IgA1沉积疾病的治疗的制作方法

专利名称：IgA1沉积疾病的治疗的制作方法
政府资助本发明全部或部分由NIH，NIDCR的基金NIH RO1 DE 09677资助。美国政府对本发明享有一定的权利。
背景技术：
人组织和器官中免疫球蛋白A1(IgA1)沉积是包括IgA肾病、疱疹样皮炎(DH)和亨诺赫-舍恩莱因紫癜(HS)的许多人类疾病的特征。IgA1沉积与诸如肾衰、皮肤水疱、皮疹、关节炎、胃肠道出血与腹痛的多种临床表现相关。
对表现出异常IgA1沉积的患者存在有几种治疗选择。它们包括施用具有免疫抑制和抗炎特征的皮质类固醇、减轻肾炎的膳食性鱼油补充剂和减小进行性肾病和肾衰危险性的血管紧张素转化酶抑制剂。这些治疗不直接作用于组织或器官中的IgA1沉积。
为了解决去除IgA1沉积的这一问题，已经将外源蛋白水解酶在IgA1沉积动物模型中进行了测试(Gesualdo L.et al，(1990)J.Clin.Invest.86715-722和Nakazawa M.et al.(1986)J.Exp.Med 1641973-1987)。蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶通过蛋白水解性切割肾脏中的IgA1沉积起作用，但是对IgA1分子不特异，会消化多种其他蛋白质。
因此，尽管该领域中有进展，但本领域中仍需要可以用来治疗IgA1沉积疾病的治疗性药物。

发明内容
本发明公开了细菌IgA1蛋白酶在治疗组织和器官中IgA1沉积方面的用途。细菌IgA1蛋白酶特异性切割IgA1分子，从而提供了特异性切割并除去IgA1沉积的方法。因此，提供了治疗以IgA1沉积为特征的疾病的治疗性药物。具体而言，公开了治疗IgA肾病、疱疹样皮炎(DH)和亨诺赫-舍恩莱因紫癜(HS)的治疗性药物。
本文公开了一种编码与氨基酸标签融合的IgA1蛋白酶的核酸分子，所述的氨基酸标签位于IgA1蛋白酶自催化切割位点的上游。
在一个实施方案中，与IgA1蛋白酶融合的标签是特异性结合蛋白质配基如抗体或肽的标签。该标签可以是c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5或HIS。
在一个方面中，提供了用于治疗IgA1沉积的药物组合物，其包含复合有抗体如抗IgA1蛋白酶抗体的IgA1蛋白酶。
在另一个方面中，提供了用于治疗IgA1沉积的药物组合物，其包含复合有标签配基的带标签的IgA1蛋白酶。与IgA1蛋白酶融合的标签可以是c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5或HIS。因此，所述的配基可以是抗标签抗体，如抗FLAG抗体、抗MYC抗体、抗VSV抗体、抗HA抗体或抗V5抗体。作为替代实施方案，配基可以是肽或非肽配基，如螯合分子。
在另一个方面中，提供了治疗以IgA1沉积为特征的疾病的方法。该方法涉及向患者施用治疗有效量的IgA1蛋白酶。
在一个实施方案中，该治疗方法使用与复合有标签配基如抗标签抗体的标签融合的IgA1蛋白酶。与IgA1蛋白酶融合的标签可以是c-Myc、Flag、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5或HIS。因此，抗标签抗体可以是抗FLAG抗体、抗MYC抗体、抗VSV抗体、抗HA抗体或抗V5抗体。
在另一个实施方案中，以IgA1沉积为特征的疾病是IgA肾病、疱疹样皮炎或亨诺赫-舍恩莱因紫癜。


图1示出了IgA1的铰链区和铰链区中几个IgA1蛋白酶的切割位点(SEQ IDNO1)。
图2a示出了进行自催化切割并释放自催化切割的可溶性成熟IgA1蛋白酶的IgA1蛋白酶前体。
图2b示出了His标签已经与IgA1蛋白酶融合从而使His标签位于成熟IgA1蛋白酶的羧基端附近的IgA1蛋白酶。因此，可溶性IgA1蛋白酶可以与抗His抗体复合，以用于治疗目的。
图3示出了流感嗜血杆菌Rd IgA1蛋白酶前体蛋白的示意图，并示出了位于自催化切割位点(位点a)上游的氨基酸序列，原始序列(SEQ ID NO2)。突变序列(SEQID NO3)示出了His标签与IgA1蛋白酶框架内融合的位置，位于蛋白水解性切割位点上游2个氨基酸处。还示出了原始序列的相应核酸序列(SEQ ID NO25)和突变序列的相应核酸序列(SEQ ID NO26)。
图4示出了产生的PCR定向诱变片段，用于通过常规连接技术将HIS标签插入到流感嗜血杆菌Rd IgA1蛋白酶中。
图5示出了流感嗜血杆菌Rd的蛋白质序列(SEQ ID NO4)。
图6示出了流感嗜血杆菌Rd的核苷酸序列(SEQ ID NO5)。
具体实施例方式
本发明涉及细菌免疫球蛋白A1蛋白酶(IgA1蛋白酶)在治疗以IgA1沉积为特征的疾病方面的用途。
定义本文所用的术语“IgA1蛋白酶”指特异性切割人IgA1分子的细菌酶。“特异性切割”指蛋白酶在人IgA1分子铰链区中切割，不切割人IgA2分子。IgA1蛋白酶在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中表达为跨细菌膜的单链前体。革兰氏阴性菌的IgA1蛋白酶进行自催化切割，释放N端可溶性IgA1成熟蛋白酶。
本文所用的术语“位于上游”指标签的空间参数，其中氨基酸标签序列位于距离自催化切割的IgA1蛋白酶位点氨基端至少2个氨基酸，或1个氨基酸，或0个氨基酸处，至多位于距离自催化切割的IgA1蛋白酶位点氨基端50个氨基酸，从而使标签位于可溶性分泌的IgA1蛋白酶羧基端上游2个或1个或0至50个氨基酸处。
本文所用的术语“标签”指长度为3-40个氨基酸的多肽序列。标签可以具有对肽、蛋白配基或非肽配基的特异结合亲和性。特异结合亲和性可以使与之融合的IgA1蛋白酶复合有配基，从而使IgA1蛋白酶得以检测、分离并放大为复合形式，或用于治疗目的。本文中，标签还包括荧光标签、发光标签或生色标签。标签的非限制性例子包括c-Myc、HA，和VSV-G、HSV、FLAG、V5和HIS。
“复合有配基”指IgA1蛋白酶特异性结合结合配对物，如抗体或螯合分子。特异结合配对物可以与基质如小珠结合。术语“特异结合”指两种分子，如抗体或蛋白质或肽或螯合剂的相互作用，其中相互作用依赖于各分子上特定结构的存在。例如，当两种分子是蛋白质分子时，第一分子上的结构识别并结合第二分子上的结构，而不结合一般蛋白质。本文所用的术语“特异性结合”指与分子结合非特异性分子相比，分子以至少大于2倍的亲和力、优选至少10倍、20倍、50倍、100倍或更大的亲和力与特异性结合配对物结合。
“检测”指确定标签存在与否的方式，如用抗标签单克隆抗体进行western印迹的“检测”、通过免疫荧光的检测或由于标签本身荧光的检测。根据本发明的合适标签的例子包括c-Myc、Flag、HA，和VSV-G、HSV、FLAG、V5和HIS。
“分离”指IgA1蛋白酶和细菌细胞材料如细胞膜与存在于细菌生长培养基中的任意蛋白质或核酸分离。非限制性分离方法的例子包括使用金属螯合树脂或小珠分离具有多聚-组氨酸标签的IgA1蛋白酶、免疫沉淀和使用抗标签抗体的亲和柱纯化。
本文所用的术语“抗体”指能够结合抗原如标签或IgA1蛋白酶的免疫球蛋白分子或其片段。术语“抗体”包括例如完整的任意同种型抗体(IgG、IgA、IgM、IgE等)，还包括也与脊椎动物如哺乳动物蛋白质特异反应的其片段。可以使用常规技术使抗体片段化。因此，该术语包括抗体分子中能够与特定蛋白质选择性反应的蛋白水解切割的或重组制备部分的片段。这种蛋白水解的和/或重组片段的非限制性例子包括Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、dAbs和包含通过肽接头连接的VL和VH结构域的单链抗体(scFv)。ScFv可以共价或非共价地连接，以形成具有两个或更多结合位点的抗体。因此，抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体，或其他纯化的抗体制剂和重组抗体。本文中，术语“抗标签抗体”指特异性结合标签的抗体。
本文所用的术语“IgA1沉积”指人类组织或器官中IgA1免疫球蛋白以聚集或非聚集形式的积累。
本文中，“以IgA1沉积为特征的疾病”指其中发生IgA1沉积的任意疾病，例如但不局限于IgA肾病、疱疹样皮炎和亨诺赫-舍恩莱因紫癜。
本文所用的“IgA1肾病”指肾脏内以IgA1沉积为特征的肾脏疾病。
本文所用的“疱疹样皮炎”指皮肤和其他组织中与IgA1沉积相关的慢性水疱疾病。
本文所用的“亨诺赫-舍恩莱因紫癜”指皮肤组织和肾脏组织中以IgA1沉积为特征的皮肤和肾脏疾病。
本文所用的“药物组合物”包含药理学上有效量的活性药剂和药学上可接受的载体。本文所用的“药理学上有效量”或简称“有效量”指有效产生目的性药理、治疗或预防效果的药剂量。例如，如果与疾病或病症相关的可测定参数减小至少25％，则给定的临床治疗认为是有效的。
I.IgA1蛋白酶本文中，使用IgA1蛋白酶治疗以IgA1沉积为特征的疾病。IgA1蛋白酶是特异性切割人IgA1分子的细菌酶。人IgA2对几乎所有的已知IgA1蛋白酶有抗性，因为IgA2分子缺少存在于所有IgA1分子中的铰链区。IgA1分子的铰链区由包含多种IgA1蛋白酶切割位点的一串氨基酸组成，如图1所示。IgA1蛋白酶在革兰氏阴性菌中表达为跨细菌内膜的单链前体。然后前体蛋白将自身插入到细菌外膜中进行自催化切割，释放成熟的可溶性IgA1蛋白酶(图2a)。革兰氏阳性菌的IgA蛋白酶也可用于本发明，虽然它们不具有自催化分泌机制。对于这些蛋白酶，将表位标签加入到酶蛋白中。
在本发明的一个实施方案中，标签序列与IgA1蛋白酶框架内融合，从而使标签序列位于分泌的IgA1蛋白酶羧基端附近(图2b)。图3示出了流感嗜血杆菌Rd IgA1蛋白酶前体蛋白的示意图，该示意图说明标签序列(如His标签)与自催化位点a、b和c上游的IgA1蛋白酶融合。
多种细菌产生IgA1蛋白酶，可用在本发明中。这些细菌包括但不局限于1型和2型流感嗜血杆菌、1型和2型脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、肺炎链球菌、血链球菌、多枝梭菌、产黑色普雷沃菌和解脲尿枝原体。
