脂肪胺的微生物生产的制作方法

脂肪胺的微生物生产的制作方法
【专利摘要】本发明公开涉及用于脂肪胺及其衍生物的生产的重组微生物有机体。本发明进一步考虑了培养的重组宿主细胞以及通过使用这些宿主细胞生产脂肪胺的方法。
【专利说明】
脂肪胺的微生物生产
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年12月5日提交的美国临时申请号61/912,184的权益，该申请的 内容全部W引用方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明公开设及用于脂肪胺及其衍生物生产的重组微生物有机体。另外包括表达 生物合成的蛋白质的重组宿主细胞，其中所述的生物合成的蛋白质在体内将脂肪醒转化成 脂肪胺。本发明公开还涵盖了通过使用表达运些生物合成的蛋白质的宿主细胞来生产脂肪 胺的方法。
【背景技术】
[0004] 脂肪胺是脂肪酸、締控或醇的氮衍生物。它们由天然脂肪或油形成，或者由合成的 或石油化工原材料形成。今天，运些化合物主要通过甘油=醋（例如动物脂或植物油（例如 挪子油、芥花油和菜巧油））的化学改性来生产。
[0005] 市售可得的脂肪胺是由碳链或特定链长(范围为Cs至C22)的混合物形成的。通常， 根据氨分子的氨原子被脂肪烷基或甲基基团替代的数量，脂肪胺分为伯胺、仲胺和叔胺。已 知脂肪胺是通过物理键合或化学键合而强烈地粘附在表面上的阳离子表面活性化合物。许 多市售的产品是使用脂肪胺作为反应中间体而制备的。例如脂肪胺用作表面活性剂和个人 护理产品（例如洗发剂和调理剂）的成分。脂肪胺的最大的市场是织物柔软剂和洗涂剂。月旨 肪胺还用作发泡剂和润湿剂，抗静电剂(在纺织和塑料工业中），润滑剂，涂料增稠剂，油田 化学品，渐青乳化剂，石油添加剂，腐蚀抑制剂，汽油和燃油添加剂，浮选剂，颜料润湿剂，环 氧树脂固化剂，杀虫剂等（参见Visek K. (SOOS)^tty Amines;Kirk-〇thmer Encyclopedia of Chemic曰I Technology)。
[0006] 通过微生物发酵生产脂肪胺提供了许多益处，例如提供了更一致的组成，W较低 的成本制造，和降低对环境的影响。此外，开启了除了目前使用的天然脂肪和油、W及合成 的或石油化工原材料W外的多样的新原料。目前，没有用于脂肪胺的微生物生产的有效的 方法。本发明公开解决了运种需要。
[0007] 发明概述
[000引本发明公开的一个方面提供了用于脂肪胺生产的重组微生物有机体，包含用于将 脂肪醒转化成脂肪胺的改造的代谢途径。在此，所述的重组微生物有机体具有用于将脂肪 醒转化成脂肪胺的改造的代谢途径，包括具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性的外源生物合成 酶。在一个实施方案中，外源的生物合成酶是腐胺氨基转移酶，例如YgjG。在另一个实施方 案中，外源的生物合成酶是GABA氨基转移酶，例如化UEsYgjG是由在重组微生物有机体或重 组微生物细胞中表达的编码ygjG基因的核酸序列编码。相似地，PimE是由在重组微生物有 机体或重组微生物细胞中表达的编码PimE基因的核酸序列编码。在另一个实施方案中，外 源的生物合成酶是胺脱氨酶，例如得自脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的甲基胺 脱氨酶。重组微生物有机体或重组微生物细胞在体内或在细胞内生产脂肪胺。脂肪胺重组 微生物有机体或重组微生物细胞释放至培养基中。在一个实施方案中，重组微生物有机体 或微生物细胞为重组细菌细胞。
[0009] 本发明公开的另一个方面提供了用于脂肪胺生产的重组微生物有机体，包含用于 将脂肪醒转化成脂肪胺的改造的代谢途径。重组微生物有机体具有用于将脂肪醒转化成脂 肪胺的第一改造的代谢途径，包括具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性的外源生物合成酶(如 上）。在一个实施方案中，重组微生物有机体具有用于将酷基-ACP或酷基-CoA转化成脂肪酸 的另一种或第二改造的代谢途径。第二改造的代谢途径是可任选的。在此，通过具有硫醋酶 活性的生物合成酶，酷基-ACP或酷基-CoA转化成脂肪酸。在一个实施方案中，具有硫醋酶活 性的生物合成酶是由在重组微生物有机体或微生物细胞中表达的编码tesA基因的核酸序 列所编码。重组微生物有机体或重组微生物细胞在体内或在细胞内生产脂肪胺。脂肪胺被 重组微生物有机体或重组微生物细胞释放至培养基中。在一个实施方案中，重组微生物有 机体或微生物细胞为重组细菌细胞。
[0010] 本发明公开的另一个方面提供了用于脂肪胺生产的重组微生物有机体，包含用于 将脂肪醒转化成脂肪胺的第一改造的代谢途径。重组微生物有机体具有用于将脂肪醒转化 成脂肪胺的第一改造的代谢途径，包括具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性的外源生物合成酶 (如上）。在一个实施方案中，重组微生物有机体具有用于将酷基-ACP或酷基-CoA转化成脂 肪酸的另一种或第二改造的代谢途径(如上）。在另一个实施方案中，重组微生物有机体还 具有用于将脂肪酸转化成脂肪醒的另一种或第=改造的代谢途径。运种第=改造的代谢途 径是可任选的，并且与第二改造的代谢途径无关。在此，通过具有簇酸还原酶(CAR)活性的 生物合成酶，脂肪酸转化成脂肪醒。在一个实施方案中，具有CAR活性的生物合成酶是由在 重组微生物有机体或微生物细胞中表达的编码Ca巧基因的核酸序列所编码。重组微生物有 机体或重组微生物细胞在体内或在细胞内生产脂肪胺。脂肪胺被重组微生物有机体或重组 微生物细胞释放至培养基中。在一个实施方案中，重组微生物有机体或微生物细胞为重组 细菌细胞。
[0011] 本发明公开的另一个方面提供了用于脂肪胺生产的重组细菌细胞，其包含编码具 有硫醋酶活性的外源生物合成酶的一个或多个表达的基因；编码具有簇酸还原酶活性的外 源生物合成酶的一个或多个表达的基因；W及编码具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性的外源 生物合成酶的一个或多个表达的基因，其中所述的重组细菌细胞在体内或在细菌细胞内生 产脂肪胺。脂肪胺被重组细菌细胞释放至培养基中。在此，具有硫醋酶活性的外源生物合成 酶将酷基-ACP或酷基-CoA转化成脂肪酸。具有簇酸还原酶(CAR)活性的外源生物合成酶将 脂肪酸转化成脂肪醒。具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性的外源生物合成酶将脂肪醒转化成 脂肪胺。在一个实施方案中，具有硫醋酶活性的外源生物合成酶是由编码tesA基因的核酸 序列所编码。在另一个实施方案中，具有CAR活性的外源生物合成酶是由编码Ca巧基因的核 酸序列所编码。在另一个实施方案中，具有氨基转移酶活性的外源生物合成酶为腐胺氨基 转移酶，例如YgjG或GABA氨基转移酶例如化证。YgjG是由编码ygjG基因的核酸序列所编码。 化UE是由编码PimE基因的核酸序列所编码。在另一个实施方案中，具有胺脱氨酶活性的外 源生物合成酶为甲基胺脱氨酶，例如得自脱氮副球菌的甲基胺脱氨酶。
[0012] 本发明公开的另一个方面提供了用于脂肪胺生产的重组细菌细胞，包含编码具有 硫醋酶活性而将酷基-ACP或酷基-CoA转化成脂肪酸的外源生物合成酶的一个或多个表达 的基因；编码具有簇酸还原酶活性(CAR)而将脂肪酸转化成脂肪醒的外源生物合成酶的一 个或多个表达的基因；W及编码具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性而将脂肪醒转化成脂肪胺 的外源生物合成酶的一个或多个表达的基因，其中所述的重组细菌细胞在体内或在细菌细 胞内生产脂肪胺。在一个实施方案中，具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性的外源生物合成酶 为腐胺氨基转移酶，例如YgjG。在另一个实施方案中，具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性的外 源生物合成酶为GABA氨基转移酶，例如化UEsYgjG是由在重组细菌细胞中表达的编码ygjG 基因的核酸序列编码。相似地，PimE是由在重组细菌细胞中表达的编码PimE基因的核酸序 列编码。在另一个实施方案中，具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性的外源生物合成酶是胺脱 氨酶，例如得自脱氮副球菌的甲基胺脱氨酶。在一个实施方案中，具有硫醋酶活性的外源生 物合成酶是由编码tesA基因的核酸序列所编码。在另一个实施方案中，具有CAR活性的外源 生物合成酶是由编码Ca巧基因的核酸序列所编码。重组细菌细胞在体内或在细胞内生产脂 肪胺。脂肪胺重组细菌细胞释放至培养基中。
[0013] 本发明公开进一步包括用于脂肪胺生产的重组细菌细胞，包含用于将酷基-ACP或 酷基-CoA转化成脂肪酸的第一改造的途径;用于将脂肪酸转化成脂肪醒的第二改造的代谢 途径；W及用于将脂肪醒转化成脂肪胺的第=改造的代谢途径，其中所述的重组细菌细胞 在体内或在细胞内生产脂肪胺。在一个实施方案中，酷基-ACP或酷基-CoA通过外源表达的 具有硫醋酶活性的生物合成酶而转化成脂肪酸；脂肪酸通过外源表达的具有簇酸还原酶 (CAR)活性的生物合成酶而转化成脂肪酸；W及脂肪醒通过外源表达的具有氨基转移酶或 胺脱氨酶活性的生物合成酶而转化成脂肪胺。在一个实施方案中，具有氨基转移酶或胺脱 氨酶活性的外源生物合成酶为腐胺氨基转移酶，例如化jG。在另一个实施方案中，具有氨基 转移酶或胺脱氨酶活性的外源生物合成酶为GABA氨基转移酶，例如化UEnYgjG是由在重组 细菌细胞中表达的编码ygjG基因的核酸序列编码。相似地，PuuE是由在重组细菌细胞中表 达的编码PimE基因的核酸序列编码。在另一个实施方案中，具有氨基转移酶或胺脱氨酶活 性的外源生物合成酶为胺脱氨酶，例如得自脱氮副球菌的甲基胺脱氨酶。在一个实施方案 中，具有硫醋酶活性的外源生物合成酶是由编码tesA基因的核酸序列所编码。在另一个实 施方案中，具有CAR活性的外源生物合成酶是由编码Ca巧基因的核酸序列所编码。重组细菌 细胞在体内或在细胞内生产脂肪胺。脂肪胺被重组细菌细胞释放至培养基中。
[0014] 本发明公开的另一个方面提供了用于脂肪胺生产的重组微生物有机体，包括但不 限于埃希氏菌属、芽抱杆菌属、蓝藻口、乳杆菌属、发酵单胞菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲 霉菌属、木霉属、脉抱菌属、镶刀菌属、腐质霉属、根毛霉菌属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、 毛霉菌属、毁丝菌属(Myceliophtora)、青霉属、毛平革菌、侧耳属、栓菌属、金抱子菌属、酵 母菌属、寡养单胞菌属（Steno化ophamonas)、裂殖酵母属、耶氏酵母属和链霉菌属。在一个 实施方案中，埃希氏菌属为大肠杆菌化scherichia coli)。在另一个实施方案中，蓝藻口包 括但不限于原绿球藻、聚球藻、集胞藻属、蓝杆藻和念珠藻(Nostoc punctiforme)。在另一 个实施方案中，蓝藻口包括但不限于细长聚球藻（Synechococ州S elongaUis)PCC7942、集 胞藻属的菌种PCC6803和聚球藻的菌种PCC7001。
[0015] 本发明公开的另一个方面提供了生产脂肪胺的方法，包括在包含碳源的发酵肉汤 中培养重组微生物有机体。微生物有机体涵盖了用于在体内生产脂肪胺的至少一种改造的 代谢途径(如上）。本发明公开的另一个方面提供了在重组细菌细胞中生产脂肪胺的方法， 包括在碳源存在下，在发酵肉汤中，培养表达用于生产脂肪胺的改造的代谢途径(如上）的 细胞;W及收获在发酵肉汤中收集的脂肪胺。
[0016] 本发明公开进一步涵盖了细胞培养物，其包含用于胺生产的重组微生物细胞(如 上）。在一个实施方案中，细胞培养物涵盖了用于胺生产的重组细菌细胞。在另一个实施方 案中，重组微生物细胞为重组细菌细胞。
[0017] 本发明公开的另一个方面提供了重组微生物有机体，其具有用于脂肪醒生产的改 造的代谢途径，和将脂肪醒转化成脂肪胺的生物合成酶，其中所述的生物合成酶具有氨基 转移酶/转氨酶或胺脱氨酶活性。在一个实施方案中，生物合成酶是腐胺氨基转移酶或GABA 氨基转移酶。在另一个实施方案中，生物合成酶为胺脱氨酶或胺氧化酶。
[0018] 本发明公开的另一个方面提供了重组微生物有机体，其具有用于脂肪醒生产的改 造的代谢途径和用于脂肪胺生产的改造的代谢途径，包括将脂肪醒转化成脂肪胺的生物合 成酶，其中所述的重组微生物有机体为微生物细胞。在一个方面中，微生物细胞为重组细 胞。微生物细胞包括但不限于埃希氏菌属、芽抱杆菌属、蓝藻口、乳杆菌属、发酵单胞菌属、 红球困属、假单胞困属、曲霉困属、木霉属、脉抱困属、镶刀困属、腐质霉属、根毛霉困属、克 鲁维酵母属、毕赤酵母属、毛霉菌属、毁丝菌属、青霉属、毛平革菌、侧耳属、栓菌属、金抱子 菌属、酵母菌属、寡养单胞菌属、裂殖酵母属、耶氏酵母属和链霉菌属。在一个实施方案中， 埃希氏菌属为大肠杆菌。在另一个实施方案中，蓝藻口包括但不限于原绿球藻、聚球藻、集 胞藻属、蓝杆藻和念珠藻。在另一个具体的实施方案中，蓝藻口为细长聚球藻P(X7942、集胞 藻属的菌种PCC6803、或聚球藻的菌种P(X7001。
[0019] 本发明公开的另一个方面提供了重组微生物有机体，其具有用于脂肪醒生产的改 造的代谢途径和用于脂肪胺生产的改造的代谢途径。在一个实施方案中，用于脂肪醒生产 的改造的代谢途径包括将脂肪酸转化成脂肪醒的硫醋酶和/或簇酸还原酶(CAR),而用于脂 肪胺生产的改造的代谢途径包括将脂肪醒转化成脂肪胺的氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨 酶。在一些实施方案中，硫醋酶是由编码tesA基因的核酸序列（具有或不具有前导序列）编 码的，而簇酸还原酶(CAR)是由编码Ca巧基因的核酸序列编码的，两者均在微生物有机体中 表达。在一个实施方案中，氨基转移酶/转氨酶为腐胺氨基转移酶或GABA氨基转移酶。在一 个实施方案中，腐胺氨基转移酶为YgjG,其是由在微生物有机体中表达的编码ygjG基因的 核酸序列编码。在另一个实施方案中，GABA氨基转移酶为化证，其是由在微生物有机体中表 达的编码PimE基因的核酸序列编码。在另一个实施方案中，胺脱氨酶为得自脱氮副球菌的 甲基胺脱氨酶。在一个实施方案中，脂肪胺被微生物有机体释放至上清液或培养基中。在另 一个实施方案中，脂肪胺从微生物有机体的内部收集，其中可W在发酵过程中或发酵过程 之后提取脂肪胺。
[0020] 本发明公开进一步考虑了生产脂肪胺的方法，包括在包含碳源的发酵肉汤中培养 重组微生物有机体，其中所述的重组微生物有机体包含用于脂肪醒生产的改造的代谢途 径，W及将脂肪醒转化成脂肪胺的生物合成酶，其中所述的生物合成酶具有氨基转移酶或 胺脱氨酶活性，并且其中所述的微生物有机体在体内生产脂肪胺。
[0021] 本发明公开进一步涵盖了重组微生物细胞，其包括一种或多种具有硫醋酶或簇酸 还原酶(CAR)活性的酶的表达；W及具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性的酶的表达，其中所述 的微生物细胞生产脂肪胺。在一个实施方案中，生物合成酶为腐胺氨基转移酶，例如化jG或 GABA氨基转移酶，例如化址。在另一个实施方案中，生物合成酶为胺脱氨酶，例如得自脱氮 副球菌的甲基胺脱氨酶。在另一个实施方案中，生物合成酶为胺氧化酶。
[0022] 此外，本发明公开的另一个方面提供了在重组的微生物有机体中生产脂肪胺的方 法。该方法包括在碳源存在下，在发酵培养基中培养微生物细胞(如上）；W及收获在上清液 或发酵培养基中收集的脂肪胺。重组微生物细胞表达用于脂肪醒生产的改造的代谢途径， W及将脂肪醒转化成脂肪胺的生物合成酶，其中所述的生物合成酶具有氨基转移酶或胺脱 氨酶活性。在另一个方面中，重组微生物细胞表达用于脂肪醒生产的改造的代谢途径，W及 用于胺生产的改造的代谢途径，包括将脂肪醒转化成脂肪胺的生物合成酶，其中所述的生 物合成酶具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性。
