专利名称：二唾液酸十一糖链天冬酰胺－脂肪酸酰胺、含有该化合物的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺、含有该化合物的组合物或药物。
背景技术：
流感是每年都在世界中流行的传染病，尽管有疫苗，但是每年还是有很多人被传染，为发烧、头痛、筋关节痛等烦恼。另外，作为并发症的流感脑炎·脑症会导致最坏的情况死亡。尽管存在疫苗，但到目前为止流感病毒仍然成为人们恐惧的原因是由于流感病毒容易发生基因突变，抗原的形式发生变化，由疫苗在体内增加的抗体不能识别那些变化的抗原，所以疫苗的效果降低。即使每年都在某种程度上预测什么样的流感可能流行，问题是由于有时新型病毒突然发生，不能迅速供给相应的疫苗。所以必须开发对于多种流感病毒都有效的特效药。近年来，流感病毒的感染机制、在分子·基因水平上的阐明由于科学技术的飞跃进步能够实现，各种各样的流感病毒感染抑制剂的合成正在研究中。
流感病毒的感染、增殖的机制如下所述。首先，病毒侵入生物体内，当接近宿主细胞时，病毒表层上的称为血细胞凝集素的3聚体蛋白质与宿主细胞上的受体唾液酸糖链特异结合。唾液酸糖链在末端含有唾液酸，主要是这个唾液酸参与与血细胞凝集素的结合。然后，病毒与宿主细胞的膜发生融合，病毒的RNA流入到宿主细胞内，接下来病毒基因在宿主细胞内被复制，出现子代病毒。然后病毒出芽到宿主细胞外，完成增殖。当病毒出芽时，血细胞凝集素与唾液酸糖链再度结合，处于同一病毒表层上的称为唾液酸酶的酶将唾液酸从唾液酸糖链上切下，可以进行出芽。
近年来，已经制作了可以抑制在该病毒感染的最终阶段发生的唾液酸酶反应作用的新的治疗药。其为ザナミビル(商品名リレンザ、グラクソ·ウエルカム公司)和磷酸オセルタミビル(商品名タミフル、日本ロシエ公司)。然而，由于这两个唾液酸酶抑制剂抑制感染的最终阶段，所以当病毒增殖达到高峰之后效果小，所以希望发病后48小时以内给药。由于这一原因，作为有效的治疗药，希望合成能够抑制病毒结合到宿主细胞的最初阶段的化合物。
在血细胞凝集素抑制剂的开发中，已知与单价性的唾液酸糖链衍生物相比，分子内具有多个唾液酸糖链的多价性唾液酸糖链衍生物对流感病毒具有更高的抑制作用。这是由于对于病毒表面上存在的许多血细胞凝集素，与多个单价性唾液酸糖链衍生物结合相比，分子内结合了多个唾液酸糖链衍生物的多价性分子结合一方可以增大配体与受体的亲和力的缘故。
到现在为止，合成了很多预期具有这样效果的多价性唾液酸糖链衍生物。蟹江等人合成了结合了唾液酸乳糖的苯乙烯聚合物(1)，并进行了与流感的结合的研究，与作为唾液酸糖链蛋白质的胎球蛋白相比，具有1000倍的强抑制活性。
另外，Whitesides等人合成了结合了唾液酸衍生物的聚丙烯酰胺聚合物(2)，表明越是高分子聚合物抑制活性越高。
然而，作为高分子化合物的聚合物由于是具有各种各样分子量的聚合物的混合物，结构还没有搞清楚。另外，如果该化合物内含有具有60KDa以上分子量的分子，这些化合物由于分子量过大，在肾脏的马耳皮基小体中不能通过肾小球囊，由于不能排出体外，所以残存在体内，使肝脏中的代谢平衡破坏，有对人体造成伤害的可能性。因此，即使实际上这样的聚合物型的化合物是有效的流感感染抑制剂，由于安全性方面存在问题，FDA(The Food Drug Administration)也不承认。
本发明的目的在于提供新型的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺、含有该化合物的组合物或药物。
另外本发明的目的还在于提供具有优异的病毒感染和/或增殖抑制作用的流感病毒感染病等病毒疾病的预防剂和/或治疗剂。
发明内容
本发明涉及二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺。
另外本发明涉及含有二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺的组合物或药物。
另外本发明涉及含有二唾液酸十一糖链天冬酰胺的药物。
本发明的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺是使二唾液酸十一糖链天冬酰胺与脂肪酸反应获得的化合物。
二唾液酸十一糖链天冬酰胺是如下所示的糖链天冬酰胺(3)