本发明的IgA1蛋白酶核苷酸序列可以从表达IgA1蛋白酶的任意细菌获得，前提是所述IgA1蛋白酶能够切割人IgA1分子。已经鉴定到来自多种细菌菌株的编码IgA1蛋白酶的核苷酸序列，包括多枝梭菌(Genebank Accession，AY028440)；解脲尿枝原体(Genebank Accession，NC_002162)；流感嗜血杆菌(Genebank Accession，X59800)和细菌菌株Rd(Genebank Accession，NC-000907)、7768(Genebank Accession，AF274862)、6338(Genebank Accession，AF27486)、2509(Genebank Accession，AF274859)、埃及嗜血菌(Genebank Accession，AF369907)、8625(Genebank Accession，AJ001741)、HK284(Genebank Accession，X82487)、Da66(Genebank Accession，X82467)，HK635(Genebank Accession，X82488)，和来自未鉴定菌株的其他保藏序列(GenebankAccession号X59800、X82488、X64357、M87492、M87491、M87490和M87489)；脑膜炎奈瑟氏球菌(Genebank Accession号AF235032)和细菌菌株Z2491(GenebankAccession，NC-03316)、B40(Genebank Accession，AF012211)、Z4099(GenebankAccession，AF012210)、Z4018(Genebank Accession，AF012209)、Z4400(GenebankAccession，AF012208)、Z3524(Genebank Accession，AF012207)、Z4024(GenebankAccession，AF012206)、Z3910(Genebank Accession，AF012205)、Z3906(GenebankAccession，AF012204)、Z2491(Genebank Accession，AF012203)、IHN341(GenebankAccession，AJ001740)、NL3327(Genebank Accession，AJ001739)、NL823(GenebankAccession，AJ001737)、NL3293(Genebank Accession，AJ001738)、HK284(GenebankAccession，X82487)、ETH2(Genbank Accession，X82469)、NGO93(Genbank Accession，X82482)、NCG80(Genbank Accession，X82479)、NG117(Genbank Accession，X82483)、HF96(Genbank Accession，X82475)、HF54(Genbank Accession，X82473)、HF48(Genbank Accession，X82480)、HF13(Genbank Accession，X82474)、NGC65(GenbankAccession，X82484)、NCG16(Genbank Accession，X82485)、SM1894(GenbankAccession，X82476)、EN3771(Genbank Accession，X82468)、NG44/76(GenbankAccession，X82481)、SM1166(Genbank Accession，X82486)、HF159(Genbank Accession，X82471)、81139(Genbank Accession，X82477)、HF117(Genbank Accession，X82470)、SM1027(Genbank Accession，X82472)和Genebank Accession号AF235032；淋病奈瑟氏球菌(Genebank Accession号，A12416)和细菌菌株MS11(Genebank Accession，S75490)；肺炎链球菌(Genebank Accession号X94909)和细菌菌株MGAS315(Genebank Accession，NC-004070)、R6(Genebank Accession，NC-003098)；和血链球菌(Genebank Accession，NC-003098)和细菌菌株SK85(Genebank Accession，Y13461)、SK49(Genebank Accession，Y13460)、SK4(Genebank Accession，Y13459)、SK162(Genebank Accession，Y13458)、SK161(Genebank Accession，Y13457)、SK115(Genebank Accession，Y13456和Sk112(Genebank Accession，Y13455)。
载体构建在本发明中，将编码IgA1蛋白酶的序列克隆到适合于表达蛋白质的载体中，使可以生成并分离可溶性IgA1蛋白酶。在下面讨论的原则指导下，可以使用常规方法构建载体(Sambrook et al.，Molecular BiologyA laboratory Approach，Cold SpringHarbor.N.Y.1989；Ausubel，et al.，Current protocols in Molecular Biology，GreenePublishing，1995)。简言之，使用常规连接技术将编码IgA1蛋白酶的DNA序列插入到细菌克隆和/或表达载体中。
为了制备编码IgA1蛋白酶的核酸，需要编码IgA1蛋白酶的基因来源。该基因可以从天然或合成来源获得。从细菌菌株中克隆新型IgA1蛋白酶基因的方法描述在Lomholt H.，et al.，Mol.Microbiol.(1995)15(3)，495-508；Fishman，Y.et al.，(1985)，p.164-168 in G.K.Schoolink(ed.)，The Pathogenic Neisseria，Am.Soc.Microbiol.，Washington DC；Koomey，J.et al.，Proc.Natl，Acad.Sci.USA，(1982)797881-7885；Halter，R，et al.，EMBO J.，(1984)31595-1601；Bricker，J.et.al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，(1983)，802681-2685；Koomey，J.M.and Falkow，S.，同上；Grundy，J.F.et al.，J.Bacteriol，(1987)1694442-4450和Gilbert，J.V.et al.，Infect.Immun.，(1988)561961-1966中，所有这些内容通过引用并入本文。
作为替代方案，可以使用对感兴趣的IgA1蛋白酶基因特异的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，从细菌基因组DNA中分离编码已知IgA1蛋白酶的DNA。简言之，使用本领域中公知的方法分离细菌基因组DNA，例如使用QIAGEN提供的细菌基因组DNA分离试剂盒，或通过引用并入本文的Sambrook et al.，Molecular BiologyA laboratory Approach，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和Ausubel，et al.，Currentprotocols in Molecular Biology，Greene Publishing，(1995)中所述的常规方法。
PCR是本领域中公知的(Mullis and Faloona，Methods Enzymol.，(1987)，155335，通过引用并入本文)。通常，根据本发明有用的寡核苷酸引物是与编码IgA1蛋白酶的模板选择性杂交以引导第二核酸链的酶法合成的单链DNA或RNA分子。引物与细菌基因组的核酸分子库中存在的靶分子的一部分互补。考虑通过化学或酶合成法来制备引物。作为替代方案，这种分子或其片段是天然存在的，从其天然来源分离或从供应商处购买。诱变寡核苷酸引物长度为15-100个核苷酸，理想的是20-40个核苷酸，虽然也使用不同长度的寡核苷酸。优选的是，引物还包含唯一的限制酶序列。
通常，当两个核酸序列基本互补(在至少14-25个核苷酸的一段上至少约65％互补，优选至少75％、更优选至少约90％互补)时发生选择性杂交。参见Kanehisa，Nucleic Acids Res.，(1984)，12203，其通过引用并入本文。因此，期望引导部位一定程度的错配是可以耐受的。这种错配小，例如单-、二-或三-核苷酸。作为替代方案，错配可以包括核苷酸环，我们将该核苷酸环定义为错配包含四个或更多核苷酸的连续系列的错配。
总之，五个因素影响引物与第二核酸分子杂交的效率和选择性。这些因素是(I)引物长度，(ii)核苷酸序列和/或组成，(iii)杂交温度，(iv)缓冲液化学和需要引物与之杂交的区域中空间位阻的潜力，当设计非随机引物序列时这些因素是重要的考虑事项。
在引物长度和引物与靶序列退火的效率及精确性之间存在正相关性较长的序列比较短的序列具有更高的熔解温度(TM)，在给定的靶序列中较不可能重复，因此使混杂的杂交最小化。具有高G-C含量或包含回文序列的引物序列倾向于自身杂交，它们的靶序列也如此，因为在溶液中通常倾向于单分子杂交动力学，而非双分子杂交动力学同时，重要的是设计含足够数目的G-C核苷酸对以紧密结合靶序列的引物，因为每个G-C碱基对通过三个氢键结合，而非象A和T碱基配对时那样通过两个氢键结合。杂交温度和引物退火效率呈反向变化，和杂交混合物中可能包括的有机溶剂如甲酰胺的浓度一样，而增加盐浓度有利于结合。在严格的杂交条件下，较长的探针比较短的探针更有效地杂交，所述较短探针在较宽松的条件下是足够的。严格的杂交条件通常包括盐浓度小于约1M，更通常小于约500mM，优选小于约200mM。杂交温度变动在低为0℃至高于22℃，高于约30℃，并(经常)超过约37℃。较长的片段进行特异性杂交需要较高的杂交温度。由于多个因素影响杂交严格性，参数的组合比任意一个参数的绝对测量值更为重要。
