生物疫苗技术领域。
背景技术：
流感是一种甲、乙、丙三型流感病毒引起的急性呼吸道传染病。本病发病急，传播快，发病率高，具有一定的死亡率，在儿童和老弱患者中死亡率较高，给人类造成严重的社会和经济后果。而且流感病毒经常不断发生抗原变异，出现新的亚种，一般10-15年发生一次世界范围内的大流行；区域性流行春秋常在各地发生。至今人类尚无有效的治疗方法，惟一的方法就是接种流感疫苗进行预防。因此，研制免疫原性好，安全副作用小，使用方便，易接受，稳定性高，能常温保存的流感疫苗具有十分重要的社会和经济效益。制备流感疫苗必须采用WHO推荐毒株结合各国实际情况的甲1、甲3和乙型三价流感病毒来制作全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗来满足不同人群需要。流感疫苗制作工艺关键技术之一就是灭活病毒，传统工艺是用甲醛灭活，由于甲醛易使病毒粒子表面蛋白抗原受损，往往影响疫苗的免疫原性。同时甲醛又有一定的刺激性和毒副作用，人体接种这种疫苗局部和全身反应都较强。为了解决甲醛灭活存在的问题，本世纪60年代，超速离心和层析技术的应用，使流感病毒纯化操作大大提高，制成了流感全病毒灭活疫苗，也只能应用于成年健康人群，而且有时还出现不良反应，老龄者及有慢性病患者不能使用。本发明采用流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法，就是利用当代高压物理学静水压技术与生物学技术结合的方法，它不仅保留流感全病毒完整结构不被破坏，而且病毒又能完全灭活，同时抗原的免疫原性又不受影响而且还有有所提高，对流感病毒变异快，变种多非常适宜，而且工艺简便，生产周期短，完全取代了化学灭活剂。制备流感疫苗关键技术之二就是裂解病毒制备裂解疫苗和亚原单位疫苗。目前国内外裂解病毒均使化学裂解剂及去污剂，尽量应用现代清除技术处理，但仍有一定的残留化学物质，对人体还会有一些副作用。为了提高流感疫苗的安全性，免疫原及稳定性，本发明采用流感病毒纳米技术裂解工艺制造疫苗的方法。就是利用当代高压物理学纳米技术与生物学技术结合的方法，取代化学裂解剂和去污剂，这种方法简便快速，安全可靠。
用上述方法制作流感系列疫苗(全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗)虽然能满足不同人群需要，但都是针剂，必须对人体要进行肌肉注射，不少人对注射感觉得有疼痛感，尤其婴幼儿有一定恐慌性，不愿意接受注射剂预防接种。为了解决这一问题，美国2003年首次推出鼻喷式疫苗，FUMIST感喷，为非注射接种用流感疫苗。由于该疫苗是采用弱化的活流感病毒株，还有一定的副作用，而且只能限于5-49岁的健康人群，其他人群不得使用，应用范围窄。
发明内容
本发明目的是针对鼻喷式流感疫苗存在的不足，应用用静水压技术灭活和纳米技术裂解流感病毒与脂肪乳结合。提供一种鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗及其制备方法，较好的解决了鼻喷式疫苗存在的问题，可以满足不同人群的需要，而且可在常温下贮存，不降低免疫原性。
鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗，包括静水压技术灭活流感全病毒与脂肪乳混合液纳米化或者纳米化静水压技术灭活流感全病毒与纳米化脂肪乳混合液，尺度10-12nm微粒悬液，其配比为100-300∶700-900。
鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗制备方法
