专利名称：粘液瘤病毒在治疗癌症和慢性病毒感染中的用途的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及粘液瘤病毒在治疗上的用途。
背景技术：
目前用于各种癌症的治疗方法经常通过毒害或杀死癌细胞而起作用。不幸的是，对癌细胞具有毒性的治疗方法一般对健康细胞也具有毒性。而且，有效治疗癌症的主要原因之一——肿瘤的异源性尚不清楚。目前的主流疗法(如化学疗法和放射疗法)倾向于在狭窄的毒力治疗范围内使用。由于肿瘤细胞各异和这些治疗方法的应用范围有限，据认为这些类型的治疗方法并不是有力的工具。
目前正在开发的现代抗癌疗法试图选择性地靶向肿瘤细胞，而对健康细胞具有更低毒性，据此更有可能使健康细胞不受到影响。
溶瘤疗法旨在利用肿瘤细胞与正常细胞间的细胞差异而实现治疗的一种方法。这种方法使用有复制能力、对肿瘤具有选择性的病毒载体作为抗癌剂。溶瘤病毒要么特异地靶向癌细胞而进行感染，要么与在健康细胞中复制相比，更适合在癌细胞中进行有效复制。这些有复制能力的溶瘤病毒是天然存在的，或者是经过基因工程改造而成为靶向异源肿瘤群的高选择性和高效性的工具。由于具有复制选择性的溶瘤病毒在正常细胞中不进行有效复制，所以特别是相对于传统疗法如放射疗法或化学疗法，对患者的毒性小。
大量研究已报道了各种病毒株的溶瘤活性，最有前景的溶瘤病毒是天然存在的或经基因修饰的腺病毒、单纯疱疹病毒1(“HSV1”)、呼肠孤病毒、痘苗病毒、水泡性口炎病毒(“VSV”)或脊髓灰质炎病毒。目前正在研究的作为抗癌剂的经修饰的溶瘤病毒包括HSV(单纯疱疹病毒)、腺病毒、新城疫病毒(“NDV”)、呼肠孤病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、VSV和脊髓灰质炎病毒。各种溶瘤病毒处于临床试验的第一或第二阶段，其中一些病毒显示出了稳定的功效。但是，不知道哪些病毒最符合持续复制、具有特异性和强溶解活性的溶瘤目的。完全有效的溶瘤病毒候选载体应该生命周期短、形成成熟病毒体快、能够在细胞间进行有效传播，并且具有便于插入的较大的基因组。同时，有证据表明，抑制早期先天性免疫应答和延缓Th1(辅助T细胞1)应答的发展对溶瘤疗法的效力至关重要。对于打算用于开发溶瘤病毒的许多病毒来说，从正常群体中所观测到的高水平的抗体和T细胞应答来测量，人类病毒显然是具有高度免疫原性的。
临床工作表明，目前的溶瘤病毒确实是安全的，但作为单一疗法的疗效还不足以具有完全的临床效果。由于经常观察到肿瘤细胞没有充分或有效受到感染，目前的动向是通过对候选病毒进行基因工程改造，以使其表达治疗性转基因，从而提高它们的效力。同时还正在结合其它常见的溶瘤疗法对大部分以上提到的溶瘤病毒进行测试。
腺病毒可以容易地进行基因操作，并且具有众所周知的与病毒蛋白相关的功能。另外，它与相当轻微的疾病有关。ONYX-015人类腺病毒(Onyx制药公司(Onyx Pharmaceuticals Inc.))是受试最广泛的针对临床应用进行了优化的溶瘤病毒之一。据信它优选在p53阴性肿瘤中复制，并且在头颈癌症患者的临床试验中展现出潜力。但是，有报道表明，ONYX-015只在14％的治疗患者中产生了客观性临床反应(Nemunaitis J、Khuri F、Ganly I、Arseneau J、Posner M、Vokes E、Kuhn J、McCarty T、Landers S、Blackburn A、Romel L、Randlev B、Kaye S、Kirn D。临床肿瘤学报(J.Clin.Oncol.)。2001年1月15日；19(2)289～298)。
WO96/03997和WO97/26904描述了可以抑制肿瘤细胞生长并对神经元细胞具有特异性的突变的溶瘤HSV。所述HSV的其它优点是其可以轻而易举地进行基因修饰，而且存在可以关闭任何不需要的病毒复制的药物。但是，这种共同的人类病原体的应用有限，这是因为很可能大量人群已经接触过该病毒，并获得了针对该病毒的免疫应答，这将削弱所述病毒的溶解效果。HSV还会导致严重的副作用或潜在的致命疾病。
III型呼肠孤病毒与相对轻微的疾病有关，并且它的病毒基因功能也已了解得相当清楚。溶瘤生物技术公司(Oncolytic Biotech)目前正在开发III型呼肠孤病毒由作为癌症治疗剂，该病毒在表达突变的ras癌基因的细胞中具有增强的复制特性，而且优先在PKR-/-细胞中生长(Strong J.E.和P.W.Lee。病毒学报(J.Virology)，1996，70612～616)。但是，难以对呼肠孤病毒进行基因操作，而且其病毒复制不易关闭。
VSV与相对轻微疾病有关，病毒基因功能也很清楚。WO99/04026披露了VSV在基因疗法中作为载体的用途，以表达治疗各种障碍的很多药物。但是，VSV存在与呼肠孤病毒同样的问题难以进行基因操作，病毒复制不易关闭。
痘苗病毒和脊髓灰质炎病毒是本领域描述的其它候选的溶瘤病毒，但与严重的或潜在致命疾病有关。
US4,806,347披露了干扰素γ和IFNγ片段对抗人类肿瘤细胞的用途。WO99/18799披露了在哺乳动物中治疗疾病的方法，在所述的哺乳动物中，病细胞具有干扰素介导的抗病毒应答缺陷，所述方法包括对所述哺乳动物施用治疗上有效量的干扰素敏感的有复制能力的克隆病毒。其具体披露了在干扰素存在的情况下，VSV病毒颗粒对肿瘤细胞具有毒性，但是VSV在正常细胞中的毒性降低。WO99/18799还披露，用干扰素处理肿瘤细胞，观察到了NDV诱导的敏感性，而将干扰素加到正常细胞，会使这些细胞抗NDV。这种方法的目的是通过用干扰素敏感病毒来感染细胞，使该细胞对干扰素敏感。
发明内容
一方面，本发明提供抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的方法，该方法包括对所述细胞施用有效量的粘液瘤病毒。
一方面，本发明提供治疗一种疾病状态的方法，该疾病状态的特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，所述方法包括对需要的患者施用有效量的粘液瘤病毒。
本发明进一步提供有效量的粘液瘤病毒在抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞中的用途，以及在制备用于抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的药物中的用途。
本发明进一步提供有效量粘液病毒在治疗患者的疾病状态中的用途，其中，所述疾病状态的特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，以及在制备用于治疗患者所述疾病状态的药物中的用途。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物含有粘液瘤病毒和药学上可接受的载体，该药物用于抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，和用于治疗特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的疾病状态。
另一方面，本发明提供含有粘液瘤病毒和说明书的试剂盒，该试剂盒用于抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，或用于治疗特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的疾病状态。所述疾病状态包括癌症和慢性病毒感染。
