关于鉴定和使用靶向癌症干细胞的试剂的方法

专利名称：关于鉴定和使用靶向癌症干细胞的试剂的方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴定靶向癌症干细胞的化合物和组合物的方法。在某些方面，本 发明涉及使用特异性靶向癌症干细胞的化合物和组合物的治疗方法，用于抑制有此需要的 受试者中的癌症干细胞生长和/或存活。本发明的其他方面涉及癌症干细胞生物标记在用 于抑制有此需要的受试者中的癌症干细胞生长和/或存活的治疗选择中的用途。
背景技术：
癌症可以起于许多遗传和后生改变，其引起控制细胞迁移、增殖、分化和生长的机 制中的缺陷。近期发现已证实肿瘤形成和生长通过在肿瘤内称为癌症干细胞的较小癌细胞 亚群驱动。癌症干细胞(CSCs)是在肿瘤团块内的细胞，其具有种植且产生次级肿瘤的能 力，且负责转移散布的癌症死亡率的主因。这个概念对于潜在癌症治疗的开发和临床前评 估具有重大牵涉。发明概述癌症干细胞(CSCs)驱动肿瘤的长期生存。常规癌症治疗虽然在根除大块肿瘤方 面是成功的，但对隐伏的CSCs —般是较不有效的。由这些恶性细胞显示出的选择性药物抗 性促成癌症中的显著发病率和死亡率。此外，CSCs在动物模型中具有以有限稀释种植肿瘤 的能力。因此，需要特异性且选择性靶向CSCs的药物的需要。然而，几个因素限制了有效 鉴定此类药物的能力。关键限制是获得和维持CSCs培养物中的困难，所述CSCs培养物在 分离时分化且停止繁殖。因此，开发靶向这个恶性亚类的药物候选物仍是癌症生物学家正 在进行的挑战。本发明的一些方面基于用于鉴定新型治疗剂的方法的发现和开发，所述新型治疗 剂靶向癌症干细胞。在本发明的特定方面，靶向癌症干细胞的疗法的发现通过高流通量筛 选方法来达到。在本发明的其他方面，公开了特异性靶向癌症干细胞的化合物。因此，本发 明公开了通过高流通量筛选方法鉴定的癌症干细胞靶向疗法及其用途。根据本发明的一个方面，提供了用于测试化合物抑制癌症干细胞生长和/或存活 的能力的方法。该方法包括(a)使一种或多种测试细胞与化合物的样品接触，其中一种或 多种测试细胞已经历上皮至间质转变，和(b)检测通过化合物的一种或多种测试细胞的生长和/或存活的抑制水平。在某些实施方案中，上皮至间质转变起因于抑制一种或多种测试细胞中的E-钙 粘蛋白活性。在某些实施方案中，抑制一种或多种测试细胞中的E-钙粘蛋白活性包括使一 种或多种测试细胞与针对E-钙粘蛋白的封闭抗体接触，诱导一种或多种测试细胞中的抗 粘附蛋白表达，或干扰一种或多种测试细胞中的细胞极性基因。在某些实施方案中，抑制一 种或多种测试细胞中的E-钙粘蛋白活性包括使一种或多种测试细胞与和E-钙粘蛋白mRNA 互补的小干扰核酸接触。在某些实施方案中，上皮至间质转变起因于诱导一种或多种测试细胞中的转录因 子活性，其中所述转录因子选自:SnailU Snail2、Goosecoid、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-I/ Zeb-2, dEFl/ZEbl、LEFl、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、H0XB7、SIM2s 和 Fos。在某些实施方案中，上皮至间质转变起因于诱导TWIST的活性。在某些实施方案 中，诱导一种或多种测试细胞中的TWIST活性包括使一种或多种测试细胞与编码TWIST的 表达载体接触。在某些实施方案中，上皮至间质转变起因于使一种或多种测试细胞与选自下述的 生长因子接触TGF- β /BMP超家族成员、Wnt家族成员、FGF家族成员、Notch配体、EGF家 族成员、IGF家族成员、PDGF和HGF。在某些实施方案中，上皮至间质转变起因于调节一种或多种测试细胞中的信号途 径活性，其中所述信号途径选自 TGF-β、Wnt、BMP、Notch、HGF-Met, EGF, IGF、PDGF, FGF, P38-mapk、Ras> PI3Kinase_Akt、Src 禾口 NF_kB。在某些实施方案中，上皮至间质转变起因于对一种或多种测试细胞实施选自 下述的应激缺氧、照射和长期化学疗法治疗。在某些实施方案中，上皮至间质转变起 因于对一种或多种测试细胞实施用烟碱或活性氧生产者例如过氧化氢(H2O2)的处理。 (参见例如，Dasgupta 等人 Nicotine induces cell proliferation, invasion and epithelial-mesenchymal transition in a variety of human cancer cell lines. Int J Cancer. 2009 年 1 月 1 日；124(1) :36-45 和 Lim 等人 Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma :methylation of the E-cadherin promoter.Gastroenterology. 2008 年 12 月；135(6) :2128-40,2140. el-8. Epub 2008年7月31日.)。在某些实施方案中，上皮至间质转变起因于对一种或多种测试 细胞实施用nAChR激动剂、C3a或MFG-E8的处理。(参见例如，Tang Z，等人，C3a mediates epithelial-to-mesenchymal transition in proteinuric nephropathy, J Am Soc N 印 hrol. 2009年 3 月；20(3) :459-60 Jinushi M，等人，Milk fat globule EGF-8 promotes melanoma progression through coordinated Akt and twist signaling in the tumor microenvironment, Cancer Res. 2008 ^ 11 ^ 1 H ；68 (21) :8889-98.)在某些实施方案中，一种或多种测试细胞包括非致瘤性细胞。在某些实施方案中，一种或多种测试细胞在经历EMT后已变为致瘤性的。在其他 实施方案中，一种或多种测试细胞在经历EMT前已变为致瘤性的。在某些实施方案中，该方法包括(a)使一种或多种测试细胞和一种或多种对照细 胞与化合物的样品接触，其中一种或多种测试细胞已经历上皮至间质转变，并且一种或多 种对照细胞未经历EMT，(b)检测通过化合物的一种或多种测试细胞和对照细胞的生长和/或存活抑制水平；和(C)如果化合物对测试细胞的生长和/或存活具有比对照细胞更大的 抑制作用，那么鉴定化合物为候选CSC选择性化学治疗剂。在特定实施方案中，测试细胞和 对照细胞是遗传上匹配的。在某些实施方案中，测试细胞表达或包含抑制E-钙粘蛋白表达 的小干扰RNA，并且对照细胞不表达此类RNA。在某些实施方案中，该方法进一步包括使一种或多种对照细胞与化合物的样品接 触，并且检测通过化合物的一种或多种对照细胞的生长和/或存活抑制水平。