专利名称：一种治疗心血管疾病的药物的制备方法及其质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的制备方法及其质量控制方法，特别是涉及一种治疗心血管疾病的药物的制备方法及其质量控制方法，属医药技术领域。
背景技术：
二十世纪中叶以来，心血管疾病日益成为主要死亡原因，心血管疾病为目前发病率很高、用药量很大的一类中老年人常发病，随着人口的老龄化及饮食习惯的影响，该类疾病发病率有不断升高趋势。近年来，心血管疾病药物的年销售量一直名列中药销售量的前三位。新药的研发工作者也给心血管疾病更多关注，但长期以来，市场上起效迅速，疗效稳定，毒副作用小的中药制剂还是非常少，本发明以此为切入点，对药效明确的中药复方制剂丹七片进行了二次开发，将其开发成为有效部位冻干粉针剂。
丹七片为《部颁标准》收载品种，用于临床治疗冠心病、心绞痛。但该品种以粗提物制成制剂，服用量大、崩解度差、无完善的质量标准、产品有效成分的含量差异较大，导致疗效不稳定。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供丹参提取物和三七提取物的最佳配比；本发明的第二个目的在于提供一种丹参提取物的制备方法；本发明的第三个目的在于提供一种丹七冻干粉针的质量控制方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的。
取丹参提取物和三七提取物，按照1∶5的比例将其混合，得到一种药物组合物，然后按药剂学常规方法，制成临床可接受的各种剂型，包括但不限于如下剂型当中的一种片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂等。
所述丹参提取物可以是丹参总酚酸；所述的三七提取物可以是三七总皂苷。
所述的药物组合物，其中含丹参提取物以丹酚酸B镁盐计，为10-16.67％(g/g)；含三七提取物以人参皂苷Rg1计，为40-83.33％；含丹酚酸B镁盐为8-15％(g/g)，人参皂苷Rg120-30％，R14-10％，Re2-5％，Rb120-40％。
其中所述的丹参提取物是经如下制备方法制备而成丹参去杂质，加6～8倍量去离子水80℃加热提取2～3次，每次0.5～2小时，滤过，合并滤液，60℃以下减压浓缩，冷却至室温后，加95％乙醇至含醇量达60-80％，静置12h，滤过，回收乙醇，通过生药量与树脂比例为1∶3-1∶8的大孔吸附树脂AB-8，用去离子水洗至流出液无糖反应，继续用30-60％乙醇洗脱，待色带下来收集洗脱液，直至洗脱液加三氯化铁、铁氰化钾试剂变绿并无沉淀为止；将洗脱液于60℃以下浓缩，喷雾干燥，即得丹参提取物。
取按上述比例关系得到的含丹参提取物和三七提取物的组合物，加注射用水使溶解，加0.1％活性炭，40℃搅拌15分钟，冷却至室温后，先用滤纸板滤过，再用0.2μm微孔滤膜滤过，加注射用水稀释，罐装，每支4ml，冷冻干燥，可制得本发明注射用丹七冻干粉针剂。
本发明注射用丹七冻干粉针的质量控制方法包括如下指纹图谱照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温25℃；检测波长203nm；以乙腈-0.1％磷酸为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行60min0-6分钟时，乙腈的比例由17％升至19％，0.1％磷酸水溶液的比例由83％降至81％；6-25分钟，乙腈由19％升到20％，0.1％磷酸水溶液由81％降为80％；25-30分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以20∶80的比例进行洗脱；从30-55分钟，乙腈的比例由20％增加至40％，0.1％磷酸水溶液的比例则由80％降至60％；从55-60分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以40∶60的比例进行洗脱；丹酚酸B镁盐对照品溶液的制备取丹酚酸B镁盐对照品，用甲醇配制成每1ml含0.25mg的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；供试品溶液的制备取本发明冻干粉末90mg，至50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图，即得；供试品指纹图谱(见
图1)共有14个共有峰，其中峰10号为丹酚酸B镁盐的色谱峰，这十四个峰的相对保留时间分别为1号峰0.095，2号峰0.163，3号峰0.433，4号峰0.577，5号峰0.615，6号峰0.654，7号峰0.714，8号峰0.860，9号峰0.909，10号峰1，11号峰1.073，12号峰1.185，13号峰1.485，14号峰1.618；部分共有峰的峰形描述4、5、6号峰相连，且4、5号峰峰高递增，8、9号峰相连，10、11号峰相连，柱效低时11号峰可能会部分包含在10号峰内，13号峰前有一小肩峰。
