专利名称：成骨生长五肽药物组合物及制备方法
技术领域：
本发明属生物制剂，具体涉及一种含成骨生长五肽(OGP10-14)的药物组合物及制备方法。
背景技术：
如何促进骨折愈合、缩短骨折愈合时间、有效治疗骨折不愈合和骨缺损，这是多年来人们苦苦探索的课题。至于骨质疏松症，它是老年人常见病之一，全球约有10％的人患有此病，其发病机理是由于骨吸收增加或骨形成减少导致骨量低下、骨脆性增加，进而发生骨质疏松性骨折。有关促进骨折愈合、治疗骨质疏松的药物的研制和开发已成为医药界的热门课题之一。
长期以来，人们发现骨髓损伤后在其修复期往往伴随着骨骼的成骨反应，并认为此反应是由骨髓组织释放某种因子入血所介导。1992年，以色列希伯来大学的Bab等人率先报道从修复期的骨髓组织纯化出一个由14个氨基酸组成的因子(H-Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH)，并将其命名为成骨生长肽(osteogenic growth peptide，OGP)，天然的OGP与人工合成的OGP均可在体外刺激成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的表达，当注入大鼠体内时，可明显增加骨量和促进骨基质矿化。此外，OGP可促进血细胞发生及移植后骨髓的生长(EMBO J，1992，111867-1873；Biochemistry.1997，36(48)14883-8；J Cell Biochem.1997，65(3)359-67；J Clin Endocrinol Metab，1995，802330-2335)。正常生理状态下，血液中有一定水平的OGP存在(主要以OGP-OGP结合蛋白——α2巨球蛋白复合物的形式)；骨髓损伤后修复期，血中OGP水平明显提高并伴有全身性成骨反应。
进一步的研究发现，OGP的氨基酸序列与组蛋白H4的C-末端序列一致(89-102)，它是组蛋白H4基因在AUG85开始翻译的产物。在血液中，OGP水解产生的五肽——OGP10-14(H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH)是具有OGP的全部生物活性的最小片段，它激活细胞内G1蛋白-MAP激酶信号途经发挥其生物学作用。(J Biol Chem.1999，274(20)14474-81；J Cell Biochem.2001，81(4)594-603.)。
基于上述的研究成果，成骨生长五肽(OGP10-14)应用于临床，正引起药学界的极大关注。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种含成骨生长五肽(OGP10-14)的药物组合物及其药物组合物的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种含成骨生长五肽(OGP10-14)的药物组合物，是由OGP10-14(H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH)作为活性成份与辅剂甘露醇和低分子右旋糖酐制成的，其中OGP10-14含量为0.01～99.99％、辅剂含量为99.99％～0.01％，并按任意比例配制而成。
本发明药物组合物的制备方法是取OGP10-14放入安培瓶内并将OGP10-14溶解于超纯水中，然后，加入甘露醇和低分子右旋糖酐，经冷冻干燥得冻干品针剂。
上述OGP10-14可以通过常规的多肽合成技术，即固相多肽合成法制备本发明中的OGP10-14的药物组合物中的主要成分OGP10-14。该方法按照已设计好的和给定的氨基酸序列，利用适当活化剂和缩合剂将氨基已保护的肽链碳末端氨基酸残基连接到固相载体上。其中所述的固相载体为二乙烯苯交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺树脂、可控孔度玻璃、TentaGel树脂、磁性树脂珠等。上述肽制备可选的树脂有wang树脂、HMPA-PEGA树脂、2-氯三苯甲基氯树脂、Merrifield树脂、Oxime树脂等。