优选使用辅助产生并优化引物序列的计算机程序设计引物。这些程序的例子有DNAStarTMsoftware package的“PrimerSelect”(DNAStar.Inc.；Madison，WI)和OLIGO4.0(National Biosciences.Inc.)。一旦设计后，就可以通过适当的方法，如Beaucage andCarruthers(1981)Tetrahedron Lett.，221859所述的氨基磷酸酯(phosphoramidite)法或根据Matteucci and Caruthers(1981)J.Am.Chem.Soc.，1033185的三酯法或使用商业自动化寡核苷酸合成仪或VLSIPSTM技术的其他化学方法来制备引物，上述文献通过引用并入本文。
使用模板细菌DNA(至少1fg更通常为1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物进行PCR。当引物集合非常异质时使用大量引物是有利的，因为每个序列仅由集合中小部分分子来显示，在后继的扩增循环中该量具有限制性。常用的反应混合物包括2μl DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10×PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)、0.4μ1.25mM dNTP、0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，CA)，并用去离子水补至总体积为25μl。覆盖矿物油，使用程序化的热循环仪进行PCR。
根据实际需要的严格性调整PCR循环中每个步骤的长度和温度以及循环数。通过引物要与模板退火的效率和要耐受错配的程度确定退火温度和时间；显然，当同时扩增并诱变核酸分子时，至少在合成的第一轮中需要错配。使用30℃-72℃之间的退火温度。模板分子的初始变性通常于92℃-99℃发生4分钟，然后进行如下的20-40个循环变性(94-99℃，15秒-1分钟)；退火(如上所述确定温度，1-2分钟)；和延伸(72℃，1-5分钟，取决于扩增产物的长度)。最终的延伸通常在72℃进行4分钟，然后是4℃无穷长(0-24小时)步骤。
PCR扩增后，可以通过常规方法如凝胶电泳或柱纯化来分离DNA。然后用合适的限制酶消化编码细菌IgAl蛋白酶的DNA，并连接到合适的克隆和/或表达载体中。
载体和宿主细胞在本发明中可以使用任意载体。本文所述的载体指用于将异源DNA导入细菌细胞进行其表达和/或复制的独立元件。适用于本发明的多种载体是公众可以得到的，包括细菌质粒和噬菌体。每个载体含有多个功能组分，通常包括克隆(或“多聚接头”)位点、复制起点和至少一个选择标记基因。如果给定的载体是表达载体，它还具有一个或多个下列组分增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，每个都定位于克隆位点附近，从而使它们与编码根据本发明的IgA1蛋白酶的基因可操作连接。
克隆和表达载体通常都含有能够使载体在一个或多个选定宿主细胞中复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列是能够使载体独立于宿主染色体DNA复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。对于多种细菌来说这种序列都是公知的。例如，质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌。
有利的是，克隆或表达载体可以包含还称作选择标记的选择基因。该基因编码转化的宿主细胞在选择培养基中存活或生长所需的蛋白质。未转化含选择基因的载体的宿主细胞不能在上述培养基中存活。常用的选择基因编码赋予抗生素或其他毒素如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素抗性、补充营养缺陷防御性或供应生长培养基中没有的关键营养成分的蛋白质。
由于根据本发明的载体的复制最便于在大肠杆菌(E.coli)中进行，使用E.coli选择标记，例如赋予抗生素氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。它们可以从E.coli质粒如Pbr322或者pUC质粒如pUC18或pUC19获得。
表达载体通常含有为宿主生物体所识别并可操作连接于目的编码序列的启动子。这种启动子可以是诱导性或组成性的。术语“可操作连接”指所述组分的关系能够使它们以其目标性的方式起作用的并置(juxtaposition)。与编码序列“可操作连接”的控制序列的连接方式应使在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
适用于原核宿主的启动子例如包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和诸如tac启动子的杂合启动子。用于细菌系统的启动子还通常含有与编码序列可操作连接的Shine-Ddlgamo序列。优选的本发明启动子是异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)调控型启动子。
任意细菌菌株都认为是表达和克隆本发明的IgA1蛋白酶的合适宿主细胞。示例性的宿主是E.coli。
将载体导入宿主细胞可以通过本领域技术人员公知的多种合适方法中的任意方法将载体导入选定的宿主细胞。例如，可以使用噬菌体载体颗粒如λ或M13进行感染，或通过质粒载体或噬菌体DNA的多种转化方法中的任意方法将载体构建体导入合适的细菌细胞。例如，常规的氯化钙介导的细菌转化法仍普遍用来将裸露的DNA导入细菌(Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，但是也可以使用电穿孔法((Ausubel et al.，Current Protocolsin Molecular Biology，(1988)，(John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY))。
纯化可溶性IgA1蛋白酶将编码IgA1蛋白酶的表达载体导入合适的细菌宿主细胞之后，通过常规的方法使细菌繁殖，以超表达可溶性的IgA1蛋白酶(Sambrook et al.，Molecular BiologyAlaboratory Approach，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和Ausubel，et al.，Current protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing，(1995)，通过引用并入本文)。简言之，使携带有编码IgA1蛋白酶的表达载体的细菌如E.coli，或具有整合到细菌基因组中的编码IgA1蛋白酶的DNA的细菌在细菌生长培养基中于37℃生长。当细菌培养物达到对数期时，通过本领域公知的方法从生长培养基中纯化IgA1蛋白酶。
例如，使表达6×His-IgA1蛋白酶的流感嗜血杆菌Rd菌在装有补充NAD与血晶素的脑-心脏输注液的发酵罐中培养20升(2个10L)。使细胞于37℃生长，直至达到静止期，16-20h。用Pellicon系统除去细菌物质，将含活性酶的各10L培养上清液浓缩至400ml。用0.05％NaN3调整缓冲液，使蛋白质位于25mM Tris/HCl缓冲液，pH7.5中。为了除去不需要的蛋白质，将80ml批量的该浓缩物加到于25mM Tris缓冲液中平衡的40ml床体积DE-52阴离子交换柱上。IgA蛋白酶不与该柱结合，作为流过物(flow through)使用500ml Tris缓冲液加以收集。根据使用人IgA底物进行的分析，回收产率通常为85-90％。然后使用硫酸铵将酶沉淀(60％饱和的硫酸铵；390gm/L)。将沉淀物用下列缓冲液溶解50mM磷酸钠、12.5mM Tris/HCl，0.3M NaCl和0.025％叠氮钠，调整至pH7.5。然后将该酶用该缓冲液透析数天。对于每10L起始培养物来说，酶溶液的终体积大致为200ml。
至于亲和纯化，将40ml份额的酶溶液加到床体积为40ml的柱中的Ni-NTA-琼脂糖上。结合的酶用含50mM磷酸钠、12.5mM Tris/HCl、0.3M NaCl和0.025％叠氮钠的500ml缓冲液洗三次。这些缓冲液洗涤的pH逐渐降低，从pH7.5开始，然后是6.6，然后是6.0，以从镍配基除去微弱吸附的非酶蛋白质。最后的洗涤还使用pH7.5的缓冲液，这次是200ml。然后使用50ml溶于50mM Tris/HCl，pH7.5中0.1M咪唑将6×His-IgA蛋白酶从Ni-NTA琼脂糖上洗脱。使用100kDa截流的Centricon膜进行正压过滤浓缩回收的酶，用25mM Hepes，pH7.15洗3次，然后保存于Hepes缓冲液中。
分析IgA1蛋白酶活性通过Plaut，AG and Bachovchin WW，IgA-specific prolyl endopeptidasesserine type.Methods Enzymol.1994；244137-51中所述的常规方法验证IgA1蛋白酶的酶活性，上述文献通过引用并入本文。可以使用纯化的蛋白酶或存在于细菌生长培养基中的IgA1蛋白酶进行分析。如果IgA1蛋白酶具有一个单位的活性，则它具有用于本发明的足够活性，所述的单位等于37℃下每分钟切割的人IgA1微克数。
II.带标签的IgA1蛋白酶在一个实施方案中，IgA1蛋白酶与标签融合。将标签与本发明的IgA1蛋白酶融合有助于蛋白酶的纯化和检测，并提供一种方法，使IgA1蛋白酶与配基如抗标签抗体复合以用于治疗目的。