本发明注射用丹七冻干粉针的质量控制方法还包括含量测定中的一种或几种A、丹参提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取本发明冻干粉末9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)计应不低于48mg；B、三七提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品适量，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取本发明冻干粉末，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C、丹酚酸B镁盐的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取本发明冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)应不少于30mg；D、人参皂苷Rg1的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取本发明冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Rg1应不少于75mg。
E、人参皂苷R1的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取本发明冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷R1应不少于15mg；F、人参皂苷Re的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取本发明冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Re应不少于8mg；G、人参皂苷Rb1的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取本发明冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；
测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Rb1应不少于75mg。
经实验研究发现，本发明中丹参提取物和三七提取物按1∶5的比例混合后制备成各种制剂的疗效要优于按其他配比关系如2∶3、1∶3等制备成各种制剂的疗效。
一般冻干粉针的制备根据药物的性质常需加入一定量的支持剂和助溶剂，而本发明冻干粉针剂含有皂苷类成分，具有支持剂的作用，在冻干初试中，其骨架搭得较好，很容易冻干，使冻干粉针呈较好的疏松状态，所以不再另加支持剂；而丹参提取物与三七提取物水溶性皆较好成药物，也不需加入助溶剂。
本发明冻干粉针剂与原制剂比较，具有以下特点生产工艺成熟、稳定，确保了产品质量的稳定；静脉给药，疗效更好，起效更快；中药复方有效部位制剂，纯度大大提高，有效部位含量达到80％以上，提高了药物的安全性；分别对中间体、成品的有效部位和单体化合物进行了含量测定，同时建立了指纹图谱检测标准，有效地控制产品的质量，确保产品的质量稳定、一致。
尤其是本发明提供了冻干粉针剂的质量控制方法，建立了指纹图谱，不仅产品质量更加稳定，而且疗效大大提高，为广大冠心病患者提供一种疗效确切、安全、稳定的药物。
本发明冻干粉针的主要有效成分为酚酸类化合物和皂苷类化合物，其中丹酚酸B镁盐为酚酸类化合物的主要有效成分，同时也是特征性成分，故选择丹酚酸B镁盐作为对照。本发明研究发现硅胶薄层板对其具有良好的分离效果，并且展开剂以氯仿—乙酸乙酯—苯—甲酸—甲醇(1.5∶2∶1∶1∶0.1)为佳，各成分能得到较好分离，2％FeCl3溶液显污绿色，斑点清晰，阴性无干扰。
指纹图谱检测方法的选择上，由于本发明冻干粉针所含的丹酚酸类成分种类较多，分离较困难。经研究，采用高效液相色谱法，能将本品的成分进行较好的分离，易于测定，因此选用高效液相色谱法进行测定。
检测波长方面，采用DAD全波长检测器对检测波长进行了考察，在203nm波长处，各色谱峰有较好的紫外吸收，因此，选择该波长作为检测波长；取丹酚酸B镁盐对照品及成品分别加水配制成一定浓度的溶液，于紫外分光光度计上200-400nm扫描，二者均在203nm处有较大吸收，因此，选用203nm作为检测波长。
以丹参、三七为原料的制剂及其相关制剂的年销售量在25亿～30亿左右，由于本发明丹参冻干粉针剂具有疗效确切、起效快、安全性高、质量稳定，有很好的市场前景。
下面实验例用于进一步说明本发明。
实验例1溶血与凝聚实验2％红细胞混悬液的制备家兔耳中动脉取血5ml，用玻璃棒搅动10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血，加约10倍量的生理氯化钠溶液，摇匀，离心(2000转/min，15min)，弃去上清液，如法处理3次，上清液不显红色；将所得红血球用生理氯化钠溶液配成2％的混悬液(V/V)，备用。