①按配比灭活的流感全病毒脂肪乳混合液置于高速搅拌器内，搅拌使其充分混合均匀；②高速搅拌均匀的流感病毒脂肪乳混合液置于纳米对撞机，选定纳米通道，确定压力，时速，流液相互对撞，使流感病毒脂肪乳混合液瞬间裂解为10-12nm微粒，裂解、乳化、分散、催化与合成同步完成，得到微粒悬液。
鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗及其制备方法的技术内容一、脂肪乳组成原料的制备脂肪乳制剂已作为营养支持的能源物质是20世纪医学发展史上重大进步，以其独特的优点在临床医学上得到广泛的应用，尤其在外科治疗方面，近年来在基础研究和临床应用均取得许多进展。
脂肪乳剂虽是较理想的供能制剂，并由于其具有的特点。对许多外科疾病患者使用更合适。更利于内脏对氨基酸的摄取和内脏蛋白合成代谢。但全部贯彻脂肪并不能达到节氨目的，中枢神经细胞与红细胞必须依赖CS供能。脂肪酸最后进入三酸循环氧化时需草酰乙酸。后者由碳水化合物产生。因而认为由GS-脂肪双能源供能优于任何单能源已成定论。为了提高现有脂肪乳制剂质量，消除一些副反应，并扩大应用范围。本发明者发明了纳米技术制备脂肪乳注射液及其制剂的应用，为本发明奠定了坚实的基础。
脂肪乳作为流感疫苗免疫抗原的载体，既是保护剂兼免疫佐剂，又是很好的稳定剂。因此制备鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗必须先制备好脂肪乳组成原料。
1、大豆油的特制精制大豆油的过程分碱炼、水洗、脱色、过滤、灭菌等过程，以除去游离脂肪酸、致热物质、色素等，使所得的精制大豆油达到静脉注射用的要求，其精制工艺流程如下 精制的大豆油为浅黄绿色，其碘价、酸价、皂化价、比重、粘度、折光率、过氧化值等，应符合规定要求。精制后保存在无菌、密闭、充氮的容器中冷藏。
2、乳化剂--精制大豆磷脂乳化剂，在静注用脂肪乳剂中是个关键问题。所用乳化剂不仅具有高效的乳化力(乳化后油滴在1pm左右)，在人体内应无毒性，化学性质稳定，不易分解，能耐受高压灭菌及长时间贮存不分解等。
乳化剂品种很多，只有蛋黄磷脂、豆磷脂(包括氢化豆磷脂)与普朝立克F-68数种，后者主要与豆磷合用作为辅助乳化剂。蛋黄磷脂自蛋黄中提取精制而得，主要含卵磷脂，尚含少量其他磷脂如脑磷脂，它易水解氧化，稳定性很高。豆磷脂系由豆油中分离出的全豆磷脂中提取精制而得，以卵磷脂成分为主，并含有少量脑磷脂，这种精制品也易被水解或氧化，但较蛋黄磷脂稳定。
卵磷脂的结构式如下
卵磷脂分子呈现微柱状，含磷酸根、但碱基的极性端具亲水性，由碳氢链组成的非极性端具亲脂性，有良好的乳化性能，比其他磷脂稳定、毒性小。
用全豆磷脂为原料，主要抽提卵磷脂，同时除去致热与降压物质。其精制过程如下加水溶化，加无水硫酸钠 干燥后乙醇提取 活性AI2O3粉状 全豆磷脂—————→析出磷脂———→磷脂乙醇液————→盐析 吸附(除去致热物质及杂质) (除去降压物质)活性炭 通N2 无水丙酮吸附后磷脂醇液—→脱色后磷脂醇液肪—→粘状膦脂肪—→精制大豆磷脂脱色 真空减压蒸馏 脱水、脱油精制的大豆磷脂炎淡黄色粘状半固体，易溶于乙醇和乙醚，不溶于丙酮，暴露在空气中极易氧化，呈深粽色，并水解变性，故应贮存在无水丙酮中。精制大豆磷脂的氮含量、磷含量、酸价、PH值、过氧化值、降压试验、热原试验、安全试验等项目，应符合规定要求。
3、药用甘油、吐温和注射用水符合药典要求脂肪乳组成的原料可在市场购得，必须符合药用标准要求，具备检测报告。
