制备多肽的方法

专利名称：制备多肽的方法
技术领域：
这项发明涉及多肽，更具体地，涉及细胞因子拮抗多肽，以及制备细胞因子拮抗多肽的方法。
背景技术：
细胞因子是免疫系统细胞分泌的多肽，对免疫系统细胞发挥调控作用。据报道，它们在众多疾病，包括过敏性鼻炎、遗传性过敏性皮炎、过敏性哮喘、某些寄生的传染病及癌症的发病机理中起了重要的角色。
通过在应答细胞表面的受体的介导，细胞应答细胞因子。细胞因子受体可以包括胞内、跨膜、胞外的成分。某些细胞因子受体多肽的胞外部分能被表达成可溶的形式。当被加入到已知的能对同源的细胞因子产生应答的细胞群中时，可溶的细胞因子受体能抑制细胞因子的作用。例如，据报道，无论在体内或体外的实验中，包含IL-13受体胞外部分的多肽具有抑制IL-13的作用。
然而，在细胞培养中，可溶的细胞因子拮抗多肽，包括基于IL-13受体多肽胞外部分的抑制剂的表达水平很低。这就限制了制备细胞因子拮抗多肽的商业可行性。因此，需要一个能从细胞培养中制备高表达水平的可溶性细胞因子拮抗多肽的有效方法。
发明简述这项发明部分基于制备IL-13拮抗多肽的一种改良方法的发现。以这种方法制备的IL-13拮抗多肽以高产的并以稳定的形式被提取。此外，此方法导致IL-13拮抗多肽的大部分产品以二聚体的形式存在，而这是拮抗多肽最活跃的形式。
这项发明也规定了一种药物组合物，包含以这里提及的方式制备的细胞因子拮抗多肽和减少在病人中的细胞因子，例如，IL-13，水平的方法，包括给病人服用治疗有效量的药物组合物。
一方面，这项发明提供了制备IL-13拮抗多肽的一种方法。方法包括提供带有宿主细胞的培养基。这种宿主细胞表达编码IL-13拮抗多肽的核酸和表达编码IL-13拮抗多肽的配位多肽的核酸。在允许表达IL-13拮抗多肽和配位多肽的条件下培养宿主细胞。从培养基中提取IL-13拮抗多肽，从而制备出IL-13拮抗多肽。
合适的配位多肽的例子包括，IL-13(包括带着人IL-13多肽氨基酸序列的IL-13多肽)，IL-13多肽的IL-13受体结合片断，IL-13受体多肽的抗体，IL-6(包括带着人IL-6多肽的氨基酸序列的IL-6多肽)。
在一些实施方案中，编码IL-13拮抗多肽的核酸是宿主细胞的内源基因。
在一些实施方案中，编码配位多肽的核酸是宿主细胞的外源基因。
这种方法选择地包含了介导外源基因进入宿主细胞。
在一些实施方案中，与IL-13拮抗多肽表达而配位多肽不表达时相比，IL-13拮抗多肽与配位多肽共表达时，能提取更多的拮抗多肽。
在一些实施方案中，当表达编码IL-13拮抗多肽和配位多肽的核酸时，宿主细胞的培养温度为从29℃到39℃左右。例如，温度可以为30℃、32℃、34℃、36℃、或37℃或38℃左右。
宿主细胞可以是稳定的转化细胞(如稳定转化细胞中国仓鼠卵巢细胞CHO)，或者是暂时的转化细胞(如暂时转化细胞COS)。
在一些实施方案中，IL-13拮抗多肽包含了至少融合了免疫球蛋白多肽的一部分的IL-13受体多肽的胞外部分。IL-13受体多肽的实例包括IL-13Rα.1、IL-13Rα.2或IL-4受体多肽链。
在一些实施方案中，IL-13拮抗多肽包含免疫球蛋白γ1多肽的Fc区域。
IL-13Rα.2Fc可作为IL-13拮抗多肽的一个实例。
在一些实施方案中，相比较而言，表达的IL-13拮抗多肽的聚合体少于，在宿主细胞中(不表达编码IL-13拮抗多肽配位多肽的核酸的)表达的IL-13拮抗多肽的聚合体。例如，不同的情况下，相对于在宿主细胞中(不表达编码IL-13多肽配位多肽的核酸)的表达的IL-13拮抗多肽的聚合体，聚合体至少减少10％，30％，50％，70％，80％，90％左右或更多。
在进一步的方面，通过提供包含细胞的培养基以及表达编码IL-13Rα2.Fc多肽的核酸和表达编码IL-13Rα2.Fc多肽配位多肽的核酸的细胞，这项发明提供了制备IL-13Rα2.Fc多肽的方法。细胞在允许表达IL-13Rα2.Fc多肽和配位多肽的条件下培养，从培养基中提取IL-13Rα2.Fc多肽，从而制备了IL-13Rα2.Fc多肽。
通过提供包含细胞的培养基以及表达编码IL-13Rα2.Fc多肽的核酸和表达编码IL-13多肽的核酸的细胞，这项发明也提供了制备IL-13Rα2.Fc多肽的另一种方法。细胞在允许表达IL-13Rα2.Fc多肽和IL-13多肽的条件下培养。从培养基中提取IL-13Rα2.Fc多肽，从而制备了IL-13Rα2.Fc多肽。
在一些实施方案中，与IL-13Rα2.Fc多肽表达而IL-13不表达时相比，IL-13Rα2.Fc多肽与IL-13多肽共表达时能提取更多的IL-13Rα2.Fc多肽。
在进一步的方面，这项发明提供了由这里所描述的方法制备的IL-13拮抗多肽(如IL-13Rα2.Fc多肽)以及制药上可接受的载体。
在更进一步的方面，这发明提供了纯化可溶性IL-13拮抗多肽的制备物，在4℃下连续孵育一星期以上，至少40％的多肽以单体或二聚体存在。在某些情况下，至少50％，60％，70％，80％，90％或95％的多肽以单体或二聚体存在。
这项发明也包含了降低在病人中的细胞因子水平的方法，包括给病人服用治疗有效量的组合物，该组合物中包含了这里描述的细胞因子多肽拮抗多肽(包含IL-13拮抗多肽)。
如非其他详细说明，这里用到的所有技术的和科学的术语与这项发明所属领域的普通技术方面的普遍理解意思相同。虽然与这里所描述相似的或同等的方法与材料能被用于发明的实验或测试，但是合适的方法与材料将在下文被描述。本申请中所有参考文献，公开的专利申请，授权专利及其他参考文献在此都引入其全文作为参考。为避免争议，目前的详述，包括定义将受控。此外，材料，方法和例子仅是说明性的，并不具有限制性。
通过下面详细的描述与权利要求，发明的其他特点与优点将会是显然的。
图表简单描述图表1A是一张放射自显影照片，显示了从COS细胞系中提取的35S标记的多肽。
图表1B是一张放射自显影照片，显示了从COS细胞系提取并通过蛋白A沉淀制备的35S标记的多肽。
图2是一张示意性图表，描述了IL-13表达质粒pTMhIL13H6EK的环形结构图。
图3是一张图表，显示了含有pTMhIL13H6EK质粒的被选克隆中IL-13Rα2.Fc融合多肽产物的水平。
图4A是一张图表，显示了在6FD3细胞系和31B5细胞系中温度对与时间相关的IL-13Rα2.Fc融合多肽产物的影响。
图4B是一张柱状图，显示了在表达sIL-13R的6FD3细胞系中温度对与时间相关的sIL-13Rα2.Fc融合多肽产物的影响，以及在共表达sIL-13R和IL-13的31B5细胞系中温度对与时间相关的sIL-13Rα2.Fc融合多肽产物的影响。对于每一种细胞系和温度，sIL-13Rα2.Fc融合多肽产物在第3、5、10、14天被检测并显示。37℃时，第14天，在6FD3或31B5细胞中都没有检测到产物。
图5A是一张示意性显示图，比较了通过SEC-HPLC纯化的IL-13Rα2.Fc融合多肽分子聚合体的洗脱曲线。
图5B是一张柱状图，表示了时间与温度对由亲本细胞系6FD3和共表达IL-13细胞系31B5制备的IL-13Rα2.Fc融合多肽主要品种相对数量的影响。对每一细胞系、时间、温度而言，第一个柱状图代表HMW2形式的水平，第二个柱状图表示了HMW1形式的水平。对每一细胞系，在指定的温度和时间下，二聚体形式的水平以小圆点表示。
图6A是一张在4℃下储存6天对制备物中主要IL-13Rα2.Fc融合多肽种类的相对分布情况的影响示意图。该制备物是通过蛋白质A纯化的来源于6FD3亲本细胞的IL-13Rα2.Fc融合多肽。
图6B是一张在4℃下储存6天对制备物中主要IL-13Rα2.Fc融合多肽种类的相对分布情况的影响示意图。该制备物是通过蛋白质A纯化的来源于IL-13共表达细胞37A4的IL-13Rα2.Fc融合多肽。
图7是一张SDS-PAGE凝胶图，显示了来源于6FD3亲本细胞和IL-13共表达细胞37A4的被蛋白质A纯化的制备物成分。
图8A是一张柱状图，表示了在37℃或31℃温度下，当与无IL-13、野生型人IL-13、R127D人IL-13、和R127P人IL-13共表达时，在第9天的条件培养基中，人sIL-13Rα2.Fc的HMW1、HMW2、二聚体形式的相关数量。对于每一数据组，柱状图的次序(从左到右)分别代表了HMW1、HMW2、二聚体形式的数量。
图8B是一张示意图，显示了人s13Rα2.Fc与人IL-13野生型，人IL-13R127D，或者人IL-13R127P共表达时，随着氯化镁浓度的增加检测到的IL-13的水平(表示为相对于通过SDS溶解检测到的IL-13的水平的百分数)。
发明详述编码细胞因子拮抗多肽的核酸与被称为配位多肽(与细胞因子拮抗多肽配位的)的核酸共同表达，从而产生细胞因子拮抗多肽。相对于单独表达细胞因子拮抗多肽而不表达配位多肽的产量，共表达时细胞因子拮抗多肽的产量有所增加。此外，相对于在单独表达细胞因子拮抗多肽而不表达配位多肽的情况下观察到的高分子量形式的数量，共表达时在细胞因子拮抗多肽准备阶段出现的细胞因子拮抗多肽的高分子量形式的数量有所减少。
细胞因子拮抗多肽作为一种术语，这里用到的细胞因子拮抗多肽，是指任何能抑制一种或更多它的同源细胞因子生物学活性的多肽。因此，细胞因子拮抗多肽包括一种抑制相应的细胞因子活性的多肽。活性抑制包括1)能结合细胞因子或其中的一个片断(如其中的生物学活性片断)；2)能干扰细胞因子受体的另一个未结合细胞因子的链，来产生一种细胞因子受体结合细胞因子的信号特性。在一些实施方案中，细胞因子拮抗包含细胞因子受体胞外的一部分。细胞因子拮抗也可以是细胞因子结合的免疫球蛋白多肽，如，多克隆抗体，单克隆抗体或其中的片断。
通常，已知核苷酸序列的和已知同源配基的任何细胞因子拮抗多肽都能被使用。IL-13受体融合多肽是一个合适的细胞因子拮抗多肽，其包含融合了一个非IL-13受体多肽(如某一免疫球蛋白片断)的IL-13受体多肽部分(如胞外部分)。IL-13受体起源部分可以来源于IL-13Rα1或IL-13Rα2受体链。此外，IL-13受体部分也可以来源于任何哺乳动物的IL-13受体多肽的氨基酸序列，包括人和啮齿动物(如大鼠或小鼠)。
鼠科动物和人细胞因子拮抗多肽序列下面提供了鼠科IL-13Rα1核酸序列以及424个氨基酸构成的编码多肽序列，分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。这些序列在Hilton等发表的Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93497-501，1996的论文中被描述。
TGAAAAGATAGAATAAATGGCCTCGTGCCGAATTCGGCACGAGCCGAGGCGAGGGCCTGCATGGCGCGGCCAGCGCTGCTGGGCGAGCTGTTGGTGCTGCTACTGTGGACCGCCACCGTGGGCCAAGTTGCCGCGGCCACAGAAGTTCAGCCACCTGTGACGAATTTGAGCGTCTCTGTCGAAAATCTCTGCACGATAATATGGACGTGGAGTCCTCCTGAAGGAGCCAGTCCAAATTGCACTCTCAGATATTTTAGTCACTTTGATGACCAACAGGATAAGAAAATTGCTCCAGAAACTCATCGTAAAGAGGAATTACCCCTGGATGAGAAAATCTGTCTGCAGGTGGGCTCTCAGTGTAGTGCCAATGAAAGTGAGAAGCCTAGCCCTTTGGTGAAAAAGTGCATCTCACCCCCTGAAGGTGATCCTGAGTCCGCTGTGACTGAGCTCAAGTGCATTTGGCATAACCTGAGCTATATGAAGTGTTCCTGGCTCCCTGGAAGGAATACAAGCCCTGACACACACTATACTCTGTACTATTGGTACAGCAGCCTGGAGAAAAGTCGTCAATGTGAAAACATCTATAGAGAAGGTCAACACATTGCTTGTTCCTTTAAATTGACTAAAGTGGAACCTAGTTTTGAACATCAGAACGTTCAAATAATGGTCAAGGATAATGCTGGGAAAATTAGGCCATCCTGCAAAATAGTGTCTTTAACTTCCTATGTGAAACCTGATCCTCCACATATTAAACATCTTCTCCTCAAAAATGGTGCCTTATTAGTGCAGTGGAAGAATCCACAAAATTTTAGAAGCAGATGCTTAACTTATGAAGTGGAGGTCAATAATACTCAAACCGACCGACATAATATTTTAGAGGTTGAAGAGGACAAATGCCAGAATTCCGAATCTGATAGAAACATGGAGGGTACAAGTTGTTTCCAACTCCCTGGTGTTCTTGCCGACGCTGTCTACACAGTCAGAGTAAGAGTCAAAACAAACAAGTTATGCTTTGATGACAACAAACTGTGGAGTGATTGGAGTGAAGCACAGAGTATAGGTAAGGAGCAAAACTCCACCTTCTACACCACCATGTTACTCACCATTCCAGTCTTTGTCGCAGTGGCAGTCATAATCCTCCTTTTTTACCTGAAAAGGCTTAAGATCATTATATTTCCTCCAATTCCTGATCCTGGCAAGATTTTTAAAGAAATGTTTGGAGACCAGAATGATGATACCCTGCACTGGAAGAAGTATGACATCTATGAGAAACAATCCAAAGAAGAAACGGATTCTGTAGTGCTGATAGAAAACCTGAAGAAAGCAGCTCCTTGATGGGGAGAAGTGATTTCTTTCTTGCCTTCAATGTGACCCTGTGAAGATTTATTGCATTCTCCATTTGTTATCTGGGGGACTTGTTAAATAGAAACTGAAACTACTCTTGAAAAACAGGCAGCTCCTAAGAGCCACAGGTCTTGATGTGACTTTTGCATTGAAAACCCAAACCCAAAGGAGCTCCTTCCAAGAAAAGCAAGAGTTCTTCTCGTTCCTTGTTCCAATCCCTAAAAGCAGATGTTTTGCCAAATCCCCAAACTAGAGGACAAAGACAAGGGGACAATGACCATCAATTCATCTAATCAGGAATTGTGATGGCTTCCTAAGGAATCTCTGCTTGCTCTG (SEQ ID NO1)MARPALLGELLVLLLWTATVGQVAAATEVQPPVTNLSVSVENLCTIIWTWSPPEGASPNCTLRYFSHFDDQQDKKIAPETHRKEELPLDEKICLQVGSQCSANESEKPSPLVKKCISPPEGDPESAVTELKCIWHNLSYMKCSWLPGRNTSPDTHYTLYYWYSSLEKSRQCENIYREGQHIACSFKLTKVEPSFEHQNVQIMVKDNAGKIRPSCKIVSLTSYVKPDPPHIKHLLLKNGALLVQWKNPQNFRSRCLTYEVEVNNTQTDRHNILEVEEDKCQNSESDRNMEGTSCFQLPGVLADAVYTVRVRVKTNKLCFDDNKLWSDWSEAQSIGKEQNSTFYTTMLLTIPVFVAVAVIILLFYLKRLKIIIFPPIPDPGKIFKEMFGDQNDDTLHWKKYDIYEKQSKEETDSVVLIENLKKAAP (SEQ ID NO2)下面提供了编码鼠科IL-13 Rα2多肽序列的核酸序列和被编码的(氨基酸)序列，分别为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。被编码的序列有383个氨基酸。SEQ ID NO4中1-322位的氨基酸序列对应于鼠科IL-13 Rα2多肽的胞外部分。IL-13 Rα2的编码序列也在Donaldson等发表的J.Immunol.，1612317-24，1998论文中被论述。
GGCACGAGGGAGAGGAGGAGGGAAAGATAGAAAGAGAGAGAGAAAGATTGCTTGCTACCCCTGAACAGTGACCTCTCTCAAGACAGTGCTTTGCTCTTCACGTATAAGGAAGGAAAACAGTAGAGATTCAATTTAGTGTCTAATGTGGAAAGGAGGACAAAGAGGTCTTGTGATAACTGCCTGTGATAATACATTTCTTGAGAAACCATATTATTGAGTAGAGCTTTCAGCACACTAAATCCTGGAGAAATGGCTTTTGTGCATATCAGATGCTTGTGTTTCATTCTTCTTTGTACAATAACTGGCTATTCTTTGGAGATAAAAGTTAATCCTCCTCAGGATTTTGAAATATTGGATCCTGGATTACTTGGTTATCTCTATTTGCAATGGAAACCTCCTGTGGTTATAGAAAAATTTAAGGGCTGTACACTAGAATATGAGTTAAAATACCGAAATGTTGATAGCGACAGCTGGAAGACTATAATTACTAGGAATCTAATTTACAAGGATGGGTTTGATCTTAATAAAGGCATTGAAGGAAAGATACGTACGCATTTGTCAGAGCATTGTACAAATGGATCAGAAGTACAAAGTCCATGGATAGAAGCTTCTTATGGGATATCAGATGAAGGAAGTTTGGAAACTAAAATTCAGGACATGAAGTGTATATATTATAACTGGCAGTATTTGGTCTGCTCTTGGAAACCTGGCAAGACAGTATATTCTGATACCAACTATACCATGTTTTTCTGGTATGAGGGCTTGGATCATGCCTTACAGTGTGCTGATTACCTCCAGCATGATGAAAAAAATGTTGGATGCAAACTGTCCAACTTGGACTCATCAGACTATAAAGATTTTTTTATCTGTGTTAATGGATCTTCAAAGTTGGAACCCATCAGATCCAGCTATACAGTTTTTCAACTTCAAAATATAGTTAAACCATTGCCACCAGAATTCCTTCATATTAGTGTGGAGAATTCCATTGATATTAGAATGAAATGGAGCACACCTGGAGGACCCATTCCACCAAGGTGTTACACTTATGAAATTGTGATCCGAGAAGACGATATTTCCTGGGAGTCTGCCACAGACAAAAACGATATGAAGTTGAAGAGGAGAGCAAATGAAAGTGAAGACCTATGCTTTTTTGTAAGATGTAAGGTCAATATATATTGTGCAGATGATGGAATTTGGAGCGAATGGAGTGAAGAGGAATGTTGGGAAGGTTACACAGGGCCAGACTCAAAGATTATTTTCATAGTACCAGTTTGTCTTTTCTTTATATTCCTTTTGTTACTTCTTTGCCTTATTGTGGAGAAGGAAGAACCTGAACCCACATTGAGCCTCCATGTGGATCTGAACAAAGAAGTGTGTGCTTATGAAGATACCCTCTGTTAAACCACCAATTTCTTGACATAGAGCCAGCCAGCAGGAGTCATATTAAACTCAATTTCTCTTAAAATTTCGAATACATCTTCTTGAAAATCAGTGTTTGTCCTAATAGTGTTGGGTTTTTGACTAAAGTGCTGGATATATATCTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO3)MAFVHIRCLCFILLCTITGYSLEIKVNPPQDFEILDPGLLGYLYLQWKPPVVIEKFKGCTLEYELKYRNVDSDSWKTIITRNLIYKDGFDLNKGIEGKIRTHLSEHCTNGSEVQSPWIEASYGISDEGSLETKIQDMKCIYYNWQYLVCSWKPGKTVYSDTNYTMFFWYEGLDHALQCADYLQHDEKNVGCKLSNLDSSDYKDFFICVNGSSKLEPIRSSYTVFQLQNIVKPLPPEFLHISVENSIDIRMKWSTPGGPIPPRCYTYEIVIREDDISWESATDKNDMKLKRRANESEDLCFFVRCKVNIYCADDGIWSEWSEEECWEGYTGPDSKIIFIVPVCLFFIFLLLLLCLIVEKEEPEPTLSLHVDLNKEVCAYEDTLC (SEQID NO4)下面提供了编码人IL-13Rα2多肽序列的核酸序列，和被编码的(氨基酸)序列，分别为SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。被编码的序列有380个氨基酸。下面列出的编码人IL-13 Rα2多肽链的核酸序列，在Genbank Acc.No.U70981.1中，以及在Cαput等，J.Biol.Chem.27116921-26，1996；Zhαng等，J.Biol.Chem.2729474-78，1997；和Guo等，Genomics 42141-45，1997的论文中都能被发现。编码IL-13 Rα2多肽的开放式阅读框开始于密码子ATG(黑体显示)，并结束于密码子TGA(黑体显示)。被编码多肽的1-27位氨基酸序列对应于氨基端的信号序列。包含IL-13受体胞外部分的合适的多肽包含了由28-340位氨基酸组成的313个氨基酸的多肽片断(以粗体显示)。
CGGATGAAGGCTATTTGAAGTCGCCATAACCTGGTCAGAAGTGTGCCTGTCGGCGGGGAGAGAGGCAATATCAAGGTTTTAAATCTCGGAGAAATGGCTTTCGTTTGCTTGGCTATCGGATGCTTATATACCTTTCTGATAAGCACAACATTTGGCTGTACTTCATCTTCAGACACCGAGATAAAAGTTAACCCTCCTCAGGATTTTGAGATAGTGGATCCCGGATACTTAGGTTATCTCTATTTGCAATGGCAACCCCCACTGTCTCTGGATCATTTTAAGGAATGCACAGTGGAATATGAACTAAAATACCGAAACATTGGTAGTGAAACATGGAAGACCATCATTACTAAGAATCTACATTACAAAGATGGGTTTGATCTTAACAAGGGCATTGAAGCGAAGATACACACGCTTTTACCATGGCAATGCACAAATGGATCAGAAGTTCAAAGTTCCTGGGCAGAAACTACTTATTGGATATCACCACAAGGAATTCCAGAAACTAAAGTTCAGGATATGGATTGCGTATATTACAATTGGCAATATTTACTCTGTTCTTGGAAACCTGGCATAGGTGTACTTCTTGATACCAATTACAACTTGTTTTACTGGTATGAGGGCTTGGATCATGCATTACAGTGTGTTGATTACATCAAGGCTGATGGACAAAATATAGGATGCAGATTTCCCTATTTGGAGGCATCAGACTATAAAGATTTCTATATTTGTGTTAATGGATCATCAGAGAACAAGCCTATCAGATCCAGTTATTTCACTTTTCAGCTTCAAAATATAGTTAAACCTTTGCCGCCAGTCTATCTTACTTTTACTCGGGAGAGTTCATGTGAAATTAAGCTGAAATGGAGCATACCTTTGGGACCTATTCCAGCAAGGTGTTTTGATTATGAAATTGAGATCAGAGAAGATGATACTACCTTGGTGACTGCTACAGTTGAAAATGAAACATACACCTTGAAAACAACAAATGAAACCCGACAATTATGCTTTGTAGTAAGAAGCAAAGTGAATATTTATTGCTCAGATGACGGAATTTGGAGTGAGTGGAGTGATAAACAATGCTGGGAAGGTGAAGACCTATCGAAGAAAACTTTGCTACGTTTCTGGCTACCATTTGGTTTCATCTTAATATTAGTTATATTTGTAACCGGTCTGCTTTTGCGTAAGCCAAACACCTACCCAAAAATGATTCCAGAATTTTTCTGTGATACATGAAGACTTTCCATATCAAGAGACATGGTATTGACTCAACAGTTTCCAGTCATGGCCAAATGTTCAATATGAGTCTCAATAAACTGAATTTTTCTTGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO5)MAFVCLAIGCLYTFLISTTFGCTSSSDTEIKVNPPQDFEIVDPGYLGYLYLQWQPPLSLDHFKECTVEYEKYRNIGSETWKTIITKNLHYKDGFDLNKGIEAKIHTLLPWQCTNGSEVQSSWAETTYWISPQGIPETFVQDMDCVYYNWQYLLCSWKPGIGVLLDTNYNLFYWYEGLDHALQCVDYTKADGQNIGCRFPYLEADYKDFYICVNGSSENKPIRSSYFTFQLQNIVKPLPPVYLTFTRESSCEIKLKWSIPLGPIPARCFDYEIEIEDDTTLVTATVENETYTLKTTNETRQLCFVVRSKVNTYCSDDGIWSEWSDKQCWEGEDLSKKTLLRPWLPFGFILILVIFVTGLLLRKPNTYPKMIPEFFCDT (SEQ ID NO6).
