专利名称：一株指示牛泡沫病毒感染的细胞系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测牛泡沫病毒(bovine foamy virus，BFV)感染的细胞系，以及该细胞系的建立方法和它的具体应用。
背景技术：
在指示细胞系出现以前，细胞培养中病毒感染的识别方法主要有观察细胞病变法、空斑试验、中和试验、免疫荧光、代谢抑制、红细胞吸附、干扰现象等。病毒在敏感细胞中繁殖，常可引起细胞代谢等方面的变化，可出现细胞病变并释放病毒至培养基中，这种情况可用细胞病变、色变法及检测培养基中病毒抗原的方法，判定病毒的存在和滴度。但这种方法测定的病毒滴度依赖实验者的肉眼观察，不同实验者可能得出不同的结果。
泡沫病毒属反转录病毒科，具有广泛的宿主范围却至今未发现其致病性，是良好的基因转移载体骨架。在泡沫病毒感染的细胞中，许多并不发生形态上的变化，不能通过细胞病变效应(CPE)方法检测其感染状态。
指示细胞系的出现大大丰富了病毒检测的手段，同时也大大提高了病毒检测的效率和灵敏性。病毒感染细胞后，刺激一些报告基因的表达，且表达量与病毒感染性成一定比例，通过测定他们的表达量可以达到检测病毒感染性大小的目的。
在泡沫病毒的研究中，为人泡沫病毒(HFV)建立的指示细胞系最多。已报道的共有三株，报告基因分别为lacZ，luc和egfp。分别用于Bet蛋白对于感染性影响的研究，病毒复制策略的研究，病毒种属之间交叉感染的研究和冻融与保存温度对于病毒感染性的维持之间关系的研究。猫泡沫病毒(FeFV)建立的指示细胞系，应用于细胞嗜性以及病毒复制的研究。可以看到，指示细胞系的应用已经渗透到各个与病毒感染性相关的领域。
近年来泡沫病毒的研究虽有很大的进展，但大部分集中于灵长类泡沫病毒，包括牛泡沫病毒在内的非灵长类泡沫病毒的分子生物学研究只是刚刚起步，至今未见牛泡沫病毒构建基因转移载体的报道。
发明内容本发明的目的是提供一株可以特异性指示牛泡沫病毒感染的细胞系及其应用。
该细胞系可以在BFV感染的特定条件下表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)，从而可以通过检测该蛋白的表达来间接指示牛泡沫病毒的感染。
本发明提供的指示牛泡沫病毒(BFV)感染的细胞系，已于2007年03月28日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市海淀区中关村中科院微生物研究所内)，其保藏号为CGMCC No.1989。
该指示细胞系的构建过程如下首先将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的全长基因插入到一种由牛泡沫病毒基因组中分离得到的特异应答牛泡沫病毒反式激活因子的应答元件之下游，构建成一个可以应答牛泡沫病毒感染的报告质粒；之后，采用脂质体的方法将该质粒转染BHK-21细胞，转染后第二天，细胞进行1∶5传代，同时在培养基中加入600μg/ml的G418，一星期后细胞开始大量死亡，到第14天对照孔细胞全部死亡，至20天，细胞开始成簇生长，此时生长的细胞即为细胞基因组中已经整合了质粒的阳性克隆；待细胞长满后将细胞冻存一部分，另一部分用于单克隆化；经过初筛后，进行单克隆操作，通过功能上的鉴定(实施例2)而得到质粒完全整合的细胞系；将剩余的细胞利用1/2有限稀释法进行单克隆化；经过3次单克隆操作，最终筛选到无本底表达但经过病毒攻击后EGFP表达量高的阳性克隆即为牛泡沫病毒BFV感染的指示细胞系。
该细胞系的确定方法如下将该细胞系与感染了BFV的胎牛肺细胞(fetal bovine lung，FBL)进行共培养，共培养时按照1∶10的稀释倍比接入BFV感染的FBL，在培养48小时后观测EGFP的表达情况；当该细胞系对病毒的刺激产生反应，EGFP的表达量明显升高，则为本专利所述的指示牛泡沫病毒感染的细胞系。
该指示细胞系可用于对不产生CPE的病毒感染的检测，对低病毒滴度感染的检测，对BFV的体外宿主细胞范围的检测，对感染性克隆的感染性的检测，对病毒随时间产生情况的检测，以及对BFV的复制策略的检测。
本发明的有益效果构建可以检测病毒感染性的细胞系具有以下意义(1)通过指示细胞系对BFV感染性的指示作用，将其应用于不同细胞中BFV的表达情况以及复制策略的探讨，有助于全面了解泡沫病毒的分子生物学特性，推动泡沫病毒分子生物学的基础研究。