[0023] 本发明的公开的另一个方面提供了由碳源衍生的脂肪胺，其中所述的碳源不是石 油化工原材料。例如本发明公开提供了由可再生的原料衍生的脂肪胺，例如C〇2、CO、葡萄 糖、薦糖、木糖、阿拉伯糖、甘油、甘露糖或它们的混合物。本文所提供的可W衍生出脂肪胺 的其他原料包括淀粉、纤维素生物质、糖蜜和碳水化合物的其他来源(包括由纤维素生物质 的水解而衍生得到的碳水化合物混合物，或由植物或天然油处理衍生得到的废料）。
[0024] 附图简述
[0025] 当与附图相关联来阅读时，可W更好地理解本发明公开，其中附图起到说明优选 的实施方案的作用。但是应该理解的是本发明公开不限于附图中公开的具体的实施方案。
[0026] 图1为由微生物细胞提取物得到的MS/GC色谱，其示出了通过硫醋酶、簇酸还原酶 和氨基转移酶/转氨酶（中间一排）的表达而生产的独特的脂肪胺峰(参见在7.61分钟出的 中间面板，用箭头标记）。上方一排为F16阴性对照；中间一排为F16-YG样品；而下方一排为 YG阴性对照。在上方和中间一排的其他峰为脂肪醇。
[0027] 图2描绘了另一个MS/GC色谱，其示出了与1-十二烧胺参照标准品（下方一排）相 比，F16-YG样品（上方一排)的稀释图谱。在上方和中间一排的其他峰为脂肪醇。
[002引图3示出了由F16-YG样品（上方一排)和1-十二烧胺参照标准品（下方一排)得到的 7.6分钟峰的离子碎片图案。在上方一排中还示出了 1-十二烧胺的特征性离子碎片（包括 Cii出4N、Cio出2N、C姐20N )的分子结构。
[0029] 发明详述
[0030] 一般综述
[0031] 本发明公开设及脂肪胺的微生物生产，其代表了一种新类型的可再生化学产品。 脂肪胺是由微生物有机体生产的，其中所述的微生物有机体表达将脂肪醒转化成脂肪胺的 改造的代谢途径。由此，微生物有机体表达至少一种外源生物合成酶，从而在体内生产脂肪 胺。外源生物合成酶可W具有氨基转移酶或胺脱氨酶活性;或者簇酸还原酶(CAR)活性;硫 醋酶活性;或者它们的组合。本文还涵盖了酶活性的备选形式。
[0032] 定义
[0033] 除非内容中明确地作出另外的指示，如本说明书和所附的权利要求书所用，单数 形式"一"、"一个"和"一种"包括复数指示物。因此，例如"宿主细胞'包括两种或更多种此类 重组宿主细胞，"脂肪胺"包括一种或多种脂肪胺或胺的混合物，"核酸序列"包括一种或多 种核酸序列；"酶"包括一种或多种酶等。
[0034] 术语"改造的代谢途径"是指一种或多种基因改造的或优化的化学反应，其是由细 胞中表达的至少一种生物合成酶所催化的，从而在细胞的内部生产某种物质（或增加该物 质的生产）（即，前体、中间体或终产物）。在一个实施方案中，生物合成酶为外源生物合成 酶。在另一个实施方案中，改造的代谢途径允许所需的终产物的细胞生产。在另一个实施方 案中，改造的代谢途径允许所需的前体的细胞生产。在另一个实施方案中，改造的代谢途径 允许所需的中间体的细胞生产。
[0035] 当术语"在体内"在生产特定产物的内容中使用时，是指"在细胞的内部"。例如在 体内的脂肪胺的生产是指在细胞的内部的脂肪胺的生产。
[0036] 本文中所指的序列编号得自由NCBI (National Center for Biotechnology Information)提供的数据库，其由the 化tional Institutes of Health,U.S.A.维护（该 编号在本文中确认为"NCBI编号"或备选地确认为"GenBank编号"），W及得自由the Swiss Institute of Bioinformatics提供的UniProt Knowledgebase(UniProtKB)和Swiss-Prot 数据库(该编号在本文中确认为"UniProt邸编号"）。
[0037] 酶分类化C)号由the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(IUBMB)建立，其描述可W在国际互联网的 IUBMB Enzyme Nomencla化re网站上获得。EC号是根据酶催化的反应将酶分类。例如如果不 同的酶(例如得自不同的有机体)催化相同的反应，则它们被分类在相同的EC号下。此外，通 过趋同进化，不同的蛋白质折叠可W催化相同的反应，因此被指定为相同的EC号（参见 Omelchenko et al.(2010)Biol.Direct 5:31)。在进化无关的并且可W催化相同的生物化 学反应的蛋白质通常称为类似的酶（即，与同源的酶相对）dEC号不同于(例如)通过氨基酸 序列来指定蛋白质的化iProt识别器。
[0038] 如本文所用，术语"核巧酸"是指多核巧酸的单体单元，其由杂环碱基、糖和一个或 多个憐酸基构成。天然形成的碱基(鸟嚷岭(G)、腺嚷岭(A)、胞喀晚(C)、胸腺喀晚(T)和尿喀 晚化)）通常为嚷岭或喀晚的衍生物，但是应该理解的是天然和非天然形成的碱基类似物也 被包括在内。天然形成的糖为戊糖(五碳糖）、脱氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA)，但 是应该理解的是天然和非天然形成的糖类似物也被包括在内。核酸通常通过憐酸键连接， 从而形成核酸或多核巧酸，但是本领域已知许多其他的键(例如憐硫酷键、棚烧憐酸键等）。
[0039] 术语"多核巧酸"是指核巧酸(RNA)和脱氧核巧酸(DNA)的聚合物，其可W是单链的 或双链的，并且其可W包括非天然或改变的核巧酸。术语"多核巧酸"、"核酸序列"和"核巧 酸序列"在本文中可W交换使用，其是指任何长度的核巧酸的聚合形式。运些术语是指分子 的一级结构，因此包括双链和单链DNA、W及双链和单链RNA。该术语包括由核巧酸类似物和 修饰多核巧酸(例如但不限于甲基化的和/或加帽的多核巧酸)形成的RNA或DNA的类似物作 为等价物。多核巧酸可W为任何形式，包括但不限于质粒、病毒、染色体、EST、cDNA、mRNA和 rRNA。
[0040] 如本文所用，术语"多肤"和"蛋白质"可W交换使用，其是指氨基酸残基的聚合物。 术语"重组多肤"是指通过重组技术生产的多肤，其中通常，将编码所表达蛋白质的CDNA或 RNA插入到合适的表达载体中，该载体进而用于转化宿主细胞，从而生产多肤。相似地，术语 "重组多核巧酸"、"重组核酸"或"重组DNA"是通过本领域那些技术人员已知的重组技术生 产的。
[0041] 如本文所用，术语"同源"和"同源的"是指包括如下序列的多核巧酸或多肤，其中 所述的序列与相应的多核巧酸或多肤序列具有至少大约50% ( % )的一致性。优选的是，同 源的多核巧酸或多肤具有如下多核巧酸序列或氨基酸序列，该多核巧酸序列或氨基酸序列 与相应的氨基酸序列或核巧酸序列具有至少大约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或者至少大约 99% 的 同源性。如本文所用，术语序列"同源性"和序列"一致性"可W交换使用。
[0042] 本领域的任一普通技术人员很好地知道确定两个或更多个序列之间的同源性的 方法。简言之，计算两个序列之间的"同源性"可W按W下方式进行。为了达到最佳比较的目 的，将序列进行比对(例如可W在第一和第二氨基酸或核酸序列的一者或二者中引入空位 W达到最佳比对的目的，并且可W忽视非同源的序列W达到比较目的）。在一个优选的实施 方案中，用于比较目的而比对的第一序列的长度为第二序列的长度的至少大约30%、优选 至少大约40 %、更优选地至少大约50%、甚至更优选地至少大约60%、甚至更优选地至少大 约70 %、至少大约80 %、至少大约85 %、至少大约90%、至少大约95%、至少大约98%或者大 约100%。然后，比较在第一和第二序列的相应的氨基酸位置或核巧酸位置处的氨基酸残基 或核巧酸。当第一序列的位置被第二序列中相应位置处的相同氨基酸残基或核巧酸占据 时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的百分同源性为序列所共有的相同位置的 数量的函数，其考虑了空位的数量和各空位的长度，必须引入空位的数量和各空位的长度 W达到两个序列的最佳比对的目的。序列的比较W及两个序列之间的百分同源性的确定可 W 使用数学算法来完成，例如化 AST(Altschul et al.，J.Mol.Biol ,215(3) :403-410 (1990))。此外，两个氨基酸序列之间的百分同源性还可W使用化edleman和Wunsch算法来 确定，其中所述的算法被引入到GCG软件包的GAP程序中，其中使用了Blossum 62矩阵或 PAM250矩阵，W及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重(化6(116111曰11 and WunschJ.Mol.Biol. ,48:444-453(1970))。此外，两个核巧酸序列之间的百分同源性 还可W使用GCG软件包中的GAP程序来确定，其中使用了 NWSgapdna. CMP矩阵W及40、50、60、 70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。本领域的任一普通技术人员可W进行最初 的同源性计算，并相应地调整算参数。优选的参数组(和如果操作者不确定应当应用哪些参 数来确定分子是否在所要求的同源性限制内而应该使用的参数组)是具有12的空位罚分、4 的空位延伸罚分和5的移码空位罚分的Blossum 62评分矩阵。序列比对的其他方法是生物
技术领域已知的（例如参见Rosenberg(2005)BMC Bioinformatics 6:278;Altschul et al. (2005)阳BS J.272(20):5101-5109)。
[0043] 术语"在低严谨性、中严谨性、高严谨性或极高严谨性的条件下杂交"描述了用于 杂交和洗涂的条件。实施杂交反应的指导可W在生物技术的文章中找到(例如参见化rrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y. (1989),6.3.1-6.3.6,其中详 细描述了水性和非水性方法，并且可W使用任何一种方法）。例如具体的杂交条件如下：（1) 低严谨性杂交条件一在大约45°C下、在6x氯化钢/巧樣酸钢(SSC)中，然后在至少50°C下、在 0.2乂55(：、0.1%505中洗涂2次(对于低严谨性条件，洗涂溫度可^升至55°(：);(2)中严谨性 杂交条件一在大约45°C下、在6xSSC中，然后在60°C的0.2义55(：、0.1%505中洗涂一次或多 次；（3)高严谨性杂交条件一在大约45°C的6xSSC中，然后在65°C下、在0.2XSSC、0.1 %SDS中 洗涂一次或多次；W及(4)极高严谨性杂交条件一在65°C的0.5M憐酸钢、7%SDS，然后在65 °C下、在0.2xSSC、l%SDS中洗涂一次或多次。除非另外指示，极高的严谨性条件(4)是优选 的条件。
[0044] 术语"内源的"是指"内部起源的"。因此，"内源的"多肤是指由宿主细胞的天然基 因组编码的多肤。例如内源的多肤可W指由亲代微生物细胞(例如亲代宿主细胞)的基因组 编码的多肤，其中重组细胞由所述的亲代微生物细胞改造(或衍生）。
[0045] 术语"外源的"是指"外部起源的"。因此，"外源的"多肤是不是指由细胞的天然基 因组编码的多肤。外源的多肤和/或外源的多核巧酸可W转移至细胞中，并且可W由不同的 细胞类型或种类克隆或衍生得到；或者可W由相同的细胞类型或种类克隆或衍生得到。例 如"外源的生物合成酶"是外源的多肤的实例，其中所述的多肤编码了具有某种酶活性的 酶。在另一个实例中，变体(即，突变的或改变的）多肤是外源的多肤的实例。相似地，非天然 形成的核酸分子一旦被引入至细胞中，对于该细胞而言，便认为是外源的。术语"外源的"还 可W用于指在非天然状态的重组宿主细胞中存在的多核巧酸、多肤或蛋白质。例如相对于 在相应的野生型宿主细胞中天然存在的野生型序列而言，"外源的"多核巧酸、多肤或蛋白 质序列可W经过修饰，例如在表达水平或者在多核巧酸、多肤或蛋白质的序列的水平下修 饰。在运些相同的细胞系中，天然形成的核酸分子对于特定的细胞而言也可W是外源的。例 如由细胞X分离的完整的编码序列对于细胞Y而言，一旦所述的编码序列被引入细胞Y，即使 X和Y是相同的细胞类型，则也是外源的核酸。
[0046] 术语"过表达的"是指与基因的内源转录速率相比，使得该基因在升高的速率下转 录。在一些实例中，过表达另外包括与蛋白质的内源翻译速率相比，相应的蛋白质的升高的 翻译速率。在一些实施方案中，术语"过表达"是指在相同的条件下在相应的野生型细胞中 正常表达的更高的浓度下，在细胞中表达多核巧酸或多肤。用于过表达的测试方法是本领 域公知的，例如可W使用dPCR来评估转录的RNA水平，并可W使用SDS page凝胶分析来评 估蛋白质水平。
[0047] 术语"异源的"是指"由不同的有机体、不同的细胞类型和/或不同的物种衍生得到 的"。如本文所用，术语"异源的"通常与多核巧酸、多肤或蛋白质相关，并且是指在给定的有 机体、细胞类型或物种中不是天然存在的多核巧酸、多肤或蛋白质。例如由植物得到的多核 巧酸序列可W通过重组方法引入至微生物宿主细胞中，并且植物多核巧酸则对于所述的重 组微生物宿主细胞而言是异源的。相似地，由蓝细菌得到的多核巧酸序列可W通过重组方 法引入至埃希氏菌属的微生物宿主细胞中，并且由蓝细菌得到的多核巧酸则对于所述的重 组微生物宿主细胞而言是异源的。在运些细胞系中，"异源的生物合成酶"是异源的多肤的 实例，其中所述的多肤编码了具有某种酶活性的酶。
[0048] 如本文所用，术语多肤的"片段"是指全长多肤或蛋白质的较短的部分，其大小为2 个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去1个氨基酸残基。在本发明公开的某些实施方案中，片 段是指多肤或蛋白质的结构域(例如底物结合结构域或催化结构域)的整个氨基酸序列。
[0049] 术语"诱变"是指一种方法，通过该方法有机体的遗传信息W稳定的方式被改变。 编码蛋白质的核酸序列的诱变产生突变体蛋白质。此外，诱变还指非编码核酸序列的改变， 而运种改变会导致修饰的蛋白质活性。
[0050] 如本文所用，"突变"是指基因的核酸位置中或者多肤或蛋白质的氨基酸位置中的 永久性改变。突变包括取代、加入、插入和/或删除。例如氨基酸位置中的突变可W为一种类 型的氨基酸被另一种类型的氨基酸的取代(例如丝氨酸（S)可W被丙氨酸(A)取代;赖氨酸 (L)可W被T(苏氨酸)取代等）。因此，多肤或蛋白质可W具有一个或多个突变，其中一个氨 基酸被另一个氨基酸取代。例如生物合成多肤或蛋白质在其氨基酸序列中可W具有一个或 多个突变。
[0051] 如本文所用，术语"生物合成酶"是指具有与脂肪酸衍生物(例如脂肪酸、脂肪醒、 脂肪醇、脂肪胺、脂肪醋等)的生物合成有关的酶活性的蛋白质。如本文所用，生物合成酶的 实例是可W将脂肪醒前体转化成脂肪胺的酶(例如产生脂肪胺的生物合成酶）。如本文所 用，生物合成酶的另一个实例是可W将脂肪酸转化成脂肪醒的酶(例如产生脂肪醒的生物 合成酶）。如本文所用，生物合成酶的另一个实例是可W将酷基-ACP或酷基-CoA转化成脂肪 酸的酶(例如产生脂肪酸的生物合成酶）。当使用生物合成酶转化细胞时，其为表达生物合 成酶的细胞(例如重组细胞）。在一个实施方案中，由表达产生脂肪胺的生物合成酶的细胞 所生产的脂肪胺相关化合物的效价和/或产率是相应的野生型细胞（即，不表达产生脂肪胺 的生物合成酶的相应的细胞）的至少2倍。在另一个实施方案中，由表达产生脂肪胺的生物 合成酶的细胞所生产的脂肪胺相关化合物的效价和/或产率是相应的野生型细胞的至少大 约1倍、至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约4倍、至少大约5倍、至少大约6倍、至少大约7 倍、至少大约8倍、至少大约9倍或至少大约10倍。在一个实施方案中，由表达产生脂肪胺的 生物合成酶的细胞所生产的脂肪胺相关化合物的效价和/或产率为相应的野生型细胞的至 少大约1 %、至少大约2%、至少大约3 %、至少大约4%、至少大约5 %、至少大约6%、至少大 约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10% W上。在另一个实施方案中，由于产生脂 肪胺的生物合成酶的表达而得到的效价和/或产率为野生型细胞的至少大约20%至至少大 约100%。在另一个实施方案中，由于产生脂肪胺的生物合成酶的表达而使得细胞生产的脂 肪胺相关化合物的效价和/或产率为相应的野生型细胞的至少大约20%、至少大约25%、至 少大约30 %、至少大约35 %、至少大约40 %、至少大约45 %、至少大约50 %、至少大约55 %、 至少大约60 %、至少大约65 %、至少大约70 %、至少大约75 %、至少大约80 %、至少大约 85%、至少大约90 %、至少大约95 %、至少大约97 %、至少大约98 %、至少大约100 % W上。
