专利名称：一种组织工程化韧带修复材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及一种组织工程化 材料及其制备方法和作为韧带修复材料的用途。
背景技术：
韧带是连接骨与骨之间的致密结缔组织，广泛分布于体内，特别是近 关节处。其功能是稳定关节，防止关节过度屈、伸。其成分主要足坚实的 和较厚的胶原纤维和少量氨基聚糖。
从宏观的观点看，韧带是成纤维细胞分泌的胶原和弹性蛋fl，片使之 机化成纤维的合成材料，及成纤维细胞组成，成纤维细胞散布在基质中的 胶原纤维束上，韧带中还含有水，能进行营养物质的运输，通过与基质中 的大分子相互作用对胶原纤维进行润滑或隔离，由此赋予韧带以黏弹性特 定。其它的一些大分子，如弹性蛋白、蛋白多糖通过与胶原束及相ii作用， 对机械复合的作用提供黏弹性的反应。弹性蛋白提供了韧带弹性反应的能 力，其作用受到平均信息量变化的影响。除了结构蛋白外，黏迮性的蛋广j 也存在于韧带中，含量相对较低，但他们在细胞粘着、迁移及创伤修复中
却起着重要的作用，包括纤连蛋白(Fibronectin, FN) ， IV型胶原、层粘 连蛋白、细胞粘合素等。
韧带损伤是青年及参加运动的人中损伤的主要类型，膝盖损伤则是最 常见的与运动相关的损伤之一，美国每年大约有150万例。在美国，每年 至少有5万患者需进行韧带的修复。迄今为止，对于韧带撕裂的治疗方法 主要是假体性植入物(包括人工的及天然的)、同种异体移楨物、异种 移植物，单独或与加强物合用修复，或者采用合成修补物替代。然而，这 ^可供选择的方案不能提供一个长期的、合理的解决途径。韧带合成材料
的移植是一个十分普遍的方法，但它容易导致移植物变形或功能丧失。异 体移植仍处于实验阶段，它可以引起对伤口愈合不利的免疫反应。自体移 植由于材料来源有限，也是矫形外科医师面临的一个难题。
这些方法已被应用多年，但在美国采用自体移植物取代受损前交叉韧
带(简称ACL)是首选方法，通常这些组织来源于髌骨的跟腱、髂胫带、半 腱肌或股薄肌。但是从这些器官获得组织会引起供体相应部位强度及功能 的丧失，导致次级并发症。在进行髌骨肌腱的自体移植时，在组织移动过 程中跟腱的断裂可能发生。此外，伴随着初期ACL的重建，ACL f建的 校正的必要性也相应增加。ACL重建将导致价格昂贵及复杂的外科手术。 因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、无排异的组织工程化韧带
的修复材料。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的安全性高、无排异的组织工程化韧带 修复材料；本发明的另一个目的就是提供所述组织工程化韧带修复材料的 制备方法。
在本发明的第-目的是通过这样的技术方案实现的，即一种组织工程 化韧带修复材料，它包括
(a) 适于植入人体关节腔内力学适应性、药学上可接受的可生物降解的
纳米微导引体-，
(b) 有优化控释动力学的韧带促愈因子或/和韧带成纤维细胞或干细
胞；
(c) 所述有优化控释动力学的韧带促愈因子或/和韧带成纤维细胞或干 细胞与导引体表面结合。
所述导引体选自以下可降解的高分子合成材料多聚乳酸(PLA)、聚 羟基乙酸(酯)(PGA)、聚乳酸羟基乙酸(PLGA)、明胶蛋白(gelaUn)、聚 乙醇酸(PLLA)、聚羟基丁酸(P4HB)、聚氨酯(PU)及上述多聚物间的共聚 物(co-polymer)。
所述导引体还可选自以下可降解的天然生物材料，包括甲克素、葡聚 糖、明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、多聚氨基酸、多肽、透明质酸及其复合 物。
