专利名称：抑制猪流感(siv)和可传播的肠胃炎冠状病毒(tgev)的含有来自酿酒酵母is2的可溶性葡 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及组合物，其含有从酿酒酵母IS2中分离的可溶性葡聚糖低聚物，其可抑制猪流感(SIV)和可传播的肠胃炎冠状病毒(TGEV)。
背景技术：
流感已成为人类发病率和老年人及婴幼儿死亡率的的主要原因。流感病毒为正粘病毒科的成员，其由四类即流感病毒A、B、C和托高土病毒属(Thogotovirus)组成。流感的临床表现包括高烧、寒战、咳嗽、喉咙痛、流涕或鼻塞、头痛、肌肉疼痛并且经常是特别疲劳。大多数感染流感病毒的病人在一或两星期内完全恢复。然而，许多人患有进一步发展的严重并发症，并死于该并发症。迄今，全世界有几种复发的大范围流行病，例如，1957年的亚洲流感(H2N2)，1968年的香港流感(H3N2)，1977年的俄国流感(H1N1)以及近期于2003年爆发的无法抵抗的香港SARS(重症急性呼吸综合症)流感，其使得所有的亚洲人都害怕死亡(de Jong JC.，等，Nature，389，pp554，1997；SubbaraoK.，等，Science，279，pp393-396，1998；Claas EC.，等，Lancet，351，pp472-477，1998；Yuen KY.，等，Lancet，351，pp467-471，1998)。已知流感来自于四类流感混合病毒，即A、B、C4型病毒和冠状病毒。尽管所有的病毒都表现出相似的临床特征，对抗一种病毒的疫苗对其它类型的流感病毒不具有免疫性。
作为一种预防方法，推荐流感病毒疫苗，并且已知它表现出70-80％的预防活性(Influenza，Plenum Medical Book Company，p291，1987)。然而，由于疫苗赋予了短期的免疫性并且采用注射提供，存在几个问题，如难以给药到儿童以及流感的初级预防。
由传染性病毒或微生物引起的猪尤其是吃奶的和断奶的小猪痢疾导致养猪场很大的经济损失。肠病毒就其肠内取向和复制而言具有独特性(Saif L.J.，等，Disease of swine 8th，Iowa State University Press，Ames.，USA，1990)。大多数肠病毒具有热不稳定性，其引发病毒性痢疾在冬天流行。
已知冠状病毒，SARS的一种病原学病毒，作为一种突变型从动物转移到人，并且是引起猪痢疾、猪丧失食欲的一种主要病毒，其导致抑制猪的生长。而且，它不能采用常规的抗生素治疗，并且至今仍未研究出基本的治疗方案。
可传播的肠胃炎(TGE)，冠状病毒的一个成员，在经济学上是一种重要的疾病，这是因为它是高传染性的，并且特征在于呕吐、严重的痢疾和小猪在出生前几周内的高死亡率。已报道在全世界包括韩国发现了该病毒。
β-葡聚糖可以从各种来源如酵母、微生物、蘑菇、谷物和藻类中分离。至今，已经进行了研究并作为多种类型的产品应用。特别是，已经研究了得自酵母细胞壁的β-葡聚糖，并且有了很好的认识。
酵母，一种微生物，在FDA中被分入GRAS(通常认为是安全的)，已经被用在包括食品领域的各种领域，而且酵母的内细胞膜包括作为主要组分的β1、3-和1、6-葡聚糖以及少量壳质和甘露蛋白，然而，其外细胞膜包括甘露蛋白，一种连接到甘露聚糖的蛋白质。
β-葡聚糖，酵母细胞壁的一种主要组分，已经被报道通过巨噬细胞的活化和增殖而增加Ag特异性免疫应答，提高对病原体如真菌、细菌、病毒等的抵抗性，抑制在损伤中观测到的免疫低下以及增加对宿主中癌或癌转移的抵抗性(Abel，G.and Czop，J.K.，Int.J.Immunophamacol.，14，pp1363-1373，1992；Babineau，等，220(5)，pp601-609，1994；Benach J.L.，等，Infection and Immunity，35(3)，pp947-951，1982；DiRenzo，L.，等，Eur.J.Immunol.，21，pp1755-1758，1991；Fukase，S.，等，Cancer Res.，47，pp4842-4847，1987；Janusz，M.J.，等，J.Immun.，142，pp959-965，1989；Olsen，E，J.，等，J.Immun.，64，pp3548-3554，1996，Sakurai，T.，等，Int.J.Immunopharmacol.，14，pp821-830，1992；Czop，J.K.，等，Prog.Clin.Biol.Res.，297，pp287-296，1989)。