[0052] 如本文所用，术语"基因"是指编码RNA产物或蛋白质产物的核酸序列；W及影响 RNA或蛋白质的表达的可操作地连接的核酸序列（例如此类序列包括但不限于启动子或增 强子序列）或编码影响RNA或蛋白质的表达的序列的、可操作地连接的核酸序列（例如此类 序列包括但不限于核糖体结合位点或翻译控制序列）。
[0053] 表达控制序列是本领域已知的，并且包括例如启动子、增强子、多聚腺巧酸化信 号、转录终止子、内部核糖体进入位点（IRES)等，它们提供了多核巧酸序列在宿主细胞中的 表达。表达控制序列特异性地与转录有关的细胞蛋白质相互作用（Maniatis et al.， Science ,236:1237-1245( 1987))。示例性的表达控制序列在生物技术教科书（例如参见 Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif. (1990))中所述。在本发明公开的方法中，一个或多个表达控制序 列与一个或多个多核巧酸序列可操作地连接。"可操作地连接"是指多核巧酸序列和表达控 制序列W运样的方式连接，使得在合适的分子(例如转录活化蛋白质）与表达控制序列结合 时，允许基因表达。根据转录和翻译的方向，可操作地连接的启动子位于所选的多核巧酸序 列的上游。可操作地连接的增强子可W位于所选的多核巧酸的上游、内部或下游。
[0054] 如本文所用，术语"载体"是指能够运送所连接的另一种核酸（即，多核巧酸序列） 的核酸分子。一种类型的有用的载体为附加体（即，能够在染色体外复制的核酸）。有用的载 体为能够使所连接的核酸自主复制和/或表达的那些。能够使与其可操作地连接的基因定 向表达的载体在本文中称为"表达载体"。总体而言，用于重组DNA技术中的表达载体通常为 "质粒"形式，其通常是指环状双链的DNA环，该DNA环作为载体形式不能与染色体结合。其他 有用的表达载体W线性形式提供。而且，还包括此类其他形式的表达载体，运些载体发挥着 等价的功能并且到目前为止是本领域已知的。在一些实施方案中，重组载体进一步包括与 多核巧酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是发育调节的启动子、细 胞器特异性的启动子、组织特异性的启动子、诱导型的启动子、构成型的启动子或者是细胞 特异性的启动子。重组载体通常包括选自W下的至少一个序列：与多核巧酸序列可操作地 缀合的表达控制序列；与多核巧酸序列可操作地缀合的选择标记；与多核巧酸序列可操作 地缀合的标记序列；与多核巧酸序列可操作地缀合的纯化部分;与多核巧酸序列可操作地 缀合的分泌序列；W及与多核巧酸序列可操作地缀合的祀向序列。在某些实施方案中，核巧 酸序列被稳定地引入到宿主细胞的基因组DNA中，并且核巧酸序列的表达处于受调节的启 动子区的控制之下。如本发明所用，表达载体包括适用于在宿主细胞中表达多核巧酸序列 的形式的、本文所述的特定的多核巧酸序列。本领域的技术人员应该理解的是表达载体的 设计可W取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需多肤的表达水平之类的因素。本发明 所述的表达载体可W被引入到宿主细胞中，从而产生由本文所述的多核巧酸序列编码的多 肤，包括融合多肤。
[0055] 术语"重组细胞"和"重组宿主细胞"在本文中可交换使用，并且是指经修饰而外源 表达至少一种生物合成酶的细胞。在一个特定的实施方案中，生物合成酶可W将脂肪醒前 体转化成脂肪胺。因此，在一个实施方案中，重组细胞涵盖了可W增加重组细胞生产脂肪胺 或脂肪胺衍生化合物的比活的生物合成酶。重组细胞可W衍生自微生物有机体或微生物细 胞，例如细菌、病毒或真菌。重组细胞可W用于生产脂肪胺。在一些实施方案中，重组细胞外 源表达一种或多种多核巧酸（多种），编码多肤的每一种多核巧酸均具有生物合成酶活性， 其中当所述的重组细胞在碳源存在下在有效表达多核巧酸（多种）的条件下培养时会生产 脂肪胺相关组合物。
[0056] 如本文所用，术语"微生物有机体"是指微小的有机体。微生物有机体的实例为细 菌、病毒或真菌。在一个实施方案中，微生物有机体为细菌细胞。在另一个实施方案中，微生 物有机体为原核生物或原核细胞。在另一个实施方案中，微生物有机体为真菌细胞，例如酵 母菌细胞。在另一个实施方案中，微生物有机体为病毒细胞。在相关的实施方案中，"重组微 生物有机体"为经遗传改变并且表达或涵盖外源和/或异源核酸序列的微生物有机体。在另 一个相关的实施方案中，"重组微生物有机体"为经遗传改变并且表达改造的代谢途径的微 生物有机体，其中所述的改造的代谢途径包括至少一种外源表达的蛋白质（例如外源生物 合成酶）。
[0057] 术语"酷基-ACP"是指在烷基链的幾基碳与酷基载体蛋白质(ACP)的憐酸泛酷琉基 乙胺基部分的硫氨基之间形成酷基硫醋。憐酸泛酷琉基乙胺基部分在翻译后通过全-酷基 载体蛋白质合酶(ACPS)(-种憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶)的作用与ACP上的保守丝氨酸残 基连接。在一些实施方案中，酷基-ACP为完全饱和的酷基-ACP的合成中的中间体。在其他的 实施方案中，酷基-ACP为不饱和的酷基-ACP的合成中的中间体。在一些实施方案中，碳链具 有大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个碳。运些 酷基-ACP的每一种都是将它们转化为脂肪酸衍生物的酶的底物。
[0058] 术语"酷基-CoA"是指在活细胞内部当辅酶A(CoA)与脂肪酸的末端连接时所形成 的暂时化合物。酷基-CoA是指与脂肪酸的代谢有关的一类辅酶。在一些实施方案中，碳链具 有大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个碳。运些 酷基-CoA的每一种都是将它们转化为脂肪酸衍生物的酶的底物。
[0059] 术语"脂肪醒生产的代谢途径"是指生产脂肪醒的任何生物合成途径。用于脂肪醒 生产的代谢途径可W包括任何数量的生产脂肪醒的酶。
[0060] 术语"用于脂肪胺生产的代谢途径"是指生产脂肪胺的任何生物合成途径。用于脂 肪胺生产的代谢途径可W包括生产脂肪胺的至少一种酶。
[0061] 如本文所用，"脂肪胺"是指具有式RNH2的胺。如本文所指，脂肪胺可W为由（例如） 脂肪酸、脂肪醒或由脂肪酷基-ACP衍生的脂肪醒制得的任何脂肪胺。在一些实施方案中，R 基团的长度为至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、 至少15、至少16、至少17、至少18或至少19个碳。备选地或此外，R基团的长度为24或更低、23 或更低、22或更低、20或更低、19或更低、18或更低、17或更低、16或更低、15或更低、14或更 低、13或更低、12或更低、11或更低、10或更低、9或更低、8或更低、7或更低、6或更低个碳。因 此，R基团可W具有通过上述任意2个端点键合的R基团。例如R基团的长度可W为6-16个碳， 长度为10-14个碳或者长度为12-18个碳。在一些实施方案中，脂肪胺组合物包含C6、C7、C8、 〔9、(：10、(：11、(：12、(：13、(：14、(：15、(：16、(：17、(：18、(：19、〔20、〔21、22、23和〔24脂肪胺的一种或多 种。在其他的实施方案中，脂肪胺组合物包含C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、 C16、C17和C18脂肪胺的一种或多种。在其他的实施方案中，脂肪胺组合物包含C12、C14、C16 和C18脂肪胺;C12、C14和C16脂肪胺;C14、C16和C18脂肪胺;或者C12和C14脂肪胺。脂肪胺的 R基团可W是直链或支链。支链可W具有多于一个的分支点，并且可W包含环状分支。在一 些实施方案中，支化的脂肪胺为C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、 019^20^21^22^23或〔24支化的脂肪胺。支化的或非支化的脂肪胺的1?基团可^是饱和 的或不饱和的。如果是不饱和的，贝化基团可W具有一个或多于一个的不饱和点。在一些实 施方案中，不饱和脂肪胺为单不饱和脂肪胺。在某些实施方案中，不饱和脂肪胺为C6:1、C7: 1、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20: 1、C21:1、C22:1、C23:1或C24:1不饱和脂肪胺。在某些实施方案中，不饱和脂肪胺为ClO: 1、 C12:1、C14:1、C16:1或C18:1不饱和脂肪胺。在其他的实施方案中，不饱和脂肪胺为在CO -7 位置处不饱和的。在某些实施方案中，不饱和脂肪胺具有Cis双键。根据氨分子的氨原子被 脂肪烷基或甲基基团替代的数量，脂肪胺分为伯胺、仲胺和叔胺。在水处理中可W用作去污 剂，在石油中用作浮选剂，在纺织品、橡胶等中用作腐蚀抑制剂的脂肪胺的实例为叔胺，例 如二甲基烷基胺((：10，(：12、(：14、(：16或(：18)和二烷基甲基胺((：10);叔胺共混物，例如二甲基 烷基胺（C8-C18、C12-C18、C12-C14 或 C16-C18)。
[0062] 术语"克隆"通常是指起源于单一的共同的祖先并且与单一的共同的祖先在遗传 上基本一致的细胞或一组细胞，例如由单一的细菌细胞形成的克隆的细菌集落的细菌。
[0063] 如本文所用，术语"培养物"通常是指包括活细胞的液体培养基。在一个实施方案 中，培养物包括在受控的条件下在预定的培养物培养基中再生产的细胞，例如在包括所选 的碳源和氮的液体培养基中生长的重组宿主细胞的培养物。动词形式的"培养"或名词形式 的"培养"是指使宿主细胞(例如重组宿主细胞)的群体在液体或固体培养基中在合适的条 件下生长。在一些实施方案中，培养是指底物W发酵方式生物转化为终产物。培养用的培养 基是公知的，并且此类培养物培养基的单个成分可得自商业来源(例如DIFCO培养基和BBL 培养基）。在一个实例中，水性营养培养基为包括氮、盐和碳的复合来源的"富集培养基"，例 如YP培养基，其包含lOg/L蛋白腺W及lOg/L酵母提取物。此外，在另一个实施方案中，营养 培养基为由痕量元素、营养物和盐组成的"基本培养基"。
[0064] 术语"修饰的活性"或"改变的活性水平"（例如对于重组宿主细胞中的酶活性)是 指在相对于亲代或天然宿主细胞确定的活性中存在的一个或多个特征的差异。通常，活性 的运种差异是在重组宿主细胞（即，具有修饰的活性)与相应的野生型宿主细胞之间确定的 (具体通过重组宿主细胞培养物与相应的野生型宿主细胞的比较）。修饰的活性可W是W下 情况的结果，例如:重组宿主细胞所表达的蛋白质的量改变(例如编码蛋白质的DNA序列的 拷贝数量升高或降低、编码蛋白质的mRNA转录子的数量升高或降低、和/或由mRNA形成蛋白 质的蛋白质翻译的量升高或降低的结果）；蛋白质结构的改变(例如一级结构改变，如蛋白 质的编码序列的改变，其导致底物特异性的改变、所见的动力学参数改变）；W及蛋白质的 稳定性改变(例如蛋白质降解的升高或降低）。在某些情况下，用于本文所述的多肤的编码 序列为为了在特定的宿主细胞中的表达而优化的密码子。例如就在大肠杆菌巧.COli)中的 表达而言，可W相应地优化一个或多个密码子(参见61'〇3^'6日1161日1.(1982)66]16 18:199-209)。
[0065] 如本文所用，术语"调节序列"通常是指DNA中碱基的序列，该序列与编码蛋白质的 DNA序列可操作地连接，其中所述的碱基的序列最终巧制蛋白质的表达。调节序列的实例包 括但不限于RNA启动子序列、转录因子结合序列、转录终止序列、转录调控因子(例如增强子 元件）、影响RNA稳定性的核巧酸序列W及翻译调节序列(例如核糖体结合位点（例如原核生 物中的化ine寸algarno序列或真核生物中的Kozak序列）、起始密码子、终止密码子）。如本 文所用，短语"相对于野生型核巧酸序列来修饰所述的核巧酸序列的表达"是指内源核巧酸 序列的表达和/或活性、或者异源或非天然的多肤编码核巧酸序列的活性的水平的增加或 降低。术语"改变的表达水平"和"修饰的表达水平"可W交换使用，并且的相同的条件下，与 多核巧酸、多肤或碳氨化合物在相应的野生型细胞中的浓度相比，多核巧酸、多肤或碳氨化 合物在改造的宿主细胞中W不同的浓度存在。如本文所用，术语"表达"对于多核巧酸而言 是使其发挥功能。当编码多肤(或蛋白质）的多核巧酸表达时，其被转录并翻译，从而生产所 述的多肤(或蛋白质）。
[0066] 如本文所用，术语"效价"是指每单位体积的宿主细胞培养物生产的脂肪胺或者脂 肪胺相关化合物或组合物的量。在本文所述的组合物和方法的任何方面中，脂肪胺W大约 2 5mg/L、大约 5 Omg/L、大约 7 5mg/L、大约 1 OOmg/L、大约 12 5mg/L、大约 150mg/L、大约 17 5mg/L、 大约 200mg/L、大约 225mg/L、大约 250mg/L、大约 275mg/L、大约 300mg/L、大约 325mg/L、大约 350mg/L、大约 375mg/L、大约 400mg/L、大约 425mg/L、大约 450mg/L、大约 475mg/L、大约 500mg/L、大约 525mg/L、大约 550mg/L、大约 575mg/L、大约 600mg/L、大约 625mg/L、大约 650mg/L、大约 675mg/L、大约 700mg/L、大约 725mg/L、大约 750mg/L、大约 775mg/L、大约 800mg/L、大约 825mg/L、大约 850mg/L、大约 875mg/L、大约 900mg/L、大约 925mg/L、大约 950mg/L、大约 975mg/L、大约 lOOOmg/L、大约 1050mg/L、大约 1075mg/L、大约 llOOmg/L、大约 1125mg/L、大约 1150mg/L、大约 1175mg/L、大约 1200mg/L、大约 1225mg/L、大约 1250mg/L、大 约 1275mg/L、大约 1300mg/L、大约 1325mg/L、大约 1350mg/L、大约 1375mg/L、大约 1400mg/L、 大约 1425mg/L、大约 1450mg/L、大约 1475mg/L、大约 1500mg/L、大约 1525mg/L、大约 1550mg/ L、大约 1575mg/L、大约 1600mg/L、大约 1625mg/L、大约 1650mg/L、大约 1675mg/L、大约 1700mg/L、大约 1725mg/L、大约 1750mg/L、大约 1775mg/L、大约 1800mg/L、大约 1825mg/L、大 约 1850mg/L、大约 1875mg/L、大约 1900mg/L、大约 1925mg/L、大约 1950mg/L、大约 1975mg/L、 大约 2000mg/L(2g/L)、3g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、 90g/L、100g/L或上述任意两个值所限定的范围的效价生产。在其他的实施方案中，脂肪胺 W高于lOOg/L、高于200g/L、或高于300g/L的效价生产。根据本发明公开的方法由重组宿主 细胞生产的脂肪胺的一个优选效价为5g/L至200g/L、10g/L至150g/L、20g/L至120g/L、W及 30g/L至lOOg/L。效价可W指由给定的重组宿主细胞培养物生产的特定脂肪胺或者脂肪胺 的组合或组合物。例如在重组宿主细胞(例如大肠杆菌）中可W将脂肪醒转化成脂肪胺的生 物合成蛋白质的表达得到了比表达相应的野生物多肤的重组宿主细胞(其缺乏可W将脂肪 醒转化成脂肪胺的生物合成蛋白质的表达)更高效价的生产。在一个实施方案中，更高的效 价范围为至少大约5g/L至大约200g/L。