在细胞因子拮抗多肽中出现的非细胞因子受体多肽细胞因子拮抗多肽可能包含免疫球蛋白部分(如免疫球蛋白γ1多肽的Fc区域；Caput等，Biol.Chem.27116921-29，1996；Donaldson等，J.Immunol.1612317-24，1998)。其他合适的非IL-13受体多肽序列包括GST，Lex-A，或MBP部分。融合多肽可能额外包含提高其稳定性的修饰成分(如pegylated部分)。
下面提供了人类Ig γ-1链恒定区域的核酸序列和被编码的330个氨基酸序列，分别为SEQ ID NO7SEQ ID NO8。它们在Ellison等，Nucleic Acids Res.，104071-9，1982发表的论文中也有所描述。
AGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGAGGCAGGTGGCGCCAGCCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGCGGTCGCACGAGGATGCTTGGCACGTACCCCCTGTACATACTTCCCGGGCGCCCAGCATGGAAATAAAGCACCCAGCGCTGCCCTGGGCCCCTGCGAGACTGTGATGGTTCTTTCCACGGGTCAGGCCGAGTCTGAGGCCTGAGTGGCATGAGGGAGGCAGAGCGGGTCCCACTGTCCCCACACTGGCCCAGGCTGTGCAGGTGTGCCTGGGCCCCCTAGGGTGGGGCTCAGCCAGGGGCTGCCCTCGGCAGGGTGGGGGATTTGCCAGCGTGGCCCTCCCTCCAGCAGCACCTGCCCTGGGCTGGGCCACGGGAAGCCCTAGGAGCCCCTGGGGACAGACACACAGCCCCTGCCTCTGTAGGAGACTGTCCTGTTCTGTGAGCGCCCCTGTCCTCCCGACCTCCATGCCCACTCGGGGGCATGCCTAGTCCATGTGCGTAGGGACAGGCCCTCCCTCACCCATCTACCCCCACGGCACTAACCCCTGGCTGCCCTGCCCAGCCTCGCACCCGCATGGGGACACAACCGACTCCGGGGACATGCACTCTCGGGCCCTGTGGAGGGACTGGTGCAGATGCCCACACACACACTCAGCCCAGACCCGTTCAACAAACCCCGCACTGAGGTTGGCCGGCCACACGGCCACCACACACACACGTGCACGCCTCACACACGGAGCCTCACCCGGGCGAACTGCACAGCACCCAGACCAGAGCAAGGTCCTCGCACACGTGAACACTCCTCGGACACAGGCCCCCACGAGCCCCACGCGGCACCTCAAGGCCCACGAGCCTCTCGGCAGCTTCTCCACATGCTGACCTGCTCAGACAAACCCAGCCCTCCTCTCACAAGGGTGCCCCTGCAGCCGCCACACACACACAGGGGATCACACACCACGTCACGTCCCTGGCCCTGGCCCACTTCCCAGTGCCGCCCTTCCCTGCAGACGGATCC(SEQID NO7)ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO8)细胞因子拮抗多肽可能额外地在其氨基末端包含异源引导序列(如来源于蜜蜂蜂毒(HBL)序列的信号肽)。此外，编码细胞因子拮抗多肽的核酸序列，能通过在其IL-13受体起源序列和异源非IL-13多肽之间，加入额外的氨基酸序列而被改造。
在例1中显示了这种编码IL-13细胞因子拮抗多肽hIL-13Rα2.Fc的核酸结构和序列。
配位多肽配位多肽，是指在编码细胞因子拮抗多肽和配位多肽的核酸的共表达过程中，结合细胞因子拮抗多肽的，从而促使细胞因子拮抗多肽表达的任何多肽。因此，配位多肽包括一种多肽，与细胞因子拮抗多肽单独表达而配位多肽不表达时细胞因子拮抗多肽的聚合状态相比，与编码细胞因子拮抗多肽的核酸共表达时的细胞因子拮抗多肽的聚合状态(如聚合量或聚合率)有所减少。
合适的配位多肽包含，例如，同源的细胞因子多肽或细胞因子多肽的细胞因子拮抗多肽结合片断。当细胞因子拮抗多肽来源于IL-13受体多肽时，配位多肽可能是IL-13，IL-6或是结合IL-13受体多肽的片断或变异体。人IL-13多肽的氨基酸序列已被破译。见GenBank Accession No.P35225及Minty等，Nature 362248-250，1993。下面提供了此序列MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO17)另一合适的配位多肽是IL-13的变异多肽，其127位置上的精氨酸被其他19种氨基酸取代。在有些情况，精氨酸被天(门)冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸代替(这里以R127D，R127E，R127P变异多肽的形式被提及)。意外发现，在纯化过程中，R127D和R127P这两种变异多肽比相应的127位上为精氨酸的多肽更易从溶液中与IL-13受体相分离。
再一合适的配位多肽是一种结合细胞因子拮抗多肽的抗体。该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。细胞因子拮抗的抗体可通过运用这领域已知的技术得到。例如，可以用细胞因子拮抗的胞外部分免疫动物，以此来获得对细胞因子拮抗蛋白特异反应的多克隆或单克隆抗体。可以用整个细胞因子拮抗，或用细胞因子拮抗的片断(例如细胞因子受体片断(如IL-13 Rα2))作为免疫原，来获得这种抗体。细胞因子拮抗的更小片断也可用于免疫动物。此领域合成这种多肽的方法已被发现，例如，在Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.，852149-2154，1963的论文中有所论述。
载体载体提供了表达细胞因子拮抗和细胞因子拮抗配位多肽的核酸，并在宿主细胞中得到核酸的复制繁殖。具有典型性的，载体包含一个选择性标记，其允许在宿主细胞中进行基因的观察和/或选择。标记包括，抗生素抗性基因，和编码催化代谢反应的酶的基因。
载体可以是染色体外的，或直接整合序列进入宿主细胞内源性染色体。载体可以额外包含某些序列，其可促进连接序列的复制。复制原点或自主复制序列(ARS)就是这样的序列的一个例子。编码细胞因子拮抗的核酸与编码它的配位多肽的核酸能在相同的核酸上出现，或者这两种核酸也能在不同的核酸中出现。
表达载体能用来表达编码细胞因子拮抗和配位多肽的核酸。这些序列以合适的状态与翻译起始子和终止子序列组合在一起。如果有需要的话，可以重组一段引导序列，引导翻译蛋白分泌到原生质空间或胞外培养基。选择性地，异源序列编码的融合蛋白包含可以体现所期望特征的氨基末端特征肽。(例如，表达的重组产品的稳定性与简易纯化性。
表达载体包含一个或更多个表达调控序列，可调节转录、RNA的加工，和/或细胞因子拮抗和配位多肽核酸的翻译。这种表达调控序列被这一领域所熟知并且包括启动子、增强子、核糖体结合位点、RNA结合位点、多聚腺苷酸位点、转录终止子序列和mRNA稳定性序列。合适的增强子和其他表达调控序列在Enhancers和Eukaryotic Gene Expression，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1983)，U.S.Pat.Nos.5691198，；5735500；5747469和5436146的论文中被论述。表达调控序列包括来源于SV40的早期和晚期的启动子，来源于逆转录病毒的长末端重复的启动子序列(包括鼠科莫洛尼氏白血病毒、鼠肿瘤病毒、禽肉瘤病毒)，腺病毒II，牛刺瘤病毒，多瘤病毒，早期CMV，HSV胸腺嘧啶脱氧核苷酸激酶和鼠科金属硫因-I的转录增强序列。另外，还包括来源于高表达基因的启动子(如糖分解酶(3磷酸甘油激酶(PGK))，酸性磷酸(酯)酶或热休克蛋白基因)。
合适的载体和启动子为在这一领域中的技术所知，其中包括表达载体pWLneo，pSV2Cat，pOG44，pSG(Stratagene公司)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia公司)，pMT2或pED，这些都被记载在Kaufman，等，Nucleic Acids Res.194485-90，1991的论文中。另外，pTMED或pHTOP表达载体也可以被使用。选择性地，表达载体可用标准的重组技术获得。(参见Sambrook，等Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor PressNew York))。
如果有需要的话，编码细胞因子拮抗和/或配位多肽的核酸可以与另一基因相连，而这一基因在细胞中的拷贝数可以被增加。二氢叶酸还原酶就是这种基因的一个例子。
细胞这项发明也包括含有载体的细胞，而此载体又带有编码细胞因子拮抗和配位多肽的核酸。细胞可以包含一条既编码细胞因子拮抗又编码配位多肽序列的核酸。另一方面，细胞可以包含两条分别编码细胞因子拮抗和配位多肽序列的核酸。
通常，能表达有功能性的细胞因子拮抗多肽和配位多肽的蛋白质的所有细胞类型都能被使用，这些蛋白质可以通过某种方式相互作用促进细胞因子拮抗多肽后来的纯化过程。这种细胞可以是原核细胞也可以是真核细胞。合适的真核细胞包括，例如，哺乳动物细胞，昆虫细胞(包括Sf9细胞)，或酵母细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括，例如，在Gluzman，Cell 23175，1981论文中提及的猴肾脏成纤维细胞的COS-7细胞系；C127猴COS细胞；中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，人肾脏细胞293，人表皮细胞A431，人Colo205细胞，3T3细胞，CV-1细胞，其他灵长类动物的转化细胞系，正常的二倍体细胞，来源于原初组织体外培养的细胞株，原初移植体，Hela细胞，鼠L细胞，BHK，HL-60，U937，HaK或Jurkat细胞，COS细胞，Rat 2，BaF3，32D，FDCP-1，PC12，M1x或C2C12细胞。在一些实施方案中，通常地，宿主细胞并不表达细胞因子拮抗多肽和/或配位多肽，或者只以低水平表达。
酵母株的例子包含，啤酒酵母，非洲酒裂解酵母，克鲁维酵母ssp.菌株，假丝酵母ssp.。菌株的例子包括，埃希氏菌属大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌属。
如果有需要的话，可以通过对表达蛋白质的翻译后的修饰(如磷酸化或糖基化)来增加蛋白质的功能。这种共价修饰可以通过已知的化学的或酶学的方法完成。
这些细胞可以被带有编码细胞因子拮抗和它的配位多肽的核酸暂时地转染或永久地转染。
在其配位多肽存在的情况下表达细胞因子拮抗多肽在允许细胞因子拮抗多肽和配位多肽表达的培养条件下，通过培养转化的宿主细胞，来制备细胞因子拮抗多肽。然后，从培养基或细胞提取物中纯化最终表达的细胞因子拮抗多肽。细胞因子拮抗多肽可以单独地或作为其他蛋白质的复合物(包括配位多肽)的一部分被分离。
通过收集表达细胞全部的膜片断并且用非离子去垢剂如Triton X-100进行抽提，可以纯化细胞因子拮抗多肽的膜结合形式。蛋白质纯化的各种方法已经在这一领域被熟知了，包括在Deutscher，ed.，Guide to Protein Purification，Methods in Enzymology，vol.182，1990的论文中描述的那些方法。最终表达的蛋白质可以用已知的纯化程序(如凝胶过滤层析和离子交换层析)获得。另外，多肽还可以通过免疫亲和层析被纯化，如在Conaldson等，J.Immunol.1612317-24，1998中描述的。
细胞因子拮抗多肽能用浓缩过滤器，如Amicon或Millipore Pellicon超滤器进行浓缩。在浓缩步骤中，纯化基质如凝胶过滤介质可以应用于浓缩。另外，离子交换树脂可被用于纯化细胞因子拮抗多肽。合适的树脂包括，例如，连接了二乙基氨基乙烷(DEAE)或polyethelenimine(PEI)基团的基质或基底。这些基质可以是丙烯酰胺，琼脂糖，右旋糖苷，纤维素或其他普遍用于蛋白质纯化的种类。另外，也可以应用阳离子交换措施。合适的阳离子交换剂包括众多不可溶的基质，这些基质包含sulfopropyl(例如，硫-琼脂糖凝胶柱)或羧甲基基团。从培养基上清中纯化细胞因子拮抗的过程也包括一步或多步亲和树脂(如伴刀豆蛋白A-琼脂糖，heparintoyopearl或Cibacrom blue 3GA琼脂糖凝胶)柱分离步骤；或通过运用亲和树脂(如苯基醚，丁基醚，或丙基醚)的疏水交互作用色谱；或免疫亲和色谱。最后，通过一步或多步填充了疏水RP-HPLC基质(例如，连接有甲基或其他脂肪基团的硅胶)的反向液相高压色谱(RP-HPLC)，细胞因子多肽可以被进一步纯化。与已知的方法相一致，包含有细胞因子拮抗或其片段，或包含有细胞因子拮抗抗体的亲和柱和蛋白A-琼脂糖凝胶，(其可以简化包含免疫球蛋白多肽的融合蛋白的纯化过程)能用于纯化。在各种的化合物中，前面提到的某些或所有纯化步骤，相互组合或与其他已知的方法联用，也可用于提供一种充分被纯化的分离的重组蛋白。在一些实施方案中，这种分离的细胞因子拮抗蛋白被纯化，这样就充分地与其他在表达多肽的细胞中相联的蛋白相分离。
细胞因子拮抗蛋白和/或它的同源配体也可以被表达成能促进随后的纯化的形式。如编码细胞因子拮抗的核酸能与非细胞因子拮抗序列，例如，麦芽糖结合蛋白(MBP)，谷胱苷肽S转移酶(GST)，硫氧还蛋白(TRX)，组氨酸标签，红血球凝聚素(HA)标签，融合为一体。后者(HA)的标签对应于起源于流行性感冒红血球凝聚素蛋白的抗原决定基(Wilson，等，Cell，37767(1984))。用于表达与纯化这种融合蛋白的试剂盒可以分别从New England BioLab(Beverly，Mass.)，Pharmacia(Piscataway，N.J.)和Invitrogen购买。蛋白质也能被一种抗原决定基标记，随后被识别这个抗原决定基的特定抗体纯化。FLAG抗原决定基是这种抗原决定基的一个例子(Kodak，New，Haven，Conn.)。用适当的特殊标记法，被标记的拮抗复合物能够从培养基中被纯化。从而，细胞因子拮抗能从它的配位多肽中被分离。
用这里描述的方法制备的细胞因子拮抗蛋白，能用来处理期望的使相应的细胞因子的活性受抑制的任何情况。当细胞因子拮抗蛋白是IL-13拮抗蛋白时，这种蛋白能用于治疗或调节与IL-13相关的或受IL-13活性影响的各种医学的情况(所有与IL-13相关的情况)。与IL-13相关的情况包括未受限制的抗体介导的情况与疾病，尤其指E抗体介导的情况(包括未受限制的过敏情况，哮喘，免疫综合症(例如，狼疮、肾综合症、肾炎、血管球性肾炎、甲状腺炎和Grave’s格雷弗氏病))，纤维症(肝纤维症)；免疫缺失症，尤其指造血干细胞缺失症，或与之关联的混乱症状；癌症或其他疾病。这样的病理的状态可能是由于疾病，接触了射线或药物而引起的，包括例如，白血球减少症、细菌性的或病毒性的传染病、贫血症、B细胞或T细胞缺失症(例如在骨髓移植后出现的免疫细胞或造血细胞的缺失)。根据这里描述的方法制备的IL-13细胞因子拮抗能有利于提高巨噬细胞的活性(例如，在疫苗接种中，对分支杆菌或胞内微生物体，或寄生感染的治疗)。
当与制药上可接受的载体结合时，细胞因子拮抗多肽可作为一种药物组合物被使用。除了IL-13或抑制子和载体以外，这种化合物还可以包括各种稀释液，填充物，盐类，缓冲剂，稳定剂，增溶剂和其他在该领域熟知的材料。术语“制药上的可接受的”指一种无毒材料，其不干扰活性成分的生物学活性的有效性。载体的特性依靠起作用的途径。