试验方法取试管6支，在试管中加入2％红细胞混悬液及生理盐水，混匀，在37℃恒温孵育30min后，分别加入不同量的药液(取本发明冻干粉针1支，加水100ml溶解)，第6管为对照管(不加药液)，混匀，置37℃恒温箱中。观察15、30、45、60、120min溶液变化。以第3试管为准，在2小时内不得产生溶血和红细胞凝聚现象。
表1 溶液配比
表2 试验结果
注-无溶血、无凝聚试验结果(见表2)表明，连续观察2小时后，所检三批样品，溶液离心(2000转/min，15min)后上清液均透明无色，振摇后无凝聚，与对照管比较无异常。见表3。
表3 三批中试产品的溶血与凝聚、澄明度、不溶性微粒检查结果
结论本发明冻干粉针溶液无溶血现象，亦未诱发红细胞凝聚。
实验例2指纹图谱的方法学研究稳定性试验取批号为040225的样品，按供试品溶液制备方法制备，分别在0、1、2、3、4小时检测指纹图。结果表明各色谱峰的保留时间和峰形基本一致，没有明显的变化，经指纹图谱相似度评价软件评价，其相似度＞95％，符合指纹图的要求。
精密度试验取批号为040225的样品，按供试品溶液制备方法制备，连续进针5次，检测指纹图。结果表明各色谱峰的保留时间和峰形基本一致，经指纹图谱相似度评价软件评价，其相似度＞95％，符合指纹图的要求。
重现性试验取批号为040301的样品5份，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品，检测指纹图。结果表明各色谱峰的保留时间和峰形基本一致，经指纹图谱相似度评价软件评价，其相似度＞95％，符合指纹图的要求。
实验例3指纹图谱及各项技术参数的研究(1)指纹图的选择我们对10批代表性供试品指纹图的检测结果进行了分析、比较(使用“计算机辅助相似性评价系统”软件)，提取得到共有模式指纹图，选择与共有模式指纹图相似度最高的供试品指纹图谱为典型的指纹图谱，作为对照指纹图谱(见图1)。
(2)共有指纹峰根据10批代表性供试品指纹图的检测结果，取每批供试品指纹图中都出现的典型色谱峰作为共有指纹峰，共14个共有峰，其中峰10号为参照物丹酚酸B镁盐的色谱峰。
部分共有峰的峰形描述4、5、6号峰相连，且4、5号峰峰高递增，8、9号峰相连，10、11号峰相连，柱效低时11号峰可能会部分包含在10号峰内，13号峰前有一小肩峰。
(3)10批中试产品的指纹图谱相似度检测按供试品指纹图谱检测方法，对10批中试产品的指纹图谱进行了检测，结果10批供试品指纹图与共有模式比较的相似度均大于90％，故本发明冻干粉针成品的指纹图谱相似度可定为不低于90％。
实验例4药材、中间体、成品三者之间指纹图谱的相关性分析丹参药材供试品的制备取丹参粉末(过40目筛)0.25g，精密称定，加8倍量去离子水80℃加热提取1小时，滤过，滤液备用，药渣再加6倍量去离子水80℃加热提取1次，1小时，滤过。合并两次滤液，60℃以下减压浓缩至干，冷却至室温后加80％乙醇7.5ml，搅拌均匀后，静置12h，滤过，滤液加80％乙醇稀释定容至10ml，摇匀，作为供试品溶液。
丹参中间体供试品的制备取丹参提取物粉末30mg，至100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
三七中间体供试品的制备取三七提取物粉末15mg，至10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
成品供试品的制备取本发明冻干粉末90mg，精密称定，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
丹酚酸B镁盐对照品溶液的制备取丹酚酸B镁盐对照品适量，用甲醇配制成每1ml含0.25mg的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
测定法按成品指纹图谱的测定方法测定。
结果分析从成品指纹图谱中可看出，色谱峰中，色谱峰1～5、7、10～12来源于丹参，色谱峰6、8、9、13、14来源于三七，其中色谱峰13可能混有丹参的成分。
实验例5三七提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定。
仪器与试剂人参皂苷Rg1对照品中国药品生物制品检定所提供，批号0703-200119。
所有其他试剂和药品均为分析纯。
仪器型号岛津UV-2401紫外分光光度计测定方法的选择本发明冻干粉针主要含有皂苷类成分，该类化合物紫外吸收为末端吸收，与一些常用的有机溶剂的截止波长接近，影响测定，故利用皂苷的某些显色反应，产生颜色后在可见光区运用比色法测定三七提取物的含量。
对照品的选择人参皂苷Rg1是三七提取物的主要有效成分之一，因此选择人参皂苷Rg1作为含量测定的对照品。
测定波长的选择将人参皂苷Rg1对照品制成每1ml含1mg的溶液，按标准曲线项下显色方法显色后，在400-900nm范围内扫描，在545nm处有最大吸收波长，因此选择545nm作为本品的测定波长。
方法学考察标准曲线的绘制精密称取人参皂苷Rg1对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.276mg的对照品溶液。精密量取100、300、500、600、700μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在545nm波长处立即测定吸收度，结果见表4。各浓度(C)相应的吸收度经统计处理，求得回归方程为A＝0.0318C+0.0899，r＝0.999。人参皂苷Rg1的线性范围27.6-193.2μg。