该二唾液酸十一糖链天冬酰胺可以根据例如特愿2002-196821的参考例1合成。
在本发明中作为构成脂肪酸酰胺的脂肪酸，可以列举碳数6～32的脂肪族饱和或脂肪族不饱和脂肪酸以及并用2种以上这样的脂肪酸。作为脂肪族饱和脂肪酸，可以列举直链或支链的己酸(己酸、2-乙基丁酸等)、庚酸(庚酸等)、辛酸(辛酸、2-乙基己酸等)、壬酸(壬酸等)、癸酸(癸酸等)、十一烷酸(十一酸等)、十二烷酸(月桂酸、2-乙基癸酸等)、十三烷酸(十三酸等)、十四烷酸(肉豆蔻酸等)、十六烷酸(棕榈酸等)、十八烷酸(硬脂酸等)、二十烷酸(花生酸等)、二十二烷酸(山萮酸等)、二十四烷酸(二十四酸等)等。
作为脂肪族不饱和脂肪酸，可以列举直链或支链的辛烯酸、癸烯酸、十一碳烯酸(十一烯酸等)、十二碳烯酸、十八碳烯酸(油酸、反油酸等)、亚油酸以及亚麻酸等。这些脂肪酸中优选碳数为8～24、更优选碳数10～22的脂肪酸，特别优选癸酸、十二碳酸、十四碳酸、十六碳酸、十八碳酸、二十碳酸、二十二碳酸以及十八碳烯酸，作为直链脂肪酸最优选的是辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸和油酸。
二唾液酸十一糖链天冬酰胺与脂肪酸的反应优选是在反应活化剂存在下反应。作为反应活化剂，可以列举例如N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑(HOBT)等。
二唾液酸十一糖链天冬酰胺与脂肪酸的反应比例，相对于1摩尔二唾液酸十一糖链天冬酰胺优选使用约0.1～10摩尔脂肪酸。反应活化剂相对于1摩尔二唾液酸十一糖链天冬酰胺优选使用约0.1～10摩尔。反应通常在0～80℃下进行，优选10～60℃，通常在约10分钟～5小时内结束。
得到的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺可以通过例如过滤、高效液相色谱(HPLC)等纯化。这些化合物可以通过NMR、HPLC(ODS柱)中UV的检测时间等进行鉴定。
本发明的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺由于同时兼有二唾液酸十一糖链天冬酰胺的亲水基团和具有长碳链的脂肪酸的疏水基团，所以在水溶液中容易发生如图1所表示的胶束化，可以得到低分子型，分子量、结构明确的多价性糖链天冬酰胺衍生物。
如果如上所述利用单价性分子的胶束化，分子量没有差异，化合物被控制在低分子，与聚合物相比可以比较简单地合成。而通过胶束化，做成多价性，可以对例如流感病毒表现出极优异的抑制活性。
本发明的药物是作为有效成分含有上述二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺的药物。另外本发明的药物是作为有效成分含有二唾液酸十一糖链天冬酰胺的药物。
本发明的药物是以含有上述有效成分和制剂用添加物(载体、赋形剂等)的药物组合物的方式提供的。作为载体可以列举乳糖、甘油等。作为赋形剂可以列举乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等。药物中有效成分的量约为0.01～95重量％、优选约1～80重量％。
本发明的药物给药途径没有特别限定，无论是经口给药或非经口给药(例如肌肉内给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药、向鼻腔等的粘膜给药、或吸入给药等)哪一种方式都可以。本发明的药物的形态没有特别限定，作为用于经口给药的制剂，可以列举例如片剂、胶囊、细粒剂、粉末剂、颗粒剂、液剂、糖浆等，作为用于非经口给药的制剂，可以列举例如注射剂、点滴剂、坐剂、吸入剂、经粘膜吸收剂、经皮吸收剂、点鼻剂、点耳剂等。
本发明的药物的形态、可使用的制剂用添加物、制剂的制造方法等本领域技术人员都可以适当选择。本发明的药物给药量可以在综合考虑了患者的性别、年龄或体重、症状的重症度、预防或治疗的给药目的、或有无其他并发症等之后适当选择。给药量一般是0.001μg/kg体重/日～1000μg/kg体重/日，优选0.001μg/kg体重/日～100μg/kg体重/日。
图1是表示二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺的胶束的图。