(2)FV作为反转录病毒中唯一的不致病性病毒，可以作为其它反转录病毒研究工作的“工具”。如筛选抗反转录病毒感染的药物，可以在FV中利用指示细胞系对感染性的检测进行初筛，从而降低研究的安全风险。
(3)BFV的天然宿主-牛是具有重要经济价值的大型哺乳动物，所以BFV为骨架构建载体具有很高的经济潜力。指示细胞系可以检测BFV改造载体的基因转移效率，为构建高校转移载体奠定基础。
具体实施方式实施例一指示细胞系的制作首先将EGFP蛋白的全长基因插入到一种由牛泡沫病毒基因组中分离得到的特异应答牛泡沫病毒反式激活因子的应答元件下游，构建成一个可以应答牛泡沫病毒感染的报告质粒。(注EGFP基因来自商业化的质粒pEGFP-N1，牛泡沫病毒反式激活因子的应答元件为我实验室自行分离得到，其序列见附表。)之后，采用脂质体的方法将该质粒转染BHK-21细胞，转染后第二天，细胞进行1∶5传代，同时在培养基中加入600μg/ml的G418。一星期后细胞开始大量死亡，到第14天对照孔(未转染的正常细胞)细胞全部死亡。至20天，细胞开始成簇生长，此时生长的细胞即为细胞基因组中已经整合了质粒的阳性克隆。待细胞长满后将细胞冻存一部分，另一部分用于单克隆化。
经过初筛后，存活下的细胞中含有一部分假阳性，即只有neo基因整合入基因组的细胞。因此需要进行单克隆操作，通过功能上的鉴定(实施例2)而得到质粒完全整合的细胞系。
将剩余的细胞利用1/2有限稀释法进行单克隆化。经过3次单克隆操作，最终筛选到无本底表达但经过病毒攻击后EGFP表达量高的阳性克隆即为BFV的指示细胞系。
注EGFP蛋白为一种可以在490nm激发光下可自发地发射内部荧光的蛋白，因此可以方便的在荧光显微镜下检测到该蛋白是否得到了表达。
实施例二指示细胞系的确定将该细胞系与感染了BFV的胎牛肺细胞(fetal bovine lung，FBL)进行共培养，共培养时按照1∶10的稀释倍比接入BFV感染的FBL，在培养48小时后观测EGFP的表达情况。
如果该细胞系对病毒的刺激产生反应，EGFP的表达量明显升高，则为本专利中的牛泡沫病毒感染指示细胞系。
实施例三指示细胞系与CPE方法的比较传统的病毒测定是基于细胞病变，其中一种经典的方法就是TCID50(Tissue CultureInfectious Dose 50％)，即50％组织细胞感染量的测定。在泡沫病毒滴度的测定中，这种方法被广泛应用，直到指示细胞系的出现。
BFV3026与FBL共培养，待细胞出现典型的核胞体后，将细胞用0.25％胰酶消化，分成等份。将FBL(P10)和指示细胞系分别按1×104细胞铺96孔板，按照1∶10的稀释倍比接入BFV3026感染的FBL。从第二天开始每天观测细胞病变(FBL)和绿色荧光蛋白的表达情况，一直记录到病毒维持最高滴度。指示细胞系检测到的最大滴度出现在感染后5天，而基于细胞病变的检测到的最大滴度出现在感染后8-9天。此外，指示细胞系检测到的病毒滴度要比病变检测到的病毒滴度高2个数量级，即前者是后者的100倍。由此可见，BICL(牛泡沫病毒指示细胞系，BICL)方法比CPE的方法更灵敏。
将被感染细胞用冻融裂解的方法得到病毒裂解液，用以10倍为梯度将病毒储液稀释后分别进行CPE的测定和指示细胞系的测定，每天记录，BICL检测到的最大滴度出现在感染后6天，而基于CPE的检测到的最大滴度出现在感染后8天。而且，BICL检测到的病毒滴度要比CPE检测到的病毒滴度高2个数量级，即前者是后者的100倍。因此在裂解液的滴度检测中，BICL检测仍然在时间和灵敏性上优于CPE方法。
实施例四指示细胞系对于不产生CPE的病毒感染的检测对于可以产生CPE的FBL细胞，指示细胞系在测量BFV感染上灵敏性要比传统的基于病变的方法高约100倍。而BFV在大部分细胞中，尤其是非天然宿主细胞中并不能引起细胞病变，而是形成一种潜伏性的感染。由于形成这种感染的细胞在外形上与普通细胞差别不大，所以对于这种细胞中病毒的含量，传统的CPE方法无法检测。
在之前BFV感染性的研究中，研究者利用PCR的方法检测到293T和HeLa中BFV为潜伏性感染。由于指示细胞系对于病毒的检测灵敏性较高，因此我们利用指示细胞系检测了在293T和HeLa细胞中病毒的感染情况，FBL为正对照。将BICL细胞按2×105细胞/孔铺六孔板，同时按1∶10的比例将BFV感染的FBL，293T以及HeLa细胞接入BICL细胞中。两天后，用倒置荧光显微镜分别观测可见光视场下和紫外视场下的细胞形态。对应FBL，293T和HeLa细胞的绿色荧光细胞百分比分别为9.93±1.04，1.70±0.39和1.90±0.50。