二、流感全病毒制备与静水压技术灭活1、流感全病毒制备流感全病毒制备，取工作流感病毒毒种，接种8-11日龄鸡胚并于34℃孵化，48-72小时后收获尿囊液，超滤浓缩，超速离心纯化，过柱层析后即为流感全病毒，半成品检定，单价病毒悬液合并贮存于2-8℃冷藏保存备用。
2、静水压设备及其工作原理简介静水压是流体静压力的简称。将固体、液体和气体均视为连续介质。在外力作用下，各部分介质通过它们之间的分界面互施大小相等、方向相反的作用力，称作用在单位界面上的力为应力。可以把应力分解成两个分量一个垂直地作用面，称为正应力，常用6表示另一个在作用面内，称切应力，常用T表示。可以证明，介质内任一点的应力状态可以用对称的应力张量来表示，应力张量共有9个分量，表示为6xTxyTxzTyx6yTyzTzxTzy6z]]>其中，6x、6y、6z分别是介质的其余部分对介质内的体积元在x、y、z方向的正应力；Tij(I，j＝x、y、z)是6个切应力，前一个足标代一切应力的方向，后一个足档代表切应力作用面的外法线方向。
定义压力为p＝-(6x+6y+6z)/3，即压力的大小等于所考察点上的3个正应力的平均值，负号表示压力的作用方向与过该点的作用面的外法线方向相反。
概括的说，静水压状态的特点是切应力为零，正应力各向同性。在高压科学技术研究中，一般称接近静水压的状态为准静水压，称远离静水压力的状态为非静水压。在压强的实验测量中，实际测量的是某一有限面积上的正压力。当该面积处于流体当中时，由于平衡态下满足静水压条件，压力分布是均匀的，于是用单位面积上的力可以把压强确定到相当高的精度。高精度静水压的获得，与所选用的传压介质的剪切强度有关。
所谓的传压介质是指传递压力的媒介物质。流体传压介质的基本功能是把施于其上的轴向压力转变成作用到试样上的均匀压力，即转变成静水压力。此外考虑到使用时的可靠、方便与安全，还要求传压介质具有下列物性化学惰性，渗透率及压缩率低，容易操作，价格低廉。根据不同的使用要求和压力范围，可选用不同的气体、液体或固体作为传压介质。一般地说，转变成静水压的能力方面，气体最佳，液体次之，固体最差，即使选用剪切强度很低的软固体也只能获得准静水压。常用的液体介质有甘油、变压器油、煤油、汽油、石油醚、戊浣与异戊烷的混合液以及水等。
常温常压静水压机由超高压容器、超高压力源及配套的管路附件系统组成，它使受压制品得到各向均匀的超高压作用。
超高压腔体积一定，通过不断增加腔体内油密度来改变腔体内压力，达到升压的目的。加压在常温下进行。升、降压过程在几秒或几十秒内完成，因此在操作过程中，可将整个系统视为绝热状态，与外界无热交换，即Dq＝Tds≈0。由于在升、降压过程中系统对外分别做负功和正功，因而系统内部有微小的温度起伏，但并不影响病毒的存活。所以，病毒的灭活完全是由压力所致而不是温度造成的。
3、流感三价全病毒混合悬液静水压灭活操作方法(1)根据流感病毒疫苗生产规模大小，引进或加工制造适于生产规模产量的静水压机，进口的自动化程度高，自己加工制作的一般手工操作，中、小型静水压机日本有定型产品出售；大规模生产的静水压机瑞典生产；我国上海大龙机械厂能加工制造。
(2)选定好静水压机，安放于符合药品GMP生产流程要求的4-8℃无菌室内，按通电源，调节电压、检测、调试至符合生产要求的各项参数指标。
(3)流感三价全病毒浓悬液，经检定合格后，装于500ml软塑料采血袋或软塑料输液袋内密封好，置于2-8℃冰箱保存备用，防止冻融，也可以加工制式的软塑料袋专供装流感病毒悬液，根据规模而定250ml-5000ml不等规格。