药物组合物可以包含额外加入的成分，包括其他的细胞因子，淋巴因子，其他造血因子(例如，M-CSF，GM-CSF，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-14，IL-15，G-CSF)，干细胞因子和红细胞生成素。药物组合物还可以包含抗细胞因子抗体。药物组合物还包括溶解血栓的或抗溶解血栓的因子(例如血纤维蛋白溶酶原催化剂和因子VIII)。药物组合物还可以包含其他抗炎症成分。这些额外的因子和/或成分可以包含在药物组合物中，与细胞因子拮抗多肽一起产生一种增效作用，或将细胞因子拮抗多肽产生的负面影响降到最小。
药物组合物可以以脂质体的形式存在，在脂质体里面细胞因子拮抗多肽除了与制药上的的可接受载体结合以外，还与两性分子成分(例如以微团、不溶性单层、液态晶体、或薄层的聚集形式存在于水相液体中的脂质)结合。未受限制地，构成脂质体形式的合适的脂质包括，甘油酯、甘油二酯、硫酯、溶血卵磷脂、磷酯、皂角苷、胆酸，以及其他类似物。这种脂质体的制备方法属于该领域的技术水平之内，例如，在U.S.Pat.No.4235871；U.S.Pat.No.4501728；U.S.Pat.No.4827028；和U.S.Pat.No.4737323的论文中都有所述及，所有的参考文献在此都引入作为参考。
这里所用的术语“治疗有效量”指药物组合物或治疗方案中每一种活性成分的总量，其充分显示了对病人有效的益处，例如在这种情况下病症的改善，康复，或康复率的增加。当作为独立的活性成分应用，单独作用时，术语就只是指那种成分。当被应用在复合物中时，术语指的是起疗效作用的活性成分的联合计量，无论是连续地或是同时地联合作用。
在测试治疗方法或使用这项发明的过程中，细胞因子拮抗多肽中治疗性有效计量对哺乳动物起作用。细胞因子拮抗多肽可以单独起作用或和其他治疗(例如，与用到细胞因子、淋巴因子或造血因子的治疗)联合起作用。当与一种或更多细胞因子、淋巴因子或其他造血因子联合起作用时，细胞因子拮抗多肽可以同时地或连续性地与细胞因子、淋巴因子或其他造血因子、血栓形成的或抗血栓形成的因子起作用。如果是持续性地起作用，主治医生将对细胞因子拮抗多肽与细胞因子、淋巴因子或其他造血因子、血栓形成或抗血栓形成因子联合使用的最佳次序作出决定。
各种方便的方法，例如口服、吸入或皮内、皮下或静脉注射，都能实现(在药物组合物中使用的或为了测试这项发明的方法而使用的)细胞因子拮抗多肽的作用。
当细胞因子拮抗多肽的治疗性有效计量通过口服方法其作用时，细胞因子拮抗多肽将被以片剂、胶囊、粉末、溶液或药剂的形式提供。当以片剂形式起作用时，发明的药物组合物可以额外包含一种固状载体例如凝胶或佐剂。片剂、胶囊、粉末包含的细胞因子拮抗多肽从大约5％-95％不等，例如，大约为25％-95％的细胞因子拮抗多肽。当以液体的形式起作用时，液状载体可以被加入其中。例如水、石油、来源于动物或植物的油脂(例如花生油、矿物油、大豆油、芝麻油或合成油)。药物组合物的液体形式还可以包含生理盐水、葡萄糖或其他糖类的溶液，或乙二醇，例如乙烯乙二醇、丙烯乙二醇、聚乙烯乙二醇。当以液体形式起作用时，药物组合物中细胞因子拮抗多肽的重量或细胞因子拮抗多肽占大约0.5％-90％不等。例如，在一些实施方案中，药物化合物包含了大约1％-50％的细胞因子拮抗多肽。
当细胞因子拮抗多肽的治疗性有效计量通过静脉、皮内的、皮下的注射形式起作用时，细胞因子拮抗多肽抑制因子将以无热源的，符合注射要求的溶液形式存在。符合注射要求(对应于pH值、离子浓度、稳定性及其他类似指标)的蛋白质溶液的制备方法，可以通过该领域的技术获得。在某些情况下，用于静脉、皮内、皮下注射的药物组合物，除细胞因子拮抗多肽抑制因子之外，额外包含了等渗介质，如钠氰化物注射液、Ring’s注射液或其他在这领域已知的介质。此项发明的药物组合物也可以包含为在此领域中的技术所知的那些稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或其他添加剂。
药物组合物中的细胞因子拮抗多肽的计量依赖于治疗情况的性状和严重性，及病人所经历的先前治疗的性状。为测试此项发明的方法用到的各种药物组合物所包含的细胞因子拮抗多肽，预计为每千克体重大概0.1微克至100毫克。
用此项发明的药物组合物进行静脉注射治疗的持续时间会有所变化，这将依赖于所治疗疾病的严重程度以及每一病人的情况和潜在的个体性反应。据预计，每次应用细胞因子拮抗多肽进行连续静脉注射的持续时间将在12-24小时的范围。最终，主治医生将决定用此项发明的药物组合物进行静脉注射治疗的适当的持续时间。
下列非限制性例子进一步阐明了这项发明。
例子例一人IL-13Rα2.Fc表达物的制备，表达和特性重组的可溶性人IL-13Rα融合蛋白被构建并命名为IL-13Rα2.Fc。
首先，用鼠科IL-13受体序列作为探针识别编码人IL-13受体序列的核酸。鼠科IL-13Rα2的识别，克隆和序列分析已经在先前的(Donαldson，等J.Immunol.，1632317-24，1998)论文中被描述。通过AMPLITAQTM聚合酶(Promega)的聚合酶链反应，来源于鼠科序列的寡核苷酸引物被用于分离人同源基因的部分片段。从Clontech得到的人睾丸polyA+RNA被用于cDNA的制备。用引物ATAGTTAAACCATTGCCACC(SEQ ID NO9)和CTCCATTCGCTCCAAATTCC(SEQ ID NO10)进行扩增，274bp的片段已被鉴定。为了从cDN A文库中识别另外的hIL-13Rα2序列，扩增片段的序列又被用于设计额外的寡核苷酸。这种准备好的寡核苷酸序列为AGTCTATCTTACTTTTACTCG(SEQ IDNO11)和CATCTGAGCAATAAATATTCAC (SEQ ID NO12)。
在标记32P后，寡核苷酸被用于筛选人睾丸cDNA文库(C1ontech)。在筛选过的超过400000个克隆中，有22个与两种寡核苷酸探针都杂交的克隆被鉴定。对其中的克隆4个进行DN A序列分析，4个都克隆编码相同的序列。hIL-13Rα2cDNA的完整长度序列被保存在基因库中(编号为U70981)。
hIL-13Rα2cDNA预期编码一个受体链，包含了N-末端胞外部分，短的跨膜部分，短的C-末端细胞质尾巴。
通过将hIL-13 Rα2的胞外部分的NH2-末端313个氨基酸与人Igγ-1重链(包含绞链-CH2CH3区域)COOH-末端231个氨基酸融合，可以构建可溶的保留其结合hIL-13能力的hIL-13Rα2受体(“hIL-13 Rα2.Fc”)。编码融合蛋白(“L2I”)的序列被克隆入载体pED，并通过COS细胞的暂时转染方法来进行评估，或克隆入pHTOP载体来评估在CHO稳定细胞系中的表达情况。
异类NH2-末端信号序列的递呈导致hIL-13 Rα2.Fc多肽在CHO细胞中的表达。天然的前导序列由此被来源于蜜蜂蜂毒基因的前导序列取代，这种序列能指导信号肽的有效递呈(Tessier等，Gene 98177-83，1991)。包含蜜蜂前导序列，hIL-13Rα2的胞外部分和Igγ-1重链的COOH-末端的分子被CHO细胞递呈，从而产生可溶的hIL-13 Rα2.Fc。
hIL-13 Rα2.Fc结构通过亚克隆进入表达载体pTMED，以允许在CHO细胞中高水平基因表达和随着转染之后进行稳定细胞系的选择与扩增。质粒PHTOP-L2I被限制性酶NotI剪切，通过Klenow酶的作用平末端化，再被限制性酶ApaI剪切后，释放包含整个hIL-13 Rα2.Fc编码区域和一部分EMCV内在核糖体进入序列的1836bp的片段。此片段被XbaI酶剪切，通过Klenow酶的作用平末端化，再被限制性酶ApaI剪切后，与质粒pTMED连接，最终产生了表达载体pTMED-L2I。通过分析整个质粒的DNA序列，确认已经制成了原先设计的结构。表达载体pTMED-L2I的DNA序列和预知的hIL-13 Rα2.Fc基因翻译产物被显示在上面的文章中。
hIL-13 Rα2.Fc基因位于脑心肌炎(EMC)病毒内在核糖体进入位点(IRES)以及选择/扩增标记基因吲哚满还原酶(DHFR)的上游位点之间，作为双顺反子mRNA的一部分被转录。DHFR基因授予转染的原先缺失dhfr的CHO细胞在无外加核酸的条件下生长的能力。鼠细胞巨化病毒的增强子和启动子序列位于hIL-13 Rα2.Fc基因的上游位点，启动双顺反子mRNA转录。腺病毒三重引导序列和混合的介入序列位于CMV增强子/启动子序列之后，并促使双顺反子mRNA的有效转录。来源于蜜蜂蜂毒基因的信号肽序列直接与hIL-13 Rα2.Fc编码区域的上游相连。
Northern和Western blot分析证实表达质粒产生预知大小的信使RNA和蛋白质(例如，带着约200个核酸的poly(A)尾巴的约3800个核酸)，和由纯化的hIL-13 Rα2.Fc蛋白执行的功能评估，表明此蛋白在体外特定地结合hIL-13并且阻止hIL-13和细胞受体的相互作用。Southern blot分析与基因组的DNA序列分析确定表达载体插入了宿主细胞基因组。总之，这些结果都阐明了细胞系表达了期望的hIL-13 Rα2.Fc蛋白。
表达载体pTMED-L2I的核酸序列如下所示。对应hIL-13Rα2.Fc和DHFR区域的核酸序列用下划线表示。hIL-13 Rα2.Fc的氨基酸序列显示在每一密码子下面。来源于蜜蜂蜂毒引导序列(HBL)的信号肽序列用下划线表示。对应hIL-13 Rα2.Fc胞外区域的氨基酸序列以黑体形式显示。
pTMED-L2I表达质粒的核苷酸序列和hIL-13 Rα2.Fc的氨基酸序列1CATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGTACTGTATACGCCACACTTTATGGCGTGTCTACGCATTCCTCTTTTATGGCGTAGTCCGCATGA61GAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCCTCAGTAATCCCTGAAAGGTTACCCAAAACGGGTCATGTATTCCAGTTATCCCCACTTAG121AACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTTGTCCTTTCAGGGTAACCTCGGTTCATGTGACTCAGTTATCCCTGAAAGGTAACCCAAA181TGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACGGGTCATGTTTTCCAGTTATCCCCCACTCAGTTACCCAAAAAGGGTAATAACCGTGCA241ACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATTGTATTCCAGTTATCCCCACTCAGTAACCCAAAAAGGTCGGTTAAATTAATTTTGCGGTA301GTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACCATGAAAGGGTGGTAACTGCAGTTACCCGATAACTTTGATTACGTTGCACTGGAAATTTG361GGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGCCATGAAAGGGTATCGACTAATTACCCTTTCATGGCAAGAGCTCGGTTATGTGCAGTTAC421GGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATCCTTCACTTTCCCGTCGGTTTTGCATTGTGGCGGGGCCAAAAGGGGACCTTTAAGGTATA481TGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCGACCAGCGTACCGTGCGTAAGATAACCGACTCGACGCAAGATGCACCCATATTCTCCGCGCTGGTCGCA541CGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGAGCTCCTCGCTGCAGCCCGCCATGGCAGCGTCAGAAGCCAGACTGGTGGCATCTTGCGTCTCGAGGAGCGACGTCGGG601AAGCTCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATTCGAGACAACCCGAGCGCCAACTCCTGTTTGAGAAGCGCCAGAAAGGTCATGAGAACCT661TCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCAAGCCTTTGGGCAGCCGGAGGCTTGCCATGAGGCGGTGGCTCCCTGGACTCGCTCAGGCGT721TCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGACTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCAAGCTGGCCTAGCCTTTTGGAGAGCTGACAACCCCACTCATGAGGGAGAGTTTTCGCCCGT
781TGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCACTGAAGACGCGATTCTAACAGTCAAAGGTTTTTGCTCCTCCTAAACTATAAGTGGACCG841CCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACAATCTTTTTGTGGCGCCACTACGGAAACTCCCACCGGCGCAGGTAGACCAGTCTTTTCTGTTAGAAAAACA901TGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATACAGTTCGAACTCCACACCGTCCGAACTCTAGACCGGTATGTGAACTCACTGTTACTGTA961CCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGGTCGACTCTAGGGTGAAACGGAAAGAGAGGTGTCCACAGGTGAGGGTCCAGGTTGACGTCCAGCTGAGATC1021(hIL-13Rα2.Fc编码区域)CGCACCACCATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTGCGTGGTGGTACTTTAAGAATCAGTTGCAACGGGAACAAAAATACCAGCACATGTAAAGAP1 >M K F L V N V A L V F M V V Y I SHBL1081TACATCTATGCGACCGAGATAAAAGTTAACCCTCCTCAGGATTTTGAGATAGTGGATCCCATGTAGATACGCTGGCTCTATTTTCAATTGGGAGGAGTCCTAAAACTCTATCACCTAGGGP18>Y I Y AT E I K V N P P Q D F E I V D PhIL-13Rα2胞外域1141GGATACTTAGGTTATCTCTATTTGCAATGGCAACCCCCACTGTCTCTGGATCATTTTAAGCCTATGAATCCAATAGAGATAAACGTTACCGTTGGGGGTGACAGAGACCTAGTAAAATTCP38> G Y L G Y L Y L Q W Q P P L S L D H F K1201GAATGCACAGTGGAATATGAACTAAAATACCGAAACATTGGTAGTGAAACATGGAAGACCCTTACGTGTCACCTTATACTTGATTTTATGGCTTTGTAACCATCACTTTGTACCTTCTGGP58> E C T V E Y E L K Y R N I G S E T W K T1261ATCATTACTAAGAATCTACATTACAAAGATGGGTTTGATCTTAACAAGGGCATTGAAGCGTAGTAATGATTCTTAGATGTAATGTTTCTACCCAAACTAGAATTGTTCCCGTAACTTCGCP78> I I T K N L H Y K D G F D L N K G I E A1321AAGATACACACGCTTTTACCATGGCAATGCA AAATGGATCAGAAGTTCAAAGTTCCTGGTTCTATGTGTGCGAAAATGGTACCGTTACGTGTTTACCTAGTCTTCAAGTTTCAAGGACCP98> K I H T L L P W Q C T N G S E V Q S S W1381GCAGAAACTACTTATTGGATATCACCACAAGGAATTCCAGAAACTAAAGTTCAGGATATGCGTCTTTGATGAATAACCTATAGTGGTGTTCCTTAAGGTCTTTGATTTCAAGTCCTATACP118>A E T T Y W I S P Q G I P E T K V Q D M1441GATTGCGTATATTACAATTGGCAATATTTACTCTGTTCTTGGAAACCTGGCATAGGTGTACTAACGCATATAATGTTAACCGTTATAAATGAGACAAGAACCTTTGGACCGTATCCACATP138>D C V Y Y N W Q Y L L C S W K P G I G V1501