本发明进一步提供在患者中检测具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的方法，该方法包括对患者施用经修饰以表达可检测标记的粘液瘤病毒；在患者中使所述病毒感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞；和在患者中检测表达可检测标记的细胞。
本发明进一步提供在样品中检测具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的方法，该方法包括培养细胞；将所培养的细胞与粘液瘤病毒接触；和确定细胞受到对粘液瘤病毒感染的感染性。
本发明基于这样的意外发现兔粘液瘤病毒能够选择性地感染包括人类肿瘤细胞在内的细胞，所述细胞具有先天性抗病毒应答缺陷，并包括对干扰素非应答的细胞。在该上下文中使用的术语“先天性”描述了非抗原特异性免疫应答。由于粘液瘤病毒在人类正常细胞中不进行有效复制，所以所述病毒可用作各种病症和不适的治疗药物，例如，作为癌症的溶瘤治疗药物，所述病症和不适的特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，包括对干扰素非应答的细胞。所述病毒还可以用于鉴定具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，以及用于在体内显示这些细胞。
对于本领域普通技术人员，通过阅读以下对本发明具体实施方案的描述，并结合附图，本发明的其它方面和特征将变得显而易见。但应理解，说明本发明优选实施方案时的详细描述和具体实施例只为阐明而提供，原因在于从这些详细描述中，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
阐明本发明的实施方案的附图只是用于举例，其中图1是病毒感染细胞后诱导的干扰素介导的抗病毒信号转导系统的示意图；图2是非允许的WT鼠胚胎成纤维细胞(“MEFs”)在接触粘液瘤病毒后的相差显微照片，该照片显示在用中和抗体抑制干扰素α/β后MEFs变得允许；图3是显示在粘液瘤病毒感染后STAT1和STAT2的磷酸化状态(激活)的Western印迹，该Western印迹显示MEF细胞的非允许感染与STAT1和STAT2的激活相关联；图4是显示在粘液瘤病毒感染后STAT3、STAT4、STAT5和STAT6的磷酸化状态(非激活)的Western印迹，该Western印迹显示MEF细胞的非允许感染不会激活这些类型中的任何一种；图5是在粘液瘤病毒感染后，IFNα/βR-/-MEFs和STAT1-/-MEFs以及JAK1-/-MEFs和JAK2-/-MEFs的相差显微照片，该照片显示IFN/STAT/JAK信号转导的失活使得允许粘液瘤病毒对细胞的感染；图6是显示在粘液瘤病毒感染后在非允许野生型MEFs中PKR的磷酸化状态的Western印迹，该Western印迹显示PKR未被粘液瘤病毒感染激活；图7是显示PKR在模拟感染的或用粘液瘤病毒预感染的野生型MEFs中的磷酸化状态的Western印迹，该Western印迹显示粘液瘤病毒在MEF细胞中阻断了PKR的激活；图8是显示在粘液瘤病毒感染后PERK在野生型MEFs中的磷酸化状态的Western印迹，该Western印迹显示粘液瘤病毒在MEF细胞中阻断了PERK的激活；图9是显示在接触粘液瘤病毒后PKR-/-、RNase L(核糖核酸酶L)-/-或Mx1-/-敲除的相差显微照片，该照片显示在MEF细胞中通过不同途径介导抗病毒状态；图10是显示在接触粘液瘤病毒后PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-三重敲除的相差显微照片；图11是显示用抗IFNα/β的中和抗体处理并接触粘液瘤病毒后PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-三重敲除的相差显微照片；图12是显示用抗IFNα/β的中和抗体处理并接触粘液瘤病毒后，eIF2α和PKR在非允许MEFs中的磷酸化水平的Western印迹，该Western印迹显示eIF2α在非允许细胞中的磷酸化由独立于PKR的途径进行催化；图13是显示粘液瘤病毒感染后STAT1在PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-三重敲除中的磷酸化状态的Western印迹，该Western印迹显示正常的IFN诱导的信号转导应答；图14是阐明感染后(P.I.)12小时酪氨酸磷酸化的STAT1在非允许的PKR-/-、RNase L-/-或Mx1-/-细胞中的亚细胞定位的相差显微照片，该图像表明，正如对正常IFN/STAT信号转导应答所进行的预测那样，STAT定位于细胞核；图15是模拟感染的或用表达GFP的死粘液瘤病毒或活粘液瘤病毒感染的患有颅内神经胶质瘤的裸鼠大脑的荧光图片，该图片表明粘液瘤病毒靶向神经胶质瘤细胞；图16是用表达GFP的粘液瘤病毒(MV GFP)感染的鼠神经胶质瘤的薄切片的荧光图像和照片，该图像和照片显示粘液瘤病毒只在肿瘤细胞中复制；图17是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或结晶紫染色的HT29人类肿瘤细胞的相差显微照片，该照片显示在人类细胞中非允许感染的一个例子；图18是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或结晶紫染色的HOP92人类肿瘤细胞的相差显微照片，该照片显示人类细胞的允许感染的一个例子；
图19是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或结晶紫染色的OVCAR4人类肿瘤细胞的相差显微照片，该照片显示人类细胞的允许感染的一个例子；图20是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或结晶紫染色的SK-MEL3人类肿瘤细胞的相差显微照片，该照片显示人类细胞的允许感染的一个例子；图21是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或结晶紫染色的SK-MEL28人类肿瘤细胞的相差显微照片，该照片显示人类肿瘤细胞的半允许感染的一个例子；图22是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或结晶紫染色后的BGMK细胞的相差显微照片，该照片显示典型的作为对照的允许感染的一个例子；图23是用浓度升高的表达LacZ蛋白的粘液瘤病毒感染后，用X-Gal染色的阳性对照BGMK细胞和人类肿瘤细胞系U87、A172和U373的相差显微照片，该照片显示这些人类神经胶质瘤细胞对粘液瘤病毒复制都是允许的；图24是描述用浓度升高的粘液瘤病毒感染后72小时，BGMK、U87、A172和U373细胞的存活率的图示，该图示证明了粘液瘤病毒杀死所有这些细胞的能力；图25是用MV GFP感染的SF041 585星形细胞瘤细胞的相差显微照片和荧光显微照片，该相差显微照片和荧光显微照片显示了在原发性人类神经胶质瘤细胞中的感染；图26是用表达LacZ蛋白的粘液瘤病毒感染的U373神经胶质瘤细胞经X-Gal染色的相差显微照片，该相差显微照片显示了这些人类肿瘤细胞的感染；图27是描述用MV GFP感染后48小时，SF04 1585细胞的存活率的图示，该图示显示了对这些受感染的人类肿瘤细胞的杀死情况；图28是用表达GFP的粘液瘤病毒感染的Daoy和D384髓母细胞瘤系的荧光显微照片，该照片显示了这些人类肿瘤细胞的感染。
具体实施例方式