(4)将静水压机密封高压腔打开，置放好装有流感三价全病毒悬液采血袋或塑料袋，选用好传压介质、密闭高压腔，接通电源，调节电压，选定200-300Mpa、静水压20-40分钟。
(5)流感三价全病毒悬液经静水压处理后及时存放于4-8℃冰箱备用。
三、纳米技术裂解流感病毒的理论依据1、流感病毒的形态结构众所周知，甲、乙型流感病毒是有囊膜病毒，呈现多型性，常为球队型，直径为80-120nm。主要包括HA和NA以及M2三种蛋白。核衣壳呈现螺旋对称，直径9-15nm。RNA为单股负链。
2、流感病毒主要为多肽成分及其抗原性质根据流感病毒各抗原成分的性质及分子量大小可以看出，其主要保护性抗原可分为HA和NA，亚单位的大小分别为70kDa，其颗粒直径在10nm以下。所以，我们选用10-12nm级对撞机对流感病毒进行技术处理，既保持其病毒的免疫原性，又能充分裂解病毒颗粒。用这种方法裂解的流感病毒免疫抗原即血凝毒和种经氨酸酶保留完全。这就是我们用纳米技术处理流感病毒，制作鼻腔吸入或鼻腔喷雾疫苗的理论依据。
四、用纳米技术裂解流感病毒及脂肪乳制备疫苗的理论基础脂肪乳由水上与油相构成，是很早以前广泛应用的基质之一，也是使药物作用持续化及作为特异组织靶向性制剂很有希望的剂型之一。以纳米技术制备脂肪乳剂为中心，就药物从脂肪乳制剂中的释放机制，作为药物脂肪乳剂及复合型脂肪乳，已有广泛前途。
1、纳米技术制备脂肪乳剂基质中药物释放机制脂肪乳一般注射用脂肪乳剂型中药物的控制释放机制以溶液给药时，基质中与组织液内药物分配平衡为恒速分配。
另外，难溶性药物小悬浊剂给药时，固体粒子的溶解度为恒速溶解，药物在油相中存在时，药物释放机制，以下式表示Q=4X(202+ZDACP)1/2DAC]]>式中a0o为调制时的油滴半径，D为扩散常数，p为粒子比重，ΔC为没滴表面与主体溶液间的药物浓度差药物只有一部分分配系数与油滴中的药物摩尔容积进行适当补正是必要的。
W/O型乳剂是外侧油相中含有药物、内侧水滴均一分散的体系。
药物的消失速度常数还可以下式表示K=ADKV1]]>式中A为水滴全面积，D为扩散常数，K为药物油水分配系数，V为水相面积，I为油相厚度。K值大，粒径小时，药物释放速度大。
2、纳米技术制备脂肪乳剂作为药物基质的载体的基本特点(1)作为油相的大豆以及乳化剂的卵磷脂，在机体内的安全性已被确认；(2)1-100nm范围内的粒径可以自由调控；(3)粒子表面的电性可自由控制；(4)水难溶药可在油相内溶解；(5)增加制稳定性(药物不易被氧化、水解)；
(6)能控制扩散，使药物缓释化；(7)缓和药物对组织的刺激性；(8)提高药物对靶组织的到达性；(9)延长药效时间；(10)减少药物用量，并降低成本。
脂肪乳剂作为药物载体，最令人感兴趣的是药效的持续化和靶向性。如脂肪乳制作为疫苗佐剂，能使保护性抗原能刺激抗体成倍增加，而且还数倍延长保护时间，在疫苗中的应用，具有重要价值。
3、纳米制备脂肪乳制剂作为药物载体可应用的范围(1)巴比类药物脂肪乳制剂可提高催眠同时近两倍数，有助于巴比类药物的脂肪纳米粒子在血流与脑间的输送，还可防止与蛋白结合或水解。
(2)一些抗癌药难溶性且在水相不稳定的药物如NSC278214，制成纳米脂肪乳剂可提高稳定性几十倍至100倍，并使药效持续增加数倍。
(3)一些毒副作用较大而难溶性药物，应用纳米技术制备的脂肪乳制剂可大幅度降低药物副作用，提高安全性。如硝酸甘油，可在脂肪乳剂中溶解，而增强药效，降低毒性。
(4)由于药物制剂及脂肪乳剂微粒大小不同，药物在人体分布有显著差别，由于用纳米级脂肪乳制剂作载体，能在肝脏，肺脏，及有炎症的脏口药物含量增高量，具有很强的靶向性，一些水溶性药物也可选用纳米级脂肪乳作载体，与水溶性制剂比更显示出强力的药效作用，由于纳米级脂肪乳在人体安全性提高，与脂质体及微胶束等制剂相比，在临床上更显示出更大的现实性。