在某些实施 方案中，一种或多种对照细胞是未经历上皮至间质转变的上皮细胞。在特定实施方案中，使 一种或多种对照细胞与对照表达构建体或对照小干扰核酸接触。在某些实施方案中，对照 小干扰核酸不靶向一种或多种对照细胞的内源基因，任选地其中所述小干扰核酸靶向GFP mRNA。在某些实施方案中，对照表达构建体编码GFP蛋白质或报道蛋白质。在某些实施方 案中，一种或多种对照细胞包括非致瘤性细胞。在其他实施方案中，一种或多种对照细胞包 括致瘤性细胞。在该方法的某些实施方案中，与至少一种其他测试细胞比较，一种或多种测试细 胞各自与不同剂量的化合物接触，和/或与化合物接触不同持续时间；和/或其中与至少一 种其他对照细胞比较，一种或多种对照细胞各自与不同剂量的化合物接触，和/或与化合 物接触不同持续时间。在特定实施方案中，该方法进一步包括分析测试和/或对照剂量应 答曲线，其中测试剂量应答曲线指示通过在多个剂量下的化合物的一种或多种测试细胞抑 制水平；并且其中对照剂量应答曲线指示通过在多个剂量下的化合物的一种或多种对照细 胞抑制水平。在某些实施方案中，分析包括测定化合物对于一种或多种测试细胞和/或一 种或多种对照细胞的EC50值。在特定实施方案中，化合物对于一种或多种对照细胞的EC50 值在统计上明显小于化合物对于一种或多种测试细胞的EC50值。在其他实施方案中，化合 物对于一种或多种对照细胞的EC50值在统计上明显大于化合物对于一种或多种测试细胞 的EC50值。在某些实施方案中，化合物是对照化合物，任选地选自多柔比星、紫杉醇、放线菌 素D、喜树碱和星形孢菌素。在某些实施方案中，一种或多种对照细胞和一种或多种测试细胞在共培养中。在 特定实施方案中，一种或多种测试细胞具有鉴定特征，其是可检测的并且不同于一种或多 种对照细胞的鉴定特征，任选地其中所述鉴定特征包括GFP蛋白质和/或癌症干细胞生物 标记的表达水平。在某些实施方案中，使一种或多种测试细胞中的GFP蛋白质表达水平与 一种或多种对照细胞中的GFP蛋白质表达水平比较。在某些实施方案中，该方法进一步包 括监控一种或多种测试细胞与一种或多种对照细胞的比，通过检测共培养物样品中每种细 胞的鉴定特征，任选地其中所述检测包括荧光激活细胞分选。在某些实施方案中，该方法进一步包括测试多个测试样品，其中所述测试样品各 自包括一种或多种测试细胞中的至少一种；和/或进一步包括测试多个对照样品，其中所 述对照样品各自包括一种或多种对照细胞中的至少一种。在某些实施方案中，每种测试样 品和/或每种对照样品在分开的培养小室中，任选地其中每个培养小室是多孔平板的孔。 在某些实施方案中，多孔平板具有选自6、12、24、96、384或1536的孔数目。在某些实施方案中，化合物得自由多种化合物组成的文库，任选地其中所述文库 选自天然产物文库、多样性文库、激酶抑制剂文库、HDAC抑制剂文库、已知生物活性化合物文库、肽文库、抗体文库或RNAi文库。在特定实施方案中，接触一种或多种测试细胞包括将 化合物的样品从文库转移到包含测试样品的培养小室；和/或其中接触一种或多种对照细 胞包括将化合物的样品从文库转移到包含对照样品的培养小室。在某些实施方案中，该方 法进一步包括鉴定对于一种或多种测试细胞比一种或多种对照细胞基本上更有细胞毒性 的前导化合物，通过比较通过化合物的一种或多种测试细胞的生长和/或存活抑制水平与 通过化合物的一种或多种对照细胞的生长和/或存活抑制水平。在特定实施方案中，该方 法进一步包括使一种或多种癌细胞与前导化合物的样品接触；并且检测通过前导化合物的 一种或多种癌细胞的生长和/或存活抑制水平。在某些实施方案中，一种或多种癌细胞得 自结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、宫颈癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱 癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样 癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、肾母细胞 瘤或睾丸瘤。在特定实施方案中，一种或多种癌细胞中的至少一种是癌症干细胞，其具有癌 症干细胞生物标记。在某些实施方案中，癌症干细胞生物标记是⑶44+和⑶的细胞表面标记谱。在 某些实施方案中，癌症干细胞是MDA-MB-231、SUM159或"T47D乳腺癌细胞。在某些实施方案中，检测一种或多种癌细胞的生长和/或存活抑制水平包括测定 其为至少一种癌症干细胞的一种或多种癌细胞的部分。在某些实施方案中，检测一种或多种癌细胞的生长和/或存活抑制水平包括测定 一种或多种癌细胞在悬浮培养中形成集落的能力。在某些实施方案中，检测一种或多种癌细胞的生长和/或存活抑制水平包括测定 一种或多种癌细胞在体内形成肿瘤的能力。在某些实施方案中，该方法进一步包括通过修饰前导化合物产生精制前导化合 物，以达到(i)改善的效力、(ii)降低的毒性(改善的治疗指数)；(iii)降低的副作用； (iv)修饰的治疗作用发作和/或效应持续时间；和/或(ν)修饰的药代动力学参数(吸收、 分布、代谢和/或排泄)。在特定实施方案中，该方法进一步包括测定前导或精制前导化合 物的体内毒理学谱，其通过执行前导或精制前导化合物的定量结构活性关系分析。在某些 实施方案中，该方法进一步包括通过用药学上可接受的载体配制前导或精制前导化合物产 生药物组合物。在某些实施方案中，该方法进一步包括在体内测试前导或精制前导化合物， 其通过给具有癌细胞的受试者施用药物组合物，并且评估化合物对受试者的毒性和/或化 合物对受试者中的癌细胞生长和/或存活的作用。在特定实施方案中，受试者选自小鼠、大 鼠、兔、犬、猫、绵羊、猪、非人灵长类和人。在某些实施方案中，该方法进一步包括测定一种或多种癌症干细胞标记在测试细 胞和/或对照细胞中的表达。在特定实施方案中，一种或多种癌症干细胞标记选自CD20、 CD24、CD34、CD38、CD44、CD45、CD105、CD133、CD166、EpCAM、ESA, SCAl、Pecam 和 Strol。在 某些实施方案中，一种或多种癌症干细胞标记是⑶对和⑶44。在某些实施方案中，检测通过化合物的测试细胞和/或对照细胞的生长和/或存 活抑制水平包括执行选自下述的测定法细胞计数测定法、复制标记测定法、细胞膜完整性 测定法、基于细胞ATP的生存测定法、线粒体还原酶活性测定法、胱天蛋白酶活性测定法、 膜联蛋白V染色测定法、DNA含量测定法、DNA降解测定法和核碎裂测定法。