CTTCTTGATACCAATTACAACTTGTTTTACTGGTATGAGGGCTTGGATCATGCATTACAGGAAGAACTATGGTTAATGTTGAACAAAATGACCATACTCCCGAACCTAGTACGTAATGTCP158>L L D T N Y N L F Y W Y E G L D H A L Q1561TGTGTTGATTACATCAAGGCTGATGGACAAAATATAGGATGCAGATTTCCCTATTTGGAGACACAACTAATGTAGTTCCGACTACCTGTTTTATATCCTACGTCTAAAGGGATAAACCTCP178>C V D Y I K A D G Q N I G C R F P Y L E1621GCATCAGACTATAAAGATTTCTATATTTGTGTTAATGGATCATCAGAGAACAAGCCTATCCGTAGTCTGATATTTCTAAAGATATAAACACAATTACCTAGTAGTCTCTTGTTCGGATAGP198>A S D Y K D F Y I C V N G S S E N K P I1681AGATCCAGTTATTTCACTTTTCAGCTTCAAAATATAGTTAAACCTTTGCCGCCAGTCTATTCTAGGTCAATAAAGTGAAAAGTCGAAGTTTTATATCAATTTGGAAACGGCGGTCAGATAP218>R S S Y F T F Q L Q N I V K P L P P V Y1741CTTACTTTTACTCGGGAGAGTTCATGTGAAATTAAGCTGAAATGGAGCATACCTTTGGGAGAATGAAAATGAGCCCTCTCAAGTACACTTTAATTCGACTTTACCTCGTATGGAAACCCTP238>L T F T R E S S C E I K L K W S I P L G1801CCTATTCCAGCAAGGTGTTTTGATTATGAAATTGAGATCAGAGAAGATGATACTACCTTGGGATAAGGTCGTTCCACAAAACTAATACTTTAACTCTAGTCTCTTCTACTATGATGGAACP258>P I P A R C F D Y E I E I R E D D T T L1861GTGACTGCTACAGTTGAAAATGAAACATACACCTTGAAAACAACAAATGAAACCCGACAACACTGACGATGTCAACTTTTACTTTGTATGTGGAACTTTTGTTGTTTACTTTGGGCTGTTP278>V T A T V E N E T Y T L K T T N E T R Q1921TTATGCTTTGTAGTAAGAAGCAAAGTGAATATTTATTGCTCAGATGACGGAATTTGGAGTAATACGAAACATCATTCTTCGTTTCACTTATAAATAACGAGTCTACTGCCTTAAACCTCAP298>L C F V V R S K V N I Y C S D D G I W S1981GAGTGGAGTGATAAACAATGCTGGGAAGGTGAAGACCTATCGAAGAAAACTCCCAAATCTCTCACCTCACTATTTGTTACGACCCTTCCACTTCTGGATAGCTTCTTTTGAGGGTTTAGAP318>E W S D K Q C W E G E D L S K K T P K S人类重链2041TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAACACTGTTTTGAGTGTGTACGGGTGGCACGGGTCGTGGACTTGAGGACCCCCCTGGCAGTP338>C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S2101GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCCAGAAGGAGAAGGGGGGTTTTGGGTTCCTGTGGGAGTACTAGAGGGCCTGGGGACTCCAGP358>V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V2161
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4501CTTTTGGCTTCCTTCCAGGCGCGGCGGCTGCTGCGCTAGCTTTTTTGGCGAGCTCGAATTGAAAACCGAAGGAAGGTCCGCGCCGCCGACGACGCGATCGAAAAAACCGCTCGAGCTTAA4561AATTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTAAGACGTAATTACTTAGCCGGTTGCGCGCCCCTCTCCGCCAAACGCATAACCCGCGAG4621TTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAAGGCGAAGGAGCGAGTGACTGAGCGACGCGAGCCAGCAAGCCGACGCCGCTCGCCATAG4681AGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAATCGAGTGAGTTTCCGCCATTATGCCAATAGGTGTCTTAGTCCCCTATTGCGTCCTTTCTT4741CATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTGTACACTCGTTTTCCGGTCGTTTTCCGGTCCTTGGCATTTTTCCGGCGCAACGACCGCAA4801TTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGAAAGGTATCCGAGGCGGGGGGACTGCTCGTAGTGTTTTTAGCTGCGAGTTCAGTCTCCAC4861GCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCGCTTTGGGCTGTCCTGATATTTCTATGGTCCGCAAAGGGGGACCTTCGAGGGAGCACGC4921CTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGGAGAGGACAAGGCTGGGACGGCGAATGGCCTATGGACAGGCGGAAAGAGGGAAGCCCTTC4981CGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCGCACCGCGAAAGAGTTACGAGTGCGACATCCATAGAGTCAAGCCACATCCAGCAAGCGAG5041CAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAAGTTCGACCCGACACACGTGCTTGGGGGGCAAGTCGGGCTGGCGACGCGGAATAGGCCATT5101CTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGGATAGCAGAACTCAGGTTGGGCCATTCTGTGCTGAATAGCGGTGACCGTCGTCGGTGACC5161TAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCATTGTCCTAATCGTCTCGCTCCATACATCCGCCACGATGTCTCAAGAACTTCACCACCGG5221TAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACATTGATGCCGATGTGATCTTCCTGTCATAAACCATAGACGCGAGACGACTTCGGTCAATG5281CTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGGAAGCCTTTTTCTCAACCATCGAGAACTAGGCCGTTTGTTTGGTGGCGACCATCGCCACC5341TTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTT
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6241GGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGCCCCGCTTTTGAGAGTTCCTAGAATGGCGACAACTCTAGGTCAAGCTACATTGGGTGAGC6301TGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACACGTGGGTTGACTAGAAGTCGTAGAAAATGAAAGTGGTCGCAAAGACCCACTCGTTTTTG6361AGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATTCCTTCCGTTTTACGGCGTTTTTTCCCTTATTCCCGCTGTGCCTTTACAACTTATGAGTA6421ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATATGAGAAGGAAAAAGTTATAATAACTTCGTAAATAGTCCCAATAACAGAGTACTCGCCTAT6481CATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAGTATAAACTTACATAAATCTTTTTATTTGTTTATCCCCAAGGCGCGTGTAAAGGGGCTTT6541AGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTCACGGTGGACTGCAGATTCTTTGGTAATAATAGTACTGTAATTGGATATTTTTATCCGC6601TATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATATAGTGCTCCGGGAAAGCAGAGCGCGCAAAGCCACTACTGCCACTTTTGGAGACTGTGTA6661GCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGCGTCGAGGGCCTCTGCCAGTGTCGAACAGACATTCGCCTACGGCCCTCGTCTGTTCGGGC6721TCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAAGTCCCGCGCAGTCGCCCACAACCGCCCACAGCCCCGACCGAATTGATACGCCGTAGTCT6781GCAGATTGTACTGAGAGTGCAC (SEQ ID NO15)CGTCTAACATGACTCTCACGTG (SEQ ID NO16)例子2带有编码可溶的IL-13拮抗多肽，人IL-13Rα2Fc，和人IL-13核酸的质粒暂时共转染COS细胞，提高了IL-13Rα2.Fc、表达水平hIL-13对表达载体L2I编码的hIL-13 Rα2.Fc的影响在COS细胞表达系统中被评估。下面介绍的是暂时转染COS细胞条件培养基的酶联免疫反应(ELISA)结果。
在mock转染细胞中没有观察到hIL-13 Rα2.Fc多肽。L2I与三种不同的hIL-13表达载体(如pXMT2(DD)，pXMT2(PMR)，pEMC3(SK))之一共转染导致了hIL-13 Rα2.Fc多肽的表达量(1.25ug/mL-3.936ug/ml)明显高于被观察的L2I+pED载体处理组(0.52ug/ml)或L2I对照组(0.39ug/ml)hIL-13 Rα2.Fc多肽的表达量。
与对照L2I+pED载体(0.52ug/ml)的hIL-13 Rα2.Fc多肽的表达水平相比，外源基因hIL-13(来源于表达hIL-13的重组E.coli菌株(Recoli hIL-13(R&D))或表达IL-13的CHO细胞系(rCHOmIL-13(DD)))加入L2I转染的细胞，没有明显增加hIL-13 Rα2.Fc多肽产物。这个结果显示，hIL-13是通过在Fc融合多肽的合成与分泌过程中的相互作用，而并非通过细胞外的相互作用，影响条件培养基中积累的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽表达水平。
在L2I和hIL-13共转染COS细胞中初生的hIL-13 Rα2.Fc的水平与初生的hIL-13 Rα1.Fc的水平相似，即使通常后者的融合多肽在条件培养基中的积累量高于hIL-13 Rα2.Fc 20倍。通过与hIL-13共表达，hIL-13 Rα2.Fc分泌物的缺点似乎被修正了。虽然不期望与理论相关，但是hIL-13 Rα2.Fc-IL-13复合物比hIL-13 Rα2.Fc更有效被细胞分泌的情况可以解释这个结果。
正如下面总结的那样，随后的研究确证了在COS细胞表达系统中，hIL-13 Rα2.Fc与hIL-13共表达时hIL-13 Rα2.Fc多肽产物的增加情况。
pL2I和无IL-13受体转染的细胞培养基中的hIL-13 Rα2.Fc多肽产物的影响也被测试了。与L2I+pED载体转染细胞相比(约0.5微克/毫升)，L2I质粒和直接表达hIL-6的质粒(1.2-1.3微克/毫升)或直接产生M-CSF产物的质粒(约0.8微克/毫升)共转染，得到了更高的hIL-13 Rα2.Fc多肽产量。但是，与共表达hIL-13配基(3.32-4.6微克/毫升)的细胞相比，hIL-6和M-CSF多肽的表达对hIL-13 Rα2.Fc多肽产物的影响有大约6-9倍的减少。
通过对转染COS细胞进行脉冲-追踪同位素标记，积累在转染COS细胞培养基中的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽也被测定。转染的COS细胞由合成的35S标记的蛋氨酸和半胱氨酸结合物通过15分钟的脉冲进行同位素标记。通过SDS-PAGE分析样本并用放射自显影显示被标记35S的蛋白。细胞的全部条件培养基的分析情况显示在

图1A中。由蛋白A从全部培养基中浓缩得到(在SDS-PAGE分析和放射自显影之前)放射标记的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的分析情况显示在图1B中。与ELISA数据一致，同L2I质粒，hIL-13质粒或L2I+hIL-6与L2I+M-CSF质粒共转染细胞相比，L2I+hIL-13质粒共转染细胞的条件培养基中融合多肽的水平增加了。