[0067]如本文所用，"由宿主细胞生产的脂肪胺相关化合物(包括脂肪胺)的产率"是指输 入的碳源在宿主细胞中被转化为产物的效率。根据本发明公开的方法经改造从而生产脂肪 胺或脂肪胺相关化合物的宿主细胞具有的产率为至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至 少7 %、至少8%、至少9%、至少10%、至少11 %、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、 至少16%、至少17 %、至少18%、至少19%、至少20%、至少21 %、至少22%、至少23%、至少 24%、至少25 %、至少26 %、至少27 %、至少28 %、至少29 %、至少30 %或者由上述任意两个 值所限定的范围。在其他的实施方案中，脂肪胺W高于大约30%、高于大约35%、高于大约 40%、高于大约45%、高于大约50%、高于大约55%、高于大约60%、高于大约65%、高于大 约70%、高于大约75%、高于大约80%、高于大约85%、高于大约90%或更高的产率生产。备 选地或此外，产率为大约30%或更低、大约27%或更低、大约25%或更低、大约22%或更低。 在另一个实施方案中，产率为大约50%或更低，大约45%或更低，或者大约35%或更低。在 另一个实施方案中，产率为大约95%或更低、90%或更低、85%或更低、80%或更低、75%或 更低、70%或更低、65%或更低、60%或更低、55%或更低、50%或更低。因此，产率可W由上 述任意两个端点来限定。例如根据本发明公开的方法由重组宿主细胞生产的脂肪胺或脂肪 胺相关化合物的产率可W为大约5%至大约15%、大约10%至大约25%、大约10%至大约 22%、大约15%至大约27%、大约18%至大约22%、大约20%至大约28%、大约20%至大约 30%、大约30%至大约40%、大约40%至大约50 %、大约50%至大约60%、大约60%至大约 70%、大约70%至大约80%、大约80%至大约90%、或大约90%至大约100%。产率可W指由 给定的重组宿主细胞培养物生产的特定的脂肪胺或脂肪胺相关化合物或脂肪胺的组合物。 例如在重组宿主细胞(例如大肠杆菌）中可W将脂肪醒转化成脂肪胺的生物合成蛋白质的 表达使得脂肪胺或脂肪胺衍生物的化合物(包括脂肪胺的组合物或共混物）W比表达相应 的野生型多肤的宿主细胞更高的产率生产。在一个实施方案中，更高的产率范围为大约 10%至大约100%的理论产率。
[0068] 如本文所用，术语"生产率"是指每单位时间内每单位体积的宿主细胞培养物生产 一种或多种脂肪胺或脂肪胺相关化合物(包括一种或多种脂肪胺的组合物或共混物)的量。 在本文所述的组合物和方法的任何方面中，由重组宿主细胞生产脂肪胺相关化合物(包括 脂肪胺的组合物或共混物）的生产率为至少lOOmg/L/小时、至少200mg/L/小时、至少300mg/ L/小时、至少400mg/L/小时、至少500mg/L/小时、至少600mg/L/小时、至少700mg/L/小时、至 少800mg/L/小时、至少900mg/L/小时、至少lOOOmg/L/小时、至少1 lOOmg/L/小时、至少 1200mg/L/小时、至少1300mg/L/小时、至少1400mg/L/小时、至少1500mg/L/小时、至少 1600mg/L/小时、至少1700mg/L/小时、至少1800mg/L/小时、至少1900mg/L/小时、至少 2000mg/L/小时、至少2100mg/L/小时、至少2200mg/L/小时、至少2300mg/L/小时、至少 2400mg/L/小时、或至少2500mg/L/小时，或者高达lOg/L/小时(取决于细胞质量）。例如根据 本发明公开所述的方法由重组宿主细胞生产的脂肪胺相关化合物(包括脂肪胺的组合物或 共混物）的生产率可W为500mg/L/小时至2500mg/L/小时、或700mg/L/小时至2000mg/L/小 时。所述的生产率可W指由给定的重组宿主细胞培养物生产的特定的脂肪胺相关化合物， 包括脂肪胺的组合物或者脂肪胺的共混物或脂肪胺的组合。例如在重组宿主细胞(例如大 肠杆菌）中可W将脂肪醒转化成脂肪胺的生物合成蛋白质的表达使得脂肪胺衍生的化合物 (包括脂肪胺W及其组合物和共混物）W比表达相应的野生型多肤的重组宿主细胞升高的 生产率生产。在一个实施方案中，较高的生产率范围为大约〇.3g/L/h至大约3g/L/h。
[0069] 如本文所用，术语"总脂肪物质"、"总脂肪胺产物"和"脂肪胺衍生物"在本文中可 W交换使用，其是指脂肪胺的量，所述的脂肪胺可W由表达可W将脂肪醒转化成脂肪胺的 生物合成蛋白质的宿主细胞生产，运可W通过GC-FID来评价。
[0070] 如本文所用，术语"葡萄糖利用率"是指每单位时间内培养物使用的葡萄糖的量， 其报告为克/升/小时(g/L/hr)。
[0071] 如本文所用，术语"碳源"是指适于用作原核或简单的真核细胞生长所需的碳源的 底物或化合物。碳源可W为多种形式，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醒、酬、氨 基酸、肤和气体(例如CO和C〇2)。示例性的碳源包括但不限于:单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露 糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖;寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如淀粉、纤维素、 胶质和木聚糖;二糖，例如薦糖、麦芽糖、纤维二糖和松二糖;纤维素材料和变体，例如半纤 维素、甲基纤维素和簇甲基纤维素钢;饱和的或不饱和的脂肪酸、班巧酸盐、乳酸盐和醋酸 盐;醇，例如乙醇、甲醇和甘油;或它们的混合物。此外，碳源还可W为光合成产物，例如葡萄 糖。在某些实施方案中，碳源为得自废气的包含CO的气体混合物。在另一个实施方案中，碳 源为得自包含碳的材料(例如生物质、木炭或天然气）的重构的、包含CO的气体混合物。在其 他的实施方案中，碳源为合成气、甲烧或天然气。在某些优选的实施方案中，碳源为生物质。 在其他优选的实施方案中，碳源为葡萄糖。在其他优选的实施方案中，碳源为薦糖。在其他 的实施方案中，碳源为甘油。在其他优选的实施方案中，碳源为甘薦汁、甘薦糖浆或玉米糖 浆。在其他优选的实施方案中，碳源衍生自可再生的原料，例如C〇2、CO、葡萄糖、薦糖、木糖、 阿拉伯糖、甘油、甘露糖或它们的混合物。在其他的实施方案中，碳源衍生自可再生的原料， 包括淀粉、纤维素生物质、糖蜜和碳水化合物的其他来源，包括由纤维素生物质的水解衍生 得到的碳水化合物混合物，或由植物-或天然油处理衍生得到的废料。
[0072] 如本文所用，术语"生物质"是指可W衍生得到碳源的任何生物材料。在一些实施 方案中，适于生物转化的生物质被加工成碳源。在其他的实施方案中，生物质不需要进一步 加工成碳源。碳源可W转化为包含脂肪胺的组合物。示例性的生物质来源为植物物质或蔬 菜，例如谷物、甘薦或柳枝稷。另一种示例性的生物质来源为代谢废物，例如动物物质(例如 牛粪便）。其他的示例性生物质来源包括藻类和其他海生植物。此外，生物质还包括由工业、 农业、林业和家庭得到的废物，包括但不限于甘油、发酵废物、未干的巧草、稻草、木材、污 物、垃圾、纤维素城市废物和食物剩余物(例如肥皂、油和脂肪酸）。此外，术语"生物质"还指 碳源，例如碳水化合物(例如单糖、二糖或多糖）。
[0073] 如本文所用，对产物(例如脂肪酸及其组合物和共混物)而言的术语"分离的"是指 由细胞成分、细胞培养物培养基、或者化学或合成的前体分离得到的产物。通过本文所述的 方法生产的脂肪胺在发酵液及细胞质中相对而言可W是不可混合的。因此，所述的脂肪胺 可W在细胞内或细胞外收集于有机相中。
[0074] 如本文所用，术语动词性的"纯化"、形容词性的"纯化的"或名词性的"纯化"是指 通过例如分离或隔离将分子从其环境中移出或分离。"基本上纯化的"分子为至少大约60% 游离于(例如至少大约70%游离于、至少大约75%游离于、至少大约85%游离于、至少大约 90%游离于、至少大约95%游离于、至少大约97游离于、至少大约99%游离于)它们所关联 的其他组分。如本文所用，运些术语还指从样品中去除污染物。例如污染物的去除可W使样 品中脂肪胺衍生的化合物(包括脂肪胺及其组合物和共混物)的百分率增加。例如当在重组 宿主细胞中生产脂肪胺相关的化合物时，可W通过去除宿主细胞蛋白质和/或其他宿主细 胞材料来纯化脂肪胺相关的化合物。纯化后，样品中脂肪胺的百分率增加。术语动词性的 "纯化"、形容词性的"纯化的"或名词性的"纯化"是相对的术语，其不需要绝对的纯度。因 此，例如当在重组宿主细胞中生产脂肪胺相关的化合物时，脂肪胺化合物基本与其他细胞 成分(例如核酸、多肤、脂质、碳水化合物或其他碳氨化合物)分离。
[0075] 如本文所用，术语"衰减"是指减弱、降低或减少。例如可W通过修饰多肤使该多肤 衰减，从而降低其活性(例如通过修饰编码多肤的核巧酸序列）。
[0076] 术语"生产脂肪醒的生物合成酶"或"脂肪醒生成酶"在本文中可交换是会用，并且 是指具有生成脂肪醒或脂肪醒前体的酶活性的多肤、蛋白质或酶。此类酶的实例包括但不 限于簇酸还原酶(CAR)(例如Ca巧)和/或硫醋酶(TE)(例如TesA, 'tesA);酷基-ACP还原酶 (AARK例如得自细长聚球藻PCC7942);酷基-CoA还原酶(例如Acrl);憐酸泛酷琉基乙胺基 转移酶(PPTase)等。
[0077] 由脂肪醒前体形成脂肪胺
[0078] 本发明公开设及脂肪胺的微生物生产。如本文所示，微生物有机体可W经过遗传 改造而表达多种生物合成酶，从而在体内生产脂肪胺。更具体而言，微生物有机体可W经过 遗传改造而表达将脂肪醒转化成脂肪胺的代谢途径。所述的途径表达至少一种生物合成 酶，其具有将脂肪醒转化成脂肪胺的氨基转移酶（例如得自大肠杆菌的腐胺氨基转移酶 (YgjG)或GABA氨基转移酶(PuuE))、胺脱氨酶(例如脱氮副球菌的甲基胺脱氨酶或假单胞菌 属菌种的quinohemo蛋白质）或胺氧化酶活性。转氨酶与氨基转移酶实施相同的反应，并且 运些名称有时可交换使用。例如GABA氨基转移酶还称为4-氨基下酸转移酶。在一个实施方 案中，氨基转移酶、转氨酶、胺脱氨酶或胺氧化酶为外源生物合成酶或者在细胞中是外源表 达的。备选地，可W通过将用于脂肪胺生产的改造途径(表达具有将脂肪醒转化成脂肪胺的 氨基转移酶、胺脱氨酶或胺氧化酶活性的生物合成酶)与用于脂肪醒生产的改造途径(表达 生产脂肪醒的外源生物合成酶)结合来生产脂肪胺。可W通过多个过程和改造的途径(例如 用于脂肪醒生产(参见美国专利N〇.8,097,439,该文献W引用方式并入本文)的改造的簇酸 还原酶(CAR)途径，用于脂肪醇生产（参见美国专利N〇.8,097,439,上文）的改造的CAR和硫 醋酶(TE)途径，用于脂肪醒或脂肪醇生产(参见美国申请公开No.20130035513,该文献W引 用方式并入本文）的改造的憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶(PPTase)和CAR途径，用于脂肪醒生 产（参见美国专利No.8,268,599,该文献W引用方式并入本文)或用于烧控生产（参见美国 专利No.8,323,924,该文献W引用方式并入本文）的改造的酷基-ACP还原酶(AAR)途径)在 体内生成此类脂肪醒前体。合适的TE的实例为'TesA(即，得自大肠杆菌的截短的硫醋酶，其 具有被除去的细胞周质前导序列（因此带有撇号），使得其保留在细胞质中）；合适的CAR的 实例为化巧;合适的AAR的实例为得自细长聚球藻P(X7942的酶(参见表6，如下）。
[0079] 在一个实施方案中，用于脂肪醒生产的改造途径和用于脂肪胺生产的改造途径的 共表达、及具有氨基转移酶、胺脱氨酶或胺氧化酶活性的生物合成酶的表达、并且补充合适 的氮源(例如谷氨酸盐、氨或过氧化氨)允许醒的前体转化成相应的胺(腐胺氨基转移酶参 见表1;酶反应的实例参见表2、3和4)。用于氨基转移酶反应的氮供者(例如谷氨酸盐）的可 利用性可W通过过表达谷氨酸盐脱氨酶可任选地增强，从而增加谷氨酸盐生物合成的速 率。天然大肠杆菌谷氨酸盐脱氨酶利用NADPH作为氧化还原辅助因子，因此，使用能够代替 地利用NADH的谷氨酸盐脱氨酶(例如得自拟杆菌属菌种的谷氨酸盐脱氨酶，包括但不限于 多形类杆菌（B.thetaiotaomicron)、脆弱类杆菌（B.fragilis)、吉氏类杆菌 (B.distasonis)、卵形类杆菌（B . ovatus )、普通类杆菌（B . vulgatus)和单形拟杆菌 (B.化iformis))来替代所述的酶可W增加细胞中NADPH的可利用性。运可W为依赖于NADPH 的其他生物合成过程(例如脂肪酸生物合成)提供增加的NADPH供应。
[0080] 下表1(下文）描绘了用于多种生物合成酶的EC号和名称，其中所述的酶可用于胺 的生产，包括氨基转移酶/转氨酶。酶学委员会或分类号巧C号)是根据它们所催化的化学反 应而用于酶的数字分类方案。EC号不是在技术上说明酶，而是它们说明酶催化的反应。例如 如果不同的酶(例如得自不同的有机体)催化相同的反应，则它们得到相同的EC号。此外，不 同的蛋白质折叠可W催化相同的反应，由于趋同进化，因此它们被分配给相同的EC号（即， 它们被称为非同源的同工酶或NISE)。如表1所示，腐胺氨基转移酶的酶活性分类在EC号 2.6.1.82下。表1中所示的所有酶均参与了得到胺的化学反应，并且由于它们的EC号均落入 EC 2.6.1下，因此分类为氨基转移酶/转氨酶(还参见表7,下文）。下表2(下文)示出了可W 由脂肪醒前体生产脂肪胺的多种不同的生物合成酶。例如氨基转移酶或转氨酶、胺氧化酶 和胺脱氨酶催化多种反应，其中脂肪醒前体被转化成脂肪胺。在一个实施方案中，改造的代 谢途径包括用于在体内生产脂肪醒的氨基转移酶或转氨酶。在另一个实施方案中，改造的 代谢途径包括用于在体内生产脂肪醒的胺氧化酶。在另一个实施方案中，改造的代谢途径 包括用于在体内生产脂肪醒的胺脱氨酶。下表3(下文)示出了通过腐胺氨基转移酶催化的 反应，即，将脂肪醒转化成脂肪胺。
[0081 ] 表1:在EC 2.6.1下与胺生产有关的酶
[0084]
[0085]
[0086]
[0087]
[008引
[0089]为了说明本发明公开，重组宿主细胞经改造而表达硫醋酶(TE)(其催化酷基-ACP 或酷基-CoA转化成游离脂肪酸)和簇酸还原酶(CAR)(其将游离脂肪酸转化成脂肪醒）。重组 宿主细胞经过进一步改造而表达腐胺氨基转移酶(YgjG),从而将脂肪醒转化成脂肪胺(试 验结果参见实施例1;由化iG实施的酶反应参见表3(上文）；氨基转移酶/转氨酶的机制参见 表5(下文））。在此，由大肠杆菌克隆ygjG基因，并将其连接至表达载体中，从而生成表达质 粒。通过克隆并整合Ca巧和tesA基因而生成第二表达质粒。然后，使用运巧巾质粒转染细胞 并将其在具有碳源的发酵肉汤中培养。证实脂肪胺的生产，而对照细胞不生产脂肪胺(参见 实施例1)。任何合适的氨基转移酶/转氨酶都可W用于生产脂肪胺，只要该酶的活性可W将 脂肪醒转化成脂肪胺即可。如果所述的细胞天然生产脂肪醒，则如实施例1所示，将该细胞 改造成表达外源腐胺氨基转移酶(YgjG),从而将天然存在的脂肪醒转化成脂肪胺。
[0090] 在另一个实施方案中，可W使用胺脱氨酶来代替氨基转移酶，而将脂肪醒转化成 脂肪胺（由胺脱氨酶实施的酶反应参见表4(下文）；和酶的实例参见表7(下文））。如果氮源 是氨而不是氨基酸，则上述情况是可用的。可W用于将脂肪醒转化成脂肪胺的胺脱氨酶的 实例落入EC号EC 1.4.9; EC 1.4.98和EC 1.4.99之下（参见表7,下文）。例如丙氨酸脱氨酶、 谷氨酸脱氨酶、1^-赖氨酸-6-脱氨酶和甲基胺脱氨酶为可W用于将脂肪醒转化成脂肪胺的 胺脱氨酶的实例(参加表7,下文）。
[0091] 在另一个实施方案中，可W使用胺氧化酶来代替氨基转移酶，而将脂肪醒转化成 脂肪胺。
[0096] 下表6和7(下文)描绘了多种酶的活性W及它们相应的酶分类化C)号。[0097] 表6:酶的活性
[0092] 夫4:眩脱気酪的巧脉
[0093]
[0094]
[0095]



[0103]
[0104] 表7:氨基转移酶/转氨酶化C 2.6. I)和胺脱氨酶化C I. 4.9，EC I. 4.98，EC 1.4.99)的实例
[0105]