(5)用纳米技术制备药物控释型多相乳剂，只要采用更为合适药用非离子表面活性剂，如吐温和司盘，即可制备出W/O型和复合型O/W/、W/OW型纳米级脂肪乳剂。
用W/O型纳米级脂肪乳剂载入疫苗保护，流感疫苗免疫抗原，可使抗体成倍提高，而且可保持较长时间。
(6)用纳米技术制备流感病毒脂肪乳用于吸入给药或用液体喷雾给药。
脂肪乳剂载体应用药物一般无特别严格的限制。它是纳米油水型脂肪乳剂，包含油组分乳化剂和流感病毒免疫杭原亚单位分子的脂肪纳米级微粒，成为分散在水中的主要成分。这种纳米级微粒均在10-12nm范围之间而且可控制在纳米级较小的幅度，用微型吸入器或用微型药用喷雾器，可以将吸入剂容易形成到达呼吸道至肺泡的气溶乳粒或鼻腔喷雾而易于吸收发挥作用。
本发明制备出的流感病毒鼻腔吸入疫苗，或鼻腔喷雾疫苗与现有流感疫苗相比有四大特点第一，免疫原性好，在分子水平上流感疫苗抗原免疫活性物质完全保留而无损伤；第二，疫苗安全性好，无不良副反应，可满足现有人群的需要；第三，稳定性好，由于流感病毒免疫抗原使用纳米脂肪乳微粒乳化，使载体保护剂和免疫佐剂融为一体，增强了疫苗的免疫原性，吸收性及稳定性，所以保存使用方便，在常温下可保存一年以上，疫苗免疫活性抗原不失活，由此结束了流感疫苗生产、贮存、运输、周转、分发、使用这条冷藏的保护链。第四，它可取代现用的流感系列疫苗(灭活全病毒苗，裂解苗及亚单位苗)为非注射剂疫苗，可直接外用，使用方便，可消除婴幼儿童恐惧感和不愿意注射的免疫人群。
五、灭活流感全病毒脂肪乳组成原料的配比精制大豆油250g、精制大豆磷脂20g、吐温150g、纯化浓缩的灭活流感全病毒血凝素含量90000微克、甘油30克，注射用水加至800ml，按比例配制。
六、纳米技术裂解灭活流感全病毒和脂肪乳制成鼻腔吸入或鼻腔喷雾疫苗工艺流程1、纳米科学概念纳米科学，是人们研究纳米尺度——即0.1至100纳米范围之内的物质所具有的特异现象和特异功能的科学，而纳米技术则是指此基础之上制造新材料、研究新工艺的方法和手段。纳米科学技术不是某一学科的延伸，也不是某一工艺产物，而是基础理论学科与当代高新技术的结晶。它以物理、化学的微观研究理论为基础，以当代精密仪器和先进的分析技术为手段，是一个内容广阔的多学科群。
纳米技术不仅是指它能制造超细粉末或纳米液体，它还泛指在扫描隧道显微镜下，直接观察和操纵单个原子和分子，按人们意愿组成需要的超微型器件。
组成自然界的最基本单位是原子，它的大小必须用埃这个单位来度量，而由原子构成分子，大小不等，一般有机小分子在几个纳米至几十纳之间，与有生命有关的大分子则大得多。
2.纳米对撞机简介纳米对撞机就是将有被加工物的液体，用高压泵加压(工程压力为10Kgf-2000Kgf/cm2)使物料以高速流进入特殊设计的振荡通道中，相向对撞机后流出(时速流为300/sec)。流体相向对撞时，对撞界面产生强冲击波，从而激励振荡器产生强高频超声波场。按需要而调控高速流体中被加工物颗粒瞬间裂解、粉碎、分散、乳化、催化与合成等功能为一体。使其加工微粒成为5-100纳米。
纳米对撞机可选用华银纳米技术设备有限公司，NT1500/5型和NT1500/75型。前者为实验型后为生产型。将脂肪乳作为药物载体，药物吸入剂，药物渗皮剂可选定NT1500/5型，作脂肪乳注射液可选定NT1500/75型。