由于酵母的β-葡聚糖为一种不溶于水的多聚糖，迄今，已经研发了如下的许多制备方法，用于获得具有高溶解性的β-葡聚糖。
US专利No.5,576,015公开了制备β-葡聚糖的方法，该β-葡聚糖具有精细微粒形状以增加其吸收率；US专利No.4,877,777公开了将化学配方引入葡聚糖以增加其溶解度的方法；US专利No.5,037,972和US专利No.6,143,883公开了制备可溶性葡聚糖微粒的方法，其通过用有机溶剂提取葡聚糖并随后用可降解β-1，3-D-葡萄糖链的β-葡聚糖酶或纤维素酶进行处理，该链为葡聚糖的一种基本结构。
然而，在以上引用的任何文献中都未报道或公开从酵母的变异菌株IS2(KCTC 0959BP)中分离的特异性可溶性葡聚糖低聚物以及该葡聚糖寡聚物用于流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒疾病的疗效，其所公开的内容作为参考并入本文。
本发明的发明人已经从研究中努力发现了来自特异性酵母变异菌株的具有药学潜能的β-葡聚糖，并最终通过证实提取自酵母变异IS2的细胞壁的分子量小于50,000 D的可溶性葡聚糖低聚物对流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒表现出潜在的抑制活性而完成了本发明。
通过以下对本发明的详细说明，本发明的这些和其它目的将会变得显而易见。
发明内容
根据本发明的一个方面，本发明提供了包含得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的药物组合物，其用于治疗和预防人和哺乳动物中由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的疾病。
根据本发明的另一方面，本发明提供了得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物在制备治疗剂中的应用，该治疗剂可治疗和预防人和哺乳动物中由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的疾病。
因此，本发明的一个目的是提供包含得自酵母变异菌株(KTCT0959BP)细胞壁的可溶性葡聚糖低聚物的药物组合物，其通过用酶处理不溶性的β-葡聚糖而获得，可用于治疗和预防人和哺乳动物中由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的疾病。
本发明的一个目的是提供得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物用于制备治疗剂的用途，该治疗剂治疗和预防人和哺乳动物中由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的疾病。
上述流感病毒包括流感病毒A、B、C4和猪流感病毒。
上述由于感染流感病毒而引起的疾病包括如SARS的流感、普通感冒、咽喉炎、支气管炎、肺炎等。
上述由于感染可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的疾病包括普通感冒、严重的急性呼吸疾病、猪流行性痢疾(PED)、可传播的胃肠炎(TGE)等。
而且，上述哺乳动物包括家畜，如狗、猫、牛、猪等。
本发明的另一目的是提供用于制备可溶性葡聚糖低聚物的方法，包括以下步骤(a)在肉汤培养基中培养酵母(酿酒酵母)变异IS2(KCTC0959BP)用于接种；(b)将以上的酵母培养物溶液接种到肉汤培养基中，培养并离心以获得酵母；(c)向其中加入NaOH以便从酵母细胞壁中提取β-葡聚糖；(d)将提取的β-葡聚糖与水解酶进行反应，并随后进行过滤以获得可溶性的葡聚糖低聚物；以及(e)最后，用冻干法进行干燥以获得本发明的可溶性葡聚糖低聚物。
本发明的可溶性葡聚糖低聚物可根据以下的优选实施例制备。