本发明人发现通常感染兔的粘液瘤病毒能够选择地感染和杀死具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞(包括人类细胞)，例如，对干扰素非应答的细胞。另一方面，粘液瘤病毒在人类正常细胞中不能进行有效复制。因为诸如癌症等很多疾病或不适的特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，包括对干扰素非应答的细胞，所以粘液瘤病毒可以用于治疗包括癌症在内的所述疾病和不适，并且对正常的健康细胞毒性低。粘液瘤病毒还可用于治疗慢性感染的细胞，因为这些细胞具有先天性抗病毒应答缺陷。例如，很多病毒编码基因产物，该产物的功能是抑制细胞的抗病毒性干扰素应答。粘液瘤病毒可以选择性地感染这些细胞。
粘液瘤病毒(“MV”)是在兔中引起粘液瘤病的病原体。MV属于DNA病毒中最大的痘病毒科的野兔痘病毒(Leporipoxvirus)属。MV在其天然宿主美洲棉尾兔中引起良性疾病。但是，它是烈性的且宿主特异性痘病毒，在欧洲兔中引起致命疾病，其特征是全身性病变，尤其是粘膜区域附近(Cameron C，Hota-Mitchell S、Chen L、Barrett J、Cao JX、Macaulay C、Willer D、Evans D、McFadden G，病毒学(Virology)，1999，264(2)298～318；Kerr P & McFadden G，病毒免疫学(ViralImmunology)，2002，15(2)229～246)。
MV病毒是一种具有163kb的双链DNA基因组的大病毒，该基因组在受感染的细胞的细胞质中复制(B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley编，病毒学，Lippincott Raven出版社，纽约，第二版，1996)。已知MV编码许多与细胞有关的分泌蛋白，该蛋白参与宿主免疫和炎性反应的下调以及对病毒感染细胞凋亡的抑制。MV可以被所有的人类体细胞吸收。但是，除了正常的兔体细胞外，如果所述细胞具有正常先天性抗病毒应答，所述病毒就不能有效感染所述细胞，意味着所述病毒不能复制和导致细胞死亡。
干扰素(“IFN”)是为应答各种刺激而分泌的细胞因子家族。干扰素结合到细胞表面受体，激活信号转导级联，该信号转导级联导致众多的细胞应答，包括抗病毒应答和生长抑制和/或凋亡信号的诱导。干扰素分为I型或II型。I型干扰素包括α干扰素、β干扰素、τ干扰素和ω干扰素，所有的都是单体；II型IFN只有IFNγ一种，为二聚体。IFNα的12种不同亚型由14个基因产生，但所有其它的干扰素都是单基因性的(Arduini等，1999)。干扰素通过调节癌基因表达来发挥直接的抗肿瘤活性。生长刺激性癌基因的过表达或肿瘤抑制物癌基因的丧失会导致恶性转化。p53、Rb、PC、NF1、WT1和DCC是涉及癌症发生的一些基因。
粘液瘤病毒和其它溶瘤病毒如呼肠孤病毒和VSV一样，都需要穿过正常健康细胞中所存在的抗病毒防护，才能在细胞中复制。MV和其它溶瘤病毒诱导干扰素的产生，一般对IFN途径的抗病毒作用敏感。由IFN抗病毒应答诱导的相关蛋白和主要影响病毒增殖的相关蛋白包括PKR、OAS合成酶和RNase L核酸酶。PKR激活eIF2α，导致抑制翻译和诱导凋亡。在图1中描述的是IFN应答途径的示意图。在正常细胞中，MV受到PKR和eIF2α的直接影响。
抗病毒应答途径在癌细胞中经常受到破坏。例如，对IFN应答的减弱或无效是在转化过程中或肿瘤发展中经常出现的遗传性缺陷。超过80％的肿瘤细胞系对干扰素不产生应答或应答受损(Stojdl等，癌细胞(Cancer Cell)，(2003)4263～275和其中所引用的参考文献；Wong等，生物化学学报(J.Biol Chem)(1997)272(45)28779～28785；Sun等，血液(blood)，(1998)91(2)570～576；Main等，癌症研究(CancerRes.)(2001)61(5)2261～2266；Balachandran等，癌细胞(2004)5(1)51～65)。发明人惊奇地发现MV能够感染和杀死癌细胞，包括人类肿瘤细胞，并且不受到任何特定理论的限制，据信MV能够感染这些细胞是因为这些细胞存在先天性抗病毒应答缺陷。
有证据表明，抑制早期先天性免疫应答和延缓Th1应答的发展对溶瘤治疗的效率是重要的。虽然粘液瘤病毒是一种烈性病毒，但是它具有宿主特异性，并且具有非常窄的宿主范围；它不感染人或鼠。不受任何具体理论的限制，据信因为粘液瘤病毒是非人类病毒，在人类中它应该没有遇到预先存在的免疫识别。因此，它作为溶瘤病毒的潜力将受到较少的损害；对允许性肿瘤细胞，粘液瘤病毒将提供比天然的人类病毒更有效的感染，据此可以为癌症提供有效的溶瘤治疗。
因此，在一个实施方案中，提供对具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞进行抑制的方法，该方法包括对所述细胞施用有效量的粘液瘤病毒。在一个实施方案中，所述细胞对干扰素不产生应答。
在具体实施方案中，所述细胞是哺乳动物癌细胞。在一个实施方案中，所述细胞是人类癌细胞，包括人类实体瘤细胞。
在另一个实施方案中，将所述细胞用病毒慢性感染。
在这里使用的术语“具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞”是指这样的细胞当接触病毒或被病毒侵入后，该细胞不诱导抗病毒防御机制(包括抑制病毒复制、产生干扰素、诱导干扰素应答途径和由或不由干扰素介导的凋亡)，并且因此所述细胞可以受到MV病毒的侵染。所述术语包括，相对于正常细胞(如没有受到感染的细胞或非癌细胞)，当与病毒接触或受病毒感染时具有减弱的或无效的先天性抗病毒应答的细胞。这包括对干扰素非应答的细胞，和凋亡反应或诱导凋亡途径减弱或无效的细胞。所述缺陷可能由多种原因引起，包括感染、遗传缺陷或环境影响。但应理解，当缺陷是由预先存在的感染引起时，可以不包括由MV引起的超感染，技术人员能够容易地鉴别这种情况。技术人员能够容易地利用适当实验检测任何特定细胞类型是否具有先天性抗病毒应答缺陷因而能够被粘液瘤病毒所感染。例如，VSV经常被用于检测细胞的抗病毒应答。
为了确定特定的细胞类型(如特定的癌细胞类型)是否具有先天性抗病毒应答缺陷，技术人员可以获取外植块，使其一些细胞在体外生长，并确定被VSV或替换性地，被粘液瘤病毒感染的感染性。
在整个说明书中所使用的术语“对干扰素非应答的细胞”意思是指这样的细胞，该细胞对干扰素活性如干扰素的抗病毒或抗肿瘤活性不产生应答，或者，该细胞不具有正常的干扰素应答，例如，减弱的或无效的干扰素应答，或者，该细胞例如用信号分子如转录因子(如STAT1)的磷酸化或激活进行检测具有不正常的干扰素信号转导。例如包括但不限于，没有经受增殖抑制的细胞，或当接触干扰素而没有被杀死的细胞，而所述干扰素的水平在可以对干扰素产生反应的细胞中足以引起所述反应。对干扰素非应答的细胞可能在胞内信号转导途径或在应答细胞中被正常激活的途径中存在缺陷。一般地，对VSV感染的易感性表明对干扰素非应答，技术人员可以容易检测特定细胞是有能力还是没有能力对干扰素产生应答，以在干扰素存在下抑制VSV感染，或者用本领域已知的其它干扰素活性标记，例如，表达水平的IFN刺激的基因如PKR、STAT、OAS、MX。
在整个说明书中所使用的术语“有复制能力”是指病毒能够在特定宿主细胞中感染和复制。
在这里使用的术语“细胞”包括单细胞，也包括多细胞或细胞群。对细胞施用药剂包括体外施用和体内施用。
在这里使用的术语“有效量”意思是以一定的剂量在一定时期内能有效获得所需结果所必需的量。
在这里使用的术语“动物”包括动物界的所有成员，包括人类。