所述的纳米导引体由上述可生物降解的材料制成的直径为400 nm 800nm电镀纳米纤维集合而成。其构成的导引体的孔隙率为85 93% ，孔 径范围为30—50pm。所述的纳米导引体分布有体积比为9: l的直径为 150pm —200jim的大孔。
所述的纳米导引体可以做成生物工程医学上可以接受的各种儿何形 状，如管状、片状、棒状、丝束状；及适合安装部位的异形；其厚度为5pm —200(im。
所述的纳米导引体表面结合的有优化控释动力学的韧带促愈因子可选 自下组胶原、转移生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因 子、表皮生长因子、其它生长因子。
所述的细胞是自体的韧带细胞或者成体干细胞。
为实现本发明第二目而采用的技术方案是这样的，即一种制备组织工 程化韧带修复材料的方法，包括以下步骤
(a) 通过电镀旋压成形的技术做成纳米纤维导管、薄层，或其它生物医 学可接受的形状；
(b) 将ACL治愈促进因子与药学上可接受的生物可降解材料混合；
(c) 将成纤维细胞或干细胞种植在纳米导引体表面。
其中，步骤(b)和(c)可以结合。 本发明的主要优点在于
1、组织工程化韧带修复材料的导引体采用纳米纤维集合而成，其表面 特性与天然的细胞外基质微结构非常类似，生物相容性好，不引起异物反 应。在种植细胞过程中，细胞顺着纳米纤维丝的方向爬行，并排列有序，
细胞在纳米导入体表面迁移的速度非常快；由于孔隙率合适，利于细胞营 养物质的获取和代谢废物的排出。
2 、组织工程化韧带修复材料可以按照组织缺损的形状任意塑形；
3、组织工程化韧带修复材料的生物力学性能好，可抗较强应力，以满
足韧带修复后早期功能锻炼的要求。
图1 促愈因子在纳米材料表面的固定示意图。
图2 流式细胞仪分析骨髓基质干细胞细胞表面标记物CD44和 CD34 。标记物CD44呈阳性，CD34呈阴性，由此来分离得到纯化的骨髓 基质干细胞。
图3制成的纳米支架的电镜扫描图(A)纳米纤维丝无序地排列形成 纳米支架.(B)经过单轴拉伸，纳米纤维丝有序地排列形成纳米支架。 图4骨髓基质千细胞在有序的纳米纤维丝上生长与在体情况的比较。 可见骨髓基质干细胞在有序的纳米纤维丝上生长与在体情况非常相似。
图5骨髓基质干细胞在纳米纤维丝上生长，细胞肌动蛋白丝染色结果。
具体实施例方式
研究发现自体自体或异体来源的韧带细胞、成体干细胞可以作为组织 工程化韧带的种子细胞来源，转移生长因子、成纤维细胞生长因子、血小 板源性生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子有利于细胞在纳米3 引物上生长、分泌和分化。将促进韧带细胞生长、分泌和分化的生长因了-与韧带细胞或成体干细胞与可降解的纳米导引体一起构成组织工程化韧带 移植物，可有效地用于修复韧带缺损。在此基础上完成了本发明。
本发明的导引体具有以下特征1、生物相容性好，不引起异物反应。 2、纳米纤维的表面特性与胶原的特性非常类似。3、孔隙率合适，利于细 胞营养物质的获取和代谢废物的排出。4生物力学性能好，可抗较强应力， 以满足韧带修复后早期功能锻炼的要求。5、可降解。
本发明对其采用的韧带成纤维细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的韧带成纤维细胞，通常，本发明的肌腱细胞是自体的或同种异休的 韧带细胞。
本发明采用的成体千细胞中比较理想的是选用间充质干细胞。可用于 本发明的间充质千细胞可以来自任何脊椎动物，较佳地是鸟类、哺乳动物， 更佳地是灵长类动物，尤其是人。
分离和获得上述韧带细胞的方法是本领域中已知的。 一种优选的方式
通过胰酶、胶原酶消化进行分离，用无血清DMEM培养基将胰酶或胶原 酶浓度调整至0.-5mg/ml (较佳地为lmg/ml) ， 37°C ±2"恒温振荡器内 消化约4一20h。