对于本发明，上述可溶性的葡聚糖低聚物可通过以下步骤制备(a)第一步，培养酵母IS2(KCTC 0959BP)的步骤包括在液体培养基中培养酵母IS2(KCTC 0959BP)，该液体培养基包括0.5-10w/v％葡萄糖、0.1-5w/v％酵母提取物、0.1-10w/v％胨；(b)第二步，从酵母培养基中获得酵母的步骤包括将第一步制备的数量介于0.1-10％(v/v)的酵母培养基接种到初级液体培养基中，该培养基包括0.5-10w/v％葡萄糖、0.1-5w/v％酵母提取物、0.01-2w/v％硫酸铵、0.001-1w/v％磷酸钾和0.001-1w/v％硫酸镁，pH介于5.0-6.0，在速度介于100-400rpm时培养12-48小时，通入的气体量介于0.3-3vvm，在培养基中的温度介于20-40℃，并随后进行离心以获得酵母；
(c)第三步，从酵母细胞壁提取湿β-葡聚糖的步骤包括将1-10％氢氧化钠溶液加入到酵母中，分散，当温度介于70-100℃时反应30分钟-5小时，而后进行离心以获得酵母的干细胞物质(DCW)，其中，该过程可重复几次以进行富集，采用强酸如盐酸和硫酸将该物质的pH滴定至介于4.0-5.0，再次分散于氢氧化钠溶液中，在75℃下进一步反应1小时，进行离心以分为氢氧化钠溶液和固体组分；并且最后，清洗并纯化该固体组分以获得湿的β-葡聚糖；(d)第四步，获得葡聚糖低聚物的液相的步骤包括向其中加入相当于葡聚糖(v/v％)1-10倍量的蒸馏水和相当于葡聚糖(v/w％)1/20-1/5量的β-葡聚糖水解酶，在温度介于30-80℃时反应6-24小时，淬灭反应后通过离心回收上清液，采用超滤膜过滤上清液以获得本发明的可溶性葡聚糖低聚物溶液，其分子量小于50,000；(e)第五步，获得最终的可溶性葡聚糖低聚物干粉的步骤包括将第四步制备的低聚物在低于-70℃下单独放置12小时-48小时，并随后冻干以获得本发明的可溶性葡聚糖低聚物粉末。
采用上述步骤制备的可溶性葡聚糖低聚物包括分子量小于50,000的葡聚糖低聚物，优选介于1,000-10,000。
本发明的另一目的是提供一种药物组合物，其包含得自酵母变异菌株(KTCT 0959BP)细胞壁的通过上述步骤获得的可溶性葡聚糖低聚物，作为一种有效量的活性组分，与其药学上可接受的载体一起，用于治疗和预防由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的哺乳动物的疾病。
本发明的另一目的是提供一种用于制备上述可溶性葡聚糖低聚物的方法。
本发明的另一目的是提供采用上述制备方法制备的得自酵母变异IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，并且本发明的另一目的是提供一种药物组合物，其包含得自酵母变异菌株(KTCT 0959BP)细胞壁的采用上述方法获得的可溶性葡聚糖低聚物，作为一种有效量的活性组分，与其药学可接受的载体一起，用于治疗和预防由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒疾病而引起的哺乳动物的疾病。
本发明的组合物可以给药到人或家畜，如狗、猫、牛和猪，并可以以普通的给药方法如与饲料混合而使用。
本发明的一个目的是提供得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物用于制备治疗剂的用途，以治疗和预防人和哺乳动物中由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的疾病。
本发明的一个目的是提供一种用于治疗或预防哺乳动物中的流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒疾病的方法，包括将有效量的包含得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的组合物与其药学上可接受的载体一起，给药到所述哺乳动物。
根据使用方法，本发明的组合物还可以包括常规的载体、佐剂或稀释剂。优选根据用途和使用方法将所述载体作为适当的物质使用，但不进行限制。适当的稀释剂列于Remington’s Pharmaceutical Science(Mack Publishing co，Easton PA)的书面文本中。
本文中，以下制备方法和赋形剂仅仅是示范性的，并非用于限制本发明。