为了产生包含标签的IgA1蛋白酶，可以使用常规的分子生物学技术将编码标签的序列与编码IgA1蛋白酶的序列框架内连接。使标签序列连接到编码IgA1蛋白酶自催化切割位点的DNA序列的上游，从而在切割IgA1蛋白酶前体时，将包含标签的可溶性IgA1蛋白酶分泌到细菌生长培养基中。
作为替代方案，通过基于PCR的定点诱变产生包含标签的IgA1蛋白酶。在本领域中已知有多种定点诱变方法使人们突变蛋白质中的特定区域。这些方法体现在可通过商业途径获得的用于进行定点诱变的多种试剂盒，包括常规的和基于PCR的方法。实例包括可以得自Stratagene的EXSITETM基于PCR的定点诱变试剂盒(Catalog No.200502；PCR based)和得自Stratagene的QUIKCHANGETM定点诱变试剂盒(Catalog No.200518；PCR based)，以及同样得自Stratagene的CHAMELEON双链定点诱变试剂盒(Catalog No.200509)。简言之，通过使编码标签的序列包含在一个PCR引物的5’或3’端附近，将标签序列引入到PCR片段中。使产生的PCR片段能够提供合适的限制位点，从而使该片段能够得以消化，然后连接到亲本载体中，以置换特定的氨基酸密码子。
在一个实施方案中，本发明的标签对于抗体具有特异的结合亲和性，从而使蛋白酶在结合配基时形成免疫复合物。例如，标签可以包含易于得到其抗体的独特表位。作为替代方案，标签可以包含螯合金属的氨基酸(如His)，从而使IgA蛋白酶可以与螯合金属的树脂或小珠如镍-NTA珠复合。
在另一个实施方案中，标签包含可检测标记物，如酶，或包含能够用可检测标记物标记的氨基酸。例如，可检测标记物包括放射性同位素、荧光分子、生色分子、发光分子和酶。本发明中的有用可检测标记物包括用标记的链亲和素偶联物进行染色的生物素、荧光燃料(如荧光素、德克萨斯红、若丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)和比色标记物如胶体金。使用这些可检测标记物的发明教导包括U.S.Pat.Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241，其整体内容通过引用并入本文。
根据本发明的合适标签的非限制性例子包括c-Myc、HA，和VSV-G、HSV、FLAG、V5和HIS。各标签的氨基酸和核酸序列如下所示。
标签 肽和核酸序列HIS蛋白质HHHHHH(SEQ ID NO6)DNACAC CAT CAC CAT CAC CAT(SEQ ID NO7)c-Myc蛋白质EQKLISEEDL(SEQ ID NO8)DNAGAG CAA AAG CTC ATT TCT GAA GAG GAC TTG(SEQ IDNO9)HA蛋白质YPYDVPDYA(SEQ ID NO10)DNATAC CCT TAT GAT GTG CCA GAT TAT GCC(SEQ ID NO11)VSV-G蛋白质YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO12)DNATAT ACA GAC ATA GAG ATG AAC CGA CTT GGA AAG(SEQID NO13)HSV蛋白质QPELAPEDPED(SEQ ID NO14)DNACAG CCA GAA CTC GCC CCG GAA GAC CCC GAG GAT(SEQID NO15)V5蛋白质GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO16)DNAGGC AAA CCA ATC CCA AAC CCA CTG CTG GGC CIG GATAGT ACT(SEQ ID NO17)FLAG蛋白质DYKDDDDKG(SEQ ID NO18)DNAGAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA GGA(SEQ IDNO19)将标签置于IgA1蛋白酶上具有易于体内和体外检测IgA1蛋白酶的益处。包含抗体表位的标签可以使用抗标签抗体或与可检测标记物偶联的抗体进行检测。可检测标记物可以是天然存在或非天然存在的、例如带有放射性同位素(如125I、35S)、荧光或发光基团、生物素、半抗原、抗原和酶的氨基酸。有许多可从商业来源获得的标签抗体，如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、V5、HIS和FLAG的抗体。此外，可以使用产生抗体的常规方法产生用于本发明的标签抗体，例如通过单克隆抗体生成法(Campbell，A.M.，Monoclonal Antibodies TechnologyLaboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，theNetherlands(1984)；St.Groth et al.，J.Immunology，(1990)351-21和Kozbor et al.，Immunology Today(1983)472)。可以使用放射性同位素、亲和标记物(如生物素、亲和素等)、酶标记物(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)，通过本领域中公知的方法对抗标签标记物进行可检测标记，所述的本领域中公知的方法诸如描述在国际申请WO 00/70023和(Harlour and Lane(1989)Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory，pp.1-726)中，其通过引用并入本文。
用于检测标签的分析法包括但不局限于Western Blot分析、免疫组化分析、Elisa、FACS分析、酶法分析和放射自显影。进行这些分析的方法是本领域的技术人员公知的。例如，可以使用光片或液闪计数器检测放射性标记物，使用检测所发射光的光检测器检测荧光标记物。通常通过对酶提供底物并检测由于酶对底物的作用而产生的反应产物来检测酶标记物，通过简单的肉眼观察有颜色的标记物检测比色标记物。
标签还可以用于将IgA1蛋白酶从其他细胞材料分离。例如，通过免疫沉淀，或使用抗标签抗体亲和柱或偶联抗标签抗体的珠。当使用HIS标签时，可以使用螯合金属的柱进行分离(参见Hochuli in Genetic EngineeringPrinciples and Methods ed.JKSetlow，Plenum Press，NY，chp 18，pp87-96)。进行这些类型纯化的方法是本领域中公知的。
在优选的实施方案中，使用抗标签抗体来产生IgA1蛋白酶免疫复合物，从而使IgA1复合后还保留酶活性。这种免疫复合物可以用在药物制剂中治疗IgA1沉积疾病。例如，当施用于患者时，认为IgA1免疫复合物被捕获在肾脏的肾小球中，IgA肾病和亨诺赫-舍恩莱因紫癜疾病中的IgA1沉积部位。
III.IgA1沉积疾病的治疗本文中，使用IgA1蛋白酶作为治疗性药物来治疗IgA1沉积疾病。IgA1分子的异常沉积已知导致肾衰、皮肤水疱、皮疹、关节炎、胃肠道出血与腹痛。
Ig肾病在一个实施方案中，本发明提供了通过向需要这种治疗的患者施用IgA1蛋白酶来治疗IgA1肾病的方法。IgA1肾病是肾脏疾病。该疾病认为是免疫复合物介导的肾小球性肾炎，其特征在于肾小球系膜区中IgA1的颗粒沉积。肾病由肾小球系膜细胞的增殖变化导致和限定。
IgA肾病是最常见类型的慢性肾小球性肾炎中的一种，随后是末期肾病的诱因。
疱疹样皮炎本发明还提供了向需要这种治疗的患者施用IgA1蛋白酶来治疗疱疹样皮炎(DH)的方法。疱疹样皮炎是与真皮-表皮交汇处IgA1沉积相关的慢性水疱性皮肤病(Hall，RP & T.J.Lawley，J.Immunol.(1985)135(3)1760-5)。DH患者具有颗粒状IgA1沉积，并具有相关的谷蛋白敏感性肠病(GSE)。
亨诺赫-舍恩莱因紫癜在另一个实施方案中，本发明提供了向需要这种治疗的患者施用IgA1蛋白酶来治疗亨诺赫-舍恩莱因紫癜(HS)的方法。亨诺赫-舍恩莱因紫癜是一种皮肤和肾脏疾病。HSP的特征在于组织中含有IgA1的免疫复合物沉积。通过免疫荧光显微镜观察皮肤组织或肾脏中IgA1沉积的现象诊断该疾病。临床表现通常包括皮疹、关节痛、腹痛和肾病。
动物模型可以在本领域技术人员所公知的任意合适动物模型中验证本发明的IgA蛋白酶的治疗效果。一些示例性的动物模型描述如下。
1.IgA肾病IgA肾病的多种大鼠和小鼠动物模型是可以获得的，并可用于本发明。这些模型描述在Emancipator，S.N.et al.，(1987)Animal models of IgA Nephropathy In IgANephropathy.A.R.Clarkson，editor.Martinus Nijhoff publishing，Boston.188-203中，其整体内容通过引用并入本文。一个示例性的模型描述在Gesualdo L.et al，(1990)J.Clin.Invest.86715-722中，其整体内容也通过引用并入本文。简言之，将IgA抗体/硫酸葡聚糖复合物注射到小鼠体内。免疫复合物沉积在肾脏中，小鼠表现出类似人IgA肾病典型情况的肾小球性肾炎。下面将更详细描述如何制作模型和用于验证治疗性药物。
以三倍过量制备硫酸葡聚糖(500kD，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和单克隆IgA抗β1-6糖苷抗体(J558Litton Bionetics，Kensington，MD)的可溶性免疫复合物(26.5μg葡聚糖/mg J558(肾病模型)；22.0μg葡聚糖/mg MOPC 104E(正常对照))。通过尾静脉注射，将含3mg抗体的复合物注射到Swiss-Webster小鼠体内。1小时后，肾脏中IgA复合物最大沉积的时间点，以给定间隔如10分钟间隔对小鼠腹腔注射多剂量盐水或治疗性药物。最后一次注射1小时后将小鼠处死。
然后将肾脏从各小鼠取出，通过光学显微镜、免疫荧光显微镜和电子显微镜观察IgA1沉积和形态。