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[0107]本发明公开的微生物有机体发挥微生物宿主细胞的作用，并且包含一个或多个多 核巧酸序列，该多核巧酸序列包含编码本发明公开的至少一种外源生物合成酶的开放阅读 框。在一个实施方案中，脂肪胺组合物是在有效表达脂肪胺的条件下在碳源存在下通过培 养的宿主细胞生产的，其中所述的宿主细胞表达外源生物合成酶（例如氨基转移酶/转氨 酶、胺脱氨酶或胺氧化酶）。在另一个实施方案中，脂肪胺组合物是在有效表达脂肪胺的条 件下在碳源存在下通过培养宿主细胞生产的，其中所述的宿主细胞表达一种或多种外源生 物合成酶（例如氨基转移酶/转氨酶、胺脱氨酶或胺氧化酶组合一种或多种醒生成酶例如 CAR(例如化巧)和/或TE(例如TesA,'tesA)。在另一个实施方案中，脂肪胺组合物是在有效 表达脂肪胺的条件下在碳源存在下通过培养宿主细胞生产的，其中所述的宿主细胞表达一 种或多种外源生物合成酶(例如氨基转移酶/转氨酶、胺脱氨酶或胺氧化酶组合一种或多种 醒生成酶例如酷基-ACP还原酶(AARK例如得自细长聚球藻PCC7942))。在另一个实施方案 中，脂肪胺组合物是在有效表达脂肪胺的条件下在碳源存在下通过培养宿主细胞生产的， 其中所述的宿主细胞表达一种或多种外源生物合成酶(例如氨基转移酶/转氨酶、胺脱氨酶 或胺氧化酶组合一种或多种醒生成酶(例如酷基-CoA还原酶(例如Acrl))。在另一个实施方 案中，脂肪胺组合物是在有效表达脂肪胺的条件下在碳源存在下通过培养宿主细胞生产 的，其中所述的宿主细胞表达一种或多种外源生物合成酶(例如氨基转移酶/转氨酶、胺脱 氨酶或胺氧化酶组合一种或多种醒生成酶例如憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶(PPTase)。
[0108] 生物合成酶的表达导致W脂肪胺和/或脂肪胺组合物或其共混物的升高的产率生 产脂肪胺。在一个实施方案中，氨基转移酶或胺脱氨酶多肤在宿主细胞中的表达导致脂肪 胺或其组合物的高的产率。在另一个实施方案中，氨基转移酶或胺脱氨酶多肤组合一种或 多种醒生成酶在宿主细胞中的表达导致脂肪胺及其组合物的高的产率。在另一个实施方案 中，胺氧化酶组合一种或多种醒生成酶在宿主细胞中的表达导致脂肪胺及其组合物的高的 产率。在一些实施方案中，生物合成酶在细胞中是外源表达的。
[0109] 本发明公开的宿主细胞或微生物有机体可W包括宿主菌株或宿主细胞，其经过进 一步的遗传改造而包含改变，从而测试特定的突变或操纵对酶活性（即，重组细胞或微生物 有机体)的效力。根据起始宿主细胞中存在的天然酶途径的类型，多种可任选的遗传操纵和 改变在一种宿主细胞和另一种宿主细胞之间可交换使用。在一个实施方案中，宿主菌株可 W用于测试氨基转移酶或胺脱氨酶多肤组合醒生成多肤的表达。为了测试特定的可变因 素，宿主菌株可W包含多种遗传改变，包括但不限于培养条件，包括发酵成分、碳源(例如原 料）、溫度、压力、降低的培养物污染条件和氧的水平。
[0110] 在一个实施方案中，宿主菌株包含可任选的fa祀和fhuA删除。酷基-CoA脱氨酶 (FadE)是对代谢脂肪酸而言重要的酶。其在脂肪酸的利用(0-氧化）中催化第二步，该步骤 是将脂肪酸(酷基-CoA)的长链断裂成酷基-CoA分子的过程。更具体而言，在细菌中脂肪酸 降解的0-氧化循环的第二步是将酷基-CoA氧化成2-締酷基-CoA,该步骤由化祀催化。当大 肠杆菌缺乏化祀时，其不能在脂肪酸作为碳源上生长，但是可W在醋酸盐上生长。无法利用 任何链长的脂肪酸符合所报告的fa祀菌株的表现型，即，化祀功能被破坏的fa祀突变体菌 株。fa祀基因可W可任选地被敲除或衰减，从而确保在脂肪胺途径中可W作为中间体的酷 基-CoA可W在细胞中累积，使得所有酷基-CoA均可W有效地转化成脂肪胺。但是，fa祀衰减 在糖作为碳源时是可任选的，运是因为在运种条件下，Fa祀的表达可能被抑制，并因此， FadE可W仅W少量存在，而不能有效地与用于酷基-CoA底物的醋合酶竞争。FadE由于降解 物阻抑而被抑制。大肠杆菌和其他微生物优选消耗糖超过脂肪酸，因此当巧巾碳源均可利用 时，糖首先通过阻抑fad调节子而被消耗（参见D.Clark,J Bacteriol. (1981)148(2) :521-6))。此外，糖的缺乏会诱导化祀表达。酷基-CoA中间体可W不再属于0氧化途径，运是因为 被fad调节子(包括化祀)表达的蛋白质受到上调，并将有效地与酷基-CoA竞争。因此，在某 些环境下可W有利的是fadE基因被敲除或衰减。由于许多碳源是碳水化合物基，所W可任 选地衰减化祀。基因化uA编码TonA蛋白质，其在大肠杆菌的外膜中是能量偶联的转运蛋白 和受体(V.Braun(2009) J Bacteriol. 191(11): 3431-3436)。其删除是可任选的。扣 uA 的删 除允许细胞更加抵抗于隧菌体的攻击，运在某些发酵条件下是有利的。因此，理想的是在发 酵运行过程中可能遭受潜在污染的宿主细胞中删除扣uA。
[0111] 在另一个实施方案中，宿主菌株(上文)还包含W下一种或多种基因的可任选的过 表达，包括f adR、f abA、f abD、f abG、f a地、f abV和/或f abF。此类基因的实例是得自大肠杆菌 的fadR，得自鼠伤寒沙口氏菌(Salmonella typhimurium)的fabA(NP_460041)，得自鼠伤寒 沙口氏菌的f abD (NP_460164)，得自鼠伤寒沙口氏菌的化bG (NP_460165)，得自鼠伤寒沙口 氏菌的fabH(NP_460163)，得自霍乱弧菌的fabV(YP_001217283)，W及得自丙酬下醇梭菌 (〔1〇3付1(1;[11111曰。61:0131115^1;[州111)的化6。(肥_350156)。运些基因（编码脂肪酸生物合成中的 酶和调节因子)的一种或多种的可任选的表达在多种培养条件下可W起到增加脂肪酸衍生 化合物的效价的作用。
[0112] 在另一个实施方案中，大肠杆菌菌株用作脂肪胺生产的宿主细胞。相似地，运些宿 主细胞可W提供一种或多种生物合成基因（即，编码脂肪酸生物合成的酶和调节因子)的可 任选的过表达，其中所述的基因在多种培养条件下可W增加脂肪酸衍生化合物(例如脂肪 胺）的效价，所述的基因包括但不限于化(11?^曰64^曰60、化66^曰地、化13￥和/或'曰6。。遗传改 变的实例包括得自大肠杆菌的fadR，得自鼠伤寒沙口氏菌的化bA(NP_460041)，得自鼠伤寒 沙口氏菌的f abD (NP_460164)，得自鼠伤寒沙口氏菌的化bG (NP_460165)，得自鼠伤寒沙口 氏菌的fabH(NP_460163)，得自霍乱弧菌的fabV(YP_001217283)，W及得自丙酬下醇梭菌的 fabF(NP_350156)〇
[0113] 在一些实施方案中，可W用于表达生物合成酶(例如氨基转移酶或胺脱氨酶组合 醒生成酶，例如CAR和/或TE和/或AAR和/或PP化Se)的宿主细胞或微生物有机体可W进一步 表达包含某些酶活性的基因，其中所述的酶活性可W增加一种或多种特定脂肪酸衍生物的 生产，例如脂肪醋、脂肪醇、脂肪胺、脂肪醒、双功能脂肪酸衍生物、二酸等。在一个实施方案 中，宿主细胞具有用于脂肪酸生产的硫醋酶活性化.C. 3.1 .2.*或E.C. 3. 1.2. 14或 E.C.3.1.1.5)，脂肪酸的生产可W通过使所述的基因过表达而增加。在另一个实施方案中， 宿主细胞具有用于脂肪醋生产的醋合酶活性化.C. 2.3.1.75)。在另一个实施方案中，宿主 细胞具有用于脂肪醇生产的酷基-ACP还原酶(AARKE. C. 1.2.1.80)活性和/或醇脱氨酶活 性化.C. 1.1.1.1.)和/或脂肪醇酷基-CoA还原酶(FARKE.C. 1.1.1 .*)活性和/或簇酸还原 酶(CARKEC 1.2.99.6)活性。在另一个实施方案中，宿主细胞具有用于脂肪醒生产的酷基-ACP还原酶(AARKE.C. 1.2.1.80)活性。在另一个实施方案中，宿主细胞具有用于烧控和締 控生产的酷基-ACP还原酶(AARKE. C. 1.2.1.80)活性和脱幾基酶活性。在另一个实施方案 中，宿主细胞具有用于脂肪醇生产的酷基-CoA还原酶化.C. 1.2.1.50)活性，酷基-CoA合酶 (Fa 加）化.(：.2.3.1.86)活性，和硫醋酶化.(：.3.1.2.*或6.(：.3.1.2.14或6.(：.3.1.1.5)活 性。在另一个实施方案中，宿主细胞具有用于脂肪醋生产的醋合酶活性化.C. 2.3.1.75)，酷 基-CoA合酶（FadD)化.C. 2.3.1.86)活性，和硫醋酶化.C. 3.1.2 . *或E . C. 3.1.2.14或 E.C.3.1.1.5)活性。在另一个实施方案中，宿主细胞具有用于酬生产的OleA活性。在另一个 实施方案中，宿主细胞具有用于内締控的生产的OleBCD活性。在另一个实施方案中，宿主细 胞具有用于脂肪醇生产的酷基-ACP还原酶(AAR)化.C. 1.2.1.80)活性和醇脱氨酶活性 (E.C.1.1.1.1.)。在另一个实施方案中，宿主细胞具有用于制备端控的硫醋酶 化.C. 3.1.2. *或E. C. 3.1.2.14或E. C. 3.1.1.5)活性和脱簇酶活性。酶活性在微生物有机体 和微生物细胞中的表达由美国专利号8，097,439;8,110，093;8,110,670 ;8,183,028 ;8， 268,599;8,283，143;8,232,924;8,372,610;和8,530,221所教导，运些文献^引用方式并 入本文。
[0114] 在其他的实施方案中，用于表达生物合成酶(例如氨基转移酶或胺脱氨酶组合醒 生成酶，例如CAR和/或TE和/或AAR和/或PP化Se)的宿主细胞或微生物有机体将包含受到上 调或过表达从而生产一种或多种特定的脂肪酸衍生物(例如脂肪胺)的某些天然酶活性。在 一个实施方案中，宿主细胞具有用于脂肪酸生产的天然硫醋酶（E.C. 3. 1.2.*或 E. C. 3.1.2.14或E. C. 3.1.1.5)活性，脂肪酸的生产可W通过是硫醋酶基因过表达来增加。
[0115] 本发明公开包括表达编码生物合成酶（例如氨基转移酶或胺脱氨酶组合醒生成 酶，例如CAR和/或TES和/或AAR和/或PP化Se)的基因的宿主菌株或微生物有机体。在一个实 施方案中，至少一种生物合成酶在宿主细胞中是外源表达的。例如宿主细胞可W表达外源 氨基转移酶，从而生产脂肪胺。在另一个实施方案中，一种或多种生物合成酶在宿主细胞中 是外源表达的。例如宿主细胞可W表达外源氨基转移酶和外源簇酸还原酶(CAR),从而生产 脂肪胺。在另一个实施方案中，一种或多种生物合成酶在宿主细胞中是外源表达的，组合在 宿主细胞中过表达的一种或多种生物合成酶。例如宿主细胞可W表达外源氨基转移酶和外 源簇酸还原酶(CAR),组合外源和/或过表达的硫醋酶，从而生产脂肪胺。硫醋酶可W是外源 表达的硫醋酶。备选地，硫醋酶可W是天然硫醋酶，该硫醋酶通过特定的强启动子或本领域 那些技术人员公知的其他分子生物学技术在细胞中过表达或转录上调。重组宿主细胞生产 脂肪胺及其组合物和共混物。脂肪胺通常由培养物培养基回收，和/或由宿主细胞分离。在 一个实施方案中，脂肪胺由培养物培养基(细胞外）回收。在另一个实施方案中，脂肪胺由宿 主细胞(细胞内）分离。在另一个实施方案中，脂肪胺由培养物培养基回收并由宿主细胞分 离。可W使用本领域已知的方法来分析由宿主细胞生产的脂肪胺组合物，例如GC-FID，从而 确定特定脂肪胺的分布，W及脂肪胺组合物的成分的链长和饱和度。
[0116] 发挥微生物有机体(例如微生物细胞)功能的宿主细胞的实例包括但不限于埃希 氏菌属、芽抱杆菌属、乳杆菌属、发酵单胞菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲霉菌属、木霉属、 脉抱菌属、镶刀菌属、腐质霉属、根毛霉菌属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、毛霉菌属、毁丝菌 属、青霉属、毛平革菌、侧耳属、栓菌属、金抱子菌属、酵母菌属、寡养单胞菌属、裂殖酵母属、 耶氏酵母属或链霉菌属。在一些实施方案中，宿主细胞为革兰氏阳性细菌细胞。在其他的实 施方案中，宿主细胞为革兰氏阴性细菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌细 胞。在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌B细胞、大肠杆菌C细胞、大肠杆菌K细胞或大肠 杆菌W细胞。在其他的实施方案中，宿主细胞为迟缓芽胞杆菌(Bacillus Ien化S)细胞、短小 芽抱杆菌(BaciIlus brevis)细胞、嗜热脂肪芽胞杆菌(BaciIlus StearothermophiIus)细 胞、地衣芽胞杆菌（Bacillus Iichenoformis)细胞、嗜碱芽抱杆菌（Bacillus alkalophiIus)细胞、凝固芽胞杆菌（Bacillus coagulans)细胞、环状芽胞杆菌（Bacillus C ir CU Ians)细胞、短小芽抱杆菌（Baci Ilus pumi Iis)细胞、苏云金芽抱杆菌（Baci Ilus 化111'；[雌1611313)细胞、克劳氏芽抱杆菌(83(3；[11118(313113；[；0细胞、巨大芽胞杆菌(83(3；[11118 megaterium)细胞、枯草芽胞杆菌（Baci Ilus subtil is)细胞或解淀粉芽抱杆菌（Baci Ilus amyIoliquefaciens) O
[0117] 在其他的实施方案中，宿主细胞为康氏木霉(Trichoderma koningii)细胞、绿色 木霉（Trichoderma viride)细胞、里氏木霉（Trichoderma reesei)细胞、长枝木霉 (Trichoderma 1〇11容化^(3111过切111)细胞、泡盛曲霉（六3口6万容;[11113过师过11101'；0细胞、烟曲霉 (Aspergillus fumigates)细胞、臭曲霉（Aspergillus foetidus)细胞、构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)细胞、黑曲霉（AspergiIlus niger)细胞、米曲霉（AspergiIlus Oirzae)细胞、特异腐质霉（HumiCOIa insolens)细胞、疏棉状嗜热丝抱菌（HumiCOIa Ianuginose)细胞、红球菌（加 odococcus opacus)细胞、米赫根毛霉（加 izomucor miehei) 细胞或米黑毛霉(Mucor michei)细胞。在其他的实施方案中，宿主细胞为变铅青链霉菌 (Streptomyces Iividans)细胞或赢灰链霉菌（Streptomyces murinus)细胞D在其他的实 施方案中，宿主细胞为放线菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为酿酒酵母细胞。
[0118] 在其他的实施方案中，宿主细胞为得自真核植物、藻类、蓝细菌、绿色硫细菌、绿色 非硫菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、极端微生物、酵母菌、真菌、它们的改造的有机体或合 成的有机体的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为光依赖的或者固定碳。在一些实施方案 中，宿主细胞具有自养活性。