根据本发明的组合物可以作为一种药物组合物提供，其含有药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶树、藻酸盐、凝胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯基砒络烷酮、水、甲基羟基安息香酸盐、丙基羟基安息香酸盐、云母、硬脂酸镁和矿物油。所述制剂还可以包括填料、抗凝聚剂、润滑剂、润湿剂、增香剂、乳化剂、防腐剂等。本发明的组合物可以被制作成当通过采用本领域公知的任何步骤将它们给药到患者后便提供快速、持续或延迟释放活性组分。
例如，本发明的组合物可以溶解在经常被用于生产注射剂的油、丙二醇或其它溶剂中。载体的适当实施例包括生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、异丙基肉豆蔻酸盐等，但不局限于它们。对于局部给药，本发明的提取物可以被制成药膏和乳霜形式。
含有天然药物组合物的药学制剂可以被制成任何形式，如口服形式(粉末、片剂、胶囊、软胶囊、水溶性药物、糖浆、西也剂药丸、粉末、香囊、颗粒)或局部制剂(乳霜、药膏、洗液、凝胶、香膏、小块、软膏、喷射液、气溶胶等)、栓剂或无菌注射剂(溶液、悬浮液、乳剂)。
本发明的药学剂量形式的组合物可以以其药学上可接受的盐的形式使用，并且也可以单独或以适当的缔合形式使用，以及与其它药学上的活性组分一起使用。
本发明的组合物的预期剂量随患者的状况和体重、严重性、药物形式、给药途径和周期而改变，并且可以由本领域技术人员进行选择。然而，为了获得预期的效果，通常推荐以0.01-10g/kg优选0.1-1g/kg体重/天的量给药本发明的组合物。可以以每天单剂量或多剂量的形式给药该剂量。
本发明的药物组合物可以通过各种途径给药到受检动物如哺乳动物(大鼠、小鼠、家畜或人)。所有的给药方式都是预期的，例如，可以是口头地、直肠地或通过静脉内的、肌内的、皮下的、皮内的、胸内的、硬膜外的或脑内室的注射而给药。
本发明的另一目的是提供一种包括组合物的保健食品，该组合物实质上包含得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，与饮食上可接受的添加剂一起，用于预防和改善由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒疾病而引起的哺乳动物的疾病。
根据组合物的总重量，用于预防和减轻由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒疾病而引起的哺乳动物疾病的保健食品可以包含约0.01-80w/w％优选1-50w/w％的上述得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的本发明的可溶性葡聚糖低聚物。
本发明提供了一种保健饮料组合物，用于预防和减轻人和哺乳动物中由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的疾病，其包括得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物。
本发明的上述低聚物组合物可以加入到食物和饮料中，用于预防和减轻人和哺乳动物中由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒疾病而引起的疾病。
为了研制保健食品，包含本发明的上述低聚物组合物的可添加食物实例例如为各种食物、饮料、面包、饼干、果酱、糖果、口香糖、茶、乳酪、维他命复合物、健康改进食物等，并且可以作为粉末、颗粒、片剂、咀嚼片、胶囊或饮料等使用。
本发明的组合物无毒性和副作用，因此，可以安全使用。
本文的上述组合物可以加入到食物、添加剂或饮料中，其中，对于保健食品组合物，上述低聚物在食物或饮料中的量一般可以介于食物总重量的约0.01-80w/w％，并且在100ml健康饮料组合物中为0.02-30g，优选0.3-5g。
倘若本发明的健康饮料组合物以指示的比例含有作为一种主要组分的上述低聚物，则对其它液体组分无特殊限制，其中，其它组分可以为各种除臭剂或天然的碳水化合物等，如常见的饮料。上述天然碳水化合物的实例为单糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麦芽糖、蔗糖等；常见的糖，如糊精、环糊精；以及糖醇，如木糖醇和赤藻糖醇等。作为不同于上述的其它除臭剂，天然除臭剂如taumatin、甜菊提取物如levaudioside A、甘草甜味料等，以及合成的除臭剂，如糖精、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(aspartam)等，可以良好地使用。在100ml本饮料组合物中，上述天然碳水化合物的量通常介于约1-20g，优选5-12g。