术语“抑制”具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞包括通过溶解作用或凋亡引起的细胞死亡，或其它机制的细胞死亡，另外还包括使得所述细胞不能生长或分裂。
粘液瘤病毒可以是属于有复制能力的痘病毒的野兔病毒种的任何任何病毒。所述粘液瘤病毒可以是粘液瘤病毒的野生株系，或粘液瘤病毒的基因修饰株系。
使用技术人员已知的标准分子生物学技术，可以容易地对粘液瘤病毒基因组进行修饰以表达一种或更多种的治疗性转基因，例如Sambrook等((2001)分子克隆实验室手册(Molecular Cloninga LaboratoryManual)，第三版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour LaboratoryPress))中所述的技术。技术人员能够容易地确定粘液瘤病毒基因组的哪些部分可以删除，使得该病毒仍然可以进行有效感染。例如，通过将已公布的病毒基因组序列与其它已被充分表征的病毒基因组进行比较，可以推测出可切除的病毒基因组的非必要部分(例如参见C.Cameron，S.Hota-Mitchell，L.Chen，J.Barrett，J.-X.Cao，C.Macaulay，D.Willer，D.Evans和G.McFadden，病毒学(1999)264298～318)。
在这里使用的术语“治疗性基因”或“治疗性转基因”意欲广泛地描述任何基因，其表达可以影响所需的结果，例如，抗病毒效果。例如，对病毒进行修饰使其携带可以提高用该病毒治疗的抗癌效果的基因。这种基因可以是参与引发凋亡的基因，或参与靶向受感染细胞以进行免疫破坏，如修复干扰素应答缺陷的基因，或结果导致表达刺激抗体应答的细胞表面标记(例如细菌细胞表面抗原)的基因。所述病毒还可以被修饰，以表达参与关闭成瘤细胞或癌细胞的增殖和生长的基因，据此阻止所述细胞的分裂。同时，所述病毒还可以被修饰以包括治疗性基因，如参与化学治疗剂合成的基因，或者，所述病毒可以被修饰以在特定类型细胞如人类细胞中具有提高的复制水平，从所述类型细胞中衍生出欲抑制或杀死的细胞。可被插入粘液瘤病毒中以提高抗癌效果的基因的具体例子包括编码TRAK蛋白的人类基因或编码E4或f4多肽的腺病毒基因，两类基因的蛋白都参与杀死人类肿瘤细胞。
应该理解，粘液瘤病毒的治疗效果可以通过病毒对细胞的溶解或递送治疗性产物而获得。
可以通过本领域已知的标准技术制备病毒。例如，病毒可以用欲使用的粘液瘤病毒株感染所培养的兔细胞、使感染继续发展以使所述病毒在所培养的细胞中复制而获得，并可用本领域已知的破坏细胞表面的标准方法进行释放，从而释放用于采集的病毒颗粒。一旦采集之后，即通过感染兔细胞的汇合坪测定病毒的滴度，并进行噬菌斑检验(见Mossman等(1996)，病毒学21517～30)。
在一个方案中，提供了在需要治疗的患者中治疗特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的疾病状态的方法，该方法包括对所述患者施用有效量的粘液瘤病毒。所述患者可以是任何动物，包括哺乳动物，其中包括人类。
在这里使用的“特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的疾病状态”是指任何与具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞有关的、涉及该细胞的或以具有该细胞为特征的疾病、障碍或不适，并且可以通过杀死这些细胞而治疗所述疾病、障碍、不适或者其症状。例如，所述疾病状态可以是癌症。所述疾病状态也可以包括病毒慢性感染。
“治疗”疾病状态是指用于获得有益的或所需的结果，包括临床结果的方法。有益的或所需的结果可以包括但不限于，减轻或改善一种或更多种症状或不适、减小病症程度、稳定疾病状态、防止疾病发展、防止疾病传播、推迟或减缓疾病进程、推迟或减缓疾病的发作、改善或减轻疾病状态、以及(部分或完全)恢复，而无论该有益的或所需的结果是否可以检测得到。“治疗”还可以指延长患者的生存时间，该生存时间长于所预测的不经治疗的生存时间。“治疗”还可以指抑制疾病进程、暂时减缓疾病进程，尽管更优选地，包括持久地中止疾病进程。正如技术人员所理解的，如果一种治疗改善了特定的疾病状态，但这种治疗对治疗的患者产生的不利效果要胜过该治疗所获得的任何益处，则结果可能不是有益的或所需的。
在一个实施方案中，所述疾病状态是癌症。所述癌症可以是任何类型的癌症，其中，尽管不必是全部细胞，但至少有一些细胞具有先天性抗病毒应答缺陷。在一个实施方案中，所述癌症可以是其中至少有一些细胞是对干扰素非应答的癌症。在这里使用的术语“肿瘤”、“肿瘤细胞”、“癌症”和“癌细胞”(可以互换使用)是指表现出不正常生长的细胞，其特征为细胞增殖明显失去控制，或已经被无限增殖化的细胞。术语“癌症”或“肿瘤”包括转移性和非转移性癌症或肿瘤。在这里使用的“成瘤的”或“瘤”泛指增殖不具有正常生长抑制机制的一个细胞或多个细胞，因此包括良性肿瘤，还包括癌细胞和发育异常细胞或增生细胞。
癌症，包括恶性肿瘤的存在，可以用本领域普遍接受的标准进行诊断。
可以根据本发明进行治疗的癌症类型包括但不限于，包括白血病和淋巴瘤在内的造血细胞癌、结肠癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝细胞癌、胆管癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、黑素瘤和其它任何肿瘤。实体瘤如肉瘤和癌包括但不限于，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴样恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳突样腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾脏细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌和中枢神经系统肿瘤(如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听觉神经瘤、少突胶质细胞瘤、髓膜瘤(menangioma)、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
在另一个方案中，所述疾病状态是慢性病毒感染。
所述慢性感染病毒可以是任何在动物细胞中以持续方式长期进行感染和复制从而导致病理状态的病毒。所述慢性感染病毒可以是与癌的发展有关或相关的病毒。
病毒慢性感染可以通过本领域已知的标准方法进行诊断。例如，慢性病毒感染可以通过患者中抗病毒抗体的存在来检测，或者通过对患者细胞中病毒RNA或DNA的存在检测呈阳性来检测。
可使用标准的给药方法对患者施用所述病毒。在一个实施方案中，病毒的施用是系统给药。在另外一个实施方案中，通过在患处注射来施用病毒。在一个特定实施方案中，所述疾病状态是实体瘤，并且通过在肿瘤部位注射而施用病毒。在许多实施方案中，病毒的施用是通过口服或胃肠外给药进行，或者采用本领域已知的标准方法进行。
当给患者施用时，病毒的有效量是以一定的剂量在足够长的期间内，减轻、改善、缓和、改进、稳定、防止传播、延缓或推迟进程或治愈疾病所需要的量。例如，有效量可以是足以获得以下效果的量降低癌细胞或成瘤细胞的数目或将其破坏；或者降低病毒慢性感染细胞的数目或将其破坏；或者抑制所述细胞的生长和/或增殖。
对患者施用的有效量可以根据许多因素而变化，所述因素例如病毒的药效特性；给药方式；患者的年龄、健康状况和体重；疾病状态的性质和程度、治疗的频度、同时进行的治疗的类型(如果有的话)，以及病毒的毒性和滴度。