上述韧带细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。 一种优选的 方法是将肌腱细胞在饱和湿度、5MC02培养箱内培养。合适的培养也包 括(但不限于)1) DMEM培养基+10M胎牛血清；2) DMKM培养基 + 20%小牛血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进韧带 细胞生长的细胞因子等)。
本发明涉及的成体干细胞为骨髓基质干细胞从Cambrex (Walkersville MD)获得，用流式细胞仪鉴定细胞表面的标记物，CD105，CD166，CD29 和CD44呈阳性，CD34， CD14， CD45呈阴性，因此来分离得到纯化的骨 髓基质千细胞。将其培养在MSCGM培养基中(Cambrex)，饱和湿度、 5%C02、 37"C恒温振荡器内。
适用于本发明的韧带细胞应能在体内或体外增殖。
适用于本发明的生物可降解材料包括(不限于)
(a) 可降解的高分子合成材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA )、 以及两者的混合物聚乳酸羟基乙酸(PLGA)、聚乙醇酸(PLLA)、聚氨 酯(Pu)和聚羟基丁酸(P4HB)等。
(b) 可降解的天然生物材料，包括甲壳素、葡聚糖、明胶、胶原蛋白、 弹性蛋白、多聚氨基酸、多肽、透明质酸及其复合物等。
(c) 上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复
合材料。
参见附图1，本发明涉及生物材料支架的制备及"纳米微创导入体--促愈因子"复合物的形成。在该促愈因子在生物可降解材料表面固定化示 意图中
Laminin——层粘蛋白,Heparin——肝素，PEG——聚乙二醇，bFGF --一碱性成纤维生长因子，Nanofiber——纳米纤维。
本发明所述的组织工程化韧带修复材料通过导入体体外培养扩增的 韧带细胞接种到生物相容性良好并可被机体吸收的nT降解生物材料上形成 生物材料一生长因子一韧带成纤维细胞/骨髓基质干细胞的生物复合物，将 该复合物植入到缺损部位，随着生物材料的逐渐降解吸收，韧带细胞继续 增值并分泌基质，最终替代生物材料而形成相应的韧带组织，达到修复韧 带缺损的目的。
本发明的组织工程化韧带修复材料的制备方法简便，将一定数量的韧 带细胞与药学t可接受的生物可降解材料混合，然后导引体表面组合结合 有优化控释动力学的韧带促愈因子或/和韧带成纤维细胞或干细胞。
本发明的组织工程化韧带移植物的形状没有特殊限制，可以按照组织 缺损的形状任意塑形。
本发明所述的纳米微创式导引体的直径较佳为500nm以卜'。
本发明组织工程化韧带移植物中的韧带细胞或者骨髓基质千细胞浓度 通常为0.5X 106/ml至5X 108/ml或更高，较佳为5X 106/ml至5 X 108/ml。
此外，在本发明的组织工程化肌腱移植物中，还可添加或复合其他各 种利于细胞增值和迁移的促愈因子。
除了将组织丄程化韧带移植物植入体内之外，还将其置于体外生物反 应器内培养，从而进行组织工程化韧带的实验，在体外形成具行一定组织 学结构、生化组成与生物力学强度的组织工程化肌腱。