纳米对撞机设备主要由进料斗、高压柱塞泵、逆向阀、高压管路、压力表、振荡器、出料斗、冷却装置、高压传感及控制电路等组成。根据结构和用途的不同，可分为研究用实验机和标准生产机。实验机为单柱塞式，输出压力有起伏变化，出料为间歇式。生产机有三个柱塞，输出压力较连续，为连续出料。
纳米对撞机的工作原理是将混有被加工物的液体，用高压泵加压以后(工程压力为10Kgf-2000Kgf/cm2以高速分为两股射流时入两片单晶金刚石晶片组成的通道中，相向对撞后流出。由于液体的速度很高(压力为700Kgf/cm2时速为300m/sec)，流体相向对撞时，对撞界面产生强冲击波，因而激励金刚石晶片产生高频强有力超声波专长，使液体中被加工物颗粒瞬间产生极热、非常的化学变化，完成裂解、乳化、分散、催化与合成同步进行，(声化学主要是利用超声空化能量为加速和控制化学反应、提高反应率、引发新的化学反应的一门新兴边缘交叉学科，是研究声能量与物质间的一种独特相互作用的学科。由于超声的空化作用，在受作用的物体中产生微观极热，持续时间又非常短，因此，可产生非常的化学变化，这种变化不同于传统的光化学、热化学和电化学过程，它有其独特的性质和规律。声空化是液体中气泡在声场作用下所发生的一系列动力学过程。当足够强度的超声小组通过液体时，一旦声波负压半周期的声压幅值超过内部静压器时，存在于液体中的微小气泡(空化核)就会迅速增大，而在相继而来的声波正压相中，气泡又被突然压缩，直到崩溃。因此，超声空化现象只能存在于液体中的微气核(空化核)内，是声场作用下空化核振动生长和崩溃闭合的动力学过程。
在空汽崩溃闭合时，泡内的气体或蒸气被压缩而产生高温及局部高压，并伴有强大的冲击波和强射流以及放电、放光等作用，同时还有机械效应和热效应。利用超声空化原理，恰好为化学反应创造了一个独特的条件。
3、纳米技术裂解灭活流感全病和脂肪乳制制疫苗工艺流程灭活流感全病毒 精制大豆油 精制大豆磷脂 药用吐温 甘油 注射用水加至 工艺说明1、制作条件必须符合GMP要求，无菌、无尘，温度必须在4～8℃条件下进行。
2、分装无论是冻干粉剂，每人份流感免疫抗原血凝素必须大于甲115微克、甲315微克、B型15微克，计45微克为每人份装量，溶液剂每人份0.5毫升，血凝素含量与粉剂相同。
本发明涉及用静水压技术灭活流感全病毒和纳米技术裂解灭活后的流感全病毒与脂肪乳，制成10-12纳米流感病毒脂肪乳小分子微粒悬液，完全保留了流感病毒免疫活性物质血凝素和神经氨酸酶。不含化学灭活剂和裂解剂。由于流感病毒活性物质与脂肪纳米微粒充分结合，用此项技术制备的鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗，它与现行流感疫苗相比具有以下特点第一，不需注射，直接外用，使用方便。可消除婴幼儿童恐惧感和不愿注射的免疫人群；第二，疫苗免疫原性好，抗原保留完全无损，而且吸收快，与脂肪乳微粒结合形成佐剂，增强免疫效果，可提高流感疫苗免疫抗体效价一倍以上；第三，由于不含化学灭活剂和裂解剂，抗原与脂肪结合，增强疫苗保护性能，一般刺激性小，无不良反应，可以满足所有人群需要；第四，贮存方便，在常温条件下，一般14-28℃可保存一年以上，保存疫苗不需要有冷藏链。
具体实施例方式
实施例11、用2003年WHO推荐的甲3(H3N2)A3/Moscow/10/99；甲1(H1N1)A1/NewCaledonis/20/99，乙型B/Johannesburg/99三株流感病毒分别接种8-11口龄鸡胚，在34℃-35℃培养48-72小时后，收获尿囊液，超滤浓缩、超速离心纯化，即为流感全病毒悬液。经半成品检测合格后病毒悬液装入1000毫升软塑料采血代密封，贮存于2-8℃冷藏室保存备用。
