专利名称：仿生人工韧带及其制备方法
技术领域：
本发明涉及仿生人工韧带以及获得该韧带的方法。
用来代替生物关节韧带尤其是膝盖关节韧带的人工韧带，在某些特定情况下优选通过自生嫁接进行直接缝合来重建。的确，在过去的20年间，这些韧带的质量无论是在机械水平还是在生物相容性上都有了显著的提高。
因此，例如从法国专利FR-96 14263可知《orientated fibres》中所提到的聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephtalate，PET)制得的人工韧带。这种韧带由自身卷曲的或折叠的织物所组成，该织物包含两个末端的骨内部分和一个中间的关节内部分通过彼此横向不相连的一束纵向连接的活动的织物纱线构成的。在固定韧带的时候，对每根活动纱线进行纵向扭曲，形成左旋或右旋韧带再制造呈弯曲状的韧带的天然屈曲。PET材料具有共知的生物相容性，由PET制成的韧带具有极高的抗张力、弯曲力和扭力的性能，因而比现有的已知韧带可能会有更长的使用寿命。
尽管人工韧带在生物力学上取得了显著的进步，但是用在病人身上时仍然出现了失败。对这些失败原因进行的调查发现，移植后纤维原细胞的再生长能力差。这些细胞在韧带表面的分布不均匀，纤维原细胞不在骨内修复区生长，而是聚集在关节内区域的纤维上。此外，这些纤维原细胞具有反常的圆形形态，它们在韧带表面的锚定点很少。这些细胞的胶原蛋白分泌的无规律性导致了关节内区域纤维的个别化，纤维在修复区包膜和中心积聚，从而导致了移植的失败。
为了给修复组织的纤维原细胞提供良好的再生长环境，法国专利FR 2 651 994建议将人工韧带和胶原蛋白一起植入，胶原蛋白纤维沿韧带的纵向轴方向，以便能通过活的连接组织为其再生长获得适宜的方向。该方法除了有限的和不太满意的效果外，还有一个主要缺点是依赖于所用的胶原蛋白的质量，而该胶原蛋白是很难再生产的。
因此，本发明发现了一种针对上述问题的补救办法，本发明提供了一种韧带的仿生功能化方法，尤其是为了改善韧带的生物整合性能而为其提供了模拟活性材料的能力。
本发明的方法，即聚酯尤其是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的仿生功能化方法，建议用于修复假体中，因为该方法包含至少一个在所述假体的聚酯表面嫁接生物活性聚合物和共聚物的步骤，该嫁接步骤首先是用臭氧对表面进行过氧化作用，接着是在含有至少一种单体的溶液中进行基团聚合的步骤。值得注意的是，聚酯假体是指任何由PET或聚酯衍生纤维构成的假体，该假体用作韧带时具有适宜性能，以及任何在表面或纤维表面上具有聚酯层尤其是PET层的假体。
已了解的是，前述法国专利FR-9614263制得的韧带表面上生成了活性生物聚合物层，细胞的粘附和增生特性由此被改变，从所得的细胞培养结果可以说明这种改变有利于正常和同源的纤维原细胞的再生长。
此外，根据本发明的另一个技术方案，这些特性还可经附加下述步骤来改进在嫁接步骤之前，仅在溶剂介质中制备聚酯表面，或在溶剂介质中然后再在水性介质中制备聚酯表面。
这两种二中择一的制备步骤通过提高嫁接表面的质量以及提高所嫁接的共聚物的量而极大地促进了嫁接步骤的效率。同时对由此制得的韧带的生物相容性特征发挥重要作用。
从下面的选择性实施方式的描述中本发明其它的优点和特点将更加清楚，这些实施方式只是本发明功能化方法的非限制性实施例。
本发明的方法在此应用于已制成的韧带假体上，或者甚至是用于制备所述假体所涉及的聚酯织物上。该方法分为下述步骤步骤1聚酯表面的制备1A)在溶剂介质中在制备用作韧带结构的聚酯织物过程中，需要所谓的脱脂步骤来除去油脂和杂质。这能使韧带在植入患者的过程中，避免急性滑膜炎型的病理反应。此外，经过该步骤，清洁的聚酯表面可以提供纤维原细胞的生长，而在不清洁的聚酯表面没有观察到这种生长。
在溶剂介质中进行的这两种二中择一的制备方法随所选溶剂性质的不同而不同。
方法1不经任何表面膨胀的脱脂
用SOHXLET装置进行最少12个萃取循环，在用己烷进行的第12个清洗循环后检查脂肪残留。用已烷清洗后接着用乙醚(RPE)冲洗最少3次，在第三次冲洗后检查脂肪残留情况。
方法2利用能引起聚酯表面膨胀的溶剂进行脱脂使用能引起聚酯表面膨胀的溶剂可提高臭氧作用步骤中被处理表面的过氧化物数量，从而获得改进移植的优点。
这种溶剂具有介电常数大于30的特点。优选地，这种溶剂是环醚类型或脂肪醚类型。可选自下述溶剂四氢呋喃(THF)、二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)。这些溶剂的优点是无毒或低毒，因而易于用在工业环境中。
处理是将聚酯部分浸入溶剂中达5分钟至约1小时，优选在10-25分钟之间。例如，可选择在室温下浸入四氢呋喃溶剂(THF)中15分钟。