当使用9芴甲氧羰基(Fmoc)系统进行固相合成时，可选用下列被保护的氨基酸残基Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Tyr(But)-OH，Fmoc-Phe-OH。在Fmoc合成系统中，首先将C端第一个氨基酸(C端Fmoc-Gly-OH)装在含羟基树脂的反应器中，按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。其中用Fmoc保护各种氨基酸的α-氨基。氨基酸的侧链保护基为Tyr用叔丁基(But)保护。使用HOBt和HBTu活化各氨基酸的羧端，并完成氨基酸分子间的缩合。完成合成后，用含有或不含有还原剂(如巯基乙醇)的三氟乙酸水溶液将合成的OGP10-14从树脂上切割下来并去除保护基。可用过滤法或乙醚沉淀法分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤或反相高压液相层析法纯化所需的肽。
当使用Boc系统进行固相合成时，可选用下列被保护的氨基酸残基Boc-Gly-OH，Boc-Tyr(Brz)-OH，Boc-Phe-OH。在Boc保护系统的固相合成中，典型的是使用Merrifield树脂。不同的是用Boc保护各种氨基酸α-氨基。氨基酸侧链保护基团是Tyr用BrZ保护。在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团(Boc)并用二异丙基乙胺(DIEA)/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用无水氟化氢(HF)，在0℃下处理1～2小时，将肽链从树脂上切下，同时除去所有保护基团。以10％～30％乙酸抽提肽。冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相色谱C18柱纯化，得到HPLC纯的OGP10-14。
本发明还可以通过以下措施来实现可使用肽化学合成领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二异丙基碳二亚胺(DIC)，二环己基碳二亚胺(DCC)进行直接偶联，或通过活性酯例如五氟苯酯，或使用Fmoc-氨基酸-羧酸酐。可以使用羟基苯骈三氮唑(HOBt)或7-氮杂羟基苯骈三唑(HOAt)或用2-(1H-苯骈三唑-1-基)，PyBOP、PyBroP、1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1H-苯骈三唑-1-基)，1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟磷酸酯(TBTU)、HATU活化氨基酸。
本发明也可以用手工方法或合成仪完成上述多肽的合成，肽自动合成仪，例如由Applied Biosystems公司生产的ABI 430A型或ABI 431A型肽合成仪也可以完成多肽的合成。
本发明的优点和产生的有益效果是通过大量的生物活性实验表明，本发明所制备的OGP10-14药物组合物在促进NIH3T3成纤维细胞增殖，促进大鼠骨髓基质细胞向成骨方向分化、促进形成成熟的骨样小结，抑制其向成脂方向分化，促进新生乳鼠跖骨生长有明显的作用。其对于促进成骨细胞的活性，通过成骨的增加来提高骨量、预防和治疗骨质疏松症、促进骨拆愈合、提高造血能力等方面产生良好的效果，为加速临床应用和商业开发提供了科学依据。
另外，本发明所制备的OGP10-14药物组合物中发挥药效作用的主要成分具有天然存在的OGP10-14结构完全相同的结构，从而显著避免了长期使用后可能造成的免疫原性。本发明与OGP相比，具有结构简单、合成成本低、药效相当，更有利于临床应用及规模生产的优点。
下面通过生物活性实验进一步的说明本发明在预防和治疗骨质疏松症、促进骨折愈合、提高造血能力等方面所产生的效果。
OGP(10-14)对NIH3T3细胞增殖的影响实验步骤
1.消化NIH3T3细胞，以2×104/ml的浓度接种于96孔培养板中，每孔200ul，培养液为含10％FCS的DMEM培养基。
2.46小时后吸出培养液，加入37℃预热的无血清DMEM200ul/孔，置培养箱孵育2小时。