表4 三七提取物标准曲线实验数据
精密度考察精密吸取对照品溶液100μl，按照含量测定方法连续5次测定其吸收度，结果表明仪器精密度较好(见表5)
表5 精密度试验结果
稳定性考察取同一供试品溶液，分别在0、5、10、15、20分钟进行测定，结果表明样品在20分钟内稳定(见表6)。
表6 稳定性试验结果
重现性试验分别称取同一批号供试品5份，按供试品溶液的制备方法制备供试品，测定吸收度，计算含量，结果表明方法重现性好(见表7)。
表7 重现性试验结果
加样回收试验精密量取人参皂苷Rg1对照品溶液50μl共5份分置于10ml具塞试管中，加入供试品溶液50μl，按含量测定方法测定，计算含量和回收率，结果表明本发明所述含量测定方法可行(见表8)。
表8 加样回收率试验结果
实验例6人参皂苷Rg1的含量测定含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定。
仪器与试剂高效液相色谱仪Agilent 1100；Agilent 1100化学工作站；紫外检测器VWD G1314A；人参皂苷Rg1对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号0703-200119)；乙腈为色谱纯(Georgetown.ont.Canada)；水为双蒸水(自制)；磷酸为分析纯(天津市天河化学试剂厂)。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％磷酸水溶液(20∶80)为流动相，流速1.1ml/min，柱温25℃，检测波长203nm，在此色谱条件下，供试品色谱中人参皂苷Rg1色谱峰分离效果较好。
检测波长的确定取人参皂苷Rg1对照品及成品分别加水配制成一定浓度的溶液，于紫外分光光度计上200-400nm扫描，二者最大吸收波长均为203nm，因此，选用203nm作为检测波长。
实验例7丹参提取物与三七提取物配比筛选动物随机分为4组模型组，丹参三七1∶5(32mg/kg)组，丹参三七1∶3(32mg/kg)组，丹参三七2∶3(32mg/kg)组，药物以生理盐水溶至所需浓度，给药体积为3ml/kg，给药途径为十二指肠。
动物以戊巴比妥钠腹腔麻醉(45mg/kg)，仰位固定，切开气管，插入气管插管，接呼吸机(SC-3型，上海医疗设备厂)行人工呼吸(32次/分，呼吸比值1∶3)；开胸，断3-5肋，打开心包膜，暴露心脏，于冠状动脉左前降支根部穿线(0号缝合线)，备结扎用；分离十二指肠，给入受试药物后关腹；穿线后稳定10分钟，将一塑料凹管与血管并列，结扎(无明显染色斑块者淘汰)，40分钟后，沿凹槽剪断结扎线，使前降支实现再灌注；缝合胸壁，恢复自主呼吸。
打开结扎2小时后结束试验，心脏结扎线以下横切5片，N-BT染色，采用多媒体彩色病理图文分析系统(MPIAS-500)，以固定象距测量总心肌面积及梗塞心肌面积，观察心肌梗塞程度；结果进行统计学处理(t检验)，结果见表9。
表9 丹参∶三七1∶5、1∶3、2∶3(32mg/kg)组对心肌梗塞程度的影响(X±SD)
*、**与模型组比较P＜0.05、P＜0.01。
结果表明，模型组梗塞区占心室及心脏百分比分别为29.8％及25.5％；1∶5组心肌梗塞程度明显减轻，梗塞面积减小，梗塞区重量减轻，梗塞区占心室及心脏百分比降低，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.01)；1∶3组及2∶3组梗塞区占心室及心脏百分比降低，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05)。表明，1∶5组作用最强。
实验例8丹七粉针剂对缺血再灌注所致心肌梗塞的影响将动物随机分为7组假手术组(取血清作正常对照)，模型组，丹参注射液1.6g/kg组，丹七粉针剂20、10、5mg提取物/kg组。药物以生理盐水溶至所需浓度，给药体积为3ml/kg，给药途径为静脉。
动物以戊巴比妥钠腹腔麻醉(45mg/kg)，仰位固定，以PlowerLab/8sp生理记录仪监测标准II导联心电图；切开气管，插入气管插管，接呼吸机(SC-3型，上海医疗设备厂)行人工呼吸(32次/分，呼吸比值1∶3)；开胸，断3～5肋，打开心包膜，暴露心脏，于冠状动脉左前降支根部穿线(0号缝合线)，备结扎用；分离股静脉准备给药；穿线后稳定10分钟，将一塑料凹管与血管并列，结扎(无ST段及T波改变者淘汰)，给入受试药物后关腹；40分钟后，沿凹槽剪断结扎线，使前降支实现再灌注；缝合胸壁，恢复自主呼吸。
打开结扎2小时后，腹主动脉取血，比色法测定血清SOD、MDA含量；心脏结扎线以下横切5片，N-BT染色，采用多媒体彩色病理图文分析系统(MPIAS-500)，以固定象距测量总心肌面积及梗塞心肌面积，观察心肌梗塞程度；结果进行统计学处理(t检验)，结果见表10。
表10 丹七粉针剂对心肌梗塞程度的影响(X±SD)