由结果可见，在FBL中病毒表达情况最好，这与只有在FBL中才能出现CPE现象相吻合。这说明，相比CPE，指示细胞系可以正确且更加准确的显示病毒在不同细胞中的表达能力大小。
实施例五指示细胞系对于低病毒滴度感染的检测在PFV(原型泡沫病毒，PFV)的研究中，研究者发现，即使在一些可以产生病变的细胞中，当病毒加入的量少或者毒力较弱的情况下，细胞也有可能只发生潜伏性感染而不产生病变。在BFV3026的研究中，冻融裂解被感染细胞，用裂解液再去感染新鲜的FBL时，产生的就是潜伏性感染。这与前面得出的裂解液感染细胞的病毒滴度要远小于共培养时活细胞中病毒的滴度这一结论相吻合。
在细胞裂解液感染细胞的病毒滴度要远远小于共培养直接感染的情况下，上清中含有的病毒颗粒更加难以检测。在本实验室前期工作中，尝试了将病毒感染的细胞上清加入到正常FBL细胞中观测病变，20天未见到核胞体的出现。在指示细胞系之前，没有一种有效的方法可以检测到上清中BFV3026病毒颗粒的存在。
在FBL细胞中培养BFV3026，至出现核胞体。取1ml上清，经0.22μm滤膜过滤后加入到BICL中(六孔板，2×105细胞/孔)，每天观测EGFP表达情况。感染后4天开始看到EGFP的表达。可以看到相对负对照，EGFP有少量表达，说明上清中存在着BFV3026病毒颗粒。这表明利用指示细胞系可以检测到潜伏性感染中病毒颗粒的存在。
实施例六指示细胞系用于检测BFV的体外宿主细胞范围在本室前人的实验中曾经检测过BFV3026的宿主范围，对于不能引起病变的细胞，研究者利用RT-PCR(反转录聚合酶链反应，RT-PCR)的方法成功的检测到了细胞中感染了BFV3026。然而这种方法并不能对于病毒表达的高低做一个描述。我们选择了一些不同物种具有代表性的细胞，利用指示细胞系检测了BFV3026在这些细胞中的表达情况。
利用FBL培养病毒，出现核胞体后收集细胞，将其分成等份用于不同细胞的感染。感染方式采用共培养的方式。病毒加入各个细胞六天后，利用前文介绍的测量TCID50的方法测量各个细胞中病毒的滴度。
在所有被测细胞中，无论是来自人，牛，鼠或者猴的细胞，都可以被BFV3026感染，病毒的表达情况略有不同。前人的实验结果显示，FBL和CV-1细胞被BFV3026感染后可以引起细胞病变。在我们得到的数据中可以看到，在FBL中病毒的表达最好，TCID50滴度达到105.5。其他不能引起病变的细胞中BFV3026的表达均在102左右，要比FBL低3个数量级左右。在CV-1细胞上，虽然可以出现核胞体，但是表达情况相对较低。由此，BFV3026虽然具有广泛的宿主范围，但是还是在来自天然宿主的细胞中表达最好。
实施例七指示细胞系用来指示感染性克隆的感染性感染性克隆质粒进入细胞后，可以转录出病毒感染必须的早早期蛋白Borf-1。然而长期检测的结果却不尽人意，在FBL中转染过量pCMV-BFV质粒后，两周依然不能看到或者极少情况下观测到CPE的出现。
前面提到我们利用指示细胞系检测了在293T和HeLa细胞中病毒的感染情况，FBL为正对照。因为同样不能引起细胞CPE，本文利用指示细胞系对于转染了pCMV-BFV后的细胞产生病毒的情况进行了检测。
选择FBL细胞，以及可以潜伏性感染的293T和HeLa细胞系进行检测，用5μg pCMV-BFV瞬时转染三种细胞。4天后将BICL细胞按2×105细胞/孔铺六孔板，同时按1∶10的比例将被转染的三种细胞分别接入BICL细胞中。两天后，用倒置荧光显微镜观测紫外视场下细胞表达EGFP情况。同时，利用计数的方法记录表达了绿色荧光蛋白细胞所占百分比。对应FBL，293T和HeLa细胞的绿色荧光细胞百分比分别为2.52±0.78，1.62±0.40和1.33±0.47。
前者BFV共培养实验中三种细胞之间BFV表达的比例约为5.8∶1∶1.1，而在转染实验中，三者的比例变为1.6∶1∶0.82。这是由于FBL的转染效率要小于293T与HeLa的转染效率，因此转染同样质粒的前提下，最终进入三种细胞的感染性质粒就有所区别，即进入FBL细胞的pCMV-BFV质粒较少。考虑到这一点，两种情况下的结果是相吻合的。