本领域技术人员可以基于上述因素决定适当的用量。根据患者的临床反应，病毒最初施用的适当数量可以按需进行调整。可以根据安全施用的最大病毒量和产生所需结果的最小病毒量，凭借经验决定病毒的有效量。
当对病毒进行系统给药时，为了使其临床效果与在患处注射病毒所获得的临床效果相同，需要施用明显更多的病毒量。但是，适当的剂量水平应该是能够获得所需结果的最小量。
待施用的病毒的浓度决定于欲施用的粘液瘤病毒特定株的毒性和目标细胞的性质。在一个实施方案中，对人类患者施用低于约109个空斑形成单位(“pfu”)的剂量。在各种实施方案中，可以施用约102pfu～约109pfu、约102pfu～约107pfu、约103pfu～约106pfu或约104pfu～约105pfu的单剂量。
根据最初治疗方式的效果，可以重复提供有效量的病毒。一般是周期性给药，同时监视所产生的任何反应。根据给药的时间表和所选择的给药途径，技术人员可以施用低于或高于如上所示的剂量。
所述病毒可以单独给药，或者结合其它治疗方法(包括化学疗法、放射疗法或其它抗病毒疗法)进行给药。例如，可以在外科手术切除原发性肿瘤之前或之后施用病毒，或者在放射疗法或传统化学治疗药物施用之前施用或同时施用或之后施用。在一个实施方案中，所述病毒可以与其它溶瘤病毒同时或顺次施用，所述其它溶瘤病毒可以针对不同的肿瘤细胞类型显示出特异性。
为了有助于给药，可以将所述病毒可以制成药物组合物的一个组分。因此，在另外的一个实施方案中，提供了含有粘液瘤病毒和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。因此，本发明一方面还包括所述药物组合物，该药物组合物用于抑制具有先天性抗病应答缺陷的细胞或治疗特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的疾病状态。所述药物组合物通常含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂和各种可兼容的载体。对于所有形式的递送，可以将所述重组病毒制备成生理盐溶液。
所述药物组合物可以还含有其它治疗剂，如抗癌剂。在一个实施方案中，所述组合物包含化学治疗剂。例如，所述化学治疗剂实质上可以是针对患者的癌细胞或成瘤细胞表现出的溶瘤效果的任何药剂和不抑制或不降低所述病毒杀死肿瘤效果的任何药剂。例如化学治疗剂可以是但不限于，蒽环霉素、烷化剂、烷基磺酸盐、吖丙啶、氮丙啶、甲基蜜胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素、含铂剂或细胞因子。优选地，所述化学治疗剂是已知的有效对抗癌细胞或成瘤细胞这些特定细胞类型的化学治疗剂。
药学上可接受稀释剂的比例和种类取决于所选择的给药途径、与活病毒的相容性和标准的制药惯例。一般地，药物组合物采用不显著影响所述活病毒生物特性的组分进行配制。
药物组合物可以通过已知制备方法进行制备，该已知制备方法适合制备给患者施用的药学上可接受的组合物，使得可以将有效量的活性物质与药学上可接受的载体结合成混合物。适合的载体，例如，在Remington的制药科学中进行了描述(Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)。基于此，所述组合物包括，但不限于，与一种或更多种药学上可接受的载体或稀释剂结合的病毒溶液，并含在具有适当pH的并与生理性液体等渗的缓冲液中。
本领域技术人员应当能够理解，根据所选择的给药途径，药物组合物可以以各种形式对患者施用。本发明所述组合物可以通过口服或胃肠外给药。胃肠外给药包括静脉内、腹膜腔内、皮下、肌内、穿过上皮、鼻内、肺内、鞘内、直肠和局部方式给药。可以通过在选定的一段时间内连续输入进行胃肠外给药。
所述药物组合物可以与惰性稀释剂或与可同化的载体一起口服施用，或者，其可以被包裹在硬的或软的壳状明胶胶囊中施用，或者压成片剂施用。对于口服治疗给药，所述病毒可以与赋形剂混合，并以可吸收片剂、含服片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂和薄片剂(wafers)等形式使用。
所述病毒溶液可以在生理学上适宜的缓冲液中制备。在普通的贮藏和使用条件下，这些制备物含有防腐剂，以防止微生物的生长，但所述防腐剂不能使所述活病毒失活。本领域技术人员应该知道如何制备适当的制剂。选择和制备适当制剂的传统工艺和组分在例如，在Remington的制药科学中和1999年出版的美国药典国家处方集(The United StatesPharmacopeiaThe National Formulary，USP 24 NF19)中进行了描述。
在不同实施方案中，所述组合物通过在诸如肿瘤部位等患处直接注射(皮下(subcuteanously)、静脉内、肌内等)进行施用，或者口服施用，作为选择的，经皮施用。
适合注射使用的药物组合物剂型包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌的可注射溶液或分散液的的无菌粉剂，其中，术语无菌不延及欲施用的活粘液瘤病毒本身。在所有的情况下，所述剂型必须无菌，并且流动性必须达到使其容易注射的程度。
欲使用的药物组合物的剂量取决于被治疗的特定疾病、疾病的严重性、患者的个体参数(包括年龄、身体条件、身高和体重)、疗程、同时进行的疗法的特性(如果有的话)、具体的给药途径，以及在保健人员的知识和专业技能范围内的其它类似因素。这些因素对本领域技术人员是已知的，并且可以通过少量常规实验获得。
所述粘液瘤病毒或含有粘液瘤病毒的药物组合物也可以包装成试剂盒，该试剂盒含有所述病毒的使用说明书，所述的使用包括，使用粘液瘤病毒来抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，或者，在需要的患者中，使用粘液瘤病毒来治疗特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的疾病状态。所述疾病状态可以是癌症，或者可以是慢性病毒感染。
本发明还考虑了粘液瘤病毒在抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞中的用途。在一个实施方案中，所述细胞对干扰素非应答。本发明还提供，在需要的患者中，粘液瘤病毒在治疗特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的疾病状态中的用途。在一个实施方案中，所述疾病状态是癌症。本发明还提供粘液瘤病毒在药物制备中的用途，所述药物用于抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞或在需要的患者中，治疗特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的疾病状态。
MV在除其天然宿主以外的动物中所具有的选择性感染先天性抗病毒应答缺陷的细胞的能力提供了MV在动物中检测具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞中的用途，所述细胞包括对干扰素非应答的细胞。否则，这些细胞可能不容易检测，例如，在动物中，还未发展成可触知的肿瘤或还未引起可察觉病症的某些癌细胞。
因而，在一个实施方案，本发明提供了在患者中检测具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的方法，该方法包括对所述患者施用经修饰以表达可检测标记的粘液瘤病毒；在患者中使所述病毒感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞；和在患者中检测表达所述可检测标记的细胞。