不同于上述组合物的其它组分为各种营养物、维他命、矿物质或电解质、合成的增香剂、在干酪巧克力等情况下的着色剂和精炼剂、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体粘合剂、pH控制剂、稳定剂、防腐剂、丙三醇、乙醇、在碳酸饮料中使用的碳化剂等。不同于上述的其它组分可以为用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果汁。
本发明的组合物可作为混合剂用于乳酸菌制饮料或软膏等。
上述组分可以单独或组合使用。
本发明提供了一种保健食品，除本发明的组合物外，其还包括约0.01-30w/w％的维他命、低聚糖和食物组分。
组分的比率不很重要，但通常介于约0.01-30w/w％/100w/w％本组合物。其中，包含上述提取物的可添加食物的实例为各种食物、饮料、口香糖、维他命复合物、增进健康食物等。
本发明的组合物还可以包括一种或多于一种的有机酸，如柠檬酸、反丁烯二酸、脂肪酸、乳酸、苹果酸；磷酸盐，如磷酸盐、磷酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、聚磷酸盐；天然的抗氧化剂，如多酚、儿茶酚、α-生育酚、迷迭香提取物、维他命C、甘草根提取物、壳聚糖、丹宁酸、植酸等。
对本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明的组合物、用途和制备方法进行各种修改和变形，不偏离本发明的主题和范围。
附图简述结合附图，根据下述的详细说明，将会更加清楚地理解本发明的以上和其它目的、特征和其它优势，其中
图1显示出可溶性的葡聚糖低聚物对在肺泡巨噬细胞中产生NO(一氧化氮)的影响。
下文中，通过以下实施例更加特异性地说明本发明。然而，应当理解本发明绝不局限于这些实施例。
实施本发明的最佳方式以下实施例和试验性的实施例用于进一步举例说明本发明，不限制其范围。
实施例1.酵母变异IS2的培养和采集将含有10g/L葡萄糖、6g/L酵母提取物、3g/L硫酸铵((NH4)2SO4)、1.5g/L磷酸钾(K2PO4)和0.5g/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)的液体培养基用作初级培养基。
将液体YPD培养基(含有葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L和胨20g/L)用于接种，并且将含有400g/L葡萄糖、30g/L酵母提取物、40g/L硫酸铵((NH4)2SO4)、15g/L磷酸钾(K2PO4)和5.7g/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)的培养基用作生长介质。
将生长培养基高压灭菌后，于其中播种100ml培养的酵母变异IS2(KCTC 0959BP)，在转速为300rpm、1vvm的通风气体、30℃和pH 5.5下培养，并且最终通过批量0培养系统获得50-55g/L的酵母干细胞物质(DCW)。
实施例2.来自酵母变异IS2的β葡聚糖提取物将在以上实施例1中制备的80g酵母DCW悬浮在1,000ml 4％氢氧化钠(NaOH)溶液中，并随后在95℃下培育1小时。培育的悬浮液在速度为2,000rpm下离心15分钟，以便分成NaOH溶液部分和固体部分。
将分离的固体部分再次悬浮在2,000ml3％氢氧化钠溶液中，在75℃下培育3小时，并随后在2,000rpm的速度下离心15分钟，以便再次分成NaOH溶液和固体部分。
用HCl将富集的固体部分调至pH 4.5，分散到最终体积为2，000ml，并在75℃下再培育1小时。将培育的悬浮液在2,000rpm的速度下培养15分钟，以便分离成NaOH溶液部分和固体部分。
用蒸馏水将固体部分冲洗3次，以便从酵母变异体的细胞壁中获得160g湿β葡聚糖。
实施例3.从酵母变异IS2的β-葡聚糖中制备可溶性葡聚糖低聚物将从实施例2中制备的160g湿β葡聚糖放入1,000ml烧瓶中，并向其中加入480ml蒸馏水和相当于1/10葡聚糖(v/w)量的β-葡聚糖酶，并在40℃下培育15小时。