例3编码可溶hIL-13拮抗多肽，IL-13Rα2.Fc知IL-13的质粒稳定共转染CHO细胞，增加了hIL-13Rα2.Fc的表达水平。
对用COS细胞暂时转染的方法表达IL-13 Rα2.Fc融合多肽的研究(在例子1中)，被扩大成用稳定CHO细胞系表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽。
A.共表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽和hIL-13多肽的稳定CHO细胞的制备包含hIL-13基因和青霉素抗性标记基因的表达质粒稳定转染表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的稳定CHO细胞系(图2)。正如在图2中描述的那样，hIL-13表达载体pTMNhIL13H6EK的转录是通过来源于鼠的细胞巨化病毒(mCMV)的增强子和启动子序列被启动的。来源于腺病毒主要的晚期启动子三重引导序列(TPL)增加了翻译的效率。hIL-13编码区域与6×组氨酸标签克隆在一起，用阳离子亲和柱通过蛋白质的一步纯化得到纯化蛋白。在6×组氨酸标签与hIL-13编码区域之间插入肠激酶剪切位点，以便在后一步纯化时移去6×组氨酸标签。hIL-13基因作为带有青霉素抗性标记(neoR)的双顺反子mRNA的一部分被表达。(neoR)基因的翻译是通过脑心肌炎病毒内在核糖体进入位点(EMCV IRES)介导的。转染之后，通过在有抗生素G418的培养基中培养，来选择表达hIL-13的细胞。
B.hIL-13 Rα2.Fc融合多肽和hIL-13的共表达，提高了在CHO细胞中hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的表达与COS细胞系统相似，hIL-13 Rα2.Fc融合多肽和hIL-13共表达的CHO细胞系与只表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的CHO细胞系进行了比较(图3)。表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的稳定细胞系(6FD3)被质粒pTMNhIL13H6EK转染，然后在含有抗生素G418的培养基中培养，来选择表达hIL-13的细胞。克隆被选取并通过31℃7天的分泌实验进行分析，通过蛋白质A-HPLC测定其浓度。结果显示在图3中，四种6FD3的对照产物被用箭头指出，其他数据点表示hIL-13共表达细胞的单独克隆。正如图表详述，所有被分析克隆比亲本细胞系有更高的hIL-13Rα2.Fc融合多肽的表达水平。通过Western blot分析确定了克隆表达的蛋白为hIL-13。在hIL-13 Rα2.Fc融合多肽与hIL-13共表达的细胞系(31B5)中，hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的表达也通过37℃14天批式馈料的实验被评估。
C、在较低温度下培养共表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽和hIL-13的CHO细胞，提高了hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的产量在6FD3亲本细胞和hIL-13共表达细胞31B5中，温度对hIL-13 Rα2.Fc融合多肽表达的影响通过14天批式馈料的实验被评估。正如图4A显示的那样，通过14天的研究，在6FD3亲本细胞和hIL-13共表达细胞31B5中，观察到hIL-13 Rα2.Fc融合多肽依赖时间的增长。而且在37℃和31℃时，共表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽和hIL-13的细胞系31B5比亲本细胞系6FD3，表达更多的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽。正如图4B中所示的，在共表达细胞31B5中hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的特定细胞产量高于亲本细胞系6FD3。而且，在31℃时细胞的产量高于37℃时细胞的产量。那就是说，与37℃培养时这些细胞的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的表达相比，CHO(31B5)共表达细胞在31℃下培养时，有更高的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的表达水平并/或分泌进入条件培养基中的水平。
D、hIL-13 Rα2.Fc融合多肽和hIL-13的共表达减少了hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的分子聚合可溶IL-13拮抗多肽(hIL-13 Rα2.Fc)的低表达水平归因于分子聚合。比较hIL-13 Rα2.Fc融合多肽和hIL-13共表达的31B5细胞系在培养基中hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的分子聚合状态和亲本细胞系6FD3产生的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的分子聚合状态，通过分子排阻层析HPLC(SEC-HPLC)的应用，分析了hIL-13共表达对hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的分子聚合状态的影响。简要地，通过蛋白质A琼脂糖凝胶纯化方法，收集和制备来源于测试细胞系的细胞培养基，并用于SEC-HPLC。
共表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽和hIL-13的37A4细胞系样本的SEC-HPLC层析图与6FD3亲本细胞样本的SEC-HPLC层析图揭示了二聚体与高分子重力形式的有关分布情况。(图5A)。正如在图5A中显示的，从6FD3亲本细胞中获得的带有条件培养基的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的典型色谱显示了hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的多个高峰(例如，峰保持的时间为约6.1-6.7分钟)，相对于hIL-13 Rα2.Fc融合多肽二聚体(峰保持时间为7.2分钟)的高分子量形式。相反的，从共表达hIL-13的31B5细胞系中获得的SEC图显示相对于hIL-13 Rα2.Fc融合多肽二聚体(峰保持时间为7.4分钟)高分子量形式的高峰极大地减少了。
产生hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的细胞在31℃或37℃培养时，被观察到在共表达hIL-13细胞系的条件培养基中发现的聚合体在很长培养阶段被维持在很低水平。在共表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽和hIL-13的31B5细胞系的样本的SEC-HPLC层析图与6FD3亲本细胞样本的SEC-HPLC层析图中，代表二聚体与高分子量形式的相关分布情况被对比。从6FD3亲本细胞中获得的带有条件培养基的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的层析图显示了三个主峰。在含有hIL-13 Rα2.Fc融合多肽二聚体的峰之前出现的两个峰分别代表HMW1和HMW2。也就是说，首先洗提的峰(峰保持时间约为8.2分钟)表示“HMW2”，第二个峰(峰保持时间约为8.4-8.6分钟)表示“HMW1”，第三个峰(峰保持时间约为9.4-9.7分钟)代表了hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的二聚体形式。相反的，从共表达hIL-13 31B5细胞系中获得的SEC图显示相对于二聚体峰，HMW1和HMW2的峰极大地减少了。
正如图5B中显示的，在细胞培养的时间为6天与9天(31℃)或6天(37℃)的条件培养基中出现的每一种主要hIL-13Rα2.Fc融合多肽种类的相对百分比，在培养了6天与9天的细胞之间并没有明显的变化。同样的，在整个研究过程中，培养温度对hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的分子聚合状态也没有出现明显的作用。
E.与hIL-13共表达的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽对冷藏是稳定的通过储存，纯化的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽二聚体被显示易于形成高分子量聚合体。通过SEC-HPLC，6天冷藏对从共表达hIL-13和hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的37A4细胞中获得的hIL-13Rα2.Fc融合多肽的分子聚合状态的影响，与冷藏对从6FD3亲本细胞系获得的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的分子聚合状态的影响进行了比较。简要地，被蛋白质A纯化的来源于亲本6FD3细胞和IL-13共表达细胞37A4细胞系的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽被存放在4℃连续六天。在第0、3、6天分别用SEC-HPLC分析。层析图显示了主要hIL-13 Rα2.Fc融合多肽种类的相对分布情况(图6)。
正如图6A显示，随着时间的推移，从亲本6FD3细胞得到的材料中HMW1和HMW2峰增加了。相反，图6B显示，从hIL-13共表达细胞37A4得到的包含hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的材料中HMW1和HMW2峰仍然很低。
通过SDS-PAGE(4-20％丙烯酰胺梯度凝胶，随后银染)，也分析了被蛋白质A纯化的，来源于亲本6FD3细胞或者共表达细胞37A4细胞系的材料。正如在图7中显示的，与亲本细胞相比，在共表达细胞的材料中有更少的染色带。这些结果与分子筛层析所得数据一致。
例子4hIL-13(R127D或R127P)突变体形式与hIL-13 Rα2.Fc融合多肽共表达的细胞显示了融合多肽的水平减少野生类型或突变形式的hIL-13与hIL-13 Rα2.Fc共表达时，产生的hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的数量被测定。突变体形式测试包括hIL-13R127D和R127P。表达在31℃和37℃下被测定。
在31℃或37℃下，野生型或突变形式的hIL-13与hIL-13 Rα2.Fc融合多肽共表达的结果被显示在图8A中。当在31℃或37℃下培养时，只表达hIL-13 Rα2.Fc融合多肽的细胞(“无IL-13”)显示了高水平的聚合体。在这两种温度下培养时，野生类型的hIL-13与hIL-13 Rα2.Fc融合多肽共表达的细胞显示了聚合体水平的减少。在试验中，只有在低温度下培养时，突变形式的hIL-13(R127D或R127P)与hIL-13 Rα2.Fc融合多肽共表达的细胞显示了融合多肽水平的减少。
hIL-13 Rα2.Fc融合多肽与野生，突变形式hIL-13(R127D或R127P)共表时，hIL-13 Rα2.Fc从其中分离的能力也被测试了。通过测定氯化镁从IL-13-hIL-13 Rα2.Fc复合物中分离IL-13的能力来评估分离。通过在蛋白质A柱里不断增加氯化镁浓度的方法，可以纯化来自于hIL-13 Rα2.Fc融合多肽与野生型或突变形式hIL-13共表达的细胞的条件培养基。于是，每一氯化镁浓度分离的IL-13的数量被测定了。
结果显示在图8B中。图片以复合物被SDS完全分离时的hIL-13峰为标准，显示了在不同浓度的氯化镁作用下，hIL-13在SEC-HPLC色谱上的峰面积。增加氯化镁浓度的洗脱缓冲液能够从hIL-13 Rα2.Fc多肽蛋白中有效分离突变体hIL-13多肽，但不有效分离野生型hIL-13多肽。
其他情况虽然这项发明随着这里的详细描述已经被阐述了，但是，前面的描述只是意图阐明而并非限制发明的范围，这点通过附录权利要求的范围被定义了。其他方面，优势和修正都在下面的权利要求范围之内。
序列表<110>韦思公司<120>生产多肽的方法<130>22058-547-061<140>Not Yet Assigned<141>2004-06-14<150>60/477,548<151>2003-06-11<160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1680<212>DNA<213>Mus musculus<400>1tgaaaagata gaataaatgg cctcgtgccg aattcggcac gagccgaggc gagggcctgc 60atggcgcggc cagcgctgct gggcgagctg ttggtgctgc tactgtggac cgccaccgtg 120ggccaagttg ccgcggccac agaagttcag ccacctgtga cgaatttgag cgtctctgtc 180gaaaatctct gcacgataat atggacgtgg agtcctcctg aaggagccag tccaaattgc 240actctcagat attttagtca ctttgatgac caacaggata agaaaattgc tccagaaact 300catcgtaaag aggaattacc cctggatgag aaaatctgtc tgcaggtggg ctctcagtgt 360agtgccaatg aaagtgagaa gcctagccct ttggtgaaaa agtgcatctc accccctgaa 420ggtgatcctg agtccgctgt gactgagctc aagtgcattt ggcataacct gagctatatg 480aagtgttcct ggctccctgg aaggaataca agccctgaca cacactatac tctgtactat 540tggtacagca gcctggagaa aagtcgtcaa tgtgaaaaca tctatagaga aggtcaacac 600attgcttgtt cctttaaatt gactaaagtg gaacctagtt ttgaacatca gaacgttcaa 660ataatggtca aggataatgc tgggaaaatt aggccatcct gcaaaatagt gtctttaact 720tcctatgtga aacctgatcc tccacatatt aaacatcttc tcctcaaaaa tggtgcctta 780ttagtgcagt ggaagaatcc acaaaatttt agaagcagat gcttaactta tgaagtggag 840gtcaataata ctcaaaccga ccgacataat attttagagg ttgaagagga caaatgccag 900aattccgaat ctgatagaaa catggagggt acaagttgtt tccaactccc tggtgttctt 960gccgacgctg tctacacagt cagagtaaga gtcaaaacaa acaagttatg ctttgatgac 1020aacaaactgt ggagtgattg gagtgaagca cagagtatag gtaaggagca aaactccacc 1080