1B)在水性介质中选择在水性介质中制备表面的目的是为了从制造的聚酯表面去除诸如低分子量有机酸的残留物，例如PET中的对苯二甲酸，从而在臭氧化之前获得一个完好的表面。
处理方法由下述步骤组成在5wt％Na2CO3的蒸馏水溶液中洗涤聚酯部分。该洗涤是在加热条件下进行的，即，在60℃至120℃的温度条件下，优选在微沸腾即100℃±5℃条件下洗涤10分钟。当然，可以使用任何其它的碱金属或碱土金属碳酸盐，例如K2CO3或CaCO3。洗涤后再用蒸馏水连续冲洗直至冲洗出的水的pH值回复到7。
1C)清洗无论先前步骤如何(采用步骤1A中的方法1或方法2，然后是步骤1B，或仅采用步骤1A)，聚酯产品都需要被清洗，例如用无水乙醇或四氢呋喃(THF)冲洗，接着烘干，如烘30分钟。
步骤2在聚酯表面嫁接生物活性聚合物或共聚物2A)单体的选择和制备本发明所用的单体是能进行基团聚合和共聚的单体，因而能产生刺激细胞尤其是纤维原细胞的增生和分化的生物相容性聚合物。这些包含羧酸盐/酯(carboxylate)、磷酸盐/酯(phosphate)、磺酸盐/酯(sulfonate)和硫酸盐/酯(sulfate)的单体，例如美国专利6,365,692中所记载的单体，在本发明中可单独使用或混合使用。优选使用甲基丙烯酸和苯乙烯磺酸盐/酯和它们的混合物。在使用这些单体聚合之前，首先要将单体纯化。例如，对于苯乙烯磺酸钠来说，将它从再蒸馏水/乙醇(10∶90，v∶v)混合物中进行重结晶来纯化，然后在70℃溶于该溶液中。接着用孔隙指数为3的烧结玻璃盘进行真空过滤，然后置于4℃。形成的磺酸钠晶体经过滤收集，所得的固体在50℃真空干燥直至恒重。
2B)臭氧化在常规使用的臭氧化装置中引入假体或步骤1制得的这些预处理的假体的聚酯织物。
例如，可以使用一个含100cm3再蒸馏水的500cm3管状反应器，该反应器具有提供臭氧的活塞管。例如，可采用相当于50g/m3氧的臭氧气体流量。对于这种用量的臭氧，臭氧化PET的最佳时间是20到90分钟。过氧化速度的测定显示，在该臭氧流量下，在臭氧化30到60分钟间获得最佳速度。还需要注意的是，臭氧化时间超过90分钟会极大损坏PET表面。
此外，对步骤1A的方法2的贡献作如下描述。事实上，与采用不会引起膨胀的溶剂相比，使用能够引起表面膨胀的溶剂会提高过氧化速度达5倍。一旦臭氧化完成，冲洗并清洗臭氧化装置中的人工韧带或聚酯织物，例如根据下述方法用再蒸馏水冲洗3次，然后用无水乙醇冲洗3次，再用四氢呋喃(THF)冲洗3次。接着，在真空烤箱中25℃干燥30分钟。
2C)聚合将步骤2A制得的所选单体放到水溶液中，优选再蒸馏水中。只要能用于基团聚合反应的任何浓度都可采用，但必须不低于5％重量百分比。优选采用溶液中单体浓度接近于溶解度极限的浓度，具有比终止反应粘度大的介质，从而促进聚合物的增长反应，而获得具有高分子量的嫁接的聚合物链。这相当于选择重量百分比浓度k＝s-ε，其中s是溶解度极限，ε是1-7％重量百分比。例如在聚苯乙烯磺酸盐的情况下，溶解度极限是20wt％，因而可选择15％的浓度。
聚合步骤的持续时间依赖于单体的性质。估计是介质在反应温度下凝胶化所需的时间。因而，例如聚苯乙烯磺酸盐在70℃时的聚合时间需要1小时，在65℃需要1小时30分钟。
聚合反应在无氧的密封小室中进行，例如在氩气环境下。将用于反应的单体或共聚用单体的溶液、预臭氧化的假体或聚酯条引入到小室中。在预定的温度下水浴加热密闭容器达前述的预定时间。
反应结束后，将嫁接了的聚酯组分从反应器中取出。为了去除未反应的单体残留物，对这些嫁接的材料进行清洗。例如，可用适当的单体溶剂例如蒸馏水清洗功能化表面几次，为了去除可能的微量未被嫁接的聚合物，可任选地再采用任何适当溶剂例如无水乙醇完成清洗。
步骤3生化试剂的注入该步骤是任选的，可采用或不采用。该步骤的目的在于加强韧带的生物整合性能力，如步骤1和2所述，仿生聚合物已在之前嫁接到韧带上了。因而，将一种或多种生化试剂注入到假体中的目的在于提高它的细胞粘附和增生特性。这些促进纤维原细胞集落化的生化试剂是纤维连接蛋白和/或I型和/或III型胶原蛋白家族中的蛋白质。优选使用前述蛋白的混合物，即，纤维连接蛋白和I型和/或III型胶原蛋白的混合物观察到了对纤维原细胞粘附的协同效果。将这些试剂注入假体可以采用如将韧带浸入含胶原蛋白的溶液中的方式来进行。
显然，注入步骤并不是一定要在嫁接步骤之后，根据韧带的制备阶段，注入步骤也可在制备韧带的其它步骤中或介于其它步骤间进行。另外，优选在注入步骤后进行韧带的灭菌步骤。
为了测定前述方法的效果，对由编织的PET纤维制得的织物进行对比实验，聚酯是结晶速度为40％±5％的半晶体且熔点接近260℃±5℃。这些纤维织物是申请人制造和销售的人工韧带的构成部分。制备未嫁接的对照PET纤维和用聚苯乙烯磺酸钠嫁接的以及用等重量的甲基丙烯酸(AM)和苯乙烯磺酸钠(SSNa)的混合物嫁接的两种类型的PET纤维。制备的不同条件见表1。