无论病毒是来自共培养的病变细胞还是感染性质粒，指示细胞系检测到的FBL，293T和HeLa之间的病毒表达差异相符，显示了指示细胞系检测系统良好的重复性。但是可以看到转染过量质粒pCMV-BFV后，细胞并不引起病变，而且在共培养条件下绿色荧光细胞百分比只有BFV3026病毒引起的1/4。因此感染性偏低，并不能作为构建载体的骨架。
实施例八利用指示细胞系检测病毒随时间产生情况为了检测BFV在细胞中的感染情况，用不同滴度的BFV3026以共培养的方式感染1×105BICL细胞。并分别在感染后的第2、3、4和5天利用流式细胞仪记录被感染细胞中表达绿色荧光蛋白的细胞所占百分比。实验设未感染的等量FBL细胞加入BICL细胞为负对照。
结果表明在被测的时间内，病毒在细胞内不断产生而导致病毒滴度的上升。对于同时所做的pCMV-BFV感染的实验，细胞在转染后2-3天病毒滴度上升较快，这是由于细胞在被转染后，瞬时大量表达蛋白。而经过3-4天的“休眠”后，包装出的假病毒开始感染新的细胞，表达绿色荧光蛋白的细胞增多。可见，指示细胞系可以灵敏的检测到FBL细胞中BFV3026产生的情况，以及质粒pCMV-BFV进入细胞后瞬时表达到产生病毒的过渡。
实施例九利用指示细胞系检测BFV的复制策略在PFV和FeFV的研究中，研究者发现虽然FV属于反转录病毒，但是在FV成熟颗粒中却发现了几乎和RNA等量的DNA。既然如此，这些DNA起到什么作用呢？存在DNA的情况下，反转录的发生会不会产生什么变化呢？这些问题最终借由指示细胞系和FV的反转录抑制剂AZT得到解决。研究者最终发现FV中反转录是必须的，但与经典的正反转录病毒不同，反转录发生在病毒复制周期晚期。
BFV在进化分类上与PFV相差较远，那么在BFV中是否存在同样的现象呢？本文利用BICL检测了三种细胞中不同时间加入AZT对于BFV的感染性影响，从而验证在BFV中，反转录是病毒完成生活周期必须的，而且发生在周期晚期。
在FBL中培养病毒，待核胞体出现后，等量的病毒按1∶10被分别加入到2×105的FBL，293T和HeLa中。这些细胞或者同时加入25μM AZT处理48小时或者不经AZT处理。之后用BICL中GFP+的细胞百分比反映BFV3026在这些细胞中感染性的变化(BICL细胞用AZT预处理24小时或者不处理)。
当AZT不存在条件下，在三种细胞中病毒复制情况良好，48小时后都能检测到病毒的产生；当病毒产生和检测环境都存在AZT的条件下，病毒的产生被抑制；当病毒产生于不存在AZT的条件下，而检测的BICL经过AZT处理时，BFV的感染性略有下降；当病毒产生于AZT环境下，而检测时BICL不经AZT处理时，BFV的感染性几乎下降为0。
可见，与传统的正反转录病毒不同，BFV病毒感染BICL并不受AZT的抑制作用，而病毒在侵入细胞后，如果细胞存在AZT，病毒不能顺利地从细胞中包装成病毒。也就是说，病毒进入细胞后，先表达病毒所需的蛋白，如Borf-1，这样就可以激活BICL上的LTR，从而检测到EGFP。在这之后，病毒的装配之前才需要反转录，所以在实验IV中BFV的感染被完全的抑制。这与PFV和FeFV研究中得到的结论相符，从而也佐证了指示细胞系检测系统的可靠性。
序列表<110>南开大学<120>一株指示牛泡沫病毒感染的细胞系及其应用<160>1<210>1<211>975<212>DNA<213>牛泡沫病毒(Bovine foamy virus(BFV)sp.)<400>1cggaggattg gctggagtgt gaggaagata gtgagaatga agaactcagt 50gtttctcccc tcacaggctg ggagcctcat agagacttaa aaaagtgggt 100aaatttcgcc ctaccttatg gatggagcct tatggacccg ctaggtaatc 150gtttcaggtc ccagaggaaa gatgattccg atgaatccac tagtacggat 200tctgaagagg agttacaaga aatacagcag atcaaccccg ctgaagtagg 250gccaagcagg cctcccggcg ggtactctaa gctgcgcagg cgccgtcggg 300ttccagctgc tcgactttac gcaactacag acagtagtga agaagacctg 350gatctgaaga