[0119] 在一些实施方案中，宿主细胞具有光合自养活性，例如在光存在下。在一些实施方 案中，宿主细胞在光缺乏下是异养的或兼养的。在某些实施方案中，宿主细胞为得自拟南 芥、柳枝稷（Panicum virgatum)、奇岗（Miscanthus giganteus)、玉米（Zea mays)、布朗葡 萄藻（Botryococcuse braunii)、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)、盐生杜氏藻 (Dunaliela salina)、聚球藻的菌种PCC 7002、聚球藻的菌种PCC 7942、集胞藻属的菌种 PCC 6803、长日篮热蓝藻（Thermosynechococcus elongates)BP-I、绿硫细菌（Chlorobium tepidum)、嗜热光合绿曲菌（ChlorojIexus auranticus)、酒色着色菌（Chromatiumm vinos um)、深红红螺菌（Rhodospirill um rubrum)、芙膜红细菌（Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌（加 odopseudomonas palusris)、永达尔梭菌（Clostridium 1 jungdahlii )、热纤梭菌（Clostridium thermocelIum)、产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)、毕赤酵母（Pichia pastoris)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、焚光假单胞菌（Pseudomonas f Iuorescens)或运动发酵单 胞菌（Zymomonas mobiIis) D
[0120] 在一个特定的实施方案中，微生物细胞得自蓝细菌，包括但不限于原绿球藻、聚球 藻、集胞藻属、蓝杆藻和念珠藻。在另一个实施方案中，微生物细胞得自特定的蓝细菌物种， 包括但不限于细长聚球藻PCC7942、集胞藻属的菌种PCC6803和聚球藻的菌种PCC7001。
[0121 ]制备重组宿主细胞和培养物的方法
[0122] 本领域公知的多种方法可W用于改造宿主细胞，从而生产脂肪胺和/或脂肪胺组 合物或共纔物。所述的方法可^包括载体的用途，优选为表达载体，包括编码生物合成酶 (例如单独的氨基转移酶或胺脱氨酶，或者组合酸生成酶，例如CA巧日/或TE和/或AA巧日/或 PPTase)的核酸，如本文所述。本领域的那些技术人员将理解的是多种病毒和非病毒载体可 W用于本文所述的方法中。
[0123] 在本发明公开的一些实施方案中，在特定组合物中的脂肪胺的较高的效价是由重 组宿主细胞培养物生产的特定类型的脂肪胺或脂肪胺的组合相对于由相应的野生型宿主 细胞的对照培养物生产的相同的脂肪胺或脂肪胺的组合的效价而言更高的效价。在一些实 施方案中，生物合成多肤(例如单独的氨基转移酶或胺脱氨酶，或者组合醒生成酶的多肤， 例如CAR和/或TE和/或AAR和/或PPTase)通过重组载体提供给宿主细胞，其中所述的重组载 体可W包括与特定的多核巧酸序列可操作地连接的启动子，其中所述的特定的多核巧酸序 列编码特定的生物合成多肤。在某些实施方案中，启动子是发育调节的、细胞器特异性的、 组织特异性的、可诱导型的、构成型的或细胞特异性启动子。重组载体通常包含选自W下的 至少一个序列：与多核巧酸序列可操作地缀合的表达控制序列；与多核巧酸序列可操作地 缀合的选择标记;与多核巧酸序列可操作地缀合的标记序列；与多核巧酸序列可操作地缀 合的纯化部分;与多核巧酸序列可操作地缀合的分泌序列；W及与多核巧酸序列可操作地 缀合的祀向序列。多核巧酸序列可W整合至重组宿主细胞的染色体中，引入至停留在重组 宿主细胞中的一个或多个质粒表达系统中，或者上述二者，其中所述的多核巧酸序列包含 编码蛋白质的开放阅读框和可操作地连接的调节序列。
[0124] 表达载体包括本文所述的适用于多核巧酸序列在宿主细胞中表达的形式的多核 巧酸序列。本领域的那些技术人员应该理解的是表达载体的设计取决于诸如待转化的宿主 细胞的选择、所需多肤的表达水平等之类的因素。本文所述的表达载体可W被引入至宿主 细胞中，从而生产由本文所述的多核巧酸序列编码的多肤，包括融合多肤。编码多肤的基因 在原核生物(例如大肠杆菌）中的表达最通常地是使用包含构成型或诱导型启动子的载体 实施的，其中所述的启动子指导了融合或非融合多肤的表达。用于原核和真核细胞的合适 的表达系统是本领域公知的（例如参见Sambrook et al., "Molecular Cloning = A Laboratory Manualsecond edition,Cold Spring Harbor Laboratory, (1989))。在某 些实施方案中，本发明公开的多核巧酸序列与由隧菌体T5衍生得到的启动子可操作地连 接。在一个实施方案中，宿主细胞为酵母细胞。在运种实施方案中，表达载体为酵母表达载 体。多种载体可W通过用于将外来核酸(例如DNA)引入至宿主细胞中的本领域公认的技术 引入至原核或真核细胞中。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可W在Sambrook等人(上 文)例如中找到。
[0125] 为了细菌细胞稳定的转染，已知的是根据所使用的表达载体和转化技术，仅一小 部分细胞将被吸收并复制表达载体。为了识别和选择运些转化子，可W将编码可选择标记 (例如抗生素抗性)的基因与目的基因一起引入至宿主细胞中。可选择标记包括赋予药品抗 性的那些，例如但不限于氨节青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素。编码可选择标记的核酸 可W在与编码本文所述的多肤相同的载体上引入至宿主细胞中，或者可W在分开的载体上 引入。被引入的核酸稳定地转化的细胞可W通过在合适的选择药品存在下的生长来识别。 [01%]重组宿主细胞的培养物和发酵
[0127]如本文所用，术语"发酵"广义而言是指宿主细胞将有机材料转化为目标物质，例 如通过在包括碳源的培养基中增殖重组宿主细胞的培养物，使重组宿主细胞将碳源转化为 脂肪胺及其衍生物。如本文所用，术语"允许生产的条件"是指允许宿主细胞生产所需产物 (例如脂肪胺或脂肪胺组合物或共混物)的任何条件。类似地，术语"其中载体的多核巧酸被 表达的条件"是指允许宿主细胞合成多肤的任何条件。合适的条件包括例如发酵条件。发酵 条件可W包括许多参数，包括但不限于溫度范围、通风水平、供料速率和培养基组成。运些 条件(单独及组合)均允许宿主细胞生长。发酵可W是需氧的、厌氧的或它们的变体(例如微 需氧的）。示例性的培养物培养基包括培养液或凝胶。通常，培养基包括可W被宿主细胞直 接代谢的碳源。此外，培养基中可W使用酶，从而有利于碳源的动员（例如淀粉或纤维素解 聚成可发酵的糖)和随后的代谢。
[0128] 就小规模的生产而言，改造的宿主细胞可^^例如大约10化^20化^30化^40化 L、500化、1血、5血、1 OmL、15mL、25mL、50mL、75血、100血、500血、1L、2L、化或 1OL的批次生长； 发酵;并诱导表达所需的多核巧酸序列，例如单独的编码氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或 胺氧化酶多肤的多核巧酸序列，或者组合编码CAR和/或TE和/或AAR和/或PPtase多肤的醒 生成多核巧酸序列。就大规模的生产而言，改造的宿主细胞可W W大约IOU 10化、IO(K)U 10，00化、100，000L、1，000，00化或更大体积的批次生产;发酵;并诱导表达所需的多核巧酸 序列。在一个优选的实施方案中，本文所述的脂肪胺和脂肪胺衍生物组合物可W在重组宿 主细胞培养物的细胞外环境中找到，并且可W容易地从培养物培养基中分离。在另一个实 施方案中，本文所述的脂肪胺和脂肪胺衍生物组合物可W在培养物中生长的重组宿主细胞 的细胞内环境中找到。脂肪胺及其衍生物可W由重组宿主细胞分泌、运送至细胞外环境中 或者主动转运至重组宿主细胞培养物的细胞外环境中。可W使用本领域已知的常规方法由 重组宿主细胞分离脂肪胺组合物。
[01巧]筛选重组宿主细胞
[0130] 在本发明公开的一个实施方案中，氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺氧化酶多 肤的活性是通过培养包含一种或多种氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺氧化酶多肤序列 (可任选地组合一种或多种醒生成多肤）的重组宿主细胞，然后筛选W识别由重组宿主细胞 生产的（例如)脂肪胺组合物的特征(例如脂肪胺及其组合物和共混物的效价、产率和生产 率)来确定的。在另一个实施方案中，氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺氧化酶多肤的活 性是通过培养包含一种或多种氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺氧化酶多核巧酸序列的 重组宿主细胞，然后筛选W识别由重组宿主细胞生产的（例如）脂肪胺组合物的特征（例如 脂肪胺及其组合物和共混物的效价、产率和生产率)来确定的。可W使用本领域已知的常规 方法，针对氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺氧化酶多肤它们的片段在细胞中的活性和/ 或胺衍生的化合物的改进/增加的生产来测试氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺氧化酶 多肤及它们的片段。例如在允许所述的多肤发挥功能并实施其酶活性的条件下，将氨基转 移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺氧化酶多肤或它们的片段在体内与底物接触（例如通过CAR 和/或TE和/或AAR和/或PP化Se在细胞中共表达来生产脂肪醒）。可W测量底物水平的降低 或者脂肪胺或脂肪胺组合物水平的升高，从而确定氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺氧 化酶的活性。备选地，在仍允许所述的多肤发挥功能并实施其酶活性的条件下，向表达氨基 转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺氧化酶多肤或者它们的片段的细胞供入脂肪醒底物。然后， 测量脂肪胺或脂肪胺组合物的水平的升高，从而确定氨基转移酶/转氨酶或胺脱氨酶或胺 氧化酶的活性。
[0131] 由重组宿主细胞衍生的产物
[0132] 如本文所用，。现代碳级份"或fM具有与化tional Institute of Sl:andards and Technology(NIST)S化ndard Reference Materials(SRMs 4990B和4990C，其分别称为草酸 标准品册X巧日册XlI)定义的相同的含义。基本定义是指0.95乘W14C/12C同位素比册Xl (参 见AD1950)。运大致相当于衰变校正过的工业革命前的木材。对于当前的活生物圈（植物材 料），fM为大约1.1。
[0133] 包括生物学方法生产的有机化合物，特别是使用本文的生物合成途径生产的脂肪 胺组合物的生物产物(例如根据本发明公开生产的脂肪胺组合物)是使用可再生来源生产 的，因此是新的物质的组合物。基于双重碳同位素指纹法（dual carbon-isotopic finge巧rinting)或1化定年法可W将运些新的生物产物与衍生于石油化学碳的有机化合物 区别开。此外，可W通过双重碳同位素指纹法(例如参见美国专利号7，169,588)来确定生物 来源碳的具体来源(例如葡萄糖与甘油等）。在商业中，区别生物产物与石油基有机化合物 的能力在追踪运些材料方面是有益的。例如，包括生物学基的和石油基的碳同位素谱二者 的有机化合物或化学品可W区别于仅由石油基材料制成的有机化合物和化学品。因此，在 商业中，可W基于本文生产的生物产物的独特的碳同位素谱来追踪或跟踪它们。通过比较 各样品中稳定碳同位素比（UC/1 2C)，可W将生物产物与石油基有机化合物区分开。给定的 生物产物中Uc/i2C比是大气二氧化碳中该二氧化碳被固定时的Uc/i 2C比的结果。它还反映 了准确的代谢途径。此外，还存在区域性差异。石油、C3植物（阔叶植物）、C4植物(草本植物） W及海洋碳酸盐类在i3C/i2CW及相应的Si3C值中全部表现出显著差异。C4和C3植物都表现 出一定范围的i 3C/i2C同位素比，但是对于C4植物而言，通常的值是大约-7至大约-13/密耳， 而对于C3植物而言，是大约-19至大约-27/密耳（例如参见Stuiver et al. ( 1977) Radiocarbon 19:355)。煤和石油通常落在后面的范围内。
[0134] 別3〔(〇/〇。）二[(13〔/120 样品-(13〔/120 标准品]/(13C/12 口标准品 Xiooo
[0135] 已经与IAEA、USGS、NIST和其它选定的国际同位素实验室合作开发了一系列备选 RM。与PDB的每单位密耳偏差的标记为SI3Cd通过高精度的稳定比率质谱（IRMS)在质量44、45 W及46的分子离子上对C〇2进行测量。本发明所述的组合物包括脂肪胺组合物和通过本文 所述的任何方法生产的产物。具体而言，脂肪胺组合物或产物具有的Si 3C可W为大约-28或 更大、大约-27或更大、-20或更大、-18或更大、-15或更大、-13或更大、-10或更大或-8或更 大。例如脂肪胺组合物或产物具有的Si 3C可W为大约-30至大约-15、大约-27至大约-19、大 约-25至大约-21、大约-15至大约-5、大约-13至大约-7或大约-13至大约-10。在其它的情况 下，脂肪胺组合物和产物具有的81化可^为大约-10、-11、-12或-12.3。此外，还可^通过比 较每种化合物中1化的量，将根据本发明公开所生产的脂肪胺组合物和产物区别于石油基有 机化合物。因为1化具有5730年的核半衰期，所W包括"较老的"碳的石油基燃料可W区别于 包括"较新的"碳的脂肪胺组合物和生物产物（参见例如Currie ,"Source Apportionment of Atmospheric Particles"，Characterization of Environmental Particles, J.Buffle and H.P.van Leeuwen，Eds .，Iof Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series(Lewis Publishers, Inc.)3-74,(1992))〇
[0136] 放射性碳定年法的基本假设是大气中1化浓度的恒定性导致活有机体中1化的恒定 性。然而，由于1950年W来的大气核试验W及1850年W来的化石燃料的燃烧，1化已经获得了 次要的地球化学时间特征（geochemical time characteristic)。1化在大气C〇2中W及由此 在活生物圈中的浓度在20世纪60年代中期核试验的高峰时几乎翻倍。此后，其逐渐地返回 至大约1.2x10-12的稳态宇宙发生（大气)基线同位素率(1化/1化），并且大致的驰豫"半衰 期"（relaxation "half-life")为7至10年。后者所述的运种半衰期不必按照字面理解;而是 必须使用详细的大气核输入/衰变函数来追踪核时代开始W来的大气和生物圈1化的变化。 后者所述的运种生物圈1化时间特征支持每年定年法测定近代生物圈的碳的承诺。可W通过 加速器质谱(AMS)测量1也结果现代碳的比例"（fM)的单位给出。本文所述的脂肪胺组合 物和产物包括可WfM 1化为至少大约1的生物产物。例如本发明公开的生物产物可W具有至 少大约1.01的fM 1化、大约1至大约1.5的fM i4C、大约1.04至大约1.18的fM i4C、或者大约 1.111 至大约 1.124 的 fM 14c。
[0137] 已知1化的另一种量度为现代碳的百分率(pMC)。对于使用1化年代的考古学家或地 质学家而言，AD 1950等于"旧的零年"。其还表示l(K)pMC。在1963年热核武器的顶峰时，大气 中的"炸弹碳"达到正常水平的几乎两倍。其在大气中的分布自其出现W来是近似的，对于 自从AD 1950生活的植物和动物表现出大于10化MC的值。随着时间的流逝，该值逐渐降低， 当今的值接近107.5pMC。运意味着诸如玉米之类的新生物质材料将给出接近107.5pMC的1化 标记。石油基化合物将具有为零的pMC值。化石碳与现代碳的组合导致现代pMC含量被稀释。 通过假定107.5pMC代表现代生物质材料的1化含量并且化MC代表石油基产物的1化含量，贝U 该材料的测量PMC值将反映两种类型的成分的比例。例如100%来源于现代大豆的材料将给 出接近107.5pMC的放射性碳标记。如果使用石油基产物将该材料稀释50%，则它将给出约 54pMC的放射性碳标记。通过指定"100%"等于107.5pMC并且指定为"0%"等于化MC而衍生 得到基于生物学的碳含量。例如测量为99pMC的样品将给出93%的等同的生物学基的碳含 量。该值被称为基于生物学的平均碳结果并且假定在所分析的材料中的所有成分均起源于 现代的生物材料或石油基材料。包括本文所述的一种或多种脂肪胺的生物产物可W具有至 少大约50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100的9]\?：。在其它的情况下，本文所述的 脂肪醋可W具有大约50至大约100、大约60至大约100、大约70至大约100、大约80至大约 100、大约85至大约100、大约87至大约98、或者大约90至大约95的pMC。在其它的情况下，本 文所述的脂肪胺组合物可W具有大约90、91、92、93、94或94.2的口1(：。