图2是表示实施例1～4的各个二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺的化学式的图。
图3是表示Dansyl-LacNAc的唾液酸化的反应方式图。
图4是表示以各个抑制剂的唾液酸量作为基准的唾液酸酶抑制活性的图。
图5是表示以各个抑制剂的摩尔浓度作为基准的唾液酸酶抑制活性的图。
具体实施例方式
以下举出参考例、实施例、试验例，对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于这些例子。
1H-NMR用Bruker的AVANCE 400(表记为400MHz)进行测定。使用重溶剂时用溶剂峰作为基准。化学位移用δ(ppm)表示，结合常数用J(Hz)表示。作为反应检测用(以下表示为TLC)使用E.Merck公司生产DC-Platten Kiesegel 60 F254(Art 1，05715)。高效液相色谱(HPLC)柱使用ナカライテスク公司的COSMOSIL PACKED ODSCOLUMN(φ4.6×150mm)、昭和电工公司生产的Shodex C18-5B。分光荧光光度计使用JASCO公司生产的FP-210 Spectrofluorometer。
参考例1二唾液酸十一糖链天冬酰胺-1的合成使粗纯化的SGP(唾液酸糖肽)(238.3mg，80.6μmol)和叠氮化钠(4.77mg，80.8μmol)溶解于7.15ml Tris-盐酸-氯化钙缓冲液(TRIZUMA BASE 0.05mol/l，氯化钙0.01mol/l，pH＝7.5)。然后向该溶液中加肌动蛋白酶(アクチナ一ゼ)-E(53.8mg)，于37℃下使其反应。165小时后，用TLC确认反应结束后，进行过滤，将滤液冷冻干燥。冷冻干燥后，将残留物用凝胶过滤柱色谱(sephadex G-25φ2.5cm×100cm)进行纯化，得到目的物天冬酰胺二唾液酸十一糖1(收量100.5mg，收率53％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ5.22(1H，s，Man 4-H1)，5.16(1H，d，J＝9.6Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.86(1H，s，Man 3-H1)，4.70-4.68(3H，m，Glc NAc2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.53(2H，d，J＝6.7Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.28(1H，b d，Man 4’-H2)，4.20(1H，b d，Man 4-H2)，3.03(2H，dd，J＝4.2Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.95(2H，dd，J＝6.9Hz，17.1Hz，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，J＝4.6H2，12.4Hz，NeuAc 7，7’-H3eq)，2.14(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.2Hz，12.1Hz，NeuAc 7，7’-H3ax)实施例1二唾液酸十一糖链天冬酰胺-癸酸酰胺3的合成将癸酸(22mg，127.6μmol)溶解于1ml二甲基甲酰胺中，然后加入二环己基碳二亚胺(23.9mg，115.8μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(13.4mg，116.4μmol)，于室温下反应。6小时后进行过滤，对滤液进行浓缩，取出残留物(癸酸琥珀酰亚胺体)。然后，将天冬酰胺二唾液酸十一糖1(10.0mg，4.27μmol)溶解于0.8ml水中，然后加入碳酸氢钠(1.4mg，16.7μmol)。再加入溶于1.2ml丙酮的癸酸琥珀酰亚胺体(3.2mg，11.8μmol)，于室温下进行搅拌。180分钟后通过TLC确认原料消失后，对溶液进行冷冻干燥。冷冻干燥后，将残留物用凝胶过滤柱色谱(sephadex G-25 φ1.0cm×20cm)进行纯化，进行冷冻干燥。