**与模型组比较P＜0.01.
试验结果证实，模型组梗塞区占心室及心脏百分比分别为32.4％及27.3％；丹七三个剂量组梗塞面积减小，梗塞区占心室及心脏百分比降低，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。表明丹七粉针剂可明显减轻心肌梗塞程度，梗塞面积减小，梗塞区重量减轻，梗塞区占心室及心脏百分比降低，对心肌缺血再灌注损伤有明确的保护作用。
说明书附图
图1指纹图谱实施例1丹参提取物的制备丹参(100kg)去杂质，截切成0.5cm左右小段，加8倍量去离子水80℃加热提取1小时，滤过，滤液备用，药渣再加6倍量去离子水80℃加热提取2次，每次0.5小时，滤过；合并三次滤液，60℃以下减压浓缩至相对密度为1.28-1.30(50℃)，冷却至室温后加95％乙醇至含醇量达80％，静置12h，滤过，回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.28-1.30(50℃)，通过大孔吸附树脂AB-8(生药量与树脂比例为1∶4)，用去离子水洗至流出液无糖反应，继续用40％乙醇洗脱，待色带下来收集洗脱液，直至洗脱液加三氯化铁、铁氰化钾试剂变绿并无沉淀为止。将洗脱液于60℃以下，浓缩至相对密度为1.28-1.30(50℃)，喷雾干燥，即得丹参提取物(1000g)。
实施例2丹七冻干粉针剂的制备丹参总酚酸 120g三七总皂苷 600g注射用水 8000ml制成2000支取丹参总酚酸和三七总皂苷，加一定量的注射用水使溶解，加入0.1％活性炭，40℃搅拌15分钟，冷却至室温后，先用滤纸板滤过，再用0.2μm微孔滤膜滤过，加注射用水稀释至8000ml，灌装，每支4ml，冷冻干燥，即得2000支粉针。
经测定，测得每支冻干粉针剂中丹酚酸B镁盐含量为12.73％；人参皂苷R1含量为5.87％，人参皂苷Re含量为3.60％，人参皂苷Rb1含量为20.68％，人参皂苷Rg1含量为23.89％。
实施例3 丹七冻干粉针剂的制备丹参提取物120g三七提取物600g注射用水 8000ml制成2000支取丹参提取物和三七提取物，加一定量的注射用水使溶解，加入0.1％活性炭，40℃搅拌15分钟，冷却至室温后，先用滤纸板滤过，再用0.2μm微孔滤膜滤过，加注射用水稀释至8000ml，灌装，每支4ml，冷冻干燥，即得2000支粉针。
经测定，测得每支冻干粉针剂中丹酚酸B镁盐含量为11.97％；人参皂苷R1含量为5.26％，人参皂苷Re含量为3.78％，人参皂苷Rb1含量为20.15％，人参皂苷Rg1含量为23.10％；丹参总酚酸含量为15.84％，三七总皂苷含量为78.12％。
实施例4丹七注射液的制备丹参提取物60g三七提取物300g甲硫氨酸 10g注射用水 2000ml制成1000支取按实施例1的方法制备的丹参提取物和三七提取物及甲硫氨酸，加适量注射用水使溶解，加0.1％活性炭，40℃搅拌15分钟，冷却至室温后，先用滤纸板滤过，再用0.2μm微孔滤膜滤过，加注射用水稀释至2000ml，灌封，每支2ml，灭菌，即得。
经测定，测得每支注射液中丹酚酸B镁盐含量为11.78％；人参皂苷R1含量为5.63％，人参皂苷Re含量为3.56％，人参皂苷Rb1含量为20.32％，人参皂苷Rg1含量为23.46％；丹参总酚酸含量为15.88％，三七总皂苷含量为77.91％。
实施例5本发明胶囊剂的制备丹参提取物60g三七提取物300g硬脂酸镁 3.6g制成1000粒取丹参提取物和三七提取物混匀，加入1％的硬脂酸镁，混匀后灌装胶囊，得胶囊900粒，一日两次，每次1粒。
经测定，测得每粒胶囊中丹酚酸B镁盐含量为11.97％；人参皂苷R1含量为5.26％，人参皂苷Re含量为3.78％，人参皂苷Rb1含量为20.15％，人参皂苷Rg1含量为23.10％；丹参总酚酸含量为15.84％，三七总皂苷含量为78.12％。
实施例6本发明丸剂的制备丹参提取物60g三七提取物300g去离子水 适量制成3000粒取丹参提取物和三七提取物混匀，以水为润湿剂，用泛丸法制成3000粒，一日2次，每次3粒。
经测定，测得每粒丸剂中丹酚酸B镁盐含量为12.73％；人参皂苷R1含量为5.87％，人参皂苷Re含量为3.60％，人参皂苷Rb1含量为20.68％，人参皂苷Rg1含量为23.89％；丹参总酚酸含量为16.01％，三七总皂苷含量为77.92％。
实施例7本发明颗粒剂的制备丹参提取物120g三七提取物600g5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液 适量制成1000袋取丹参提取物和三七提取物混匀，以5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液制软材，14目筛制粒，干燥制得颗粒剂460袋，每袋1g，一日两次，每次1袋。
实施例8本发明滴丸的制备丹参提取物120g三七提取物600g聚乙二醇6000 1875g制成1000袋聚乙二醇6000置水浴上完全熔融，加入丹参提取物和三七提取物，搅拌使溶解，保持80℃滴入15℃液体石蜡中成丸，制备成滴丸750袋，每袋5.0克，一日两次，每次1袋。
实施例9本发明片剂的制备丹参提取物120g三七提取物600g淀粉 150g5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液 适量硬脂酸镁 1％制成1000片取丹参提取物与淀粉混匀，再和三七提取物混匀，以5％聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液制软材，16目筛制粒，干燥后整粒，加入1％的硬脂酸镁，混匀压片。一日2次，每次1片。
实施例10本发明口服液的制备丹参提取物 120g三七提取物 600g甜叶菊素 2g去离子水 10000ml制成1000支将丹参提取物、三七提取物和甜叶菊素，溶于去离子水中制备成口服液10000ml，灌装，每支10ml。每天2次，每次1支。
施施例11注射用丹七冻干粉针指纹图谱的测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温25℃；检测波长203nm；以乙腈为流动相C，以0.1％磷酸为流动相D，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行60min0-6分钟时，乙腈的比例由17％升至19％，0.1％磷酸水溶液的比例由83％降至81％；6-25分钟，乙腈由19％升到20％，0.1％磷酸水溶液由81％降为80％；25-30分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以20∶80的比例进行洗脱；从30-55分钟，乙腈的比例由20％增加至40％，0.1％磷酸水溶液的比例则由80％降至60％；从55-60分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以40∶60的比例进行洗脱。