反应停止后，将反应混合物在7,000rpm下离心15分钟以收集上清液。将收集的上清液过滤并通过采用超滤膜(Filtron Co.，MWCO10K)去除未反应的酶以获得含有MW小于10,000道尔顿的含葡聚糖低聚物的溶液。继溶液于-74℃下单独放置过夜后，将该溶液冻干以产生5.8g粉末状的可溶性葡聚糖低聚物。
试验性实施例1.可溶性的葡聚糖低聚物对在肺泡巨噬细胞中产生NO(一氧化氮)的影响为测定可溶性葡聚糖低聚物对在肺泡巨噬细胞中产生NO的影响，进行了以下步骤。
1-1.细胞培养物利用磷酸缓冲盐(PBS，2.56g/L NaH2PO4·H2O，22.5g/LNa2HPO4·7H2O，87.9g/L NaCl，pH 7.2)从年龄介于1-3星期的母猪肺中分离肺泡巨噬细胞，并采用DMEM培养基将被分离的肺泡巨噬细胞悬浮在10％FBS和2x抗细菌-抗真菌溶液中，在75cm2的细胞培养瓶中以漂浮。从漂浮液中提取RNA并采用文献中公开的方法进行PCR(聚合酶链反应)以证实巨噬细胞是否被七类猪病毒感染，即猪细小病毒、2型猪圆环病毒、1型猪圆环病毒、猪生殖和呼吸综合症病毒、日本脑炎病毒、encephalomyelocarditis病毒和假性狂犬病病毒(Jabrane等，Can.Vet.J.，35，pp86-92，1994)。检查肺泡巨噬细胞的感染12小时后，利用PBS溶液在接种肺泡巨噬细胞前轻微地清洗微量板两次，并且用胰蛋白酶-EDTA溶液从瓶表面脱离肺泡巨噬细胞。最后，将脱离的肺泡巨噬细胞接种入24孔平板至平板中每一孔的浓度为1×106-107/ml。
1-2.诱导NO产生将实施例3制备的可溶性葡聚糖低聚物溶解在DMEM培养基中至浓度为10mg/ml，以两倍稀释的方式从0.625mg/ml稀释到5mg/ml/孔。36小时后，另外加入以两倍稀释的方式从100ug/ml稀释到25ug/ml/孔微量板的LPS(脂多糖，Sigma，USA)溶液并培养36小时。培养后，收集培养基的上清液以测定它们的NO(一氧化氮)产生。将仅用LPS处理的组和未处理组均用作阴性组。采用常规的分析试剂盒测定NO产生(硝酸盐/亚硝酸盐比色分析试剂盒，Cayman Chemical Co.，USA)。
结果，采用得自酵母变异菌株IS2的可溶性葡聚糖低聚物处理的试验组显示出相对于阴性对照组而言，NO产生增加较多，并且证实了通过可溶性葡聚糖低聚物的NO产生以剂量相关方式增加(见图1)。
试验性实施例2.可溶性葡聚糖低聚物对猪流感病毒的抗病毒活性为了测定可溶性葡聚糖低聚物对猪流感病毒的抗病毒活性，将在试验性实施例1中采用本发明的可溶性葡聚糖低聚物处理及未处理的两种培养基上清液用猪病毒处理并接种到肺泡巨噬细胞。通过观察如下的病毒细胞病理效应(CPE)测定二者的抗病毒作用。
2-1.病毒和细胞制备从感染流感病毒的猪肺中分离猪流感病毒，并且测出猪的TCID50(组织培养物感染剂量50)值为5×107.5/ml。
从在试验性实施例1-2中获得的肺泡巨噬细胞培养基的上清液中制备本试验中使用的NO。在试验中，使用了得自狗肾的MDCK(Mardin-Darby Canine Kidney，ATCC，USA)细胞。
2-2.间接测定抗病毒作用通过培养而制备细胞使其在96孔平板上增殖为单层。5mg/ml的葡聚糖处理组和葡聚糖/LPS共处理组均分别用作NO处理组，并且DMEM培养基处理组和葡聚糖/LPS无处理治疗组均用作阴性对照组。以不同的浓度即103、102和10TCID50/孔平板接种猪流感病毒。在接种24和36小时后，利用反相显微镜测定病毒的细胞病理效应(CPE)。将连续三个孔的平均值用于每组，并将结果分为4个等级，即最强CPE(+++)、中等CPE(++)、轻微CPE(+)和无CPE(-)，并与文献中公开的方法进行对比(Belaid等，J.Med.Virol.，66(2)，pp229-34，2002)。
结果，在所有的试验组中，葡聚糖/LPS共处理组显示出最高的抗病毒作用。特别是，证实了与对照组相比，在36小时后，葡聚糖/LPS处理组抑制病毒的CPE为70％和约30％。而且，在用浓度为102和101TCID50的少量流感病毒处理的组中，抑制作用直到接种36小时后保持100％(见表1)。
表1