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<400>5cggatgaagg ctatttgaag tcgccataac ctggtcagaa gtgtgcctgt cggcggggag 60agaggcaata tcaaggtttt aaatctcgga gaaatggctt tcgtttgctt ggctatcgga 120tgcttatata cctttctgat aagcacaaca tttggctgta cttcatcttc agacaccgag 180ataaaagtta accctcctca ggattttgag atagtggatc ccggatactt aggttatctc 240tatttgcaat ggcaaccccc actgtctctg gatcatttta aggaatgcac agtggaatat 300gaactaaaat accgaaacat tggtagtgaa acatggaaga ccatcattac taagaatcta 360cattacaaag atgggtttga tcttaacaag ggcattgaag cgaagataca cacgctttta 420ccatggcaat gcacaaatgg atcagaagtt caaagttcct gggcagaaac tacttattgg 480atatcaccac aaggaattcc agaaactaaa gttcaggata tggattgcgt atattacaat 540tggcaatatt tactctgttc ttggaaacct ggcataggtg tacttcttga taccaattac 600aacttgtttt actggtatga gggcttggat catgcattac agtgtgttga ttacatcaag 660gctgatggac aaaatatagg atgcagattt ccctatttgg aggcatcaga ctataaagat 720ttctatattt gtgttaatgg atcatcagag aacaagccta tcagatccag ttatttcact 780tttcagcttc aaaatatagt taaacctttg ccgccagtct atcttacttt tactcgggag 840agttcatgtg aaattaagct gaaatggagc atacctttgg gacctattcc agcaaggtgt 900tttgattatg aaattgagat cagagaagat gatactacct tggtgactgc tacagttgaa 960aatgaaacat acaccttgaa aacaacaaat gaaacccgac aattatgctt tgtagtaaga 1020agcaaagtga atatttattg ctcagatgac ggaatttgga gtgagtggag tgataaacaa 1080tgctgggaag gtgaagacct atcgaagaaa actttgctac gtttctggct accatttggt 1140ttcatcttaa tattagttat atttgtaacc ggtctgcttt tgcgtaagcc aaacacctac 1200ccaaaaatga ttccagaatt tttctgtgat acatgaagac tttccatatc aagagacatg 1260gtattgactc aacagtttcc agtcatggcc aaatgttcaa tatgagtctc aataaactga 1320atttttcttg cgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380aa1382<210>6<211>380<212>PRT<213>智人<400>6Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile1 5 10 15Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val20 25 30Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr35 40 45
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Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu290 295 300Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly305 310 315 320Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu325 330 335Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu340 345 350Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr355 360 365Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr370 375 380<210>7<211>2802<212>DNA<213>智人<400>7agctttctgg ggcaggccag gcctgacctt ggctttgggg cagggagggg gctaaggtga 60ggcaggtggc gccagccagg tgcacaccca atgcccatga gcccagacac tggacgctga 120acctcgcgga cagttaagaa cccaggggcc tctgcgccct gggcccagct ctgtcccaca 180ccgcggtcac atggcaccac ctctcttgca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 240ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 300gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 360cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 420gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 480aacaccaagg tggacaagaa agttggtgag aggccagcac agggagggag ggtgtctgct 540ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac gcatcccggc tatgcagccc cagtccaggg 600cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct 660cagggagagg gtcttctggc tttttcccca ggctctgggc aggcacaggc taggtgcccc 720taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg tgctgggctc agacctgcca agagccatat 780ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc accccaaagg ccaaactctc cactccctca 840gctcggacac cttctctcct cccagattcc agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc 900caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc 960gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc 1020agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctcagc acctgaactc ctggggggac 1080
cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 1140aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 1200acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 1260gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 1320agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 1380aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg gctcggccca 1440ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa 1500ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1560acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1620cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1680ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1740tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1800ggtaaatgag tgcgacggcc ggcaagcccc cgctccccgg gctctcgcgg tcgcacgagg 1860atgcttggca cgtaccccct gtacatactt cccgggcgcc cagcatggaa ataaagcacc 1920cagcgctgcc ctgggcccct gcgagactgt gatggttctt tccacgggtc aggccgagtc 1980tgaggcctga gtggcatgag ggaggcagag cgggtcccac tgtccccaca ctggcccagg 2040ctgtgcaggt gtgcctgggc cccctagggt ggggctcagc caggggctgc cctcggcagg 2100gtgggggatt tgccagcgtg gccctccctc cagcagcacc tgccctgggc tgggccacgg 2160gaagccctag gagcccctgg ggacagacac acagcccctg cctctgtagg agactgtcct 2220gttctgtgag cgcccctgtc ctcccgacct ccatgcccac tcgggggcat gcctagtcca 2280tgtgcgtagg gacaggccct ccctcaccca tctaccccca cggcactaac ccctggctgc 2340cctgcccagc ctcgcacccg catggggaca caaccgactc cggggacatg cactctcggg 2400ccctgtggag ggactggtgc agatgcccac acacacactc agcccagacc cgttcaacaa 2460accccgcact gaggttggcc ggccacacgg ccaccacaca cacacgtgca cgcctcacac 2520acggagcctc acccgggcga actgcacagc acccagacca gagcaaggtc ctcgcacacg 2580tgaacactcc tcggacacag gcccccacga gccccacgcg gcacctcaag gcccacgagc 2640ctctcggcag cttctccaca tgctgacctg ctcagacaaa cccagccctc ctctcacaag 2700ggtgcccctg cagccgccac acacacacag gggatcacac accacgtcac gtccctggcc 2760ctggcccact tcccagtgcc gcccttccct gcagacggat cc2802<210>8<211>330<212>PRT<213>智人<400>8Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30
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<223>Description of Artificial Sequenceoligonucleotideprimer<400>10ctccattcgc tccaaattcc 20<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Description of Artificial Sequenceoligonucleotideprimer<400>11agtctatctt acttttactc g21<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Description of Artificial Sequenceoligonucleotideprimer<400>12catctgagca ataaatattc ac 22<210>13<211>565<212>PRT<213>智人<400>13Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile1 5 10 15Ser Tyr Ile Tyr Ala Thr Glu Ile Lys Val Asn Pro Pro Gln Asp Phe20 25 30Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr Leu Tyr Leu Gln Trp Gln35 40 45Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu Cys Thr Val Glu Tyr Glu50 55 60Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr Trp Lys Thr Ile Ile Thr65 70 75 80