3.吸出培养液，加入含0.2％BSA及10-13-10-5M的OGP(10-14)无血清DMEM培养基(加入前37℃预热30min)200ul/孔，各组3孔细胞。对照组培养液中无OGP(10-14)。
4、培养48小时(图1)。
5.每孔加入MTT(5mg/ml)20ul，37℃孵育4小时，弃上清，每孔加入二甲基亚砜150ul，振荡10分钟，于490nm测吸光度值。
6.OD值用SPSS统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05为有显著性差异。
结果MTT法测定结果见附表1，OGP(10-14)促进NIH3T3细胞增殖最适浓度为10-10。
附表1 不同浓度OGP(10-14)对NIH3T3增殖的影响(OD值)
OGP(10-14)对大鼠骨髓基质细胞成骨分化的影响实验方法1.原代培养 将Wistar大鼠颈椎脱位法处死，75％的酒精中浸泡5分钟后取出，无菌条下取出双侧的股骨，经无菌生理盐水漂洗干净后剪除股骨干的两端，暴露骨髓腔，注射器针头插入髓腔，用5ml DMEM培养液冲洗髓腔，冲出的骨髓细胞放于离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，用含10％FBS，青、链霉素各100u/ml的DMEM培养液5ml制成骨髓细胞悬液，以次用8号和4号针头抽吸细胞悬液两次，将细胞过滤为单细胞悬液，计数有核细胞后以2×105/cm2种植于3个75ml培养瓶内，37℃二氧化碳孵箱中培养，CO2浓度5％，湿度95％。3天后首次换液，以后每隔3-5天换液一次。
2.传代培养 原代培养14天细胞生长融合，吸出培养液，用37℃1×PBS洗细胞2次，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞5-10min，镜下观察大部分细胞变为圆形后立即加入含有10％的FBS的DMEM终止细胞的消化过程。吸管吹打贴壁细胞，使细胞完全脱离瓶壁，吹打成细胞悬液，吸出置于离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，重新加入DMEM培养液，吹打重悬细胞，依次用8号和4号针头过滤成单细胞悬液，计数细胞后以5×103/cm2种植于2个100ml培养瓶内，37℃二氧化碳孵箱中培养，CO2浓度5％，湿度95％。3天后首次换液，以后每隔3-5天换液一次，待长满瓶底形成单细胞层继续传代。
3.诱导成骨1)细胞分组传3代骨髓基质细胞(图2)分A、B、C三组，A组培养液为原代培养液+50ug/ml维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松；B组培养液为原代培养液+50ug/ml维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-10mol/L的OGP10-14；C组培养液为原代培养液+50ug/ml维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松+10-10mol/L的OGP10-14。
2)将传3代的细胞以1×104/孔种于24孔培养板中并进行爬片，诱导12天后各组取3孔细胞行ALP的改良Gomori氏钙钴法染色，光镜观察，随机数取10个非重叠视野(×100)，计数碱性磷酸酶阳性细胞占总细胞数的比例。
3)于诱导后12天终止培养，各组取3孔，吸出培养液，每孔加入无血清DMEM培养液1ml，用细胞刮器收集细胞，反复冻融裂解细胞，3000rpm离心10min，取上清夜，用ALP试剂盒在全自动生化分析仪上测定细胞内ALP活性。
4)于诱导后第35天各组取3孔细胞做Von Kossa染色，镜下计数各孔钙化结节数。
4.统计分析测得数据用SPSS统计软件进行分析。
结果1.于诱导后第12天做ALP染色(图3)，每张玻片随机数取10个视野计算结果见附表2。结果显示，与10-8mol/L地塞米松比较，10-10mol/L的OGP10 -14对BMSC向成骨方向分化有促进作用。地塞米松(10-8mol/L)与OGP10-14(10-10mol/L)联合作用时，其效应大于单一因素的作用，呈现出显著的协同作用。