简言之，为了监测IgA1沉积，将突然冷冻的肾皮质样品以4μm低温恒温切片，用对小鼠IgA(US Biochemical Corp)特异的山羊抗血清中的免疫荧光标记的IgG片段进行染色，将免疫荧光用于IgA1沉积的半定量评定(Nakazawa，M.et al.，(1986)Lab.Invest.55551-556和Nakazawa，M.et al.，(1986)J.Exp.Med.1641973-1987)。当评定的IgA1沉积数向正常肾脏中观察到的IgA1沉积数减少时，则认为治疗性药物是有效药物。
通过用PAS试剂对肾皮质切片进行染色来评定形态学变化，如肾小球系膜基质增生(expansion)和肾小球系膜细胞增多(hypercellularity)(Gesualdo，L.et al，(1990)J.Clin.Invest.86715-722)。简言之，将肾皮质固定在10％福尔马林中，包埋在石蜡中并进行染色。根据Nakazawa，M.et al.(1986)Lab.Invest.55551-556和Nakazawa，M.et al.(1986)J.Exp.Med.1641973-1987中所述的方法对肾小球系膜基质增生和肾小球系膜细胞增多进行半定量评定，所述文献的整体内容通过引用并入本文。
正常肾小球基质评定为0。当观察到变宽的肾小球系膜蒂(stalk)时，肾小球基质的增生评定为+1；当观察到毛细腔上的基质扩侵(encrochment)时，评定为+2；当随毛细腔的下降观察到肾小球系膜蒂的显著变宽时，评定为+3。当肾小球系膜基质的增生向正常肾脏中观察到的基质形态减少时，例如向评定值+2、+1或0减少时，认为治疗性药物是有效药物。
正常肾小球系膜细胞构成评定为0，限定为每个肾小球系膜区中有3或更少的细胞核。当观察到每个肾小球系膜区中有4-6个细胞核时，细胞增多评定为+1；当在大多数区域中观察到每个肾小球系膜区中有4-6个细胞核并且有些区域具有7或更多个核时，评定为+2，当大多数区域中观察到每个肾小球系膜区有7个或更多个细胞核时，评定为+3。当肾小球系膜细胞增多向正常肾脏中观察到的减少时，例如向评定值+2、+1或0减少时，认为治疗性药物是有效药物。
还通过计算机形态测量对从每只小鼠随机选择的肾小球中的总肾小球面积、基质面积和肾小球细胞构成进行了定量(Cue image analysis system，Olympus Corp.，Columbia，MD.)(Gesualdo L.et al，(1990)J.Clin.Invest.86715-722)。简言之，将皮质方块在2.5％戊二醛的0.1M二甲基胂酸盐溶液中固定，在1％OsO4中后固定，然后包埋在Spurr’s环氧树脂(Polysciences，Inc.Warrington，PA)中。将50-70nm的切片用乙酸双氧铀和氢氧化铅染色。对编码的方格在JEOL JEM 100 EX显微镜中进行检验，如Nakazawa，M.et al.，(1986)J.Exp.Med.1641973-1987中所述对基质、细胞构成和免疫沉积进行半定量，所述文献的整体内容通过引用并入本文。
血尿(尿中存在红细胞)和蛋白尿(尿中存在蛋白质)也是IGA肾病的合适指标。简言之，将小鼠置于代谢笼中，24小时收集蛋白尿。将尿离心，通过在3％sulfalicylic acid中的比浊法分析蛋白质，通过显微镜分析血尿，如Nakazawa，M.et al.，(1986)J.Exp.Med.1641973-1987中所述，其整体内容通过引用并入本文。通常，没有IgA肾病的正常小鼠在每个高倍视野(40×)中红细胞少于3个，而患有IgA肾病的小鼠在每个高倍视野中红细胞多于10个。每个高倍视野中红细胞数目的减少指示为治疗性药物对于IgA肾病是有效的。在治疗之前对小鼠检验血尿和蛋白尿，以确定指示疾病的参照值。与治疗前获得的血尿和蛋白尿的值相比，用治疗性药物治疗后参照值减小5％、10％、30％、40％、优选50％、更优选大于50％指示为对IgA1肾病治疗是有效的。
IV.剂量、配方和施用本文中，使用细菌IgA蛋白酶来治疗IgA沉积疾病。本发明中的IgA1蛋白酶可以用于组合有药学上可接受载体的组合物中。这种组合物还可以含有稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域中公知的其他材料。在一个方面中，IgA1蛋白酶与抗体复合以形成治疗性免疫复合物。这种治疗性免疫复合物对于治疗以肾脏中IgA1沉积的疾病是特别有用的，因为免疫复合物认为在施用时定位于肾小球中。
术语“药学上可接受”指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。载体的特征取决于施用途径。这些载体包括但不局限于盐水、缓冲的盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。对于口服药物来说，药学上可接受的载体包括但不局限于药学上可接受的赋形剂，如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙与乳糖，而玉米淀粉和褐藻酸是合适的崩解剂。粘合剂包括淀粉和明胶，而润滑剂如果存在的话通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可以包覆有诸如甘油基单硬脂酸酯或甘油基二硬脂酸酯的材料，以延缓在胃肠道中的吸收。
药学上可接受的盐可以用无机酸形成，如乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐丁酸盐、柠檬酸盐、camphorate、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。碱盐包括铵盐，碱金属盐例如钠盐和钾盐，碱土金属盐例如钙盐和镁盐，和有机碱的盐例如二环己胺盐、N-甲基-D-葡萄糖胺盐，和氨基酸的盐例如精氨酸、赖氨酸等。另外，碱性含氮基团可以用下列试剂形成季铵盐低级烷基卤化物，如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物，如癸基、十二烷基、十四烷基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，如苄基和苯乙基溴化物等。由此得到水溶性或油溶性或可分散的产物。
组合物还可以包含其他试剂，这些试剂增强组合物的活性，或加强其在治疗中的活性或用途，或维持治疗性药物在保存过程中的活性。这些额外的因子和/或药剂可以包括在组合物中，以产生协同效应或使副作用最小化。此外，本发明组合物的施用可以和其他治疗同时进行。
本发明的治疗性药物的施用可以通过多种常规途径进行，例如口服、吸入、局部涂敷或经皮、皮下、腹腔内、非肠道或静脉内注射。
本发明中含有治疗性药物的组合物可以静脉内施用，例如通过注射单位剂量。术语“单位剂量”用于本发明的治疗性组合物时，指对于患者来说适合作为单一剂量的有形分立的单位，每个单位含有计算用来产生与所需稀释剂即载体或赋形剂相关的所需治疗效果的预定量活性材料。
本发明的治疗性药物的施用模式包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和动脉内注射和输注。用于非肠道施用的药物组合物包含药学上可接受的无菌水溶液或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及使用前重构成无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。合适无菌水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和诸如油酸乙酯的可注射有机酯。例如，可通过使用包衣材料如卵磷脂、通过维持分散体情况下的所需颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。这些组合物还可以含有辅药，如防腐剂、湿化剂、乳化剂和分散剂，和/或遮蔽治疗性药物的免疫原性决定簇的化合物。通过加入诸如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、酚山梨酸等的各种抗细菌和抗真菌剂，可以提供对微生物作用的预防。可能还需要加入等渗剂，如糖、氯化钠等。通过加入延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶，可以产生可注射药物剂型的更长时间吸收。通过形成治疗性药物存在于可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯、聚原酸酯和聚酐中的微胶囊基质，制备可注射的贮存形式。根据治疗性药物和聚合物的比例与所用特定聚合物的性质，可以控制治疗性药物释放的速率。还可以通过将治疗性药物诱捕入与身体组织相容的脂质体或微乳液来制备贮存型可注射配方。例如可以通过除菌滤器进行过滤或通过使用前将无菌固体组合物形式的、可以溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射溶媒的无菌药物，使可注射配方无菌。
配方包括适合于口服、直肠施用、眼用(包括玻璃体内或intracameral)、经鼻施用、局部施用(包括经颊和舌下)、子宫内、阴道内或非肠道施用(包括皮下、腹腔内、肌肉内、静脉内、真皮内、颅骨内、气管内和硬膜外)。配方可以方便地以单位剂量形式存在，可以通过常规的药学技术制备。这些技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂相混合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体或细分固体载体或二者均匀并密切混合并根据需要使产品成型来配制配方。
适于非肠道施用的配方包括水和非水无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使配方与接受者的血液等渗的溶质；水和非水无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂和增稠剂。配方可以存在于单位剂量剂量或多剂量容器中。即时注射溶液和悬浮液可以从前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