2、按国家规定的质量标准和工艺生产出的合格流感三价全病毒悬液1000ml装量的密封软塑料采血袋，置于中型静水压机内，用静水压机处理，压力250Mp2，时间30分钟，经静水压机处理后，再存放入4-8℃冷藏室备用。
实施例2取流感全病毒灭活后病毒悬流，检定以血凝素效价为180000微克悬液若干毫升(每毫升血凝素大于70微克)，计算流感全病毒灭活悬液加入量，配精制大豆油500克，精制大豆磷脂40克，吐温300克，甘油60克，注射用水加至2000毫升置于玻璃容器内充分混合备用。
实施例31、将合格的流感三价灭活全病毒与脂肪乳混合液一起置于高速搅拌器搅拌15分钟，使其充分混合，放入调试好的中型纳米对撞机，对灭活流感全病毒与脂肪乳混合液进行纳米对撞机处理，调节电压、压力、流量，使病毒和脂肪乳混合液裂解为10-12nm大小微粒，经纳米对撞机处理后，再放入4-8℃冰箱内。
2、纳米技术处理后，流感病毒与脂肪乳均为10nm尺度，按流感疫苗质检规程检定合格后，必须使其每毫升混合液血凝素含量大于70微克。然后分装于制式鼻腔吸入瓶内，冷冻干燥，每人份(一瓶)冻开粉剂血凝素必须大于45微克，即甲315微克，甲115微克，乙型15微克，此产品为流感病毒鼻腔吸入疫苗；也可将混悬液直分装于制式鼻腔喷雾器内，每人份(一瓶)0.5毫升，血凝素含量必须大于45微克，此产品作为流感病毒鼻腔喷雾疫苗。
实施例41、内含血凝素9万微克的静水压灭活流感全病毒悬液200ml与脂肪乳悬液800ml的混合悬液纳米化。
2、脂肪乳悬液包括精制大豆油250克、精制大豆磷脂20克、吐温150克、甘油30克、注射用水加至800毫升。
实施例51、鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗制备方法①按配比灭活的流感全病毒脂肪乳混合悬液置于高速搅拌器内，搅拌使其充分混合均匀；②高速搅拌均匀的流感病毒脂肪乳混合悬液置于纳米对撞机，选定纳米通道，确定压力，时速，流液相互对撞，使流感病毒脂肪乳混合液瞬间裂解为10-12nm微粒，裂解、乳化、分散、催化与合成同步完成，得到微粒悬液。
实施例6鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗制备方法①按配比灭活的流感全病毒脂肪乳混合液置于高速搅拌器内，15分钟搅拌使其充分混合均匀；②高速搅拌均匀的流感病毒脂肪乳混合液置于纳米对撞机，选定10-12nm通道，确定压力700kgt/cm2，时速300/sec，流液相互对撞，使流感病毒脂肪乳混合液瞬间裂解为10-12nm微粒，裂解、乳化、分散、催化与合成同步完成，得到微粒悬液。
实施例7合成后的10-12nm流感病毒脂肪乳微粒液，装入制式鼻腔吸入器，冷冻干燥为鼻腔吸入流感疫苗。
实施例8合成后的10-12nm流感病毒脂肪乳微粒液，直接分装制式鼻腔喷雾器，即为鼻腔喷雾流感疫苗。
实施例9鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗制备方法尺度10-12nm微粒，纳米化静水压技术灭活流感全病毒悬液与纳米化脂肪乳悬液按配比混合，置于高速搅拌器内，搅拌使其充分混合均匀；得到微粒悬液。
权利要求
1.鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗，包括静水压技术灭活流感全病毒与脂肪乳混合液纳米化或者纳米化静水压技术灭活流感全病毒与纳米化脂肪乳混合液，尺度10-12nm微粒悬液，其配比为100-300∶700-900。