丹酚酸B镁盐对照品溶液的制备取丹酚酸B镁盐对照品，用甲醇配制成每1ml含0.25mg的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；供试品溶液的制备取丹七冻干粉末90mg，至50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图，即得；对照指纹图谱见图1。
共有峰供试品指纹图谱与对照指纹图谱应在相应保留时间处出现相同色谱峰，两者相似度不低于90％；供试品指纹图谱共有14个共有峰，其中峰10号为参照物丹酚酸B镁盐的色谱峰；这十四个峰的相对保留时间分别为1号峰0.095，2号峰0.163，3号峰0.433，4号峰0.577，5号峰0.615，6号峰0.654，7号峰0.714，8号峰0.860，9号峰0.909，10号峰1，11号峰1.073，12号峰1.185，13号峰1.485，14号峰1.618；其中4、5、6号峰相连，且4、5号峰峰高递增，8、9号峰相连，10、11号峰相连，柱效低时11号峰可能会部分包含在10号峰内，13号峰前有一小肩峰。
实施例12注射用丹七冻干粉针的含量测定A、丹参提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)计应不低于48mg
B、三七提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C、丹酚酸B镁盐的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)应不少于30mg；D、人参皂苷Rg1的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Rg1应不少于75mg。
实施例13注射用丹七冻干粉针的含量测定A、丹参提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)计应不低于48mg；B、三七提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；
C、丹酚酸B镁盐的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末针约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)应不少于30mg；E、人参皂苷R1的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷R1应不少于15mg。
实施例14注射用丹七冻干粉针的含量测定A、丹参提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)计应不低于48mg；B、三七提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备量取丹七冻干粉末，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C、丹酚酸B镁盐的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)应不少于30mg；
F、人参皂苷Re的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Re应不少于8mg。
实施例15注射用丹七冻干粉针的含量测定A、丹参提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)计应不低于48mg；B、三七提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C、丹酚酸B镁盐的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)应不少于30mg；G、人参皂苷Rb1的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Rb1应不少于75mg。
实施例16注射用丹七冻干粉针的质量控制方法
指纹图谱照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温25℃；检测波长203nm；以乙腈-0.1％磷酸为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行60min；0-6分钟时，乙腈的比例由17％升至19％，0.1％磷酸水溶液的比例由83％降至81％；6-25分钟，乙腈由19％升到20％，0.1％磷酸水溶液由81％降为80％；25-30分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以20∶80的比例进行洗脱；从30-55分钟，乙腈的比例由20％增加至40％，0.1％磷酸水溶液的比例则由80％降至60％；从55-60分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以40∶60的比例进行洗脱；丹酚酸B镁盐对照品溶液的制备取丹酚酸B镁盐对照品，用甲醇配制成每1ml含0.25mg的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；供试品溶液的制备取丹七冻干粉末90mg，至50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图，即得；对照指纹图谱见图1。
供试品指纹图谱共有14个共有峰，其中峰10号为丹酚酸B镁盐的色谱峰，这十四个峰的相对保留时间分别为1号峰0.095，2号峰0.163，3号峰0.433，4号峰0.577，5号峰0.615，6号峰0.654，7号峰0.714，8号峰0.860，9号峰0.909，10号峰1，11号峰1.073，12号峰1.185，13号峰1.485，14号峰1.618；部分共有峰的峰形描述4、5、6号峰相连，且4、5号峰峰高递增，8、9号峰相连，10、11号峰相连，柱效低时11号峰可能会部分包含在10号峰内，13号峰前有一小肩峰。