[0138] 脂肪胺组合物
[0139] 脂肪胺的结构是基于一个或多个C8至C24脂肪族烷基基团（R = C8-C24)，W及一个 或多个胺(N)或季锭。脂肪族烷基链是强烈疏水性的，而胺是亲水性的。因此，脂肪胺作为一 个分子(包含疏水性实体和亲水性实体)具有两性本性。当脂肪胺溶解于水或其他溶剂中 时，由于分子的一部分被溶剂排斥，所W脂肪胺形成微团。如此，脂肪胺是阳离子表面活性 化合物（即，通过化合物的亲水性部分表征的表面活性剂），其通过物理键或化学键强烈地 附着在表面上，由此修饰表面性质。脂肪胺的表面活性为乳化、润湿、起泡和增稠。此外，月旨 肪胺具有吸附性，包括软化、附着、润滑、腐蚀抑制、抗静电性和疏水作用；W及反应性，包括 离子交换、脱色和絮凝作用。
[0140] 本发明公开考虑了用于许多工业应用（包括作为化学中间体、处理助剂W及许多 配制物中的功能成分）的脂肪胺及其衍生物的生产。脂肪胺的实例包括在所述的宿主细胞 中生产的W及由本文所述的脂肪醒前体中衍生的那些。本文生产的脂肪胺和/或脂肪胺组 合物或共混物可W单独使用，或者在合适的组合或共混物中使用。本发明公开的脂肪胺在 工业应用中具有用途，包括但不限于去污剂(清洁剂、增稠剂、纤维软化剂）；洗碟剂;发泡剂 和润湿剂;破乳剂(药物、纸、石油）；乳化剂(溶剂、溶剂清洁剂、娃树脂、油、蜡光剂、皮革处 理、甘油=醋）；表面活性剂;洗发剂和护发素;在织物和塑料工业(织物、聚合物、电子器件、 静电喷涂、纸）中的抗静电剂;燃料添加剂；润滑剂和润滑添加剂(滑脂增稠剂、机油）；涂料 增稠剂;矿物处理;纸的制造;石油的生产和精炼(石油添加剂、油田化学品）；渐青乳化剂； 腐蚀抑制剂(酸、水处理、金属加工、石油）；汽油和燃油添加剂;浮选剂;环氧树脂固化剂；W 及农业化学品和杀虫剂。在一些方面中，本发明公开设及生产包含脂肪胺的脂肪胺组合物 的方法，其中所述的脂肪胺是由碳链的混合物或者范围为大约C8至大约C24的特定链长制 成的。在一个特定的方面中，本发明公开设及生产脂肪胺组合物的方法，其中所述的脂肪胺 组合物包含脂肪伯胺(RN出）。在另一个方面中，还考虑了脂肪仲胺化NH)和/或脂肪叔胺(S 烷基(R3N)、二烷基甲基(RsNC出），和/或烷基二甲基(RN(C出)2))。在另一个方面中，本发明公 开涵盖了伯胺的生产，其中所述的伯胺可W成为用于工业产品的一级构件，并且提供用于 多种化学衍生物(例如多胺、乙氧化胺、乙氧化二胺、丙氧化胺、胺盐、胺的氧化物、酷胺、乙 氧化酷胺和腊)的来源材料。在相关的方面中，所述的方法包括适用于制备脂肪胺和脂肪胺 组合物的遗传改造的生产宿主，其中所述的脂肪胺和脂肪胺组合物包括但不限于适用于生 产化学衍生物及其组合物的伯胺，包括但不限于多胺、乙氧化胺、乙氧化二胺、丙氧化胺、胺 盐、胺的氧化物、酷胺、乙氧化酷胺和腊。
[0141] 通常，本发明公开的脂肪胺或脂肪胺组合物由宿主细胞的细胞外环境中分离得 到。在一些实施方案中，脂肪胺或脂肪胺组合物是由宿主细胞部分或全部自发分泌的。在备 选的实施方案中，脂肪胺或脂肪胺组合物可任选地在一种或多种转运蛋白的帮助下被转运 至细胞外环境中。在其他的实施方案中，脂肪胺或脂肪胺组合物被动转运至细胞外环境中。
[0142] 所述的方法可W生产脂肪胺，包括C8-C24脂肪胺。在一些实施方案中，脂肪胺包括 08、〔9、(：10、(：11、(：12、(：13、(：14、(：15、(：16、(：17、(：18、(：19、〔20、〔21、〔22、〔23和/或〔24脂肪胺。 在其他的实施方案中，脂肪胺组合物包括C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、 C17和C18脂肪胺中的一种或多种。在其他的实施方案中，脂肪胺组合物包括C12、C14、C16和 C18脂肪胺;C12、C14和C16脂肪胺;C14、C16和C18脂肪胺;或者C12和C14脂肪胺。脂肪胺的R 基团可W是直链或支链的。支链可W具有多于一个分支点，并且可W包括环状分支。在一些 实施方案中，支化的脂肪胺为C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、 020、〔21^22、〔23或〔24支化的脂肪胺。支化的或非支化的脂肪胺的1?基团可^是饱和的或 不饱和的。如果是不饱和的，贝化基团可W具有一个或多于一个的不饱和点。在一些实施方 案中，不饱和的脂肪胺为单不饱和脂肪胺。在某些实施方案中，不饱和脂肪胺为C6:1、C7:1、 C8:1、C9: UClO: UCll :1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20:1、 C21:1、C22:1、C23 :1或C24:1不饱和脂肪胺。在某些实施方案中，不饱和脂肪胺为ClO : 1、 C12:1、C14:1、C16:1或C18:1不饱和脂肪胺。在其他的实施方案中，不饱和脂肪胺为在CO -7 位置处不饱和的。在某些实施方案中，不饱和脂肪胺具有Cis双键。
[0143] 在一个优选的实施方案中，脂肪胺为伯胺，包括但不限于辛基胺、癸基胺、十二烧 基胺、十四烷基胺、十六烷基胺、十八烷基胺、硬脂酷胺和油基胺。在另一个实施方案中，月旨 肪胺为仲胺，例如1-十二烧胺（月桂基胺）、1-十六烷基胺(栋桐酷基胺）、1-十八烷基胺(硬 脂酷胺)等。在另一个实施方案中，脂肪胺为叔胺，例如1-十八締-9-基胺（油基胺)等。脂肪 胺的其他实例为烷基二甲基胺，包括但不限于辛基二甲基胺、癸基二甲基胺、十二烷基二甲 基胺、十四烷基二甲基胺、十六烷基二甲基胺、十八烷基二甲基胺和油基二甲基胺。脂肪胺 的其他实例为二烷基甲基胺，包括但不限于二辛基甲基胺、二癸基甲基胺、二(十二烷基）甲 基胺、二（十四烷基）甲基胺、二（十六烷基）甲基胺、和二(十八烷基）甲基胺。本发明公开进 一步考虑了通过本文所述的重组宿主细胞生产的脂肪胺，该脂肪胺可用于化学衍生物，例 如脂肪酷胺（例如硬脂酷胺、油酷胺、芥酸酷胺）；季锭盐（例如四甲基氯化锭、四甲基漠化 锭、四乙基漠化锭、四丙基漠化锭）；和乙氧基化物(例如月桂基胺、硬脂酷胺、油基胺、十八 烷基胺）。
[0144] 在其他的实施方案中，脂肪胺包括直链脂肪胺。在其他的实施方案中，脂肪胺包括 支链脂肪胺。在其他的实施方案中，脂肪胺包括环状部分。在一些实施方案中，脂肪胺为不 饱和脂肪胺。在其他的实施方案中，脂肪胺为但不饱和脂肪胺。在其他的实施方案中，脂肪 胺为饱和脂肪胺。在另一个方面中，本发明公开的特征在通过任一种所述的方法或任一种 本文所述的微生物有机体生产的脂肪胺，或者表面活性剂，其包含由任一种所述的方法或 任一种本文所述的微生物有机体生产的脂肪胺。在一些实施方案中，脂肪胺具有的Si 3C为大 约-15.4或更高。在某些实施方案中，脂肪胺具有的Si3C为大约-15.4至大约-10.9,或大约-13.92至大约-13.84。在一些实施方案中，脂肪胺具有的fM^C为至少大约1.003。在某些实施 方案中，脂肪胺具有的fM^C为至少大约1. Ol，或者至少大约1.5。在一些实施方案中，脂肪胺 具有的fM^C为大约1.111至大约1.124。 实施例
[0145] W下具体的实施例意图说明本发明公开，并且不应该解释为限定权利要求书的范 围。
[0146] 实施例1:
[0147] 通过硫醋酶（'tesA)和簇酸还原酶(CarB)与腐胺氨基转移酶(ygjG)共表达，并补 充氮源(谷氨酸盐），在体内生成脂肪醒前体和相应的脂肪胺。将脂肪醒前体转化成相应的 胺。
[0148] 使用W下引物，通过PCR由大肠杆菌MG1655菌株克隆ygjG基因：
[0149] 正向引物：
[01 加]' 5-AGGAGGAATAACATATGAACAGGTTACCTTCGAGCGCATCGGC-3 '
[0151] 反向引物：
[0152] ' 5-CCCAAGCTTCGAATTCTTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCATGGCC-3 '
[0153] 然后，将ygjG基因连接至表达载体pACYC(即，高拷贝表达载体）中，从而生成质粒 pACYC-ygjG。生成第二质粒，并命名为pCL1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05(即，低拷贝质粒）， 其包含耻垢分枝杆菌Ca巧基因和得自大肠杆菌的硫醋酶基因（'tesA)的变体。将巧巾质粒共 转染至大肠杆菌菌株中，该菌株不生产脂肪胺化VD2.1，包含得自大肠杆菌MG1655菌株的A fa祀A tonA fabB-A329V PT5-entD)，从而得到菌株F16-YG。还使用分别用作对照的各种质 粒转染宿主细胞，得到对照菌株F16(p化1920-CarB-18-cTesA2-13C05)和对照菌株YG (pACYC-ygjG)。
[0154] 在32°C下，使细胞在补充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis- tris，pH 7.0的M9基本培养基中生长，并使用ImM异丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧（IPTG) 在ODsoo~1.0诱导。（IPTG引发Iac操纵子转录，并在所述的基因处于Iac操纵子控制下的情 况下用于诱导蛋白质的表达。）在诱导时，还加入5g/L k谷氨酸盐作为氮源。使包含pACYC-ygjG的菌株在抗生素簇节青霉素存在下生长，并使包含P化1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05的 菌株在奇霉素存在下生长，从而选择各自得质粒。在过夜生长后，向3种菌株的培养物补充 另外的lOg/L葡萄糖和5g/L心谷氨酸盐。在诱导后的24小时，将ImL培养物的等分物冷冻。
[0155] 为了制备用于分析的样品，将0.5mL乙酸乙醋加入至各培养物的等分物中。然后将 样品在最大速度下满流处理15分钟，并离屯、5分钟。使用Gas Chromatograph Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法:烧控I无分流CTC)下分析有 机相。其中yg jG、a巧和' tesA被外源表达的F16-YG菌株在7.6分钟时形成独特的峰（图1中间 面板），该峰在YG或F16的阴性对照中未观察到（图1顶部和底部面板）。通过NIST 05化学化 合物文库识别由F16-YG培养物得到的样品中在7.6分钟时的独特的峰为1-十二烧胺。购自 Sigma/Al化ich的分析参照标准品（P;roduct#325163)与F16-YG样品连续2次运行，通过其停 留时间（图2)和其离子碎片图案（图3)证明所述的化合物的特征为1-十二烧胺，其中所述的 离子碎片图案显示在m/z = 142,156和170,和分子离子为185下的特征碎片。
[0156] 实施例2:
[0157] 通过酷基-ACP还原酶(AAR)与腐胺氨基转移酶(ygjG)共表达，并补充氮源(谷氨酸 盐），可W在体内生成脂肪醒前体和相应的脂肪胺。将脂肪醒前体转化成相应的胺。
[0158] 使用W下引物，通过PCR由大肠杆菌MG1655菌株克隆ygjG基因：
[0159] 正向引物：
[0160] ' 5-AGGAGGAATAACATATGAACAGGTTACCTTCGAGCGCATCGGC-3 '
[0161] 反向引物：
[0162] ' 5-CCCAAGCTTCGAATTCTTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCATGGCC-3 '
[0163] 然后，可W将ygjG基因连接至表达载体pACYC中，从而生成质粒pACYC-ygjG。生成 第二质粒，并命名为P化1920-aar，其为包含得自细长聚球藻PCC7942(aar)的AAR基因的pCL 基的质粒。将巧巾质粒共转染至大肠杆菌菌株中，该菌株不生产脂肪胺(上文），从而得到菌 株F17-YG。还使用分别用作对照的各种质粒转染宿主细胞，得到对照菌株F17(pCL1920-aar)和对照菌株YG(pACYC-ygjG)。
[0164] 在 32°C 下，使细胞在补充 3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0NX-100,0.1Mbis-tris，pH 7.0的M9基本培养基中生长，并使用ImM异丙基0-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧（IPTG) 在ODs日日~1.0诱导。在诱导时，还加入5g/L k谷氨酸盐作为氮源。使包含pACYC-ygjG的菌株 在抗生素簇节青霉素(0.05mg/mL)存在下生长，并使包含pCL1920-aar的菌株在O.lmg/mL奇 霉素存在下生长，从而选择各自质粒。在过夜生长后，向巧巾菌株的培养物补充另外的lOg/L 葡萄糖和5g/L心谷氨酸盐。在诱导后的24小时，可W将ImL培养物的等分物冷冻。
[0165] 为了制备用于分析的样品，可W将0.5mL乙酸乙醋加入至各培养物的等分物中。然 后可W将样品在最大速度下满流处理大约15分钟，并根据需要离屯、大约5分钟。可W使用 Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法： 烧控1无分流CTC)下分析有机相。预计其中ygjG和aar被外源表达的F17-YG菌株产生一个或 多个独特的峰，运些峰代表了类似于实施例1中观察到的脂肪胺(上文），并且运些峰在YG或 F17的阴性对照中未观察到。可W通过NIST 05化学化合物文库识别由F17-YG培养物得到的 样品中任何独特的峰为1-十二烧胺。为了比较，可W将购自Sigma/Al化ich的分析参照标准 品（Product#325163)与F17-YG样品连续2次运行，从而通过停留时间和离子碎片图案证明 所生产的化合物。
[0166] 实施例3:
[0167] 通过硫醋酶(TesA)和簇酸还原酶(化巧)与GABA氨基转移酶(PimE)共表达，并补充 氮源(谷氨酸盐），可W在体内生成脂肪醒前体和相应的脂肪胺。脂肪醒前体可W转化成相 应的胺。可W使用合适的正向引物和反向引物，通过PCR由大肠杆菌菌株克隆PimE基因（类 似于实施例1和2中的教导，上文）。然后，可W将PimE基因连接至表达载体（例如pACYC，上 文）中，从而生成质粒pACYC-puuE。生成第二质粒，并命名为P化1920-CarB-18-cTesA2-13C05，其为包含耻垢分枝杆菌Ca巧基因和得自大肠杆菌的硫醋酶基因（' tesA)的变体的第 二表达载体(参见实施例1，上文）。可W将巧巾质粒共转染至大肠杆菌菌株中，该菌株不生产 脂肪胺(上文），从而得到菌株F18-YG。还可W使用分别用作对照的各种质粒转染宿主细胞， 得到对照菌株F18(p 化 1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05)和对照菌株PU(pACYC-pimE)。
[016引在32°C下，可W使细胞在补充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis-化is,pH 7.0的M9基本培养基中生长，并使用ImM异丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧 (IPTG)在ODsgg~1.0诱导。在诱导时，还可W加入5g/L k谷氨酸盐作为氮源。可W使包含 pACYC-puuE的菌株在抗生素簇节青霉素 (0.05mg/mL)存在下生长，并可W使包含P化1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05的菌株在O.lmg/mL奇霉素存在下生长，从而选择各自质粒。在过夜 生长后，可W向巧巾菌株的培养物补充另外的lOg/L葡萄糖和5g/L心谷氨酸盐。在诱导后的 24小时，可W将ImL培养物的等分物冷冻。