根据本发明的另一个方面，提供了用于表征一种或多种细胞的方法。该方法包括 (a)使一种或多种细胞与选自多柔比星、紫杉醇、放线菌素D、喜树碱和星形孢菌素的化合 物接触，(b)检测通过化合物的一种或多种细胞的生长和/或存活抑制水平，和(c)使(b) 的结果和对照水平比较，其中如果通过化合物的一种或多种细胞的生长和/或存活抑制水 平在统计上明显小于对照水平，那么一种或多种细胞具有癌症干细胞特征。在某些实施方案中，该方法进一步包括评估一种或多种细胞中的癌症干细胞生物 标记。在特定实施方案中，癌症干细胞生物标记选自E-钙粘蛋白表达、TWIST表达和⑶44/ CD24 cell细胞表面标记谱。在某些实施方案中，功能测定法是集落形成测定法或体内肿瘤 种植测定法。在某些实施方案中，对照水平是通过化合物的一种或多种癌细胞的生长和/或存 活抑制水平，所述一种或多种癌细胞不是癌症干细胞。根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗具有癌症或怀疑具有癌症的受试者的 方法。该方法包括给受试者施用与有效量的药物组合物组合的有效量的紫杉醇，所述药物 组合物包括依托泊苷、沙利霉素、阿巴克丁或尼日利亚菌素。根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗具有癌症或怀疑具有癌症的受试者的 方法。该方法包括给受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括依托泊苷、沙利 霉素、阿巴克丁、尼日利亚菌素、或前述任何的衍生物。根据本发明的另一个方面，提供了用于选择关于具有癌症的受试者治疗的方法。 该方法包括评估癌症中的癌症干细胞生物标记，并且如果检测出癌症干细胞生物标记，那 么通过给受试者施用有效量的药物组合物来治疗受试者，所述药物组合物包括沙利霉素、 阿巴克丁、依托泊苷或尼日利亚菌素或其衍生物，任选地与紫杉醇或其衍生物组合。在某些实施方案中，评估癌症干细胞生物标记包括获得来自受试者的癌症样品。在某些实施方案中，癌症干细胞生物标记选自E-钙粘蛋白表达；TWIST表达和 ⑶44/tDM cell细胞表面标记谱。在特定实施方案中，癌症中的E-钙粘蛋白和/或TWIST 表达这样进行测定通过测量癌症中的E-钙粘蛋白和/或TWIST蛋白质和/或RNA表达 水平，和任选地使该水平与参考标准比较。在某些实施方案中，参考标准是癌症干细胞中的 E-钙粘蛋白和/或TWIST蛋白质和/或RNA表达水平。在其他实施方案中，参考标准是癌 细胞中的E-钙粘蛋白和/或TWIST蛋白质和/或RNA表达水平，所述癌细胞不是癌症干细 胞。在某些实施方案中，癌症是结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞 癌、宫颈癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、 乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜 癌、精原细胞癌、胚胎性癌、肾母细胞瘤或睾丸瘤。在特定实施方案中，癌症是乳腺癌或肺癌。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，其任选地是人。在某些实施方案中，药物组合物静脉内、肌内、皮下、腹膜内、经口或作为气溶胶施用。根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗具有癌症或怀疑具有癌症的受试者的 方法。该方法包括给受试者施用有效量的包括化合物的药物组合物，相对于未经历EMT的对照细胞的生长和/或增殖抑制，所述化合物选择性抑制已经历EMT的测试细胞生长和/
或增殖。在某些实施方案中，测试和对照细胞是遗传上匹配的。在某些实施方案中，测试细胞是非致瘤性的。根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗具有癌症或怀疑具有癌症的受试者的 方法。该方法包括给受试者施用有效量的化合物，相对于其对非CSC癌细胞的作用，所述化 合物选择性抑制癌症干细胞增殖或杀死癌症干细胞。根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗具有癌症或怀疑具有癌症的受试者的 方法。该方法包括给受试者施用有效量的化合物，相对于其对非癌性细胞的作用，所述化合 物选择性抑制癌症干细胞增殖或杀死癌症干细胞。根据本发明的另一个方面，提供了鉴定用于药物开发的靶的方法。该方法包括步 骤提供选择性抑制测试细胞生长和/或增殖的化合物，其中所述测试细胞是已经历EMT的 细胞；并且鉴定化合物的生物靶。在某些实施方案中，生物靶是由测试细胞表达的蛋白质或RNA。在某些实施方案中，化合物是表1中列出的化合物或其衍生物。在某些实施方案中，该方法进一步包括执行筛选，以鉴定与生物靶相互作用或作 用于生物靶的第二种化合物。根据本发明的另一个方面，提供了鉴定用于药物开发的靶的方法。该方法包括步 骤使测试细胞或测试细胞裂解物与选择性抑制测试细胞生长和/或增殖的化合物接触， 其中所述接触在其中化合物可以与细胞生物分子在物理上相互作用的条件下执行，并且其 中测试细胞是已经历EMT的细胞；分离与化合物在物理上相互作用的细胞生物分子；和鉴 定生物分子。在某些实施方案中，该方法进一步包括执行筛选，以鉴定与生物分子相互作用或 作用于生物分子的第二种化合物。在某些实施方案中，化合物是表1中列出的化合物或其衍生物。在某些实施方案中，使化合物与载体附着，由此形成亲和基质。根据本发明的另一个方面，提供了产生癌症干细胞的方法。该方法包括诱导癌细 胞经历EMT。在某些实施方案中，癌细胞是实验上产生的癌细胞。在某些实施方案中，实验上产 生的癌细胞包括编码癌基因的表达载体。在特定实施方案中，癌基因是V12H-RAS。在某些实施方案中，癌细胞衍生自天然存在的癌症。在某些实施方案中，上皮至间质转变起因于抑制癌细胞中的E-钙粘蛋白活性。在 特定实施方案中，抑制癌细胞中的E-钙粘蛋白活性包括使癌细胞与针对E-钙粘蛋白的封 闭抗体接触，诱导癌细胞中的抗粘附蛋白表达，或干扰癌细胞中的细胞极性基因。在特定其 他实施方案中，抑制癌细胞中的E-钙粘蛋白活性包括使癌细胞与和E-钙粘蛋白mRNA互补 的小干扰核酸接触。在某些实施方案中，通过在一种或多种测试细胞中表达转录因子来诱导癌细胞经 历 EMT，其中所述转录因子选自Snaill、Snail2、Goosecoid、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-I/ Zeb-2, dEFl/ZEbl、LEFl、Myc、HMGA2、TAZ, Klf8、HIF-1、H0XB7、SIM2s 和 Fos。在特定实施方案中，通过组成性诱导转录因子活性来诱导癌细胞经历EMT。在某些实施方案中，相对于未诱导经历EMT的癌细胞具有的可能性，癌症干细胞 具有增加的下述可能性⑴起始肿瘤；(ii)在软琼脂悬浮培养中形成集落；和/或(iii) 形成肿瘤球。在某些实施方案中，该方法进一步包括评估测试试剂抑制癌症干细胞增殖、在软 琼脂悬浮培养中的集落形成、肿瘤球形成、和/或肿瘤起始能力的能力。在特定实施方案 中，如果抑制癌症干细胞的增殖、在软琼脂悬浮培养中的集落形成、肿瘤球形成、和/或肿 瘤起始能力，那么测试试剂被鉴定为用于癌症治疗的候选试剂。在某些实施方案中，该方法进一步包括将具有癌症干细胞性质的癌细胞引入动物 宿主内。在特定实施方案中，该方法进一步包括评估测试试剂抑制动物宿主中的癌症干细 胞增殖或肿瘤起始能力的能力。