含量测定A、丹参提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)计应不低于48mg；B、三七提取物的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录V A紫外分光光度法测定；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品适量，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C、丹酚酸B镁盐的含量测定照《中国药典》2000年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐(C36H28MgO16)应不少于30mg；D、人参皂苷Rg1的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取丹七冻干粉末约90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Rg1应不少于75mg。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于所述的组合物是由丹参提取物与三七提取物按1∶5的比例组合而成。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的丹参提取物是指丹参总酚酸；所述的三七提取物是指三七总皂苷。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该组合物含丹参提取物以丹酚酸B镁盐计，为10-16.67％；含三七提取物以人参皂苷Rg1计，为40-83.33％。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该组合物含丹酚酸B镁盐为8-15％；人参皂苷Rg120-30％，R14-10％，Re 2-5％，Rb120-40％。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的药物组合物，其特征在于加入辅料，制备成临床可接受的剂型片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂、冻干粉针剂。
6.一种冻干粉针剂，其特征在于是由如下方法制备而成按1∶5的比例取丹参提取物和三七提取物，加注射用水使溶解，加0.1％活性炭，40℃搅拌15分钟，冷却至室温后，先用滤纸板滤过，再用0.2μm微孔滤膜滤过，加注射用水稀释，罐装，每支4ml，冷冻干燥，即得。
7.根据权利要求1、2或3所述的药物组合物，其特征在于其中丹参提取物是由如下方法制备而成丹参去杂质，加6～8倍量去离子水80℃加热提取2～3次，每次0.5～2小时，滤过，合并滤液，60℃以下减压浓缩，冷却至室温后，加95％乙醇至含醇量达60-80％，静置12h，滤过，回收乙醇，通过生药量与树脂比例为1∶3-1∶8的大孔吸附树脂AB-8，用去离子水洗至流出液无糖反应，继续用30-60％乙醇洗脱，待色带下来收集洗脱液，直至洗脱液加三氯化铁、铁氰化钾试剂变绿并无沉淀为止；将洗脱液于60℃以下浓缩，喷雾干燥，即得丹参提取物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于其中丹参提取物是由如下方法制备而成丹参去杂质，加8倍量去离子水80℃加热提取1小时，滤过，滤液备用，药渣再加6倍量去离子水80℃加热提取2次，每次0.5小时，滤过，合并三次滤液，60℃以下减压浓缩，冷却至室温后加95％乙醇至含醇量达80％，静置12h，滤过，回收乙醇，通过生药量与树脂比例为1∶4的大孔吸附树脂AB-8，用去离子水洗至流出液无糖反应，继续用40％乙醇洗脱，待色带下来收集洗脱液，直至洗脱液加三氯化铁、铁氰化钾试剂变绿并无沉淀为止；将洗脱液于60℃以下，浓缩至50℃时相对密度为1.28-1.30，喷雾干燥，即得丹参提取物。
9.根据权利要求6所述的一种冻干粉针剂指纹图谱的的测定方法，其特征于该方法包括下列步骤照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温25℃；检测波长203nm；以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行60min
0-6分钟时，乙腈的比例由17％升至19％，0.1％磷酸水溶液的比例由83％降至81％；6-25分钟，乙腈由19％升到20％，0.1％磷酸水溶液由81％降为80％；25-30分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以20∶80的比例进行洗脱；从30-55分钟，乙腈的比例由20％增加至40％，0.1％磷酸水溶液的比例则由80％降至60％；从55-60分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以40∶60的比例进行洗脱；丹酚酸B镁盐对照品溶液的制备取丹酚酸B镁盐对照品，用甲醇配制成每1ml含0.25mg的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；供试品溶液的制备取冻干粉针90mg，至50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图，即得。
10.根据权利要求9所述的一种冻干粉针剂的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法中供试品指纹图谱共有14个共有峰，其中10号峰为参照物丹酚酸B镁盐的色谱峰；这十四个峰的相对保留时间分别为1号峰0.095，2号峰0.163，3号峰0.433，4号峰0.577，5号峰0.615，6号峰0.654，7号峰0.714，8号峰0.860，9号峰0.909，10号峰1，11号峰1.073，12号峰1.185，13号峰1.485，14号峰1.618；其中4、5、6号峰相连，且4、5号峰峰高递增，8、9号峰相连，10、11号峰相连，柱效低时11号峰可能会部分包含在10号峰内，13号峰前有一小肩峰。
11.根据权利要求6所述的一种冻干粉针剂的质量控制方法，其特征在于该方法含有如下含量测定方法A.丹参提取物的含量测定对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐计应不低于48mg；B.三七提取物的含量测定对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C.丹酚酸B镁盐的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐应不少于30mg；D.人参皂苷Rg1的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Rg1应不少于75mg。