2.于诱导后12天测定细胞内ALP活性，结果见附表3。结果显示，与10-8mol/L地塞米松比较，l0-10mol/L的OGP10-14对BMSC的ALP活性表达有促进作用。地塞米松(10-8mol/L)与OGP10-14(10-10mol/L)联合作用时，其效应大于单一因素的作用，呈现出显著的协同作用。
3.于诱导后35天做钙染色(图4)，镜下及大体观察细胞的染色情况，各组中均有非常多的黑色银染颗粒沉积，细胞结构已不清晰。其中C组的强度明显强于A、B两组，镜下见该组中大片的黑色无结构银染区，大小、形态各异；而A、B组中这种区域相对较少。镜下计数钙化结节数结果见附表4。A与C比较P＝0.009，B与C比较P＝0.034，A与B比较P＝0.315。以上结果说明10-8mol/L地塞米松与10-10mol/L的OGP10-14均可促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化，促进形成成熟的骨样小结。10-8mol/L地塞米松与10-10mol/L的OGP10-14联合作用时，其效应大于单一因素的作用，呈现出显著的协同作用。
附表2 OGP10-14对BMSC向成骨细胞转化的影响
x±S各组间比较P＜0.05附表3 OGP10-14对骨髓基质细胞ALP活性的影响
附表4 OGP10-14对BMSC钙化的影响
±xS各组间比较P＜0.05OGP(10-14)对大鼠骨髓基质细胞成脂分化的影响实验方法1.实验分组传3代骨髓基质细胞分对照组和实验组，对照组培养液为原代培养液+0.5mmol/L IBMX+10ug/ml胰岛素+100ug/ml吲哚美辛+10- 6mol/L地塞米松；实验组培养液为对照组培养液+10-10mol/L的OGP10-14。
2.各组细胞以1×104/孔种于24孔培养板中并进行爬片，每组3孔细胞。诱导21天后行脂肪细胞油红O染色，染色完成后光镜观察，照相留取资料。各浓度组每张玻片随机数取10个非重叠视野(×100)，计算脂肪细胞占总细胞数的比例。
3.成脂诱导21天终止培养，吸出培养液，每组3孔细胞，每孔加入无血清DMEM培养液1ml，用细胞刮器收集细胞，反复冻融裂解细胞，然后用氯仿∶甲醇(2∶1v/v)混合液抽提5分钟。将有机相37℃水浴，使甲醇、氯仿挥发后，用甘油三酯试剂盒在全自动生化分析仪上测定甘油三酯含量。
4.测得数据用SPSS统计软件进行单因素方差分析。
结果光镜下观察脂肪细胞油红O染色(图5)，每张玻片随机数取10个视野计算结果见附表5。统计结果显示，OGP10-14具有抑制BMSC向脂肪细胞转化的作用(P＜0.01)。甘油三酯含量测定结果见附表6(组间比较P＜0.05)。
附表5 OGP10-14对BMSC向脂肪细胞转化的影响
附表6 OGP10-14对骨髓基质细胞成脂分化的影响
OGP(10-14)对新生Wistar大鼠跖骨生长的影响实验方法1.新生Wistar大鼠处死，75％酒精浸泡2分钟。无菌条件下完整取出跖骨48块，分别培养在两块24孔培养板中，每孔加入含0.2％BSA，0.3mg/mlL-glutamine，0.05mg/ml ascorbic acid，1mM sodiumglycerophosphate，100U/ml penicillin及100μg/ml streptomycin的DMEM培养液0.45ml。
2.48块跖骨分8组，每组6块，各组分别加入用PBS液配制的浓度为10-4-10-10M的OGP(10-14)溶液0.05ml，使其在培养液中的终浓度为10-5-10- 11M。对照组加入无菌PBS液0.05ml。
3.和湿度、5％CO2、37℃的条件下培养，每天换液1次。
4.养0、1、2、3、4、5、6和7天，在倒置相差显微镜下(40倍)测量骨的长度(图6)。
实验结果见附表7，OGP(10-14)促进跖骨生长的最佳有效浓度为10-9。
附表7 OGP(10-14)对新生Wistar大鼠跖骨生长的影响
x±S与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.0