表1样品的制备
然后，进行生物学评价的各种检测，尤其是纤维原细胞培养的检测，以及测试纤维原细胞在这些不同表面上粘附性的检测，结果见下表。
表2生物学评价
观察到，在聚酯韧带表面上嫁接仿生聚合物，尤其是苯乙烯磺酸盐/酯，为表面的纤维原细胞提供了正常和均一的发育环境。
此外，处理后的表面对蛋白质有很高的亲合力，可以很好得吸附胶原蛋白以及纤维原细胞的其它集落刺激生化因子。因而能够理解的是，韧带表面经步骤1和2的方法处理后，再经过步骤3来注入此类生化因子，韧带能明显提高纤维原细胞的吸附能力并适宜性调整细胞的发育。
最后，本发明的仿生功能化方法显然能用在任何类型的需要改善生物整合性的聚酯假体上，本发明给出的例子仅仅是说明性的，并不是用来限制本发明的应用。
权利要求
1.一种处理聚酯人工假体的方法，尤其是处理聚对苯二甲酸乙二醇酯的人工假体，以便使假体具有模拟存活物质的能力，其特征在于，所述的仿生功能化方法包括在所述假体的聚酯表面上嫁接生物活性聚合物和共聚物的至少一个步骤，该嫁接步骤是由臭氧化作用获得表面的过氧化步骤以及接着在含有至少一种单体的溶液中进行基团聚合的步骤所组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，聚对苯二甲酸乙二醇酯是半晶体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，对于50g/cm3的臭氧含量，臭氧化时间为20至90分钟。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，单体是苯乙烯磺酸钠。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，单体溶液中单体的浓度为5％至k％，其中浓度k接近于溶液中单体的溶解极限。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在嫁接步骤之前还有一个步骤，即仅在溶剂介质中制备聚酯表面，或先在溶剂介质中然后在水性介质中制备聚酯表面。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，溶剂介质由己烷和乙醚组成。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，溶剂介质由至少一种能通过膨胀而改变表面的溶剂组成。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，能通过膨胀而改变表面的溶剂是低毒或无毒的环醚或脂肪醚。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，能通过膨胀而改变表面的溶剂具有大于30的介电常数。
11.根据权利要求8，9或10中任意一项所述的方法，其特征在于，能通过膨胀而改变表面的溶剂选自下述溶剂四氢呋喃(THF)、二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在水性介质中制备表面的过程由下述步骤组成为了去除制备的聚酯表面上的残留物，在碱金属或碱土金属碳酸盐溶液如Na2CO3或CaCO3溶液中，在热条件下处理聚酯表面。
13.根据前述任意一项所述的方法，其特征在于，在嫁接步骤之后还包括将一种或多种纤维原细胞的促集落生化剂注入到假体中的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的生化剂是纤维连接蛋白和/或I型和/或III型胶原蛋白家族中的蛋白质。
15.权利要求1-14中的任意一项方法用于纺织或编织的PET纤维形式的人工韧带中。
全文摘要
本发明涉及由聚酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯制得的仿生人工韧带以及该韧带的仿生功能化方法。本发明方法的特征在于该方法包括在所述假体的聚酯表面上嫁接生物活性聚合物和共聚物的步骤，该嫁接步骤是由臭氧化作用获得表面的过氧化步骤以及接着在含有至少一种单体的溶液中进行基团聚合的步骤所组成。所述方法还任选地包括将纤维连接蛋白和/或I型和/或II型胶原蛋白注入到假体中的步骤。如此获得的假体能使纤维原细胞正常均匀地再生，从而显著改进聚酯假体的生物整合性。
文档编号A61F2/08GK1777450SQ200480004135
公开日2006年5月24日 申请日期2004年1月19日 优先权日2003年1月17日
发明者贝尔纳·布吕莱, 雅克-菲利浦·拉布罗, 韦罗妮克·米戈内, 米哈埃拉·乔巴努, 格拉谢拉·帕翁－贾维德, 阿兰·西奥夫 申请人:拉思公司-科学研究与应用试验室