12.如权利要求6所述的一种冻干粉针剂的质量控制方法，其特征在于该方法含有如下含量测定方法A.丹参提取物的含量测定对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐计应不低于48mg；B.三七提取物的含量测定对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C.丹酚酸B镁盐的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐应不少于30mg；E.人参皂苷R1的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷R1应不少于15mg。
13.如权利要求6所述的一种冻干粉针剂的质量控制方法，其特征在于该方法含有如下含量测定方法A.丹参提取物的含量测定对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐计应不低于48mg；B.三七提取物的含量测定对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C.丹酚酸B镁盐的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐应不少于30mg；F.人参皂苷Re的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Re应不少于8mg。
14.如权利要求6所述的一种冻干粉针剂的质量控制方法，其特征在于该方法含有如下含量测定方法A.丹参提取物的含量测定对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐计应不低于48mg；B.三七提取物的含量测定对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C.丹酚酸B镁盐的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐应不少于30mg；G.人参皂苷Rb1的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Rb1应不少于75mg。
15.如权利要求6所述的一种冻干粉针剂的质量控制方法，其特征在于该方法为指纹图谱照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温25℃；检测波长203nm；以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行60min
0-6分钟时，乙腈的比例由17％升至19％，0.1％磷酸水溶液的比例由83％降至81％；6-25分钟，乙腈由19％升到20％，0.1％磷酸水溶液由81％降为80％；25-30分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以20∶80的比例进行洗脱；从30-55分钟，乙腈的比例由20％增加至40％，0.1％磷酸水溶液的比例则由80％降至60％；从55-60分钟，保持乙腈-0.1％磷酸水溶液以40∶60的比例进行洗脱；丹酚酸B镁盐对照品溶液的制备取丹酚酸B镁盐对照品，用甲醇配制成每1ml含0.25mg的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，至50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图，即得；供试品指纹图谱共有14个共有峰，其中10号峰为参照物丹酚酸B镁盐的色谱峰；这十四个峰的相对保留时间分别为1号峰0.095，2号峰0.163，3号峰0.433，4号峰0.577，5号峰0.615，6号峰0.654，7号峰0.714，8号峰0.860，9号峰0.909，10号峰1，11号峰1.073，12号峰1.185，13号峰1.485，14号峰1.618；其中4、5、6号峰相连，且4、5号峰峰高递增，8、9号峰相连，10、11号峰相连，柱效低时11号峰可能会部分包含在10号峰内，13号峰前有一小肩峰；含量测定A.丹参提取物的含量测定对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针9mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，以水为空白，在288nm波长处测定吸收度，计算，即得；粉针每1支按干燥品计算，含丹参提取物以丹酚酸B镁盐计应不低于48mg；B.三七提取物的含量测定对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每ml中含人参皂苷Rg11mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针，加入甲醇制成每ml含1.8mg溶液，作为供试品溶液；测定法量取对照品溶液和供试品溶液各100μl分置于10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，于60℃水浴中保温15min，立即置冰水中冷却5min，加冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，照分光光度法，在545nm波长处立即测定吸收度，计算，即得；粉针每1支含三七提取物以人参皂苷Rg1计应不低于210mg；C.丹酚酸B镁盐的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长288nm；理论板数按丹酚酸B镁盐峰计算，应不低于3000；对照品溶液的制备称取丹酚酸B镁盐对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含丹酚酸B镁盐应不少于30mg；D.人参皂苷Rg1的含量测定照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；检测波长203nm；对照品溶液的制备称取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备称取冻干粉针90mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；粉针每1支含人参皂苷Rg1应不少于75mg。
全文摘要
本发明公开了一种治疗心血管疾病的药物组合物及其制备方法和质量控制方法。本发明是将丹参提取物与三七提取物以最佳配比1∶5的比例混合后制成各种制剂，本发明还涉及从中药丹参中提取丹参提取物的方法；同时提供了本发明冻干粉针剂的质量控制方法，分别对中间体、成品的有效部位和单体化合物进行了含量测定，建立了指纹图谱检测标准，能有效地控制产品的质量，保证产品的质量安全、稳定、一致。
文档编号A61K36/25GK1726959SQ20041007010
公开日2006年2月1日 申请日期2004年7月30日 优先权日2004年7月30日
发明者屠鹏飞, 吴婉莹, 赵晶丽, 姜勇, 张彤梅 申请人:北京华医神农医药科技有限公司