图1 OGP(10-14)诱导NIH3T3细胞增殖(相差镜，×100)图2 第3代骨髓基质细胞培养1周后融合(相差镜×100)图3 骨髓基质细胞成骨诱导12天(ALP钙钴法染色×40)图4 骨髓基质细胞成骨诱导35天(Von Kossa染色×40)图5 骨髓基质细胞成脂诱导3周(油红O染色×40)图6 OGP(10-14)促进新生大鼠跖骨生长(相差镜×40)具体实施方式
实施例1
(1)用Boc系统合成OGP10-14H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH采用Merrifield树脂(1g，氯取代值为1.06mmol/g)，使用Loffit法连接第一个Boc保护的氨基酸
取代值采用改进的Gisin法测定，将接好第一个氨基酸的Merrifield树脂装于多肽合成反应器中，然后按下表所示步骤由C端向N端逐个缩合各个被保护的氨基酸，每步反应完成后，经负压作用过滤去除各试剂。步骤如下
重复1～22步进行C端氨基酸逐个向N端的延伸反应。
每进入下一个氨基酸缩合循环用Kaiser试剂检验游离氨已确定缩合和脱保护是否完全。按上述反应步骤由C端氨基酸逐个向N端延伸肽链后得到目的肽链树脂，将树脂从反应器中移出后进行真空干燥。
(2)肽链树脂的氟化氢(HF)切割反应将干燥的肽树脂置于反应器中，加入苯甲醚(1ml/g树脂)，反应器外使用液氮/冰水冷浴，通入无水HF液体(5m1/0.1mmol肽)，冰浴下反应2小时。移去冰浴，真空泵除去HF，将反应物用无水乙醚洗涤3次(1ml/g树脂)，使用10％、20％、30％的乙酸梯度抽提粗肽3次(10ml/g树脂)，去离子水稀释后冷冻干燥。
(3)OGP10-14粗肽的纯化称取上述粗产物50mg，溶于1ml1N乙酸中，将溶液过SephadexG10柱(2.0×25cm)，1N乙酸洗脱以脱盐。收集全排峰后进行冷冻干燥。进一步将所得脱盐品过高压液相反向层析C18柱(Waters7.8mm×3cm)。收集主峰，真空除去乙酸，冷冻干燥，纯化后的样品纯度达95％以上，核磁分析及质谱分析结果均符合理论值。
(4)OGP10-14冻干品针剂的制备取50μg OGP10-14放入安培瓶内，并将OGP10-14溶解于0.5ml超纯水中，然后，加入1ml20％甘露醇和0.5ml 6％低分子右旋糖酐，经冷冻干燥得冻干品针剂。使用时用1ml生理盐水稀释。
实施例2(1)用Fmoc系统合成OGP10-14接第一个Fmoc保护的氨基酸。
将起始Wang树脂(1g，1.57mmolOH/g resin)装于圆底烧瓶中，加入15mLDCM/DMF(9∶1)。将1.5eqAa溶于少量DMF，再加入1.5eqHOBt，溶解后加入烧瓶，再加入1eqDIC。0.1eqDMAP溶于DMF再加入烧瓶中。室温磁力搅拌2～3h。加入2eq醋酐和2eq吡啶室温再搅拌30min。过滤，洗涤，干燥。将接好第一个氨基酸的Wang树脂装于多肽合成反应器中。然后按下表所示步骤由C端向N端逐个缩合各个被保护的氨基酸，每步反应完成后，经负压作用过滤去除各试剂。步骤如下
重复1-5完成C端氨基酸逐个向N端的延伸。
每个氨基酸脱保护和缩合后用茚三酮法测定游离氨基进行检验。按上述反应步骤由C端氨基酸逐个向N端延伸肽链后得到目的肽链树脂，将树脂从反应器中移出后进行真空干燥。
(2)肽链树脂的切割反应将干燥的肽链树脂(1g)置于反应器中，加入Regent K(TFA∶水∶苯酚∶苯甲硫醚∶1，2乙二硫醇＝82.5∶5∶5∶5∶2.5)25ml，室温反应3h，间歇搅拌。过滤清液，旋转蒸发，用冷的乙醚沉淀，低温离心，沉淀用水溶解，冷冻干燥。
(3)纯化方法同上述实施例1中(3)方法。
(4)OGP10-14冻干品针剂制备取50μg OGP10-14放入安培瓶内，并将OGP10-14溶解于0.5ml超纯水中，然后，加入1ml20％甘露醇和0.5ml 6％低分子右旋糖酐，经冷冻干燥得冻干品针剂。使用时用1ml生理盐水稀释。
权利要求
1.一种含成骨生长五肽(OGP10-14)的药物组合物，其特征在于药物组合物是由OGP10-14作为活性成份与辅剂甘露醇和低分子右旋糖酐制成的，其中OGP10-14含量为0.01～99.99％、辅剂含量为99.99％～0.01％，并按任意比例配制而成。