[0169] 为了制备用于分析的样品，可W将0.5mL乙酸乙醋加入至各培养物的等分物中。然 后可W将样品在最大速度下满流处理大约15分钟，并根据需要离屯、5分钟。可W使用Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法：烧控 1 无分流CTC)下分析有机相。预计其中PimE，Ca巧和/或' tesA被外源表达的F18-PU菌株产生 一个或多个独特的峰，运些峰在PU或F18的阴性对照中未观察到。可W通过NIST 05化学化 合物文库识别由F18-PU培养物得到的样品中所预计的独特的峰。可W将购自Sigma/ Aldrich的分析参照标准品（P;roduct#325163)与F18-PU样品连续2次运行，从而证明新型脂 肪胺化合物的特性。
[0170] 实施例4:
[0171] 通过AAR与GABA氨基转移酶(PimE)共表达，并补充氮源(谷氨酸盐），可W在体内生 成脂肪醒前体和相应的脂肪胺。脂肪醒前体可W转化成相应的胺。
[0172] 可W使用合适的正向引物和反向引物，通过PCR由大肠杆菌菌株克隆PimE基因（类 似于实施例1中的教导，上文）。可W将PimE基因连接至表达载体(例如pACYC，上文）中，从而 生成质粒pACYC-pimE。可W生成第二质粒，并命名为P化1920-aar，其为包含由细长聚球藻 PCC7942(aar)得到的AAR基因的另一种表达载体。可W将巧巾质粒共转染至大肠杆菌菌株 中，该菌株不生产脂肪胺(上文），从而得到菌株F19-PU。还可W使用分别用作对照的各种质 粒转染宿主细胞，得到对照菌株F19(p化1920-aar)和对照菌株PU(pACYC-pimE)。
[0173] 在32°C下，可W使细胞在补充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis-化is,pH 7.0的M9基本培养基中生长，并使用ImM异丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧 (IPTG)在ODsgg~1.0诱导。在诱导时，还可W加入5g/L k谷氨酸盐作为氮源。可W使包含 pACYC-puuE的菌株在抗生素簇节青霉素 (0.05mg/mL)存在下生长，并可W使包含P化1920-aar的菌株在O.lmg/mL奇霉素存在下生长，从而选择各种质粒。在过夜生长后，可W向巧中菌 株的培养物补充另外的lOg/L葡萄糖和5g/L心谷氨酸盐。在诱导后的24小时，可W将ImL培 养物的等分物冷冻。
[0174] 为了制备用于分析的样品，可W将0.5mL乙酸乙醋加入至各培养物的等分物中。然 后可W将样品在最大速度下满流处理大约15分钟，并根据需要离屯、大约5分钟。可W使用 Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法： 烧控1无分流CTC)下分析有机相。预计其中PimE和/或aar被外源表达的F19-PU菌株产生一 个或多个独特的峰，运些峰在PU或F19的阴性对照中未观察到。可W通过NIST 05化学化合 物文库识别由F19-PU培养物得到的样品中所预计的独特的峰。可W将购自Sigma/Al化ich 的分析参照标准品（Product#325163)与F19-PU样品连续2次运行，从而证明新型脂肪胺化 合物的特性。
[0175] 实施例5:
[0176] 通过硫醋酶(TesA)和簇酸还原酶(CarB)与胺脱氨酶(例如脱氮副球菌的甲基胺脱 氨酶或假单胞菌属菌种的quinohemo蛋白质胺脱氨酶)共表达，并补充氮源(氨），可W在体 内生成脂肪醒前体和相应的脂肪胺。脂肪醒前体可W转化成相应的胺。
[0177] 可W使用合适的正向引物和反向引物，通过PCR克隆由脱氮副球菌或假单胞菌属 的菌种得到的胺脱氨酶(AD)基因（类似于实施例1中的教导，上文）。然后，可W将AD基因连 接至表达载体(例如pACYC，上文）中，从而生成质粒pACYC-AD。可W生成第二质粒，并命名为 P化1920-化巧-18-cTesA2-13C05,其为包含耻垢分枝杆菌Ca巧基因和得自大肠杆菌的硫醋 酶基因（'tesA)的变体的另一种表达载体(参见实施例1，上文）。可W将巧巾质粒共转染至大 肠杆菌菌株中，该菌株不生产脂肪胺(上文），从而得到菌株F20-AD。还可W使用分别用作对 照的各种质粒转染宿主细胞，得到对照菌株F20(pCL1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05)和对照 菌株 AD(pACYC-AD)。
[0178] 在32°C下，可W使细胞在补充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis-化is,pH 7.0的M9基本培养基中生长，并使用ImM异丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧 (IPTG)在ODsqq~1.0诱导。在诱导时，还可W加入大约0.5-lg/L氨作为氮源。可W使包含 pACYC-AD的菌株在抗生素簇节青霉素（0.05mg/mL)存在下生长，并可W使包含P化1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05的菌株在O.lmg/mL奇霉素存在下生长，从而选择各自质粒。在过夜 生长后，可W向巧巾菌株的培养物补充另外的lOg/L葡萄糖和大约0.5-lg/L氨。在诱导后的 24小时，可W将ImL培养物的等分物冷冻。
[0179] 为了制备用于分析的样品，可W将0.5mL乙酸乙醋加入至各培养物的等分物中。然 后可W将样品在最大速度下满流处理大约15分钟，并根据需要离屯、5分钟。可W使用Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法：烧控 1 无分流CTC)下分析有机相。预计其中AD，ca巧和/或'tesA被外源表达的F20-AD菌株产生一 个或多个独特的峰，运些峰在PU或F20的阴性对照中未观察到。可W通过NIST 05化学化合 物文库识别由F20-AD培养物得到的样品中所预计的独特的峰。可W将购自Sigma/Al化ich 的分析参照标准品（Product#325163)与F20-AD样品连续2次运行，从而证明新型脂肪胺化 合物的特性。
[0180] 实施例6:
[0181] 通过AAR与胺脱氨酶（例如脱氮副球菌的甲基胺脱氨酶或假单胞菌属菌种的 quinohemo蛋白质胺脱氨酶)共表达，并补充氮源(氨），可W在体内生成脂肪醒前体和相应 的脂肪胺。脂肪醒前体可W转化成相应的胺。
[0182] 可W使用合适的正向引物和反向引物，通过PCR由大肠杆菌菌株克隆胺脱氨酶 (AD)基因（类似于实施例1中的教导，上文）。可W将AD基因连接至表达载体(例如pACYC，上 文）中，从而生成质粒pACYC-AD。可W生成第二质粒，并命名为pCL1920-aar，其为包含由细 长聚球藻P(X7942(aar)得到的AAR基因的另一种载体。可W将2种质粒共转染至大肠杆菌菌 株中，该菌株不生产脂肪胺(上文），从而得到菌株F21-AD。还可W使用分别用作对照的各种 质粒转染宿主细胞，得到对照菌株F21(p化1920-aar)和对照菌株AD(pACYC-AD)。
[0183] 在32°C下，可W使细胞在补充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis-化is,pH 7.0的M9基本培养基中生长，并使用ImM异丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧 (IPTG)在ODsqq~1.0诱导。在诱导时，还可W加入大约0.5-lg/L氨作为氮源。可W使包含 pACYC-AD的菌株在抗生素簇节青霉素 (0.05mg/mL)存在下生长，并可W使包含pCL1920-aar 的菌株在O.lmg/mL奇霉素存在下生长，从而选择各自质粒。在过夜生长后，可W向3种菌株 的培养物补充另外的lOg/L葡萄糖和大约0.5-lg/L氨。在诱导后的24小时，可W将ImL培养 物的等分物冷冻。
[0184] 为了制备用于分析的样品，可W将0.5mL乙酸乙醋加入至各培养物的等分物中。然 后可W将样品在最大速度下满流处理大约15分钟，并根据需要离屯、大约5分钟。可W使用 Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法： 烧控1无分流CTC)下分析有机相。预计其中AD和/或aar被外源表达的F21-AD菌株产生一个 或多个独特的峰，运些峰在AD或F21的阴性对照中未观察到。可W通过NIST 05化学化合物 文库识别由F21-AD培养物得到的样品中所预计的独特的峰。可W将购自Sigma/Aldrich的 分析参照标准品（Product#325163)与F21-AD样品连续2次运行，从而证明新型脂肪胺化合 物的特性。
[0185] 对于本领域的任一技术人员显而易见的是，在不脱离本发明公开的精神和范围的 条件下可W对上述方面和实施方案进行多处修改和改变。此类修改和改变均在本发明公开 的范围内。
【主权项】
1. 一种用于脂肪胺生产的重组微生物有机体，其包含用于将脂肪醛转化成脂肪胺的改 造的代谢途径，其中所述的代谢途径包含具有氨基转移酶或胺脱氢酶活性的外源生物合成 酶，并且其中所述的微生物有机体在体内生产所述的脂肪胺。2. 权利要求1所述的重组微生物有机体，其中所述的脂肪胺被所述的微生物有机体释 放至培养物培养基中。3. 权利要求1所述的重组微生物有机体，其中所述的外源生物合成酶为腐胺或GABA氨 基转移酶。4. 权利要求3所述的重组微生物有机体，其中所述的腐胺氨基转移酶为YgjG。5. 权利要求4所述的重组微生物有机体，其中所述的YgjG是由在所述的微生物有机体 中表达的编码ygjG基因的核酸序列所编码。6. 权利要求3所述的重组微生物有机体，其中所述的GABA氨基转移酶为PuuE。7. 权利要求6所述的重组微生物有机体，其中所述的PuuE是由在所述的微生物有机体 中表达的编码puuE基因的核酸序列所编码。8. 权利要求1所述的重组微生物有机体，其中所述的外源生物合成酶为胺脱氢酶。9. 权利要求8所述的重组微生物有机体，其中所述的胺脱氢酶为脱氮副球菌的甲基胺 脱氢酶。10. 权利要求1所述的重组微生物有机体，其中所述的重组微生物有机体进一步包含用 于将酰基-ACP或酰基-CoA转化成脂肪酸的另一种改造的代谢途径。11. 权利要求10所述的重组微生物有机体，其中所述的酰基-ACP或所述的酰基-CoA通 过具有硫酯酶活性的生物合成酶而转化成脂肪酸。12. 权利要求11所述的重组微生物有机体，其中所述的具有硫酯酶活性的生物合成酶 是由在所述的微生物有机体中表达的编码tesA基因的核酸序列所编码。13. 权利要求1所述的重组微生物有机体，其中所述的重组微生物有机体进一步包含用 于将脂肪酸转化成脂肪醛的另一种改造的代谢途径。14. 权利要求13所述的重组微生物有机体，其中所述的脂肪酸通过具有羧酸还原酶 (CAR)活性的生物合成酶而转化成脂肪醛。15. 权利要求14所述的重组微生物有机体，其中具有CAR活性的生物合成酶是由在所述 的微生物有机体中表达的编码carB基因的核酸序列所编码。16. 权利要求1所述的重组微生物有机体，其中所述的重组微生物有机体为重组微生物 细胞。17. 权利要求16所述的重组微生物细胞，其中所述的重组微生物细胞为重组细菌细胞。18. 权利要求16所述的重组微生物细胞，其中所述的重组微生物细胞选自埃希氏菌属、 芽孢杆菌属、蓝藻门、乳杆菌属、发酵单胞菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲霉菌属、木霉属、 脉孢菌属、镰刀菌属、腐质霉属、根毛霉菌属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、毛霉菌属、毁丝菌 属、青霉属、毛平革菌、侧耳属、栓菌属、金孢子菌属、酵母菌属、寡养单胞菌属、裂殖酵母属、 耶氏酵母属和链霉菌属。19. 权利要求18所述的重组微生物细胞，其中所述的埃希氏菌属为大肠杆菌。20. 权利要求18所述的重组微生物细胞，其中所述的蓝藻门选自原绿球藻、聚球藻、集 胞藻属、蓝杆藻和念珠藻。21. 权利要求18所述的重组微生物细胞，其中所述的蓝藻门选自细长聚球藻PCC7942、 集胞藻属的菌种PCC6803和聚球藻的菌种PCC7001。22. -种生产脂肪胺的方法，其包括在包含碳源的发酵肉汤中培养权利要求1所述的重 组微生物有机体。23. -种用于脂肪胺生产的重组细胞细胞，其包含： (i) 一种或多种表达基因，其编码具有硫酯酶活性的外源生物合成酶； (ii) 一种或多种表达基因，其编码具有羧酸还原酶活性的外源生物合成酶；以及 (iii) 一种或多种表达基因，其编码具有氨基转移酶或胺脱氢酶活性的外源生物合成 酶，其中所述的重组细菌细胞在体内生产所述的脂肪胺。24. 权利要求23所述的重组细菌细胞，其中所述的脂肪胺被所述的细菌细菌释放至培 养物培养基中。25. 权利要求23所述的重组细菌细胞，其中所述的具有硫酯酶活性的外源生物合成酶 将酰基-ACP或酰基-CoA转化成脂肪酸。26. 权利要求25所述的重组细菌细胞，其中所述的具有羧酸还原酶活性的外源生物合 成酶将所述的脂肪酸转化成脂肪醛。27. 权利要求26所述的重组细菌细胞，其中所述的具有氨基转移酶或胺脱氢酶活性的 外源生物合成酶将所述的脂肪醛转化成脂肪胺。28. 权利要求23所述的重组细菌细胞，其中所述的具有硫酯酶活性的外源生物合成酶 是由编码tesA基因的核酸序列所编码。29. 权利要求23所述的重组细菌细胞，其中所述的具有羧酸还原酶活性的外源生物合 成酶是由编码carB基因的核酸序列所编码。30. 权利要求23所述的重组细菌细胞，其中所述的具有氨基转移酶活性的外源生物合 成酶为腐胺或GABA氨基转移酶。31. 权利要求30所述的重组细菌细胞，其中所述的腐胺氨基转移酶为YgjG。32. 权利要求31所述的重组细菌细胞，其中所述的YgjG是由编码ygjG基因的核酸序列 所编码。33. 权利要求30所述的重组细菌细胞，其中所述的GABA氨基转移酶为PuuE。34. 权利要求33所述的重组细菌细胞，其中所述的PuuE是由编码puuE基因的核酸序列 所编码。35. 权利要求23所述的重组细菌细胞，其中所述的具有胺脱氢酶活性的外源生物合成 酶为甲基胺脱氢酶。36. 权利要求35所述的重组细菌细胞，其中所述的甲基胺脱氢酶得自脱氮副球菌。37. 权利要求23所述的重组细菌细胞，其中所述的重组细菌细胞选自埃希氏菌属、芽孢 杆菌属、蓝藻门、乳杆菌属、发酵单胞菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲霉菌属、木霉属、脉孢 菌属、镰刀菌属、腐质霉属、根毛霉菌属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、毛霉菌属、毁丝菌属、 青霉属、毛平革菌、侧耳属、栓菌属、金孢子菌属、酵母菌属、寡养单胞菌属、裂殖酵母属、耶 氏酵母属和链霉菌属。38. 权利要求37所述的重组细菌细胞，其中所述的埃希氏菌属为大肠杆菌。39. 权利要求37所述的重组细菌细胞，其中所述的蓝藻门选自原绿球藻、聚球藻、集胞 藻属、蓝杆藻和念珠藻。40. 权利要求37所述的重组细菌细胞，其中所述的蓝藻门选自细长聚球藻PCC7942、集 胞藻属的菌种PCC6803和聚球藻的菌种PCC7001。41. 一种包含权利要求23所述的细菌细胞的细胞培养物。42. -种生产脂肪胺的方法，其包括在包含碳源的发酵肉汤中培养权利要求23所述的 细菌细胞。43. -种在细菌细胞中生产脂肪胺的方法，其包括： (i) 在碳源存在下，在发酵肉汤中培养权利要求23所述的细胞；以及 (ii) 收获在所述的发酵肉汤中收集的脂肪胺。
【文档编号】C12N9/10GK105874075SQ201480065828
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年12月5日
【发明人】S·B·德尔卡黛莉, L·G·霍姆
【申请人】Reg生命科学有限责任公司