在特定实施方案，如果抑制癌症干细胞的增殖或肿瘤起始 能力，那么测试试剂被鉴定为用于癌症治疗的候选试剂。根据本发明的某些方面，提供了通过前述方法中的任何产生的癌症干细胞。根据本发明的其他方面，提供了包括前述癌症干细胞的动物宿主。根据本发明的其他方面，提供了包括具有癌细胞的容器的试剂盒，所述癌细胞已 使用本文公开的方法中的任何一种诱导经历EMT，以产生癌症干细胞。在某些实施方案中， 试剂盒进一步包括具有癌细胞的第二个容器，所述癌细胞未诱导经历EMT，并且与已诱导经 历EMT以产生癌症干细胞的癌细胞在遗传上匹配。根据本发明的其他方面，提供了包括具有非癌细胞的容器的试剂盒，所述癌细胞 已使用本文公开的方法中的任何一种诱导经历EMT，以产生非癌症干细胞。在某些实施方案 中，试剂盒进一步包括具有非癌细胞的第二个容器，所述非癌细胞未诱导经历EMT，并且与 已诱导经历EMT以产生非癌症干细胞的非癌细胞在遗传上匹配。在特定实施方案中，与试剂盒一起提供的一个或多个容器进一步包括冷冻保护 剂。应当理解试剂盒并不限于任何一种具体冷冻保护剂，并且技术人员将能够选择合适 的冷冻保护剂(例如，DMS0)。用于细胞的低温保存的示例性方法和试剂公开于Freshney R. I. , Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique,第 4 版，第 19 章， ffiley-Liss, Inc. (2000)中。附图简述

图1描述了 E-钙粘蛋白抑制和EMT诱导对转移、原发性肿瘤发生率、乳腺球形成 能力和抗原标记表达的作用。图IA描述了在永生化的HMLE和经转化的HMLER细胞中的 E-钙粘蛋白和间质蛋白质N-钙粘蛋白和波形蛋白表达水平。β-肌动蛋白用作装载对照。 底图显示细胞角蛋白8在shCntrl和shEcad HMLER细胞中的表达。图IB描述了(左侧) 荷有HMLER-shCntrl禾口 shEcad细胞的正位原发性月中瘤(orthotopic primary tumor)或这 些系的尾静脉注射后8周的小鼠中的肺转移总负荷的定量。每个条代表分析的5只小鼠/ 组的平均值士 s. d. (*p < 0. 001)。右侧荷有HMLER-shCntrl和shEcad细胞的正位原发性 肿瘤的小鼠肺叶的代表性荧光图像。GFP信号指示肿瘤细胞的存在。还显示的是来自相同 肺组的切片用抗大T抗体的代表性免疫组织化学染色。褐色核染色指示肿瘤细胞。N，肺组 织；M，转移小结(右图)。图IC描述了通过HMLER-shCntrl和HMLER-shEcad细胞形成的 原发性皮下肿瘤的生长模式。每个数据点代表8个原发性肿瘤的平均值(标准差士 s. d.)。图ID描述了在温育10周后用HMLER-shCtnrl或HMLER-shEcad细胞以所示数目的注射细 胞接种的NOD/Scid小鼠中的皮下肿瘤发生率。应当指出尽管HMLER-shCntrl细胞在较低 稀释度下无法起始肿瘤，但HMLER-shEcad保留这样的能力。(E) HMLE和HMLER衍生细胞系 就⑶M和⑶44表达而言的流式细胞术分析。红圈指示⑶24TD44+CSC样部分。应当指出 表达shE-Cad的永生化(HMLE)和经转化的(HMLER)细胞包含明显更大数目显示CSC抗原 谱的细胞图2描述了通过EMT的传代导致对常规化学治疗药物的抗性。图2A描述了用紫 杉醇和多柔比星处理的经转化的HMLERshCntrl (浅灰色线)和HMLERshEcad(深灰色线) 细胞的剂量应答曲线。虚线指示50%部分存活。应当指出对于2种药物和任何给定浓度， 与HMLERshCntrl细胞比较，HMLERshEcad细胞更有抗性。图2B描述了永生化细胞对化学 治疗药物的应答。HMLEshCntrl和HMLEshEcad细胞用所示药物在3个浓度下处理3天，并 且使用MTS测定法就生存进行测定。尽管多柔比星、放射菌素D、紫杉醇和喜树碱是化学治 疗药物，但星形孢菌素是有效诱导凋亡的一般激酶抑制剂。图2C描述了紫杉醇处理导致已 经历EMT的较小细胞群体的选择性扩展。对照HMLE细胞和表达GFP的HMLEshEcad细胞以 20 1的比混合，并且一式三份地种植到6孔平板上。在种植后1天，将在2. 5nm或IOnm 浓度下的DMSO或紫杉醇加入混合细胞群体上，随后为3天温育。在处理结束时通过流式细 胞术分析GFP阳性细胞的数目。在右侧上的曲线图显示GFP阳性的定量。应当指出在IOmM 紫杉醇处理后，GFP阳性从5%增加到14%。图3描述了高流通量筛选，以鉴定具有癌症干细胞特异性毒性的化合物，并且提 供(A)描述筛选设计的示意图；(B)命中位置未显示任何显著位置偏差的证据，和(C)来自 起始筛选的ζ得分分布。图4A描述了用在起始筛选过程中鉴定的8种化合物处理的HMLEshCntrl (A，浅 灰色曲线)和HMLEshEcacKA，深灰色曲线)细胞的剂量应答曲线。将每种系的1000个 细胞种植到384孔平板上，并且用在2. 5对数范围内的8个不同化合物浓度处理。通过 Cell-Titer-Glo测量在3天处理后的细胞生存。应当指出尽管顶端4种化合物(从左到右 沙利霉素、阿巴克丁、依托泊苷和尼日利亚菌素)显示针对HMLEshEcad细胞的选择毒性，但 底部4种化合物(从左到右克霉唑、吖啶、间苯二酚和西吡氯铵，CPC)未显示此类行为。 图4B描述了用与(A)中相同的化合物处理的HMLEshCntrl (具有正方形数据点的曲线)和 HMLE-Twist (具有三角形数据点的曲线)细胞的剂量应答曲线。应当指出即使使用不同EMT 诱导方法，沙利霉素、阿巴克丁、依托泊苷和尼日利亚菌素(顶部，从左到右)的选择性也被 保留。(底图从左到右克霉唑、吖啶、间苯二酚和西吡氯铵，CPC)图4C描述了使表达GFP 的对照HMLE细胞和未经标记的HMLE-twist细胞混合且铺平板到ΙΟ-cm皿上。在种植后1 天，加入以所示浓度的DMS0、沙利霉素(1.25或5μΜ)或阿巴克丁(0. 25或1. 25 μ Μ)。因 为GFP载体包含杀稻瘟菌素抗性基因，所以使用杀稻瘟菌素处理作为用于表达GFP的对照 HMLE细胞扩展的阳性对照。在3天温育后，通过流式细胞术分析细胞的混合群体，并且测定 GFP阳性细胞百分率。应当指出沙利霉素和阿巴克丁处理都导致针对GFP阴性HMLE-twist 细胞的选择和GFP阳性对照细胞的相对扩展。图4D描述了用沙利霉素和阿巴克丁处理的经 转化的HMLERshCntrl (浅灰色线)和HMLERshEcad (深灰色线)细胞的剂量应答曲线。虚 线指示50%部分存活。应当指出即使当细胞进行转化时，沙利霉素针对经历EMT的细胞的选择毒性也保留。图5A描述了就CD44和CD24的细胞表面表达而言，Suml59, MDA-MB-231和T47D 细胞系的流式细胞术分析。应当指出尽管Suml59和MDA-MB-231系中的大多数细胞包含 大量CSCs，但T47D细胞具有非常少的此类细胞。图5B描述了用沙利霉素处理的Suml59、 MDA-MB-231和T47D细胞的剂量应答曲线。