冷冻干燥后，用高效液相色谱(ODS柱φ4.6×150mm，洗脱溶剂为60分钟内水100％→乙腈100％的梯度，流速1.0ml/min)进行纯化，得到目的物癸酸-天冬酰胺二唾液酸十一糖3(收量7.7mg，收率72％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.12(1H，d，J＝9.6Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.87(1H，s，Man 3-H1)，4.71-4.69(3H，m，Glc NAc 2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.59(1H，dd，J＝4.5Hz，8.0Hz，Asn-αCH)，4.53(2H，d，J＝7.9Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.29(1H，b d，Man 4’-H2)，4.21(1H，b d，Man 4-H2)，2.88(2H，dd，J＝4.4Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.78-2.70(3H，m，Neu Ac 7，7’-H3eq，Asn-βCH)，2.34(2H，t，J＝7.4Hz，COCH2)，2.14(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.2Hz，12.0Hz，NeuAc 7，7’-H3ax)，1.71-1.60(2H，m，CH2)，1.42-1.30(12H，m，CH2)，0.95(3H，t，J＝6.5Hz，CH3)实施例2二唾液酸十一天冬酰胺-肉豆蔻酸酰胺4的合成将肉豆蔻酸(22.0mg，96.3μmol)溶解于1ml二甲基甲酰胺中，然后加入二环己基碳二亚胺(18.2mg，88.2μmol)和N-羟基苯并三唑(11.9mg，96.7μmol)，于室温下反应。6小时后进行过滤，对滤液进行浓缩，取出残留物(肉豆蔻酸苯并三唑体)。然后，将天冬酰胺二唾液酸十一糖1(6mg，2.57μmol)溶解于0.8ml水中，然后加入碳酸氢钠(0.86mg，10.3μmol)。再加入溶于1.2ml丙酮的肉豆蔻酸苯并三唑体(2.8mg，7.70μmol)，于室温下进行搅拌。180分钟后通过TLC确认原料消失后，对溶液进行冷冻干燥。冷冻干燥后，将残留物用凝胶过滤柱色谱(sephadex G-25 φ1.0cm×20cm)进行纯化，进行冷冻干燥。冷冻干燥后，用高效液相色谱(ODS柱φ4.6×150mm，洗脱溶剂为60分钟内水100％→乙腈100％的梯度，流速1.0ml/min)进行纯化，得到目的物肉豆蔻酸-天冬酰胺二唾液酸十一糖4(收量5.3mg，收率81％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.12(1H，d，J＝9.6Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.87(1H，s，Man 3-H1)，4.70-4.69(3H，m，Glc NAc 2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.59(1H，dd，J＝4.6Hz，8.1Hz，Asn-αCH)，4.54(2H，d，J＝7.8Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.29(1H，b d，Man 4’-H2)，4.20(1H，b d，Man 4-H2)，2.88(2H，dd，J＝4.6Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.83-2.70(3H，m，Neu Ac 7，7’-H3eq，Asn-βCH)，2.34(2H，t，J＝7.4Hz，COCH2)，2.14(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc 7，7’-H3ax)，1.71-1.60(2H，m，CH2)，1.42-1.30(20H，m，CH2)，0.95(3H，t，J＝6.5Hz，CH3)实施例3二唾液酸十-天冬酰胺-硬脂酸酰胺5的合成将硬脂酸(22.0mg，77.3μmol)溶解于1ml二甲基甲酰胺中，然后加入二环己基碳二亚胺(14.4mg，69.8μmol)和N-羟基苯并三唑(9.5mg，77.2μmol)，于室温下反应。