可以使用使诊断图像可视化的任何传统方法检测感染的细胞。所述检测方法取决于所使用的特定的可检测标记。例如，可以使用荧光数字成像显微镜检测被经过基因修饰以表达荧光蛋白的粘液瘤病毒感染的细胞。其它方法包括计算机控制X线断层摄影术(CT)、全身扫查如正电子发射X线断层摄影术(PET)、磁共振成像(MRI)和超声波检查法。熟练技术人员能够决定用于检测特定可检测标记的适当方法。
可检测标记包括但不限于，任何标记，其用于表达或合成的基因可以插入粘液瘤病毒基因组中，以在被经修饰的病毒感染的细胞中表达或合成所述标记。例如，在一个实施方案中，可检测标记可以是荧光蛋白。对患者施用所述修饰病毒后，以适当的时间间隔检测被感染的细胞，以使病毒感染任何具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，并使可检测标记在所述细胞中的表达达到可检测的水平。例如，可以在对患者施用经基因修饰以表达荧光蛋白的病毒后2～20天的任何时候进行检测。
检测方法可以在患者中间断性地重复进行，以在所述患者中监测具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的存在。例如，检测施用粘液瘤病毒的所述细胞的方法，如有必要，可以按6个月、1年或2年的间隔在患者中进行，这取决于具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的特性和由所述细胞在患者中的存在所导致的任何疾病状态的特性。重复所述方法一段时间，以监测疾病状态的发展或缓解，或疾病在患者体内的扩散。
粘液瘤病毒能够选择性感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，并且可以在细胞中用作所述缺陷的指示物。因此，用本发明的方法，可以对从患者中取出的细胞进行先天性抗病毒应答缺陷检测。当与其它指示物结合时，这种检测可以指示患者可能患有特定的疾病状态，例如，癌症。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了在样品中检测具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的方法，该方法包括培养所述细胞；使所培养的细胞与粘液瘤病毒接触；以及检测细胞受到粘液瘤病毒感染的感染性。
所述细胞可以通过已知活组织检查方法从包括人类在内的研究对象中取得。所述活组织检查方法决定于待检细胞的所在部位和类型。
按照已知培养技术培养细胞，并通过往培养基中加入活病毒而与MV接触。感染复数(“MOI”)可因特定细胞类型的最佳MOI、密度和培养技术而异，使用已知的接触MV后会被感染的细胞培养物作为阳性对照。
所培养的细胞被MV感染的感染性可以通过技术人员已知的各种方法，包括MV对细胞的致死能力进行检测。也可以包括将试剂加入所述细胞培养物，以完成其与病毒表达产物的酶促或化学反应。所述病毒表达产物可以由插入到MV基因组中的报告基因来表达。
在一个实施方案中，可以将MV进行修饰，以使对感染状态的检测变得容易。例如，可以对MV进行基因修饰以表达标记，该标记可通过相差显微术、荧光显微术或放射成像而容易地进行检测。所述标记可以是参与比色反应或放射标记反应的表达后的荧光蛋白或表达后的酶。在另一个实施方案中，所述标记是破坏或抑制受检细胞特定功能的基因产物。
在这里引用的所有参考文献以参考的方式完全引入。
实施例病毒株所使用的病毒株包括野生型MV、经修饰以表达绿色荧光蛋白(“GFP”)或β-半乳糖苷酶(“LacZ”)的MV，以及被杀死(“死”)的MV。用标准技术对病毒进行制备和滴定。
细胞系利用小鼠胚胎成纤维细胞(“MEFs”)进行小鼠试验，所述小鼠胚胎成纤维细胞来自野生型小鼠和经以下敲除的小鼠IFNα/β受体纯合敲除、STAT1纯合敲除、PKR杂合敲除、RNase L杂合敲除、Mx1杂合敲除、PKR/RNase L/Mx1三重纯合敲除。
以BGMK对照细胞和人类肿瘤细胞系进行人类试验，所述人类肿瘤细胞系为HT29、HOP92、OVCAR4、OVCAR5、SK-MEL3、SK-MEL28、M14、SKOV3、PC3、DU145、CAKI-1、786-0、T47D、MDAMB 435、SF04、U87、A172、U373、Daoy和D384，如Stojdl等所述(癌细胞(CancerCell)，(2003)4263～275)。
方法一般地，分析和试验如Lalani等在病毒学(1999)256233～245和Johnston等在病毒学报(2003)77(13)7682～7688中所述进行。
对于体内小鼠研究，将人类颅内神经胶质瘤U87植入裸鼠。植入后15天，用活的或死的MV GFP对小鼠进行肿瘤内注射，滴度为5×106，或进行模拟感染。感染后72小时，杀死动物，取出大脑，埋入最佳切温复合物(Optimal Cutting Temperature compound，OCT)，切制冷冻切片。通过荧光显微术可以看到整个大脑切片中的粘液瘤病毒-GFP。然后固定切片，并用H&E(苏木精和曙红)染色，使肿瘤可视化。
对于人类肿瘤细胞分析，手术一结束即进行肿瘤胰蛋白酶化(trypsonized)并铺板，第二天，用病毒进行感染，MOI为0.1、1.0或10。在感染后24小时和48小时，分别用相位显微镜术和荧光显微术收集有关细胞毒性和病毒表达的数据。利用黄色四唑盐MTT进行检测，以定量感染后48小时、72小时或96小时的细胞存活率％(为模拟感染存活的细胞的百分比)。
用10M.O.I的粘液瘤病毒-GFP感染人类小儿髓母细胞瘤细胞系Daoy和D384。感染后72小时，用MTT检测细胞的生存能力。
小鼠细胞系的感染以前研究表明，用趋化因子受体转染的某些小鼠3T3细胞克隆可以被粘液瘤病毒感染，而其它克隆则不能。为了研究粘液瘤病毒在其它小鼠细胞中的趋向性是否取决于任何特定受体，发明人研究来自野生型(WT)小鼠和各种基因敲除小鼠的初级小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。
因为IFN在准备进行抗病毒应答中起关键作用，所以发明人假定，限制性表型与IFN介导的“抗病毒状态”有关。用抗体中和循环的IFN，或者产生IFN受体阴性小鼠或信号转导胞内途径基因缺失了的小鼠，而破坏IFN系统的事件链，将严重损害宿主对粘液瘤病毒的抗性，所述粘液瘤病毒一般不感染正常小鼠细胞。
为了检验这种假设，发明人需要证明粘液瘤病毒在非允许细胞中的非感染性是否是因为IFN的抗病毒作用。对敲除了一种或多种参与胞内IFN信号转导应答的蛋白的各种MEF细胞类型进行检验，以了解MV感染对IFN途径的影响。
对初级MEFs进行的实验证明，野生型(“WT”)MEFs没有被粘液瘤病毒感染。当通过用抗IFNα/β的中和抗体阻断IFN途径时，完全可以用粘液瘤病毒感染MEFs(图2)。但是，与抗IFNγ中和抗体接触的MEFs仍然保持非允许。这就总体上说明了IFNα/β，而不是IFNγ，在为粘液瘤病毒体外感染MEFs创造允许环境中的重要性。在文献中已经确定了不同的IFNα/β和IFNγ胞内信号转导途径。但是，与所培养的成纤维细胞不同，IFNα/β和IFNγ均可能在被感染的宿主中起重要作用。发明人推测，在IFNα/β和/或IFNγ途径中存在缺陷的人类肿瘤将对粘液瘤病毒的体内感染是易感性的。
发明人测定了STAT1和STAT2在MV感染的非允许WT MEFs中的活性。在图3中显示的结果表明，STAT1和STAT2被激活。进一步研究表明，STAT3、STAT4和STAT5没有被激活(图4)。