2.一种如权利要求1所述的一种含成骨生长五肽药物组合物的制备方法，其特征在于取OGP10-14放入安培瓶内并将OGP10-14溶解于超纯水中，然后，加入甘露醇和低分子右旋糖酐，经冷冻干燥得冻干品针剂。
3.根据权利要求2所述的一种含成骨生长五肽的药物组合物的制备方法，其特征在于成骨生长五肽OGP10-14是采用常规的固相多肽合成技术制备的。
4.如权利要求5所述的一种含成骨生长五肽药物组合物的制备方法，其特征在于1)在Fmoc保护系统的固相合成中，首先将C端第一个氨基酸(C端Fmoc-Gly)装在含羟基树脂的反应器中，按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸，其中用Fmoc保护各种氨基酸的α-氨基，氨基酸的侧链保护基为Tyr用叔丁基(But)保护，使用HOBt和HBTu活化各氨基酸的羧端，并完成氨基酸分子间的缩合，完成合成后，用含有或不含有还原剂(如巯基乙醇)的三氟乙酸水溶液将合成的OGP(10-14)从树脂上切割下来并去除保护基，可用过滤法或乙醚沉淀法分离得到粗肽，将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤或反相高压液相层析法纯化所需的肽；2)在Boc保护系统的固相合成中，典型的是使用Merrifield树脂，不同的是用Boc保护各种氨基酸α-氨基，氨基酸侧链保护基团是Tyr用BrZ保护。在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团(Boc)并用二异丙基乙胺(DIEA)/二氯甲烷中和，肽链缩合完成后，用无水氟化氢(HF)，在0℃下处理1-2小时，将肽链从树脂上切下，同时除去所有保护基团，以10％-30％乙酸抽提肽，冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相色谱C18柱纯化，得到HPLC纯的OGP(10-14)。
5.如权利要求3所述的一种含成骨生长五肽药物组合物的制备方法，其特征在于当采用Fmoc系统进行固相合成时，可选用下列被保护的氨基酸残基Fmoc-Gly，Fmoc-Tyr(But)，Fmoc-Phe；当使用Boc系统进行固相合成时，可选用下列被保护的氨基酸残基Boc-Gly，Boc-Tyr(Brz)，Boc-Phe。
6.根据权利要求3所述的一种含成骨生长五肽的药物组合物的制备方法，其特征在于所述的固相多肽合成载体为二乙烯苯交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺树脂、可控孔度玻璃、TentaGel树脂、磁性树脂珠；上述肽制备可选的树脂有wang树脂、HMPA-PEGA树脂、2-氯三苯甲基氯树脂、Merrifield树脂、Oxime树脂。
7.根据权利要求3所述的一种骨生长五肽的药物组合物的制备方法，其特征在于可使用肽化学合成领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，偶联剂可使用二异丙基碳二亚胺(DIC)，二环己基碳二亚胺(DCC)进行直接偶联，或通过活性酯例如五氟苯酯，或使用Fmoc-氨基酸-羧酸酐；或使用羟基苯骈三氮唑(HOBt)或7-氮杂羟基苯骈三唑(HOAt)或用2-(1H-苯骈三唑-1-基)，PyBOP、PyBroP、1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1H-苯骈三唑-1-基)，1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟磷酸酯(TBTU)、HATU活化氨基酸。
全文摘要
本发明属生物制剂，具体涉及一种含成骨生长五肽(OGP
文档编号A61P19/10GK1785424SQ20041007337
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月9日 优先权日2004年12月9日
发明者王锐, 陈志信, 常民, 彭雅丽 申请人:兰州大学