6小时后进行过滤，对滤液进行浓缩，取出残留物(硬脂酸苯并三唑体)。然后，将天冬酰胺二唾液酸十一糖1(8.0mg，3.36μmol)溶解于1.2ml水中，然后加入碳酸氢钠(3.2mg，38.1μmol)。再加入溶于1.8ml丙酮的硬脂酸苯并三唑体(8.8mg，20.2μmol)，于37℃下进行搅拌。195分钟后通过TLC确认反应结束后，对溶液进行冷冻干燥。冷冻干燥后，将残留物用凝胶过滤柱色谱(sephadex G-25 φ1.0cm×20cm)进行纯化，进行冷冻干燥。冷冻干燥后，用高效液相色谱(ODS柱φ4.6×150mm，洗脱溶剂为60分钟内水100％→乙腈100％的梯度，流速1.0ml/min)进行纯化，得到目的物硬脂酸-天冬酰胺二唾液酸十一糖5(收量6.2mg，收率69％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.12(1H，d，J＝9.5Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.86(1H，s，Man 3-H1)，4.71-4.69(3H，m，Glc NAc 2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.59(1H，dd，J＝4.6Hz，8.2Hz，Asn-αCH)，4.54(2H，d，J＝7.8Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.29(1H，b d，Man 4-H2)，4.20(1H，b d，Man 4-H2)，2.88(2H，dd，J＝4.7Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.78-2.70(3H，m，Neu Ac 7，7’-H3eq，Asn-βCH)，2.34(2H，t，J＝7.3Hz，COCH2)，2.16(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc 7，7’-H3ax)，1.71-1.60(2H，m，CH2)，1.42-1.30(28H，m，CH2)，0.96(3H，t，J＝6.7Hz，CH3)实施例4二唾液酸十一天冬酰胺山萮酸酰胺6的合成将山萮酸(20.0mg，58.7μmol)溶解于3ml二甲基甲酰胺中，然后加入二环己基碳二亚胺(10.3mg，50.0μmol)和N-羟基苯并三唑(6.8mg，50.3μmol)，于室温下反应。19小时后进行过滤，对滤液进行浓缩，取出残留物(山萮酸苯并三唑体)。然后，将天冬酰胺二唾液酸十一糖1(5mg，2.1μmol)溶解于1.2ml水中，然后加入碳酸氢钠(2.0mg，21.0μmol)。再加入溶于1.8ml丙酮的山萮酸苯并三唑体(8.8mg，18.9μmol)，于37℃下进行搅拌。20小时后通过TLC确认反应结束后，对溶液进行冷冻干燥。冷冻干燥后，将残留物用凝胶过滤柱色谱(sephadex G-25 φ1.0cm×20cm)进行纯化，进行冷冻干燥。冷冻干燥后，用高效液相色谱(ODS柱φ4.6×150mm，洗脱溶剂为60分钟内水100％→乙腈100％的梯度，流速1.0ml/min)进行纯化，得到目的物山萮酸-天冬酰胺二唾液酸十一糖6(收量3.24mg，收率57％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)(δ5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.12(1H，d，J＝9.2Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.86(1H，s，Man 3-H1)，4.70-4.69(3H，m，Glc NAc 2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.59(1H，dd，J＝4.5Hz，8.0Hz，Asn-αCH)，4.54(2H，d，J＝7.4Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.29(1H，b