2-3.直接测定抗病毒作用为了测定可溶性葡聚糖低聚物的抗病毒活性，将在实施例3中制备的每个5mg/ml的低聚物接种到96孔平板，同时每个孔平板上有上述试验性实施例2-1中的MDCK细胞上的猪病毒，浓度为103、102和101TCID50。将仅用葡聚糖处理的组用作阴性对照组。在接种24和36小时后，采用反相显微镜测定病毒的细胞病理效应(CPE)。将连续三个孔的平均值用于每组，并且将结果分为4个等级，即最强CPE(+++)、中等CPE(++)、轻微CPE(+)和无CPE(-)，并与文献(Belaid等，J.Med.Virol.，66(2)，pp229-34，2002)中公开的方法进行对比。此外，将在实施例3中制备的5mg/ml低聚物的混合液以及猪流感病毒接种到单层细胞上，以证实葡聚糖低聚物的直接抗病毒作用。
结果，相对于对照组而言，接种后直到24小时，仅用葡聚糖处理的组显示出潜在的100％抗病毒作用，与病毒的数量无关。用少量病毒(102和101TCID50)处理的两组和用大量病毒(103TCID50)处理的组在接种后直到36小时显示出100％和70％的抗病毒活性(见表2)。
表2
试验性实施例3.可溶性葡聚糖低聚物对TGEV(可传播的肠胃炎冠状病毒)的抗病毒作用为了测定可溶性葡聚糖低聚物对TGEV(可传播的肠胃炎冠状病毒)的抗病毒作用，进行了如下过程。
3-1.病毒和细胞制备可传播的肠胃炎冠状病毒(TGEV)(一种冠状病毒)的Miller株从Seoul National University处获得，文献(Kim B.and Chae C.，J.Comp.Path.，126，pp30-37，2002)，并且在试验前测定TGEV的TCID50值为1×106/ml。
本试验中，从猪睾丸中分离猪睾丸细胞(ATCC，USA)。
3-2.间接测定抗病毒作用为测定本发明的可溶性葡聚糖低聚物的间接抗病毒作用，将在实施例1-2中制备的肺泡巨噬细胞的培养物上清液与冠状病毒混合，并且将混合物接种到96孔平板上的单层。类似于在实施例2-2公开的方法进行其它步骤。
结果，在所有组中，从用葡聚糖和LPS处理的肺泡巨噬细胞制备的培养物上清液显示出最高的抗病毒活性。在病毒大量时(103TCID50)，相对于对照组而言，用葡聚糖和LPS处理的组的CPE值显示出潜在的抗病毒作用，在接种后24小时为约70％，并且相对于对照组而言，在接种后36小时为约30％(见表3)。
表3
3-3.直接测定抗病毒作用为测定本发明的可溶性葡聚糖低聚物的直接抗病毒作用，将在实施例3中制备的每个5mg/ml的低聚物与猪病毒混合，并且将混合物接种到96孔平板上。相似于实施例2-3中公开的方法进行其它的步骤。
结果，在所有组中，仅用可溶性葡聚糖低聚物处理的组显示出最高的抗病毒活性。仅用可溶性葡聚糖低聚物处理的组的CPE值显示出潜在的抗病毒作用，与对照组相比，在病毒最大量时(103TCID50)接种24小时为约70％，在病毒大量时(103，103TCID50)为约30％，并且在病毒少量时(101TCID50)接种36小时为约70％(见表4)。
表4
试验性实施例4.毒性测试4-1.方法利用实施例3的低聚物对ICR小鼠(平均体重25±5g)和Sprague-Dawley大鼠(235±10g，Jung-Ang Lab Animal Inc.)进行了急性中毒测试。分别对由10只小鼠或大鼠组成的四个组口头给药4mg/kg、40mg/kg、400mg/kg和4,000mg/kg的测试样品或溶剂(0.2ml，i.p.)并观察两星期。
4-2.结果在任意组或任一性别中，对死亡率、临床征兆、体重改变以及总体发现无治疗相关的效果。这些结果暗示出本发明制备的提取物为有潜力的，并且安全。
以下将描述制备方法和赋形剂的种类，但本发明不局限于它们。典型的制备实施例描述如下。
制备粉末实施例的干粉50mg乳糖100mg云母10mg
通过将上述组分混合并填充密封包装而制备粉末制品。
制备片剂实施例3的干粉50mg玉米淀粉 100mg乳糖 100mg硬脂酸镁 2mg通过将上述组分混合并成片而制备片剂制品。
制备胶囊实施例3的干粉50mg玉米淀粉 100mg乳糖 100mg硬脂酸镁 2mg通过将上述组分混合并采用常规的明胶制备方法填充明胶胶囊而制备胶囊制剂。
制备注射剂实施例3的干粉50mg注射用蒸馏水 最适量PH控制剂 最适量通过溶解活性组分、将pH控制到约7.5并随后将所有组分填充在2ml ample中以及采用常规的注射品制备方法进行消毒而制备注射制剂。