本文所用的“治疗有效量”指药物组合物或方法中足以表现出有意义的患者有益效果，即治疗、愈合、预防或改善相关的医学症状、或增加这些症状的治疗、愈合、预防或改善速率的各活性成分的总量。当用于单独施用的单一活性成分时，术语指成分自身。当用于组合物时，术语指产生治疗效果的活性成分的组合量，不论是组合施用、依次施用或同时施用。通常，组合物将以100μg-10mg/kg体重、优选1μg-100μg/kg的单一剂量施用。该剂量可以每天、每周、每月、每年重复，或是由治疗医师考虑合适的剂量。
当本发明的治疗性药物的治疗有效量进行口服时，本发明的组合物可以是液体形式，组合物含有约0.5-90重量％的本发明蛋白质，优选约1-50重量％的本发明蛋白质。
当治疗有效量的本发明的治疗性药物通过静脉内、经皮或皮下注射施用时，蛋白质将是无致热原的、可非肠道施用的水溶液形式。具有适当pH、等渗性、稳定性等的这种可非肠道施用的蛋白质溶液位于本领域的技术范围之内。除了本发明的蛋白质之外，用于静脉内、经皮或皮下注射的优选组合物还应含有等渗赋形剂，如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸盐化的林格注射液，或本领域中公知的其他赋形剂。本发明的组合物还可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域中技术人员公知的其他添加剂。
使组合物和组织接触的局部施用适合于疱疹样皮炎。“接触”不仅指局部涂敷，还指将组合物引入到组织中或组织的细胞中的递送方式。
定时释放或持续释放递送系统的使用也包括在本发明中。在手术困难或不可能，如由于年龄或病程本身而虚弱的患者，或危险-效益分析指示为控制较治愈有利的情况下，这些系统是极为需要的。
本文所用的持续释放基质是由下列材料制成的基质，所述的材料通常是可以被酶降解或酸/碱水解或溶解的聚合物。一旦进入体内，基质就由酶或体液作用。持续释放基质需要选自生物相容性材料，如脂质体、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚原酸酯、多聚蛋白质、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、多聚氨基酸、诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸的氨基酸、多聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。优选的生物可降解基质是聚丙交酯、聚乙交酯或聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)中的一种基质。
本发明药物组合物中本发明的治疗性药物的量取决于待治疗疾病的性质和严重程度、患者以前所经历的治疗的性质。最后，主治医师来决定用来治疗各个体患者的本发明治疗性药物的量。首先，主治医师施用低剂量的本发明的治疗性药物，并观察患者的反应。然后施用较高的剂量，直到患者获得最佳的治疗效果，此时剂量不再增加。
使用本发明的药物组合物进行静脉治疗的持续时间依赖所治疗疾病的严重程度和各个体患者的状况和潜在的异质反应而变动。认为本发明的治疗性药物每次应用的持续时间为12-72小时的连续静脉内施用，速率为约30mg/小时。最后，主治医师确定使用本发明药物组合物进行静脉内治疗的合适持续时间。
实施例实施例1.构建带标签的IgA1蛋白酶使用含有编码流感嗜血杆菌IgA1蛋白酶的DNA序列的质粒pFG26进行基于PCR的定点诱变，使His标签与流感嗜血杆菌IgA1蛋白酶框架内融合。如图4所示，从pFG26产生了两个PCR片段。使用如下所示的寡核苷酸引物“HFD6His1”(引物1)和“HFD6His2”(引物2)产生了第一个片段，XbA 1和pml 1片段。使用如下所示的引物3和引物4产生了第二个片段，pmL I和Acc I片段。
引物2HFD-5XbaI5’GATCCGCTTACCAATTATGC 3’(SEQ ID NO20)引物2HFD6His15’CTTGGTACGCTAGGCACGTGATGATGATGATGATGAGGTGTTGTGATATTTGTCG-3’(SEQ ID NO21)引物2HFD6His25’-CCTAATAATATTCAAGCTCACGTGCCTAGCGTACC-3’(SEQ ID NO22)引物2HFD-F-ACCI5’-TTCAGCAGAAGTCTCTTGC-3’(SEQ ID NO23)通过PCR扩增2个片段后，将片段Xba I与Pml I或者Pml I与Acc I消化，并使用常规技术连接到亲本pFG26质粒的Xba I和Acc I位点上。通过DNA测序证实突变，新的质粒命名为pJQ/Rd6His。消化该片段，使6个组氨酸的DNA密码子置换IgA1蛋白酶中1007-1012位置上的原始密码子；asn-asn-ile-gln-ala-asp(SEQ IDNO24)。
实施例2.产生表达带标签的IgA1蛋白酶的细菌菌株通过常规的重组技术产生仅表达带标签的具有酶活性的IgA1蛋白酶的流感嗜血杆菌细菌菌株。简言之，将实施例1中产生的质粒pJQ/Rd6His用限制酶Cla I和NdeI切割。分离基因，并转化到产生不具有酶活性的IgA1蛋白酶的流感嗜血杆菌Rd菌株(Rd3-13)中(Plaut AG，Qiu，J，Grundy，F.and Wright，A.J Infect Dis.(1992)Jul；166(1)43-52)，以使得带His标签的IgA1蛋白酶通过重组插入到细菌基因组中。通过使用人IgA1作为底物验证选定克隆的细菌生长培养基中活性蛋白酶的存在来筛选恢复酶活性的细菌。
使用基因组DNA的PCR片段验证Pml I位点的存在来证实6-His突变向活性酶中的引入。该菌株命名为Rd 6His。
Rd 6His菌株具有和野生型菌株Rd相同的生长速率和菌落形态。IgA酶活性产量和酶大小与野生型没有区别。虽然将6His突变引入到距离自催化a位点2个氨基酸处，对于从细菌细胞的酶分泌和自身加工都不存在可检测到的问题。
经Western印迹分析，确定单克隆抗5His抗体(Qiagen，Inc)与蛋白酶结合。当在溶液中与单克隆抗体组合时，Rd 6His IgA蛋白酶保留有完全的活性。
实施例3可以在IgA肾病小鼠模型中验证IgA1蛋白酶用于治疗IgA肾病的治疗效果。
每个实验使用多只Swiss-Webster小鼠(Charles River Laboratories)，并分组(通常10只小鼠/组)。首先将小鼠置于代谢笼中，24小时收集尿液以测定尿液中血尿(尿中存在红细胞)和蛋白尿(尿中存在蛋白质)的量。这提供了正常健康小鼠中血尿和蛋白尿的基础值。然后如Gesualdo L.et al，(1990)J.Clin.Invest.86715-722中所述在小鼠中诱导IgA肾病。
诱导肾病后，对小鼠腹腔注射多剂量盐水(对照)、无活性IgA1蛋白酶(对照)、活性IgA1蛋白酶和复合有免疫球蛋白(如复合有抗标签抗体或抗IgA1蛋白酶抗体)的IgA1蛋白酶。示例性的给药方案包括腹腔注射0.1-0.5mg蛋白酶，每天2次，注射5天。剂量和给药方案可以根据小试实验中观察到的治疗效果，例如根据在一只小鼠上观察到的治疗效果而变动。通常，可以选择不激发组织或临床毒性作用的最大剂量。当IgA1蛋白酶复合有配基时，改变配基浓度以确定最有效的蛋白酶/配基比例。还可以改变施用方式，例如可以通过静脉注射进行施用。
施用最后一次剂量的治疗性药物1-24小时之后，通过测定不接受治疗性药物的小鼠中的血尿和蛋白尿来验证小鼠IgA肾病的缓解。与不接受治疗性药物的小鼠相比血尿和蛋白尿量向正常健康小鼠所观察到的值的减少指示为治疗成功。
还评价了IgA肾病的形态学指标。收集尿液后将小鼠处死，摘除肾脏以如所述那样测定(i)IgA1沉积，(ii)肾小球系膜基质的增生和(iii)肾小球系膜细胞增多的量。与不接受治疗性药物的小鼠中观察到的相比，i-iii参数的减小指示为治疗成功。
实施例4在疱疹样皮炎的小鼠模型中验证IgA1蛋白酶用于治疗疱疹样皮炎的治疗效果。
实施例5在亨诺赫-舍恩莱因紫癜的小鼠模型中验证IgA1蛋白酶用于治疗亨诺赫-舍恩莱因紫癜的治疗效果。
本文所引用的所有专利、专利申请和发表的文献的整体内容都通过引用并入本文。虽然参照本发明的优选实施方案具体说明并描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解在不背离所附权利要求书中包括的本发明范围的条件下，可以对其进行形式和细节方面的各种改变。
序列表<110>新英格兰医学中心医院有限公司安德鲁·G·普劳特仇家舟<120>IgA1沉积疾病的治疗<130>28154/2068<140>尚未转让<141>2004-03-05<150>US 60/453055<151>2003-03-07<160>26<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>25<212>PRT<213>人<400>1Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser1 5 10 15Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys20 25<210>2<211>13<212>PRT<213>流感嗜血杆菌<400>2Ile Thr Thr Pro Asn Asn Ile Gln Ala Asp Val Pro Ser1 5 10<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变的蛋白酶序列<400>3Ile Thr Thr Pro His His His His His His Val Pro Ser1 5 10<210>4