图5C描述了响应用沙利霉素处理在Suml59细 胞系内CSC群体(浅灰色条)中的减少，和在非CSC群体(深灰色条)中的伴随增加。图6描述了沙利霉素对HMLER细胞系中的CSC群体的作用。㈧HMLER细胞用媒介 物对照(dmso)、沙利霉素或紫杉醇以所示浓度处理15天。在处理结束时执行FACS分析，以 测量⑶44+/⑶M-CSC群体(右图)。应当指出沙利霉素使⑶44+/⑶群体从基础的4. 9% 降低到0.2%。还对经处理的培养物实施乳腺球形成测定法(左图)。乳腺球数目/由每 种培养物形成的1000个细胞在测定孔的代表性照片下指出。(B)在用媒介物对照(dmso)、 沙利霉素或紫杉醇以(A)中所示浓度处理15天后，HMLER培养物的生长速率。图7描述了原发性小鼠乳房干细胞、正常人乳腺干细胞样细胞和赘生性人乳腺干 细胞样细胞表达与EMT相关的标记。(A)使用FACS从人乳房缩小成形术组织中分离⑶44高 /CD24低细胞(R4)和CD44低/CD24高细胞(R3)。(B)相对于CD44低/CD24高细胞(R3)， 在⑶44高/⑶对低细胞(R4)中编码E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、SIP-I和F0XC2的mRNAs 表达水平，如通过实时RT-PCR测定的。GAPDH mRNA用于标准化模板装载中的变异性。数据 报告为平均值+/-SEM。(C)热度图(本文也称“热图”)描述了与CD44低/CDM高细胞比 较，在CD44高/CDM低细胞中编码EMT标记的mRNAs表达水平，如通过SAGE分析测定的。 深灰色和浅灰色正方形分别与高和低mRNA水平相应。图8描述了 EMT诱导与癌症干细胞相关的表型。㈧用它莫西芬处理10天时间段 的NeuNT-Snail-ER、NeuNT-Twist-ER和NeuNT对照载体细胞的相位差图像以及未经处理的 细胞的图像。(B)在小图A中所示的细胞中HER2/neU、E-钙粘蛋白、纤连蛋白和波形蛋白蛋 白质表达的蛋白质印迹分析。肌动蛋白用作上样或加载对照。(C)通过用它莫西芬处 理或未处理10天的NeuNT-Snai 1-ER、NeuNT-Twist-ER或NeuNT对照载体细胞种植的乳腺 球的定量。数据报告为平均值+/-SD。(D)在用它莫西芬处理10天后，在NeuNT-Snail-ER、 NeuNT-Twist-ER和NeuNT载体细胞的软琼脂培养过程中形成的集落图像。软琼脂测定法在 不存在它莫西芬的情况下执行。(E)小图D中所示的软琼脂集落(或称“克隆”)的定量。 数据报告为平均值+/-SD(**-P < 0. 01 ；_-P < 0. 001，与对照比较)。图9描述了通过Snail-ER或Twist-ER它莫西芬诱导性载体诱导EMT产生具有干 细胞性质的细胞(A)用它莫西芬处理12天的Snail-ER、Twist-ER或对照载体细胞的相位 差图像。(B)编码与EMT相关蛋白质的mRNAs的表达水平，如在通过Snail-ER的异位表达 诱导经历EMT的HMLE细胞中观察到的(它莫西芬诱导的)。表达水平相对于12天它莫西 芬处理的第0天报告。GAPDH mRNA用于标准化模板装载中的变异性。数据报告为平均值 +/-SEM。图10描述了在它莫西芬G-OHT)处理(中间箭头)10天后经历EMT或未经处理 (顶端箭头)的HMLEN-Snail-ER或HMLEN-Twist-ER细胞的相位差图像。在这种4-0HT处 理后，撤出4-0HT，并且在15天后观察细胞。未受感染的细胞或用所示病毒载体感染的细胞 显示于柱中。
图11描述了使用SnailJwist或对照载体在HMLER细胞中的EMT诱导(A)。使用 针对E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、纤连蛋白和波形蛋白的抗体，通过Snail或Twist的异位表 达诱导经历EMT的HMLER细胞的免疫染色。显示对照细胞的免疫染色用于比较(B)。相对 于对照载体感染的细胞，通过Snail或Twist的异位表达诱导经历EMT的HMLERs中与EMT 相关的mRNAs表达，如通过实时RT-PCR测定的。GAPDHmRNA用于标准化模板装载中的变异 性。数据报告为平均值+/-SEM。(C)通过Snail、Twist或对照载体的异位表达诱导经历 EMT的HMLER细胞中的⑶44高/⑶对低细胞百分率。(D)乳腺球数目/1000个表达Snail、 Twist或对照载体的HMLER细胞。数据报告为平均值+/-SEM。图12描述了衍生自表达Snail、Twist或对照载体的HMLER细胞的肿瘤的H&E染 色。衍生自表达㈧载体、(B)Snail、(C)Twist的HMLER细胞的肿瘤的光学显微镜图像 (IOX)。图13A描述了用DMS0、紫杉醇或沙利霉素以指定剂量处理4天的HMLER细胞。显 示了在化合物处理后的⑶细胞百分比，并且通过荧光激活细胞分选进行定量。 条形图描述了用2种不同HMLER细胞群体(HMLER_1、HMLER_2)的2次独立实验的结果。图 13B描述了用所示化学化合物处理的HMLER_2癌细胞群体的荧光激活细胞分选谱(CD44与 ⑶对比较)。左上方的椭圆形(----)指示富含CSC部分，并且左下方椭圆形(----)指示 CSC耗尽部分。图14A描述了用DMS0、紫杉醇(泰素)或沙利霉素以指定剂量处理的亲本HMLER 细胞的乳腺球形成潜力。图14B描述了用DMS0、紫杉醇或沙利霉素处理的MCF7Ras或4T1 细胞。下文显示了乳腺球形成潜力。图15A描述了在用沙利霉素、紫杉醇或媒介物处理的小鼠中，通过SUM159乳腺癌 细胞的体内肿瘤形成。沙利霉素处理导致肿瘤生长的抑制。图15B描述了从来自沙利霉素、 紫杉醇或DMSO处理小鼠的SUM159肿瘤获得的癌细胞的乳腺球形成潜力。图16描述了沙利霉素处理减少临床相关乳腺CSC和祖先基因的表达。基因集富 集分析用于测定与紫杉醇处理比较，先前报告的与干细胞样细胞相关的3个基因集是否响 应于沙利霉素而被阻遏。曲线图是Kolmogorov-Smirnov富集得分与基于差异表达的基因 排序比较。显示了反映关于每个分析的统计显著性的P值。详述肿瘤发生或致瘤性涉及许多遗传和后生改变，其引起细胞增殖、分化、生长和存活 中的缺陷。这些细胞缺陷产生可以是良性或恶性的肿瘤。虽然良性肿瘤通常在原发性肿瘤 中保留局限性，所述原发性肿瘤在原始部位处保留局限性，并且就肿瘤生长而言通常是自 限性的，但恶性肿瘤具有持续生长的趋势和播散或转移至遥远位置的能力。恶性肿瘤通过 一系列逐步的进行性改变发展，所述改变导致不受控制的细胞增殖和侵入周围组织且转移 至不同器官部位的能力。近期发现已证实肿瘤形成和生长通过肿瘤内的较小癌细胞亚群-癌症干细胞驱 云力(Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. , Proc Natl Acad Sci U S A 2003 ； 100 (7) :3983-8) (Li C, Heidt DG, Dalerba P，等人，Cancer Res 2007 ；67 (3) :1030-7) (0' Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE.，Nature 2007 ； 445(7123) :106-10)(Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E,等人，Nature 2007 ；445(7123) :111-5) (Singh SK, Hawkins C, Clarke ID,等人，Nature 2004 ；432 (7015) 396-401)。癌症干细胞(CSCs)在功能上定义为在肿瘤团块内具有种植且产生继发性肿瘤 的能力的那些细胞。在某些方面，已在操作上通过其在动物模型中在有限稀释下种植肿瘤 的能力定义CSCs。在这个功能范畴中牵涉的是癌症干细胞是在肿瘤内负责癌症死亡率-转 移播散主因的细胞的观念。这个概念对于潜在癌症治疗的开发和临床前评估具有重大牵 涉。本发明描述了使得能够开发靶向癌症干细胞的新型治疗的新方法。在本文描述的本发 明方法之前，癌症干细胞靶向疗法的开发以高流通量筛选设置是不可能的。经由使所述方 法付诸实践，通过开发特异性靶向癌症干细胞的新型化合物，我们建立了用于本发明的原 理验证。因此，本发明首次使得能够使用高流通量筛选方法鉴定靶向癌症干细胞的治疗。上皮至间质转变正常和肿瘤细胞在体外和体内以各种分化状态存在。这些分化状态通过至少部分 起于其中细胞驻留的组织微环境的复杂信号整合进行调节。通过许多遗传干扰可以诱导细 胞(例如，癌细胞)经历上皮至间质转变(EMT)，例如经由特定因子(例如，Twist、Snail、 TGF-β或MMPs)的过表达，或通过粘附连接蛋白质例如E-钙粘蛋白的抑制。不管使用的诱 导方法，已诱导成EMT的细胞表达相似表型性状和蛋白质标记(例如，生物标记)，指出EMT 是核心分化程序。本发明涉及已诱导成EMT的细胞共享癌症干细胞的许多性质的发现，所 述性质包括与癌症干细胞相关的细胞表面标记的表达，在悬浮培养中生长，在体内在低细 胞数目下的肿瘤形成，和对特定标准化学治疗药物的抗性。因此，由已经历上皮至间质转变 (也称为间质转分化或上皮至间质转分化)的细胞显示的分化状态可以用于鉴定特异性靶 向癌症干细胞的治疗。在某些实施方案中，提供了诱导上皮-间质转变(例如，产生测试细 胞)的方法。如本文使用的，“上皮至间质转变”(EMT)指上皮细胞至具有一种或多种间质特征 的细胞的转化或部分转化，所述一种或多种间质特征的细胞也具有癌症或非癌症干细胞的 一种或多种性质。一种或多种癌症或非癌症干细胞性质可以包括一种或多种蛋白质(例 如，细胞表面标记)的存在或不存在(高表达水平或低表达水平)，和/或一种或多种(至少 2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种)功能性质中的增加，所述功能性质包括在悬 浮培养中生长(增殖)的能力，在体内在低细胞种植数目下形成肿瘤的能力，对特定化学治 疗的抗性(例如，对紫杉醇的抗性)，转移能力，迁移能力，对凋亡或失巢凋亡(anoikis)的 抗性，扩散和细胞形状的延长。应当理解通过执行与对照细胞的比较，可以评估已经历EMT 的细胞显示一种或多种蛋白质表达的增加或降低，或癌症干细胞的一种或多种功能性质中 的增加的程度，所述对照细胞例如是未经历EMT的细胞(阴性对照细胞)，或已经历EMT的 细胞(阳性对照细胞)，例如癌症干细胞。与未经历EMT的细胞比较，已经历EMT的细胞中关于其的表达增加指示EMT的蛋 白质例子包括N-钙粘蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、Snaill (Snail)、Snail2 (Slug)、Twist、 Goosecoid、FOXC2、SoxlO、MMP-2、MMP-3、MMP-9、整联蛋白 νβ 6、CD44 和 ESA。与未经历 EMT 的细胞比较，已经历EMT的细胞中关于其的表达减少指示EMT的蛋白质例子包括E-钙粘蛋 白、桥粒斑蛋白、细胞角蛋白、闭锁蛋白和CDM。上皮细胞已经历EMT的程度可以通过测定 至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9 种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种或更多种蛋白质的表达进行评估。此类蛋白质的表 达可以使用各种测定方法进行测定，包括本文公开的那些和本领域已知的其他。应当理解 其表达水平指示细胞中的EMT的某些蛋白质也是可以引起EMT发生的蛋白质。例如，在上 皮细胞中Twist的过表达引起细胞经历EMT。类似地，在上皮细胞中E-钙粘蛋白表达中的 减少引起细胞经历EMT。因此，当通过增加(例如，通过cDNA介导的过表达)蛋白质例如 Twist表达或降低(例如，通过RNAi介导的抑制)蛋白质例如E-钙粘蛋白表达来达到EMT 时，其他蛋白质(例如，CD44、桥粒斑蛋白)表达中的改变可以充当EMT的合适指示剂。应当理解癌症或非癌症干细胞的功能性质可以使用本领域已知的各种方法进行 评估。悬浮培养中的生长例如可以这样进行评估通过在旋转烧瓶中培育已经历EMT的细 胞，并且测量旋转烧瓶中随着时间过去细胞数目中的改变。细胞数目中的这种改变可以与 对照细胞的细胞数目中的改变比较，所述对照细胞未经历EMT并且已在相同或相似条件下 生长。与在相同或相似条件下生长但未经历EMT的对照细胞比较，在悬浮培养中生长已经 历 EMT 的细胞倍增时间中高达 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%UOO% 或更多增加，可能指示在悬浮中生长的能力增加。已经历EMT的细胞在体内在低细胞种植数目下形成肿瘤的能力可以通过与对照 细胞比较进行评估，所述对照细胞未经历EMT。在体内在低细胞种植数目下形成肿瘤的能 力依赖于各种因素，所述因素对于技术人员将是显而易见的，包括例如其中注射细胞的动 物类型(例如小鼠)、其中种植(例如，注射)细胞的位置、和动物发动针对细胞的免疫应 答的能力。如本文使用的，“低细胞种植数目”意指高达10°、高达101、高达102、高达103、 高达104、高达105、高达IO6或更多细胞的种植。在细胞种植后(例如，一个或多个位置或 在一个或多个动物中)在体内形成的肿瘤数目是通过其可以进行与对照的这种比较的示 例性参数。在细胞种植后在体内形成的肿瘤大小(例如，体积)是通过其可以进行与对照 的这种比较的另一种示例性参数。例如，肿瘤发生率或大小中高达lO^dO^dO^dO^、 50%,60%,70%,80%,90%,100%或更多增加，可以指示在体内在低细胞种植数目下形成 肿瘤的能力。用于评估癌症或非癌症干细胞的功能性质的其他方法在本文中和其他地方公 开，并且对于技术人员将是显而易见。