为了确定IFNα/β胞内途径在保持MEFs非允许状态中的重要性，进行基因缺失研究，以使IFNα/β受体和胞内级联受到破坏。进行IFN受体或JAK1或STAT1的基因缺失。用MV感染WT MEFs、IFNα/βR-/-MEFs和STAT1-/-MEFs。IFNα/βR-/-MEFs和STAT1-/-MEFs对MV是允许的，证明IFNα/β和STAT1的信号转导级联对MV感染是关键的(图5)
蛋白激酶R(PKR)是在众多细胞中受到IFNα/β的诱导的酶。这种激酶，在dsRNA(双链RNA)存在时，经受自体磷酸化作用，然后磷酸化多个细胞蛋白，包括真核蛋白合成起始因子(eIF-2α)，该真核蛋白合成起始因子的磷酸化可以诱导对蛋白翻译的抑制和凋亡。PKR还指示RNase L的激活。发明人检测了MV感染后PKR在非允许MEFs中的激活。在建立了良好的抗病毒状态的非允许MEFs中，PKR未被磷酸化(图6)。而且，MV感染抑制了PKR的磷酸化(图7)。另外，粘液瘤病毒感染后，PERK(与PRK类似，ER激酶)在初级WT MEFs中未被磷酸化(图8)。
用MV感染PKR、RNase L或Mx1单基因敲除的MEFs(图9)。发现PKR、RNase L或Mx1对保持对于粘液瘤病毒感染的非允许性是非必需的。为了进一步确认PKR、RNase L或Mx1的非必需性，进行PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-的三重敲除。PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-的三重敲除并未有助于粘液瘤病毒的感染(图10)，但是，用抗干扰素α/β的中和抗体处理PKR、RNase L和Mx1三重KO(三重敲除)的MEFs，对粘液瘤病毒感染变得允许(对比图10和图11)。这些实验证明，PKR、RNaseL和Mx1对于介导MEFs对MV的允许性不是必需的。
为了检测MV感染后，eIF-2α和PKR在非允许的野生型MEFs和允许的IFNα/βR-/-MEFs和STAT1-/-MEFs中的激活，进行了进一步的实验。MV感染后，尽管PKR在允许的和非允许的MEFs中未被磷酸化，但eIF-2α在两种情况下均被磷酸化(图12)。这证明没有PKR和PERK的参与，抗病毒状态由另外导致eIF2α磷酸化的途径介导。
粘液瘤病毒感染非允许的PKR、RNase L和Mx1三重敲除后的MEFs后，STAT1同时受到丝氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸化(图13)。还显示了粘液瘤病毒感染后，酪氨酸磷酸化的STAT1在非允许PKR-/-+RNase L-/-+Mx1-/-MEFs中的亚细胞定位(图14)。
总之，这些结果表明，平行的PKR/PERK独立的涉及IFN/STAT1的抗病毒途径对痘病毒趋向性是关键的。而且，eIF2α磷酸化是IFN抗病毒作用最好的标记。
人类肿瘤研究发明人在体内系统中研究了MV感染人类肿瘤细胞的能力。用人类神经胶质瘤细胞注射裸鼠，随后形成颅内神经胶质瘤。活病毒能够感染这些人类肿瘤细胞，但不感染周围细胞(图15)。在图16中显示来自GFP的荧光信号定位于肿瘤。
假设许多人类肿瘤对干扰素非应答，并且，与在正常人类细胞所发现的IFN信号级联相比，肿瘤细胞没有正常的IFN信号级联，发明人进行了研究以探索粘液瘤病毒对人类肿瘤的影响。结果概括如下。
最初，使用粘液瘤病毒来研究对各种对照和人类肿瘤细胞系BGMK、HT29、HOP92、OVCAR4、SK-MEL3和SK-MEL28的感染性和胞溶作用。MV显示出各种感染性和胞溶效果HT29(图17)、HOP92(图18)、OVCAR4(图19)、SK-MEL3(图20)、SK-MEL28(图21)和BGMK(图22)。
对其它肿瘤细胞进行了检验，以下表1将所检验的各种肿瘤类型分为非允许、允许或半允许。半允许表示，相对于允许细胞系，粘液瘤病毒是可以中度感染的。
表1粘液瘤病毒对人类肿瘤细胞的趋向性
随着MV-LacZ浓度的上升，各种人类肿瘤系对感染所显示出的反应也不一样。例如，U373细胞需要更高的病毒滴度才能获得U87在低滴度即获得的杀死细胞的水平(图23和图24)。粘液瘤病毒有效地感染星形细胞瘤细胞(图25)和神经胶质瘤细胞(图26)。粘液瘤病毒在感染后48小可有效杀死人类星形细胞瘤细胞和小儿髓母细胞瘤细胞(图27和图28)。
本领域技术人员应当理解，可以对这里所描述的示例性实施方案进行许多修改。而本发明包括如权利要求书所限定范围内的所有这样的修改。
权利要求
1.一种抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的方法，该方法包括对所述细胞施用有效量的粘液瘤病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是对干扰素非应答的。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述细胞显示出不正常的干扰素信号转导。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述细胞为哺乳动物癌细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述细胞为人类癌细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒为野生型病毒。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒是经过基因修饰的。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒经过基因修饰以表达治疗性基因。
9.如权利要求6所述的方法，其中，所述细胞是肺癌细胞、黑素瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肾癌细胞、神经胶质瘤细胞或星形细胞瘤细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是受到病毒慢性感染的人类细胞。
11.一种治疗疾病状态的方法，所述疾病状态的特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，所述方法包括对需要的患者施用有效量的粘液瘤病毒。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述疾病状态为癌症。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述癌症为实体瘤。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述癌症为造血细胞癌、结肠癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝细胞癌、胆管癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌或黑素瘤。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述造血细胞癌为白血病或淋巴瘤。
16.如权利要求12所述的方法，其中，所述癌症为肺癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肾脏癌、神经胶质瘤或星形细胞瘤。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述患者为人类。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒为野生型病毒。