制备液体实施例3的干粉0.1～80g糖 5～10g柠檬酸 0.05～0.3％焦糖 0.005～0.02％维他命C 0.1～1％
蒸馏水79～94％CO2气体 0.5～0.82％通过溶解活性组分、填充所有组分以及通过采用常规的液体制备方法进行消毒而制备液体制剂。
制备保健食品实施例3的干粉 1000mg维他命混合物 最适量维他命A醋酸盐 70mg维他命E 1.0mg维他命B10.13mg维他命B20.15mg维他命B6 0.5mg维他命B12 0.2mg维他命C 10mg生物素10mg烟酸胺1.7mg叶酸 50mg泛酸钙0.5mg矿物混合物最适量硫酸亚铁 1.75mg氧化锌0.82mg碳酸镁25.3mg单磷酸钾 15mg磷酸二钙 55mg柠檬酸钾 90mg碳酸钙100mg氯化镁24.8mg上述维他命和矿物混合物可以以多种方式改变。这些改变不视为偏离本发明的主题和范围。
制备健康饮料实施例3的干粉 1000mg柠檬酸1000mg低聚糖100g杏浓缩物 2g牛磺酸1g蒸馏水900ml通过将活性组分溶解、混合、于85℃下搅拌1小时、过滤并随后将所有组分填充1000ml ample中以及采用常规的健康饮料制备方法进行消毒来制备健康的饮料制品。
对本发明进行了如此地描述，很明显可以以很多方式改变本发明。这种改变不视为偏离本发明的主题和范围，并且希望所有这些对本领域技术人员将会是显而易见的变形包含在以下权利要求书的范围以内。
工业实用性如上所述，分子量介于1,000-10,000的可溶性葡聚糖低聚物，其通过利用市场上可购买的β-葡聚糖水解酶处理从酵母变异IS2的细胞壁分离的不溶性β-葡聚糖而制得，该可溶性葡聚糖低聚物对流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒显示出潜在的抑制性，因此，它可以作为治疗剂或保健食品使用，用于治疗和预防被流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒感染的疾病。
权利要求
1.可溶性葡聚糖低聚物在制备治疗剂方面的用途，所述可溶性葡聚糖低聚物得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)，所述治疗剂可用于治疗和预防人和哺乳动物中由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的疾病。
2.根据权利要求1的用途，其中，所述流感病毒为流感病毒A、B、C4或猪流感病毒。
3.根据权利要求1的用途，其中，所述被流感病毒感染的疾病为流感、普通感冒、咽喉炎、支气管炎或肺炎。
4.根据权利要求1的用途，其中，所述被可传播的肠胃炎冠状病毒感染的疾病为普通感冒、严重的急性呼吸疾病、猪流行性痢疾(PED)或可传播的胃肠炎(TGE)。
5.根据权利要求1的用途，其中，所述哺乳动物为人和家畜。
6.一种药物组合物，其包含利用酶处理不溶性的β-葡聚糖而从酵母变异菌株(KTCT 0959BP)细胞壁获得的可溶性葡聚糖低聚物，所述组合物可用于治疗和预防人和哺乳动物中由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的疾病。
7.一种保健食品，其包括作为一种活性组分的得自酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，以及饮食上可接受的添加剂，所述保健食品可用于预防和改善由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的哺乳动物疾病。
全文摘要
本发明涉及分子量介于1,000－10,000的可溶性葡聚糖低聚物，其通过利用市场上可购买的β－葡聚糖水解酶处理酵母变异IS2的分离细胞壁的不溶性β－葡聚糖而制得。所述可溶性葡聚糖低聚物对流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒的活性表现出潜在的抑制功效，因此，它可以作为治疗剂或保健食品用于治疗和预防由于感染流感病毒和可传播的肠胃炎冠状病毒而引起的哺乳动物疾病。
文档编号A61K31/716GK1809366SQ200480017555
公开日2006年7月26日 申请日期2004年6月23日 优先权日2003年6月23日
发明者文元国, 金东右, 朴正勋, 郑凤铉 申请人:天然F&P公司