<211>1694<212>PRT<213>流感嗜血杆菌<400>4Met Leu Asn Lys Lys Phe Lys Leu Asn Phe Ile Ala Leu Thr Val Ala1 5 10 15Tyr Ala Leu Thr Pro Tyr Thr Glu Ala Ala Leu Val Arg Asp Asp Val20 25 30Asp Tyr Gln Ile Phe Arg Asp Phe Ala Glu Asn Lys Gly Arg Phe Ser35 40 45Val Gly Ala Thr Asn Val Glu Val Arg Asp Lys Asn Asn His Ser Leu50 55 60Gly Asn Val Leu Pro Asn Gly Ile Pro Met Ile Asp Phe Ser Val Val65 70 75 80Asp Val Asp Lys Arg Ile Ala Thr Leu Ile Asn Pro Gln Tyr Val Val85 90 95Gly Val Lys His Val Ser Asn Gly Val Ser Glu Leu His Phe Gly Asn100 105 110Leu Asn Gly Asn Met Asn Asn Gly Asn Ala Lys Ser His Arg Asp Val115 120 125Ser Ser Glu Glu Asn Arg Tyr Phe Ser Val Glu Lys Asn Glu Tyr Pro130 135 140Thr Lys Leu Asn Gly Lys Ala Val Thr Thr Glu Asp Gln Thr Gln Lys145 150 155 160Arg Arg Glu Asp Tyr Tyr Met Pro Arg Leu Asp Lys Phe Val Thr Glu165 170 175Val Ala Pro Ile Glu Ala Ser Thr Ala Ser Ser Asp Ala Gly Thr Tyr180 185 190Asn Asp Gln Asn Lys Tyr Pro Ala Phe Val Arg Leu Gly Ser Gly Ser195 200 205Gln Phe Ile Tyr Lys Lys Gly Asp Asn Tyr Ser Leu Ile Leu Asn Asn210 215 220His Glu Val Gly Gly Asn Asn Leu Lys Leu Val Gly Asp Ala Tyr Thr225 230 235 240Tyr Gly Ile Ala Gly Thr Pro Tyr Lys Val Asn His Glu Asn Asn Gly245 250 255Leu Ile Gly Phe Gly Asn Ser Lys Glu Glu His Ser Asp Pro Lys Gly260 265 270
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gcagaaaata aagggagatt ttctgttggt gcaacaaatg tggaagtgag agataaaaat 180aaccactctt taggcaatgt tttacctaat ggcattccga tgattgattt tagtgttgtg 240gatgtagata aacgcatcgc cacattgata aatccacaat atgtagtagg tgtaaaacac 300gttagtaacg gcgtgagtga actacatttt gggaacttaa atggcaatat gaataatggc 360aatgctaaat cgcaccgaga tgtatcttca gaagaaaata gatatttttc cgttgagaaa 420aatgagtatc caactaaatt gaatggaaaa gcagtaacta ctgaagatca aactcaaaaa 480cgccgtgaag actactatat gccacgtctt gataaatttg ttaccgaagt tgcaccaata 540gaggcttcaa ctgcaagtag tgatgctggc acatataatg atcagaataa atatcctgct 600tttgtaagac taggaagtgg tagtcaattt atttataaaa aaggagataa ttacagctta 660attttaaata atcatgaggt tggaggcaat aatcttaaat tggtgggcga tgcctatacc 720tatggtattg caggcacacc ttataaagta aaccacgaaa ataatggact aattggtttt 780ggcaattcaa aagaggaaca cagcgatcca aaaggaatat tatctcaaga tccgcttacc 840aattatgctg ttttaggcga cagtggctcc ccattatttg tatatgatag agaaaaagga 900aaatggcttt ttcttgggtc ttatgatttt tgggcaggtt ataacaaaaa atcttggcaa 960gaatggaata tttataaacc tgaatttgca aaaactgttc tagataaaga tactgcaggt1020tctttaactg gttctaacac ccaatacaat tggaatccta ctggcaaaac aagcgttatt1080tctaatggtt ctgaatctct aaatgttgat ttattcgata gtagtcagga tactgactct1140aagaagaaca atcacggaaa aagtgtgact cttagaggaa gtggaacgct taccttaaat1200aataatatcg atcaaggcgc aggcggcttg ttctttgaag gagattatga agttaaaggc1260acttctgata gtaccacttg gaaaggagct ggcgtttctg ttgctgatgg aaaaacagta1320acgtggaaag tacataaccc gaaatctgat cgtttagcta aaatcggcaa aggaacatta1380attgtagaag gaaagggaga aaataaaggt tcgctaaaag tgggcgatgg tactgttatc1440ttaaaacaac aagctgatgc caataataaa gttaaagcct tttcacaagt aggtatagta1500agtggtcgct caactgttgt acttaatgat gataagcaag tagatccaaa ttccatttac1560tttggcttta gaggtggtcg attagatgcc aatggcaata atctcacttt tgaacatatc1620cgtaatattg atgatggcgc aagactagta aatcacaata ccagcaaaac ctctactgta1680acaattactg gggaaagtct aattacagat ccaaatacaa ttactccata taatatagac1740gcaccagatg aagataatcc ttatgccttt cgacggatta aagatggagg acagctctat1800
ttaaatttgg aaaattacac ttattatgcg ttaagaaaag gtgcgagcac tcgttcagaa1860ttacctaaaa atagtggcga aagcaatgaa aattggctat atatgggtaa aacttccgat1920gaagccaaaa gaaatgtaat gaaccatatc aacaacgagc gtatgaatgg ctttaacggt1980tattttggcg aggaagaggg taaaaataac ggtaatctaa atgtgacttt taaaggcaaa2040agtgagcaaa atcgcttttt attaacaggc ggaacaaacc ttaatggcga tttaaaggtt2100gaaaaaggca cattattcct ttctggcaga ccaacaccgc acgcaagaga tattgcaggt2160atttcttcga caaaaaaaga tcaacacttt gctgaaaata atgaagtggt agtagaagat2220gactggatta accgcaattt taaagcaaca aatattaatg taaccaataa cgcaaccctt2280tattcaggtc gcaatgttgc aaacattact tcaaatatca cagcttctga taatgcaaaa2340gtacatattg gctataaagc aggcgatacc gtttgtgtac gttctgacta tacgggctat2400gtgacttgca ctactgacaa gttatccgat aaagccctta atagctttaa cgccaccaat2460gtatctggca atgtaaattt atcaggtaat gcaaactttg tcttaggcaa agctaactta2520ttcggcacaa ttagcggcac gggaaatagc caagtacgtt taaccgaaaa tagccattgg2580catttaacag gcgatagcaa tgttaatcag ttaaatttag acaaggggca tattcattta2640aatgcacaaa acgatgcaaa taaagtaact acatataaca cgctgactgt gaatagctta2700tcaggtaacg gttctttcta ttatttaact gatctttcca ataaacaagg cgacaaagtt2760gttgtaacta aatccgccac aggtaacttt acattacaag tggcagataa aacaggcgag2820cctacaaaaa