19.如权利要求17所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒是经过基因修饰的。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒经过基因修饰以表达治疗性基因。
21.如权利要求18所述的方法，其中，所述病毒通过注射而施用到癌症部位。
22.如权利要求18所述的方法，其中，对所述病毒进行系统施用。
23.如权利要求18所述的方法，其中，施用的所述病毒少于109pfu。
24.如权利要求23所述的方法，其中，施用的所述病毒为约102pfu～109pfu。
25.如权利要求11所述的方法，其中，所述疾病状态为慢性病毒感染。
26.有效量的粘液瘤病毒在抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞中的用途。
27.有效量的粘液瘤病毒在药物制备中的用途，所述药物用于抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。
28.如权利要求26或27所述的用途，其中，所述细胞是对干扰素非应答的。
29.如权利要求28所述的用途，其中，所述细胞显示出不正常的干扰素信号转导。
30.如权利要求26～29任一项所述的用途，其中，所述细胞为哺乳动物癌细胞。
31.如权利要求30所述的用途，其中，所述细胞为人类癌细胞。
32.如权利要求31所述的用途，其中，所述细胞是肺癌细胞、黑素瘤细胞、肾癌细胞、神经胶质瘤细胞或星形细胞瘤细胞。
33.如权利要求26～32任一项所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒为野生型病毒。
34.如权利要求26～32任一项所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒是经过基因修饰的。
35.如权利要求34所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒经过基因修饰以表达治疗性基因。
36.如权利要求26或27所述的用途，其中，所述细胞受到病毒的慢性感染。
37.有效量的粘液瘤病毒在治疗患者的疾病状态中的用途，其中，所述疾病状态的特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。
38.有效量的粘液瘤病毒在药物制备中的用途，所述药物用于治疗患者的疾病状态，其中，所述疾病状态的特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。
39.如权利要求37或38所述的用途，其中，所述疾病状态为癌症。
40.如权利要求39所述的用途，其中，所述癌症为实体瘤。
41.如权利要求39所述的用途，其中，所述癌症为造血细胞癌、结肠癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝细胞癌、胆管癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌或黑素瘤。
42.如权利要求41所述的用途，其中，所述造血细胞癌为白血病或淋巴瘤。
43.如权利要求39所述的用途，其中，所述癌症为肺癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肾脏癌、神经胶质瘤或星形细胞瘤。
44.如权利要求37或38所述的用途，其中，所述疾病状态为慢性病毒感染。
45.如权利要求37～44任一项所述的用途，其中，所述患者为人类。
46.如权利要求37～45任一项所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒为野生型病毒。
47.如权利要求37～45任一项所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒是经过基因修饰的。
48.如权利要求47所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒经过基因修饰以表达治疗性基因。
49.一种含有粘液瘤病毒和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于治疗特征为存在具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的疾病状态。
50.如权利要求49所述的药物组合物，其中，所述疾病状态为癌症。
51.如权利要求50所述的药物组合物，其中，所述癌症为实体瘤。
52.如权利要求50所述的药物组合物，其中，所述癌症为造血细胞癌、结肠癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝细胞癌、胆管癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌或黑素瘤。
53.如权利要求52所述的药物组合物，其中，所述造血细胞癌为白血病或淋巴瘤。
54.如权利要求50所述的药物组合物，其中，所述癌症为肺癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肾脏癌、神经胶质瘤或星形细胞瘤。
55.如权利要求54所述的药物组合物，该药物组合物还含有治疗剂。
56.如权利要求55所述的药物组合物，其中，所述治疗剂为化学治疗剂。
57.如权利要求54所述的药物组合物，该药物组合物适合于在肿瘤部位注射。
58.如权利要求49所述的药物组合物，其中，所述疾病状态为慢性病毒感染。
59.一种含有粘液瘤病毒和说明书的试剂盒，该试剂盒用于抑制具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。
60.如权利要求59所述的试剂盒，其中，所述细胞是对干扰素非应答的。
61.一种含有粘液瘤病毒和说明书的试剂盒，该试剂盒用于在需要的患者中治疗癌症。
62.一种含有粘液瘤病毒和说明书的试剂盒，该试剂盒用于在需要的患者中治疗慢性病毒感染。
63.一种在患者中检测具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的方法，该方法包括对患者施用经修饰以表达可检测标记的粘液瘤病毒；在患者中使病毒感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞；以及在患者中检测表达可检测标记的细胞。
64.一种在样品中检测具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞的方法，该方法包括培养所述细胞；将所培养的细胞与粘液瘤病毒接触；以及确定细胞受到粘液瘤病毒感染的感染性。
全文摘要
本发明涉及粘液瘤病毒的治疗用途。粘液瘤病毒可以选择性地感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，包括对干扰素非应答的细胞，并且粘液瘤病毒可以用于治疗特征为存在所述细胞的疾病，包括癌症。
文档编号A61P31/00GK1756563SQ200480006172
公开日2006年4月5日 申请日期2004年3月8日 优先权日2003年3月7日
发明者格兰特·麦克菲登, 约翰·C·贝尔 申请人:罗巴斯研究机构