d，Man 4’-H2)，4.21(1H，b d，Man 4-H2)，2.88(2H，dd，J＝4.4Hz，16.4Hz，Asn-βCH)，2.78-2.70(3H，m，NeuAc 7，7’-H3eq，Asn-βCH)，2.35(2H，t，J＝7.3Hz，COCH2)，2.13(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.1Hz，12.0Hz，NeuAc7，7’-H3ax)，1.71-1.60(2H，m，CH2)，1.42-1.30(36H，m，CHx)，0.95(3H，t，J＝6.6Hz，CH3)上述实施例1～4的各个二唾液酸十一天冬酰胺-脂肪酸酰胺的化学式如图2所示。
试验例1流感病毒感染抑制剂的唾液酸酶抑制活性的测定(1)荧光标记的N-乙酰乳糖胺衍生物的唾液酸化对二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺在水溶液中实际上是否胶束化进行研究。因此测定对荧光标记的唾液酸糖链的唾液酸酶抑制活性，求IC50。对于荧光标记的唾液酸糖链7分别使二唾液酸十一糖链天冬酰胺1以及合成的4个糖脂质衍生物共存，测定唾液酸酶抑制活性，如果抑制活性随碳链长度增加而增加的话，那么该现象可以认为是胶束化的效果。首先合成荧光标记的唾液酸糖链。在荧光标记中使用Dansyl基。合成对N-乙酰乳糖胺衍生物进行Dansyl标记的6-[(N-Dansyl)氨基]-己基-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(以后表记为Dansyl-LacNAc)，然后使用α(2，6)唾液酸转移酶将唾液酸转移到半乳糖上，合成Dansyl标记的唾液酸糖链(以后表记为NeuAc-LacNAc-Dansyl)。
将Dansyl-LacNAc、CMP-唾液酸、α(2，6)唾液酸转移酶、碱性磷酸酶、牛血清白蛋白溶解于二甲胂酸缓冲液(pH6.0，50mM)，于37℃下反应65小时，通过高效液相色谱进行纯化，可以得到NeuAc-LacNAc-Dansy17，收率为69％。在测定化合物7的1HNMR时，可以确认2.74ppm、1.80ppm分别为唾液酸中特有的峰的3位的赤道(equatorial)、轴向的质子峰。与原料Dansyl-LacNAc的1HNMR比较可知由于7的半乳糖1位的质子峰与原料的峰相比，漂移到高磁场，所以唾液酸结合在半乳糖6位上。通过上述那样操作对化合物7进行了鉴定。图3给出了上述反应。
(2)二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺的唾液酸酶抑制活性测定在通过唾液酸酶使NeuAc-LacNAc-Dansyl水解的实验中，作为抑制剂分别加入合成的糖脂质衍生物3、4、5、6以及唾液酸乳糖、二唾液酸十一糖链天冬酰胺1，求对应于各个抑制剂的IC50。反应条件如下所述。向100μM的NeuAc-LacNAc-Dansyl中按照10μM、100μM、300μM的3个条件加入各个抑制剂(溶剂为溶解了牛血清白蛋白的HEPES缓冲液)，然后加唾液酸酶，于37℃下温育30分钟。然后通过高效液相色谱对荧光标记的NeuAc-LacNAc-Dansyl的分辨率进行定量，由该结果算出IC50。将该结果按照底物类别归纳为曲线。这些曲线的纵轴是使酶反应抑制50％所必需的抑制剂浓度(IC50)。图4中的曲线是相对于系统内的唾液酸量求IC50得到的。天冬酰胺二唾液酸十一糖由于分子内含有2个唾液酸，所以求得的IC50的实测值是唾液酸的量的2倍。结果如图4所示。
相对于抑制剂本身的摩尔浓度求实测的IC50，唾液酸乳糖以外的抑制剂的IC50为图4值的一半(图5)。由图4中的曲线可知，碳链最短的癸酸作为疏水基团只与天冬酰胺二唾液酸十一糖1结合，IC50的值为没有结合疏水基团的二唾液酸十一糖链天冬酰胺1值的3/4。这样的现象可以认为疏水基团的羧酸与作为亲水基团的二唾液酸十一糖链天冬酰胺结合，该化合物进行胶束化，一个分子内含有多个二唾液酸十一糖链天冬酰胺，所以被唾液酸酶囚禁的频率上升，抑制NeuAc-LacNAc-Dansyl的唾液酸除去的力提高。另外判明疏水基的碳链越长(癸酸→肉豆蔻酸→硬脂酸→山萮酸)，IC50的值系统性地变小。这被认为是由于疏水基的碳链越长，胶束体的表面积上升，其分子表面内含有的二唾液酸十一糖链天冬酰胺的数量上升，因此抑制NeuAc-LacNAc-Dansyl的唾液酸水解的能力提高。由图5可知分子内的唾液酸乳糖系只是增加一个，就可提高对唾液酸酶的抑制活性，而且碳链越长，其效果会变得更强。