用本发明方法形成的组织工程化韧带移植物或韧带，可直接植入休内 韧带缺损处。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅!i]于说明木 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验^ 法，通常按照常规条件，例如实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 骨髓基质干细胞的获取种子细胞是组织工程研究的基本要素。应用组织工程技术构建韧带组 织要求用尽可能少的细胞在体外扩增培养达到构建肌腱组织所需的细胞数曰.虽。骨髓基质千细胞从Cambrex (Walkersville MD)获得，用流式细胞仪 鉴定细胞表面的标记物CD44呈阳性，CD34呈阴性(参见附图2)，因此 来分离得到纯化的骨髓基质干细胞。将其培养在MSCGM培养基屮 (Cambrex)，饱和湿度、5%C02、 37。C恒温振荡器内。骨髓基质干细胞的传代培养步骤包括吸取培养皿中的全部培养液，PBS冲洗；加入0.25%的胰蛋"酶3ml， 置入37。C孵箱中消化2分钟；倒置显微镜下观察见韧带细胞由梭型变成透 亮圆球型，加入含10X胎牛血清的DMEM培养液终止消化；用带橡胶管 的弯头吸管刮、吹打使培养皿中的骨髓基质干细胞呈单个悬浮状态。细胞 计数，按2Xl(^个细胞/ml进行传代培养。韧带成纤维细胞也可以通过已知方法的培养获得。 实施例2 ^入体的制备将PLA和PGA的共聚物经电镀旋压成形仪喷涂处理后，再经单轴拉 伸仪作用后，纳米纤维丝有序排列形成导入体材料集合体。图3为制成的纳米支架的电镜扫描图，其中左图为纳米纤维丝无序地 排列形成纳米导入体。右图为经过单轴拉伸，纳米纤维丝有序地排列形成 纳米导入体。导入体以采用经过单轴拉伸，有序地排列的纳米纤维丝集合 体为最佳。 上述导入体的制备是组织工程技术的一个重要方面。以前有人用碳纤 维、人发辫等作为肌腱组织工程中的生物才来支架。但因为表面组织盲.接 力学效应及纤维材料间相互摩擦使力学负荷衰减，并转移到新生胶原纤维 组织商，使胶原纤维长度及直径增加，而碳纤维阶段或碎屑被巨噬细胞、 纤维细胞包裹，沉积于体内，时间延长会发生崩解，巨噬细胞聚积在周ffl 因子异物反应。人发制成的支架材料对人体组织有良好的亲和力和牛.物相 容性，无吸收变质现象，但愈合时间较长，粘连问题仍存在，效果不理想。PLA和PGA的共混物具有良好的生物相容性，可降解的优点。在预制支 架时，将PLA和PGA制成的纳米纤维，拉成有序的状态，再巻成导管状， 不仅有利于细胞在纳米材料表面有序以较快的速度向前爬行，而—R保持了 支架的形状，增加了支架的生物力学强度，同时纳米材料的孔隙允许营养 物质的自由交换，也允许细胞的进出。实施例3组织工程化韧带修复材料复合物的形成本发明的关键因素是导入体。细胞生长在所述导入体上并分泌细胞外 基质，在早期，导入体起到细胞外基质的作用，随着时间的延长，分泌的 细胞外基质逐渐增多，生物材料支架逐渐降解。还具有良好的生物相容性 及孔隙率，生物力学性能良好，在早期能替代所要修复组织的生物力学功 能。本实施例采用的聚羟基乙酸作为导入体，种植骨髓基质干细胞而构成 组织工程化韧带修复材料复合物。上述组织T.程化韧带修复材料复合物的制备步骤包括 体外培养的骨髓基质干细胞，制成浓度50Xl(^个细胞/ml的细胞悬液。 生物支架预置在100mm的培养皿中，骨髓基质干细胞接种于生物材料支架 卜.，以使细胞与生物材料粘附牢固。置饱和湿度、5%C02， 37。CC()2培养 箱中孵育4小时。加入含10X胎牛血清的DMEM培养液中，在饱和湿度， 5%C02， 37'CC02培养箱中继续培养7天，每2天换液1次。然后在安光 显微镜下观察。
参见图4，显微观察结果显示接种后3小时骨髓基质千细胞与聚径基乙酸开始粘附，io小时可牢固地贴附于纳米纤维上，并在体外培养过程中分泌大量的细胞外基质。纳米纤维基本呈纵向排列，较为规则。细胞染 色后观察显示骨髓基质干细胞在有序排列的纳米材料上生长情况非常类 似于细胞在体内的生长真实情况。种植的细胞不仅保持了它1!、]的形状和农 型，而且通过纳米纤维的连接组成了三维的细胞网络。实施例4 体外骨髓基质干细胞在不同的纳米纤维丝上生长，细胞肌动蛋白丝染色结果。参见图5.