catctcaata aggagctgga ctgtttgaga tctgtgtgtg 400attacattgt attaagatag cctgttactg gggttcggag gatggctcat 450caagctagta aggagctccc tgaagccata tccgaggctc agtagaaaga 500cagtacctcg cctgtgtggg ttcgaggtca ggcggtatgc tttctacttt 550ttagatgtat aactagaaga ataaggttaa ggagatgctt tttaaataga 600tagcttaggg agtaagttag atagcttaaa gaacaagtta actgcaagta 650tcgcttatgc tcagaatcag gaagtagctt gcgtcaccag ttatagagaa 700ataagagctt gaaagttaac cgcaacatag gatgtgagtc atagctattt 750tagtaagtta gcgcttggga actgagagaa caaggttcgg atcccatatc 800attataataa aatatatctt gtataagtag ttagcttact gtaaaagggg 850ggaattattg ggaatcccat attgtaggaa aagtcagttg gataaggata 900taaaaccctt agactgtaag gaaggaggag ctcttgaatc ggctgcgccc 950gtgagagatc tgacttccag gctgt97权利要求
1.一株指示牛泡沫病毒感染的细胞系，其保藏号为CGMCC No.1989。
2.根据权利要求1所述的指示牛泡沫病毒感染的细胞系，其特征是该细胞系的构建过程如下首先将增强型绿色荧光蛋白的全长基因插入到一种由牛泡沫病毒基因组中分离得到的特异应答牛泡沫病毒反式激活因子的应答元件之下游，构建成一个可以应答牛泡沫病毒感染的报告质粒；之后，采用脂质体的方法将该质粒转染BHK-21细胞，转染后第二天，细胞进行1∶5传代，同时在培养基中加入600μg/ml的G418，一星期后细胞开始大量死亡，到第14天对照孔细胞全部死亡，至20天，细胞开始成簇生长，此时生长的细胞即为细胞基因组中已经整合了质粒的阳性克隆；待细胞长满后将细胞冻存一部分，另一部分用于单克隆化；经过初筛后，进行单克隆操作，通过功能上的鉴定而得到质粒完全整合的细胞系；将剩余的细胞利用1/2有限稀释法进行单克隆化；经过3次单克隆操作，最终筛选到无本底表达但经过病毒攻击后增强型绿色荧光蛋白EGFP表达量高的阳性克隆即为牛泡沫病毒感染的指示细胞系。
3.一种权利要求1所述的指示牛泡沫病毒感染的细胞系的应用，其特征是该指示细胞系用于对BFV感染性的指示，即用于对不产生CPE的病毒感染的检测，对低病毒滴度感染的检测，对BFV的体外宿主细胞范围的检测，对感染性克隆的感染性的检测，对病毒随时间产生情况的检测，以及对BFV的复制策略的检测。
全文摘要
一株指示牛泡沫病毒感染的细胞系及其应用。该细胞系可以在BFV感染的特定条件下表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，从而通过检测该蛋白的表达来间接指示牛泡沫病毒的感染。该细胞系(其保藏号为CGMCC No.1989)的构建过程首先将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的全长基因插入到一种特异应答牛泡沫病毒反式激活因子的应答元件下游，构建成一个可以应答牛泡沫病毒感染的报告质粒；之后，采用脂质体的方法将该质粒转染BHK－21细胞，转染后第二天，细胞进行1∶5传代，并加入G418进行筛选，一星期后细胞开始大量死亡，至20天，细胞开始成簇生长，经过初筛后，将细胞利用1/2有限稀释法进行单克隆化操作，最终筛选到无本底表达但经过病毒攻击后EGFP表达量高的阳性克隆即为BFV的指示细胞系。
文档编号C12Q1/04GK101058802SQ20071005715
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月17日 优先权日2007年4月17日
发明者乔文涛, 马喆, 郝朋, 陈启民, 耿运琪 申请人:南开大学