(3)二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺的流感病毒抑制活性测定作为抑制剂分别加入实施例1～4的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺(图2的衍生物3、4、5、6)，求对应的流感病毒(血细胞凝集素)抑制活性。反应条件如下所述。
使用的流感病毒是A/ニエ一カレドニア/20/99(H1N1)。
向鸡受精卵接种，采取小尿膜液(レょう尿膜液)，进行超离心纯化，将经福尔马林钝化的样品作为纯化病毒抗原使用。对该抗原进行醚处理之后，将收集了HA(血细胞凝集素)级分的组分作为HA分离级分。
1)将上述图2的衍生物3、4、5、6各2mg溶解于PBS 1ml中。
2)将样品用PBS稀释成原液、2倍、4倍、8倍。
3)于96孔U板(三光纯药)将样品各10μl和病毒稀释液40μl混合。
4)于4℃下静置60分钟。
5)向混合物中加50μl PBS，制作50μl的2倍阶段稀释液。
6)将鸡红细胞(日本生物检测研究所)调整到0.5％。
7)向各个孔添加血细胞悬浮液50μl，混合后于4℃下静置60分钟。
8)测定流感病毒(血细胞凝集素)抑制活性，结果表明衍生物3在190.0μmol、衍生物4在95.0μmol、衍生物5在47.5μmol、衍生物6在37.5μmol下表现出抑制活性。
本发明的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺以及二唾液酸十一糖链天冬酰胺具有特别优异的病毒感染和/或增殖抑制作用，作为例如流感病毒感染病等的病毒疾病的预防剂和/或治疗剂发挥优异的效果。
权利要求
1.二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺。
2.权利要求1所述的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺，其中脂肪酸是碳数为8～24的脂肪酸。
3.权利要求2所述的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺，其中脂肪酸是碳数为10～22的脂肪酸。
4.权利要求3所述的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺，其中脂肪酸是从癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸以及油酸中选择的一种以上的脂肪酸。
5.含有权利要求1～4任一项所述的二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺以及制剂用添加物的组合物。
6.权利要求5所述的组合物，其中制剂用添加物是从乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇中选择的一种以上的添加物。
7.含有二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺的药物。
8.含有从二唾液酸十一糖链天冬酰胺-脂肪酸酰胺以及二唾液酸十一糖链天冬酰胺中选择的一种以上以及制剂用添加物的药物。
9.权利要求7或8所述的药物，其是病毒疾病的预防剂和/或治疗剂。
10.权利要求7～9任一项所述的药物，其是流感病毒感染病的预防剂和/或治疗剂。
全文摘要
本发明涉及二唾液酸十一糖链天冬酰胺－脂肪酸酰胺、含有其的药物以及含有二唾液酸十一糖链天冬酰胺的药物。
文档编号A61P31/16GK1809594SQ20048001744
公开日2006年7月26日 申请日期2004年6月29日 优先权日2003年6月30日
发明者梶原康宏, 前田广景, 深江一博 申请人:大塚化学株式会社, 梶原康宏