2.根据权利要求1所述鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗，内含血凝素9万微克的静水压灭活流感全病毒悬液200ml与脂肪乳悬液800ml的混合液纳米化。
3.根据权利要求1或2所述鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗，脂肪乳悬液包括精制大豆油250克、精制大豆磷脂20克、吐温150克、甘油30克、注射用水加至800毫升。
4.鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗制备方法①按配比灭活的流感全病毒脂肪乳混合液置于高速搅拌器内，搅拌使其充分混合均匀；②高速搅拌均匀的流感病毒脂肪乳混合液置于纳米对撞机，选定纳米通道，确定压力，时速，流液相互对撞，使流感病毒脂肪乳混合液瞬间裂解为10-12nm微粒，裂解、乳化、分散、催化与合成同步完成，得到微粒悬液。
5.根据权利要求4所述鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗制备方法，①按配比灭活的流感全病毒脂肪乳混合液置于高速搅拌器内，15分钟搅拌使其充分混合均匀；②高速搅拌均匀的流感病毒脂肪乳混合液置于纳米对撞机，选定10-12nm通道，确定压力700kgt/cm2，时速300/sec，流液相互对撞，使流感病毒脂肪乳混合液瞬间裂解为10-12nm微粒，裂解、乳化、分散、催化与合成同步完成，得到微粒悬液。
6.根据权利要求4或5所述鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗制备方法，合成后的10-12nm流感病毒脂肪乳微粒液，装入制式鼻腔吸入器，冷冻干燥为鼻腔吸入流感疫苗。
7.根据权利要求4或5所述鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗制备方法，合成后的10-12nm流感病毒脂肪乳微粒液，直接分装制式鼻腔喷雾器，即为鼻腔喷雾流感疫苗。
8.鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗制备方法尺度10-12nm微粒，纳米化静水压技术灭活流感全病毒悬液与纳米化脂肪乳悬液按配比混合，置于高速搅拌器内，搅拌使其充分混合均匀；合成的微粒液完成。
全文摘要
鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗及其制备方法，包括静水压技术灭活流感全病毒与脂肪乳混合液纳米化或者纳米化静水压技术灭活流感全病毒与纳米化脂肪乳混合液，尺度10－12nm微粒，其比例为100－300∶700－900。完全保留了流感病毒免疫活性物质血凝素和神经氨酸酶。不含化学灭活剂和裂解剂。用此项技术制备的鼻腔吸入或鼻腔喷雾流感疫苗，具有以下特点非注射剂，使用方便，可消除婴幼儿童恐惧感和不愿注射的免疫人群；疫苗免疫原性好，抗原保留完全无损，可提高流感疫苗免疫抗体效价一倍以上；一般刺激性小，无不良反应，可以满足所有人群需要；贮存方便，不需要有冷藏链，在常温条件下，可保存一年以上。
文档编号A61K39/145GK1562364SQ20041002129
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月14日 优先权日2004年4月14日
发明者苟仕金, 苟鸿鹰, 王成余, 王刚 申请人:辽宁天成生物制药研究所