(参见例如，SM Frisch和H Francis, Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis, J Cell Biol. 1994 年 2 月；124(4) :619-26 ；Mushinski JF,等人，Inhibition of tumor cell motility by the interferon-inducible GTPase MxA. J Biol Chem. 2009 年 3 月 18 日；Liu YN,等 人，Activated androgen receptor downregulates E-cadherin gene expression and promotes tumor metastasis. Mol Cell Biol. 2008年 12月；28^3) :7096-108 ；Carpenter PM,等人，Motility Induction in Breast Carcinoma by Mammary Epithelial Laminin 332(Laminin 5)，Mol Cancer Res. 2009 年 4 月 7 日；Nakamura Μ,等人，Polarized hydroxyapatitepromotes spread and motility of osteoblastic cells. J Biomed Mater Res A. 2009^3, 9 H ；Gu W, ^A,Measuring cell motility using quantum dot probes. Methods Mol Biol. 2007 ;374 :125-31 ；禾口 Sakai K，等人，Inducible expression of p57KIP2 inhibits glioma cell motility and invasion. J Neurooncol. 2004年7月； 68(3) :217-23.)
本发明公开了用于诱导细胞中的EMT的方法。在特定实施方案中，通过抑制细胞 中的E-钙粘蛋白表达或活性来达到上皮至间质转变。通过使用本领域普通技术人员已知 的方法可以抑制E-钙粘蛋白的表达或活性。用于抑制E-钙粘蛋白表达或活性的示例性 方法包括使细胞和与E-钙粘蛋白mRNA互补的小干扰核酸接触，使细胞和针对E-钙粘蛋 白的封闭抗体接触，通过基于cDNA的抗粘附蛋白过表达而诱导抗粘附蛋白表达；和干扰细 胞中的细胞极性基因。例如，krilAle的耗尽破坏E-钙粘蛋白介导的细胞间粘附且诱导 EMT (Qin Y，等人，J Cell Biol 2005 ；171 :1061-71)。因此，在某些实施方案中，Scribble 例如通过RNA干扰的抑制可以诱导EMT。此外，果蝇属(Drosophila)中的遗传筛选鉴定 出影响细胞极性的许多基因，其失活导致E-钙粘蛋白表达的丧失(Pagliarini RA，等人， Science 2003 ；302 :1227-31)。用于干扰细胞极性基因以诱导EMT的其他示例性方法是本 领域已知的。在特定实施方案中，通过RNA干扰抑制E-钙粘蛋白活性。通过RNA干扰用于抑制 基因表达例如E-钙粘蛋白表达的方法是在本文中公开和本领域已知的。在某些实施方案 中，用与细胞中的E-钙粘蛋白mRNA互补的小干扰核酸转染细胞，以抑制细胞中的E-钙粘 蛋白活性。示例性小干扰核酸在本文中公开且是本领域技术人员已知的。用于转染小干扰 核酸(例如，siRNA)的方法是本领域众所周知的，并且例子在本文中公开。在某些实施方 案中，细胞具有稳定整合的转基因，其表达与E-钙粘蛋白mRNA互补的小干扰核酸(例如， shRNA, miRNA)，并且通过RNA干扰途径引起E-钙粘蛋白mRNA的下调。本领域已知的用于基因击倒的各种策略可以用于抑制基因的表达，所述基因例 如E-钙粘蛋白和对于诱导EMT有用的本文公开的其他基因。例如，可以使用利用RNA干 扰(RNAi)和/或微小RNA(miRNA)途径的基因击倒策略，包括小干扰RNA (siRNA)、小发夹 RNA(shRNA)、双链RNA(dsRNA)、miRNAs、和本领域已知的其他基于核苷酸的分子。在一个实 施方案中，基于载体的RNAi方式(例如，shRNA或shRNA-mir表达构建体)用于减少细胞 中的基因(例如，E-钙粘蛋白)表达。广泛范围的基于RNAi的方式也可以用于抑制细胞中的基因表达，例如基于 siRNA的寡核苷酸和/或经改变的基于siRNA的寡核苷酸。经改变的基于siRNA的寡核 苷酸是进行修饰以改变效力、靶亲和力、安全谱和/或稳定性的那些，例如，以使得它们对 细胞内降解有抗性或部分抗性。例如可以对寡核苷酸进行修饰例如硫代磷酸酯，以增加 对核酸酶降解的抗性，结合亲和力和/或摄取。此外，疏水化和生物缀合增强siRNA递 送和靶向(De Paula等人，RNA. 13(4) :431_56，2007)，并且具有核-二氟甲苯酰核苷酸 的 siRNAs 维持基因沉默活性(Xia 等人，ASC Chem. Biol. 1(3) =176-83, (2006)) 已产 生具有酰胺连接的寡聚核糖核苷的siRNAs，其对Sl核酸酶降解比未经修饰的siRNAs更 有抗性(Iwase R 等人 2006 Nucleic Acids Symp Ser 50:175-176)。此外，siRNAs 在 2’ -糖位置上的修饰和磷酸二酯键赋予改善的血清稳定性而不丧失功效(Choimg等人， Biochem. Biophys. Res. Commun. 342 (3) :919-26,2006) 可以用于抑制基因(例如，负面调 节EMT的基因，例如E-钙粘蛋白)表达的其他分子包括有义和反义核酸(单或双链)、核 酶、肽、DNA酶、肽核酸(PNAs)、三螺旋形成寡核苷酸、抗体和适体及其针对一种或多种基 因、RNA转录物或蛋白质中的序列的一种或多种修饰形式。通过减少基因产物的表达或通 过在突变位点处切割突变型转录物，反义和核酶抑制策略已导致肿瘤表型的逆转(Carter禾口 Lemoine Br. J. Cancer. 67 (5) :869-76,1993 ；Lange 等人，Leukemia. 6 (11) :1786-94, 1993 ；Valera 等人，J. Biol. Chem. 269 (46) :28543-6,1994 ；Dosaka-Akita 等人，Am. J. Clin. Pathol. 102(5) :660-4,1994 ；Feng 等人，Cancer Res. 55(10) :2024-8,1995 ；Quattrone 等 人，Cancer Res. 55(1) :90-5,1995 ；Lewin 等人，Nat Med. 4(8) :967-71，1998)。核酶也已提 议作为抑制突变型基因的基因表达且通过靶向反式剪接校正突变型的手段(Sullenger和 Cech Nature 371(6498) :619_22，1994 ； Jones 等人，Nat. Med. 2 (6) :643-8,1996) 通过使 用例如非特异性核酸结合蛋白质或促进寡核苷酸可以增强核酶活性(Herschlag等人，Embo J.13(12) :2913-24,1994 Jankowsky 禾口 Schwenzer Nucleic Acids Res. 24(3) :423-9, 1996)。