图中，骨髓基质干细胞在纳米纤维丝上生长，细胞肌动蛋白丝染色结果(A)骨髓基质干细胞在自然无序的纳米纤维丝支架上生长情 况观察(B)骨髓基质干细胞在有序排列的纳米纤维丝支架上生长情况观察 (C)骨髓基质干细胞在固定有多肽RGD有序排列的纳米纤维丝上生长情 况观察(D)骨髓基质千细胞在固定有纤维蛋白的有序排列的纳米纤维丝 上生长情况观察实施例5 再缝合条件下，组织工程化韧带修复材料促进受损前交义韧带 修复的实验在本实施例中，将组织工程化韧带修复材料作成管状体，在管状体的 内表面(或内外表面)附着有韧带促愈因子或/和种植韧带成纤维细胞或T 细胞。使用时将所述管状体两端缝合在受损的韧带部位，使管状体包裹在 受损或断裂韧带的上，使受损的部位得到修复并愈合。
权利要求
1、一种组织工程化韧带修复材料，其特征是它包括(a)适于能够植入人体关节腔内，力学适应性强、药学上可接受的可生物降解的纳米微导引体；(b)有优化控释动力学的韧带促愈因子或/和韧带成纤维细胞或干细胞；(c)所述有优化控释动力学的韧带促愈因子或/和韧带成纤维细胞或干细胞与导引体表面结合。
2、 根据权利要求1所述的一种组织工程化韧带修复材料，其特征&: 所述导引体选自以F可降解的高分子合成材料多聚乳酸(PLA)、聚羟搖乙酸(酯)(PGA)、聚乳酸羟基乙酸(PLGA)、明胶蛋白(gelatin)、聚乙醇 酸(PLLA)、聚羟基丁酸(P4HB)、聚氨酯(PU)及所述多聚物间的共聚物屮全少一种。
3、 根据权利要求l所述的一种组织工程化韧带修复材料，其特征足 所述导引体还可选自以下可降解的天然生物材料，包括甲壳素、葡聚糖、明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、多聚氨基酸、多肽、透明质酸及其^:合物。
4、 根据权利要求2、 3所述的一种组织工程化韧带修复材料，其特征 是所述的导引体由上述可生物降解的材料制成的直径为400nm 800mn 电镀纳米纤维集合而成；其构成的导引体的孔隙率为85 93%，孔径范闱 为30 —5(Hrni;所述的纳米导引体分布有体积比为9: l的直径为150pm-200pm的大孔。
5、 根据权利要求4所述的一种组织工程化韧带修复材料，其特征足 所述的纳米导引体可以做成生物工程医学上可以接受的各种儿何形状；比 厚度为5lim — 20C^m。
6、 根据权利要求l所述的一种组织工程化韧带修复材料，其特征足 所述的纳米导引体表面结合的有优化控释动力学的韧带促愈因子选ft:胶原、转移生长L大J于、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、表皮zl 长因子、其它生长因子中的一种。
7、 根据权利要求l所述的一种组织工程化韧带修复材料，其特征ii: 所述的细胞是卦体的韧带细胞或者成体干细胞。
8、 一种制备组织工程化韧带修复材料的方法，包括以下步骤(a) 将经过电镀旋压成形的技术做成纳米纤维状生物可降解的导引体 成型为生物医学上町接受的形状；(b) 将ACL治愈促进因子与药学上可接受的生物可降解材料混合； 或/和(C)将成纤维细胞或干细胞种植在纳米导引体表面。
全文摘要
本发明提供了一种组织工程化韧带修复材料，它包括(a)适于植入人体关节腔内力学适应性、纳米纤维化的纳米微导引体；(b)药学上可接受的生物可降解材料；(c)导引体表面组合结合有优化控释动力学的韧带促愈因子或/和韧带成纤维细胞或干细胞。本发明的组织工程化韧带修复材料可有效地治疗韧带缺损。本发明还提供了该组织工程化韧带修复材料的制备方法和用途。
文档编号A61L27/54GK101147811SQ20061005457
公开日2008年3月26日 申请日期2006年11月7日 优先权日2006年11月7日
发明者宋国立, 松 李, 苑 李, 力 杨, 蒋稼欢 申请人:重庆大学