atgaactcac gctttttgat gcgtcaaatg ctacaagaaa taatttgaat2880gtgtcattag ttgggaatac cgttgattta ggtgcttgga aatataaatt acgtaatgtt2940aatggacgtt acgatttgta taacccagag gtggaaaaaa gaaatcaaac tgtcgatacg3000acaaatatca caacacctaa taatattcaa gctgatgtgc ctagcgtacc aagtaacaat3060gaagaaatag cccgtgttga aacaccagtt ccaccacctg cgcctgctac accatcagag3120acaactgaaa cagtggctga aaatagtaag caagaaagta aaacagtaga gaaaaacgag3180caagacgcaa ccgagacaac agctcaaaat ggagaagttg cagaagaagc taaaccaagt3240gtaaaagcta atactcaaac aaatgaagtg gctcaaagtg gaagtgaaac cgaggaaact3300caaacgactg aaataaaaga aacagctaaa gtagaaaaag aggaaaaggc taaagtagaa3360aaagatgaaa ttcaagaagc acctcaaatg gcttctgaaa cgtctccgaa acaagcaaag3420cctgctccta aagaagtttc aactgatacg aaagtagaag aaactcaagt tcaagctcaa3480ccgcaaacac aatcgacaac tgttgctgcg gcagaggcaa cttcgccaaa cagtaaacca3540
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<223>异源肽标签序列<400>6His His His His His His1 5<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码异源肽标签序列的寡核苷酸<400>7caccatcacc atcaccat 18<2l0>8<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>异源肽标签序列<400>8Glu Gln Lys Leu Ile Set Glu Glu Asp Leu1 5 10<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码异源肽标签序列的寡核苷酸<400>9gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg30<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>异源肽标签序列<400>10Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5
<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>异源肽标签序列<400>12Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys1 5 10<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码异源肽标签序列的寡核苷酸<400>13tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aag 33<210>14<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>异源肽标签序列<400>14Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp1 5 10<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码异源肽标签序列的寡核苷酸<400>15
cagccagaac tcgccccgga agaccccgag gat33<210>16<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>异源肽标签序列<400>16Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr1 5 10<210>17<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码异源肽标签序列的寡核苷酸<400>17ggcaaaccaa tcccaaaccc actgctgggc ctggatagta ct 42<210>18<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>异源肽标签序列<400>18Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly1 5<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码异源肽标签序列的寡核苷酸<400>19gattacaaag acgatgacga taaagga 27<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于定点诱变的合成寡核苷酸
<400>20gatccgctta ccaattatgc 20<210>21<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于定点诱变的合成寡核苷酸<400>21cttggtacgc taggcacgtg atgatgatga tgatgaggtg ttgtgatatt tgtcg55<210>22<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于定点诱变的合成寡核苷酸<400>22cctaataata ttcaagctca cgtgcctagc gtac 34<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于定点诱变的合成寡核苷酸<400>23ttcagcagaa gtctcttgc19<210>24<211>6<212>PRT<213>流感嗜血杆菌<400>24Asn Asn Ile Gln Ala Asp1 5<210>25<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码异源肽标签序列的寡核苷酸<400>25atcacaacac ctaataatat tcaagctgat gtgcctagc 39
<210>26<211>39<212>DNA<213>流感嗜血杆菌<400>26atcacaacac ctcatcatca tcatcatcac gtgcctagc 39
权利要求
1.一种核酸分子，包含编码IgA1蛋白酶的第一DNA序列和编码标签的第二DNA序列，其中所述的第二DNA序列位于编码IgA1蛋白酶切割位点的DNA序列的上游。
2.一种分离的多肽分子，包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中所述的第一氨基酸序列包含IgA1蛋白酶，第二氨基酸序列包含标签。
3.权利要求1或2的分子，其中所述的标签特异性结合蛋白质配基。
4.权利要求3的分子，其中所述的蛋白质配基是抗体。
5.权利要求1或2的分子，其中所述的标签选自c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5和HIS。
6.一种用于治疗IgA1沉积的药物组合物，包含混合有抗体和药学上可接受载体的IgA1蛋白酶。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述的IgA1蛋白酶包含标签。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述的标签特异性结合配基。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述的配基是抗体。
10.权利要求7的药物组合物，其中所述的标签选自c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5和HIS。
11.权利要求6的药物组合物，其中所述的抗体是抗标签抗体。
12.权利要求11的药物组合物，其中所述的抗标签抗体选自抗HIS抗体、抗FLAG抗体、抗MYC抗体、抗VSV抗体、抗HA抗体和抗V5抗体。
13.一种治疗以IgA1沉积为特征的疾病的方法，包括向患者施用治疗有效量的IgA1蛋白酶。
14.一种治疗以IgA1沉积为特征的疾病的方法，包括向患者施用治疗有效量的权利要求2的多肽或权利要求6-12中任意一项的药物组合物。
15.权利要求13或14的方法，其中所述的疾病是IgA肾病。
16.权利要求13或14的方法，其中所述的疾病是疱疹样皮炎。
17.权利要求13或14的方法，其中所述的疾病是亨诺赫-舍恩莱因紫癜。
全文摘要
本发明公开了细菌IgA1蛋白酶在治疗组织和器官中IgA1沉积方面的用途。细菌IgA1蛋白酶特异性切割IgA1分子，从而提供了特异切割并除去IgA1沉积的方法。因此，提供了治疗以IgA1沉积为特征的疾病的治疗性药物。具体而言，公开了治疗IgA肾病、疱疹样皮炎(DH)和亨诺赫－舍恩莱因紫癜(HS)的治疗性药物。
文档编号A61K39/395GK1777673SQ200480006215
公开日2006年5月24日 申请日期2004年3月5日 优先权日2003年3月7日
发明者安德鲁·G·普劳特, 仇家舟 申请人:新英格兰医学中心医院有限公司