多靶核酶(连接的或鸟枪)已提议作为改善核酶效率用于基因抑制的手段(Ohkawa 等人，Nucleic Acids Symp Ser. (29) 121-2，1993)。三螺旋方法也已研究用于序列特异性基因抑制。三螺旋形成寡核苷酸也已在某 些情况下发现以序列特异性方式结合(Postel等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 88(18) 8227-31，1991 ；Duval-Valentin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 (2) :504-8,1992 ； Hardenbol 和 Van Dyke Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93(7) :2811-6,1996 ；Porumb 等人， Cancer Res. 56(3) :515-22,1996)。类似地，肽核酸已显示抑制基因表达(Hanvey等人， Antisense Res. Dev. 1(4) :307-17,1991 ；Knudsen ^P Nielson Nucleic Acids Res. 24(3) 494-500,1996 ；Taylor 等人，Arch. Surg. 132(11) :1177-83,1997) 小沟结合聚酰胺可以 以序列特异性方式与DNA靶结合，并且因此可以代表用于在DNA水平下抑制的有用小分 子(Trauger等人，Chem. Biol. 3 (5) =369-77,1996) 此外，抑制也已通过使用显性失活 突变体肽和抗体在蛋白质水平下干扰而获得(Herskowitz Nature 329(6136) =219-22, 1987 ；Rimsky 等人，Nature 341 (6241) :453-6,1989 ；Wright 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86(9) :3199-203,1989)。在许多情况下，抑制策略已导致RNA水平中的减少而无蛋 白质中的伴随减少，而在其他中，RNA中的减少已通过蛋白质中的减少反映。可以采用的抑制策略的不同排列包括DNA和/或RNA适体的使用，其可以选择为 靶向目的蛋白质(例如，E-钙粘蛋白)。例如，在年龄相关性黄斑变性(AMD)的情况下，抗 VEGF适体已产生且已显示在某些AMD患者中提供临床利益(Ulrich H，等人Comb. Chem. High Throughput Screen 9:619-632,2006)。在某些实施方案中，通过使细胞与一种或多种结合试剂(例如，针对E-钙粘蛋白 的封闭抗体)接触来抑制负面调节EMT的蛋白质(例如，E-钙粘蛋白)活性。因此，本发明 包含结合试剂，其例如可以是具有与蛋白质例如E-钙粘蛋白选择性结合的能力的抗体或 抗体片段，且诱导EMT。抗体包括多克隆和单克隆抗体，其可以根据常规方法进行制备。如 本文使用的，E-钙粘蛋白封闭抗体是与E-钙粘蛋白特异性结合且诱导EMT的抗体。明显地，如本领域众所周知的，仅抗体分子的小部分，互补位，涉及抗体与其表 ^ ya ( —Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern
Immunology Wiley & Sons,Inc., New York ；Roitt, I. (1991)Essential Immunology,第 7 版，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。pFc'和 Fc 区例如是补体级联的效 应物，但不涉及抗原结合。从其中酶促切割PFc'区，或不含pFc'区产生的抗体，命名为 F(ab' )2片段，保留完整抗体的2个抗原结合位点。类似地，从其中酶促切割!^c区，或不 含Fc区产生的抗体，命名为Fab片段，保留完整抗体分子的抗原结合位点之一。进一步加工，Fab片段由共价结合的抗体轻链和命名为Fd的部分抗体重链组成。Fd片段是抗体特异 性的主要决定簇(单个Fd片段可以与高达10条不同轻链结合，而不改变抗体特异性)，并 且Fd片段在分离中保留表位结合能力。在抗体的抗原结合部分内，如本领域众所周知的，存在与抗原的表位直接相互 作用的互补决定区(⑶Rs)，和维持互补位的三级结构的构架区(FRs)(—般参见，Clark, 1986 ；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中，存在分别通过3个互补决 定区(⑶Rl到⑶R3)分开的4个构架区(FRl到FR4)。⑶Rs且特别地⑶R3区且更特别地 重链CDR3，在很大程度上负责抗体特异性。本领域目前充分确定哺乳动物抗体的非CDR区可以由同种特异性或异种特异性 抗体的相似区域代替，同时保留原始抗体的表位特异性。这是在“人源化”抗体的开发和 使用最明确表明，在所述“人源化”抗体中使非人CDRs与人FR和/或Fc/pFc ‘区共价连 接，以产生功能抗体。参见例如，美国专利4，816，567,5, 225，539,5, 585，089,5, 693，762和 5，859，205。通过免疫接种对于人免疫球蛋白重和轻链基因座的大部分转基因的小鼠，也可以 制备全人单克隆抗体。在这些小鼠的免疫接种后(例如，XenoMouse (Abgenix)、HuMAb小鼠 (Medarex/Gerfharm))，单克隆抗体可以根据标准杂交瘤方法进行制备。这些单克隆抗体将 具有人免疫球蛋白氨基酸序列，并且因此当施用于人时，将不引发人抗小鼠抗体(HAMA)应答。因此，如对于本领域普通技术人员显而易见的，本发明还提供了 F(ab' )2, Fab, Fv和Fd片段；其中Fc和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3区已由同源人 或非人序列代替的嵌合抗体；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3区已由同 源人或非人序列代替的嵌合F (ab' ) 2片段抗体；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或 轻链CDR3区已由同源人或非人序列代替的嵌合Fab片段抗体；和其中FR和/或CDRl和/ 或CDR2区已由同源人或非人序列代替的嵌合Fd片段抗体。本发明还包括所谓的单链抗体。在某些实施方案中，通过使细胞与E-钙粘蛋白的小分子或肽拮抗剂接触来 抑制E-钙粘蛋白。在某些实施方案中，使用包含细胞粘附识别(CAR)序列的环肽， HAV(His-Ala-Val)，任选连同在CAR序列任一侧上的侧翼序列。参见例如，美国专利
发明者E·S·兰德尔, M-J·廖, P·古普塔, R·温伯格, S·马尼, T·T·昂德尔 申请人:怀特黑德生物制剂研究所, 麻省理工学院