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<223>Description of Artificial Sequenceplasmidexpression vector<400>15catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgtact 60gagtcattag ggactttcca atgggttttg cccagtacat aaggtcaata ggggtgaatc 120aacaggaaag tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat agggactttc cattgggttt 180tgcccagtac aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt ttttcccatt attggcacgt 240acataaggtc aataggggtg agtcattggg tttttccagc caatttaatt aaaacgccat 300gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta atgcaacgtg acctttaaac 360ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct cgagccaata cacgtcaatg 420ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt ttcccctgga aattccatat 480tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt ataagaggcg cgaccagcgt 540cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc agagctcctc gctgcagccc 600aagctctgtt gggctcgcgg ttgaggacaa actcttcgcg gtctttccag tactcttgga 660tcggaaaccc gtcggcctcc gaacggtact ccgccaccga gggacctgag cgagtccgca 720tcgaccggat cggaaaacct ctcgactgtt ggggtgagta ctccctctca aaagcgggca 780tgacttctgc gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc 840ccgcggtgat gcctttgagg gtggccgcgt ccatctggtc agaaaagaca atctttttgt 900tgtcaagctt gaggtgtggc aggcttgaga tctggccata cacttgagtg acaatgacat 960ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcagg tcgactctag 1020cgcaccacca tgaaattctt agtcaacgtt gcccttgttt ttatggtcgt gtacatttct 1080tacatctatg cgaccgagat aaaagttaac cctcctcagg attttgagat agtggatccc 1140ggatacttag gttatctcta tttgcaatgg caacccccac tgtctctgga tcattttaag 1200gaatgcacag tggaatatga actaaaatac cgaaacattg gtagtgaaac atggaagacc 1260atcattacta agaatctaca ttacaaagat gggtttgatc ttaacaaggg cattgaagcg 1320aagatacaca cgcttttacc atggcaatgc acaaatggat cagaagttca aagttcctgg 1380gcagaaacta cttattggat atcaccacaa ggaattccag aaactaaagt tcaggatatg 1440gattgcgtat attacaattg gcaatattta ctctgttctt ggaaacctgg cataggtgta 1500cttcttgata ccaattacaa cttgttttac tggtatgagg gcttggatca tgcattacag 1560tgtgttgatt acatcaaggc tgatggacaa aatataggat gcagatttcc ctatttggag 1620
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<210>16<211>6802<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Description of Artificial Sequenceplasmidexpression vector<400>16gtatacgcca cactttatgg cgtgtctacg cattcctctt ttatggcgta gtccgcatga 60ctcagtaatc cctgaaaggt tacccaaaac gggtcatgta ttccagttat ccccacttag 120ttgtcctttc agggtaacct cggttcatgt gactcagtta tccctgaaag gtaacccaaa 180acgggtcatg ttttccagtt atcccccact cagttaccca aaaagggtaa taaccgtgca 240tgtattccag ttatccccac tcagtaaccc aaaaaggtcg gttaaattaa ttttgcggta 300catgaaaggg tggtaactgc agttacccga taactttgat tacgttgcac tggaaatttg 360ccatgaaagg gtatcgacta attacccttt catggcaaga gctcggttat gtgcagttac 420ccttcacttt cccgtcggtt ttgcattgtg gcggggccaa aaggggacct ttaaggtata 480accgtgcgta agataaccga ctcgacgcaa gatgcaccca tattctccgc gctggtcgca 540gccatggcag cgtcagaagc cagactggtg gcatcttgcg tctcgaggag cgacgtcggg 600ttcgagacaa cccgagcgcc aactcctgtt tgagaagcgc cagaaaggtc atgagaacct 660agcctttggg cagccggagg cttgccatga ggcggtggct ccctggactc gctcaggcgt 720agctggccta gccttttgga gagctgacaa ccccactcat gagggagagt tttcgcccgt 780actgaagacg cgattctaac agtcaaaggt ttttgctcct cctaaactat aagtggaccg 840ggcgccacta cggaaactcc caccggcgca ggtagaccag tcttttctgt tagaaaaaca 900acagttcgaa ctccacaccg tccgaactct agaccggtat gtgaactcac tgttactgta 960ggtgaaacgg aaagagaggt gtccacaggt gagggtccag gttgacgtcc agctgagatc 1020gcgtggtggt actttaagaa tcagttgcaa cgggaacaaa aataccagca catgtaaaga 1080atgtagatac gctggctcta ttttcaattg ggaggagtcc taaaactcta tcacctaggg 1140cctatgaatc caatagagat aaacgttacc gttgggggtg acagagacct agtaaaattc 1200cttacgtgtc accttatact tgattttatg gctttgtaac catcactttg taccttctgg 1260tagtaatgat tcttagatgt aatgtttcta cccaaactag aattgttccc gtaacttcgc 1320ttctatgtgt gcgaaaatgg taccgttacg tgtttaccta gtcttcaagt ttcaaggacc 1380cgtctttgat gaataaccta tagtggtgtt ccttaaggtc tttgatttca agtcctatac 1440ctaacgcata taatgttaac cgttataaat gagacaagaa cctttggacc gtatccacat 1500gaagaactat ggttaatgtt gaacaaaatg accatactcc cgaacctagt acgtaatgtc 1560acacaactaa tgtagttccg actacctgtt ttatatccta cgtctaaagg gataaacctc 1620cgtagtctga tatttctaaa gatataaaca caattaccta gtagtctctt gttcggatag 1680tctaggtcaa taaagtgaaa agtcgaagtt ttatatcaat ttggaaacgg cggtcagata 1740gaatgaaaat gagccctctc aagtacactt taattcgact ttacctcgta tggaaaccct 1800ggataaggtc gttccacaaa actaatactt taactctagt ctcttctact atgatggaac 1860cactgacgat gtcaactttt actttgtatg tggaactttt gttgtttact ttgggctgtt 1920aatacgaaac atcattcttc gtttcactta taaataacga gtctactgcc ttaaacctca 1980
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<400>17Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly1 5 10 15Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu20 25 30Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys35 40 45Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys50 55 60Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu65 70 75 80Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala85 90 95Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala100 105 110Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu115 120 125Gly Arg Phe Asn130
权利要求
1.制备IL-13拮抗多肽的方法，方法包括提供包含宿主细胞的培养基，所述的宿主细胞表达编码所述IL-13拮抗多肽的核酸，所述的宿主细胞表达编码所述IL-13拮抗多肽的配位多肽的核酸；在允许表达所述IL-13拮抗多肽和IL-13拮抗多肽配位多肽的条件下，培养所述宿主细胞；从培养基中提取所述IL-13拮抗多肽，由此，制备所述IL-13拮抗多肽。
2.根据权利要求1的方法，所述的配位多肽是IL-13。
3.根据权利要求1的方法，所述的配位多肽包含SEQ ID NO17的人IL-13拮抗多肽的氨基酸序列或包含SEQ ID NO17的突变体氨基酸序列，即其126位的精氨酸被天门冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸代替。
4.根据权利要求1的方法，所述的配位多肽是IL-6。
5.根据权利要求1的方法，所述的编码IL-13拮抗多肽的核酸是所述宿主细胞的外源核酸。
6.根据权利要求5的方法，进一步包含介导所述外源核酸进入宿主细胞。
7.根据权利要求1的方法，所述的编码所述配位多肽的核酸是外源核酸。
8.根据权利要求7的方法，进一步包含介导所述外源核酸进入宿主细胞。
9.根据权利要求1的方法，与所述的编码IL-13拮抗多肽表达而配位多肽不表达时相比，所述的编码IL-13拮抗多肽与配位多肽共表达时有更多的IL-13拮抗多肽被提取。
10.根据权利要求1的方法，所述编码IL-13拮抗多肽与配位多肽的核酸表达时，所述宿主细胞的培养温度范围大约为29℃-39℃。
11.根据权利要求1的方法，当所述IL-13拮抗多肽与编码配位多肽的核酸表达时，在所述宿主细胞中的IL-13拮抗多肽的表达在大约31℃的温度下执行。
12.根据权利要求1的方法，当所述编码IL-13拮抗多肽与编码配位多肽的核酸表达时，在所述宿主细胞中的IL-13拮抗多肽的表达在大约37℃的温度下执行。
13.根据权利要求1的方法，所述的宿主细胞是稳定转染细胞。
14.根据权利要求1的方法，所述的宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
15.根据权利要求1的方法，所述的宿主细胞是暂时转染细胞。
16.根据权利要求15的方法，所述的宿主细胞是COS细胞。
17.根据权利要求1的方法，所述的IL-13拮抗多肽包含融合了至少免疫球蛋白一部分的IL-13受体多肽的胞外部分。
18.根据权利要求17的方法，所述的IL-13受体多肽是IL-13Rα2多肽。
19.根据权利要求18的方法，所述的IL-13拮抗多肽包含免疫球蛋白γ1多肽的Fc区域。
20.根据权利要求19的方法，所述的IL-13拮抗多肽是IL-13Rα2.Fc。
21.根据权利要求1的方法，所述的IL-13拮抗多肽的配位多肽是IL-13多肽的IL-13受体结合片段。
22.根据权利要求1的方法，所述的IL-13拮抗多肽的配位多肽包含了非自然存在的IL-13多肽氨基酸序列。
23.根据权利要求1的方法，所述的IL-13拮抗多肽的配位多肽是IL-13受体多肽的抗体。
24.根据权利要求1的方法，所述的表达的IL-13拮抗多肽的聚合体，与在不表达编码所述IL-13多肽的配位多肽的核酸的宿主细胞中表达的所述IL-1拮抗多肽的聚合体相比有所降低。
25.根据权利要求24的方法，所述的表达的IL-13拮抗多肽的聚合体，与在不表达编码所述IL-13多肽的配位多肽的核酸宿主细胞中表达的所述IL-1拮抗多肽的聚合体相比至少降低大约10％。
26.根据权利要求24的方法，所述的表达的IL-13拮抗多肽的聚合体，与在不表达编码所述IL-13多肽的配位多肽的核酸宿主细胞中表达的所述IL-1拮抗多肽的聚合体相比至少降低大约30％。
27.根据权利要求24的方法，所述的表达的IL-13拮抗多肽的聚合体，与在不表达编码所述IL-13多肽的配位多肽的核酸宿主细胞中表达的所述IL-1拮抗多肽的聚合体相比至少降低大约90％。
28.药物组合物，包含由权利要求1的方法制备的所述IL-13拮抗多肽和在制药上可接受的载体。
29.减少在病人IL-13量的方法，包括给所述病人服用治疗有效量权利要求28的化合物。
30.制备IL-13 Rα2.Fc多肽的方法，方法包括提供包含细胞的培养基，所述的细胞表达编码IL-13 Rα2.Fc多肽和IL-13 Rα2.Fc多肽的配位多肽的核酸；在允许表达所述IL-13 Rα2.Fc多肽和IL-13 Rα2.Fc多肽的配位多肽的条件下，培养所述宿主细胞；从培养基中提取所述IL-13 Rα2.Fc多肽，由此，制备了所述IL-13 Rα2.Fc多肽。
31.制备IL-13 Rα2.Fc多肽的方法，方法包括提供包含细胞的培养基，所述的细胞表达编码IL-13 Rα2.Fc多肽和IL-13多肽的核酸；在允许表达所述IL-13 Rα2.Fc多肽和IL-13多肽的条件下，培养所述宿主细胞；从培养基中提取所述IL-13 Rα2.Fc多肽，由此，制备了所述IL-13 Rα2.Fc多肽。
32.根据权利要求1的方法，与所述的IL-13 Rα2.Fc多肽表达而IL-13不表达时相比，所述的IL-13 Rα2.Fc多肽与IL-13共表达时能提取更多的IL-13 Rα2.Fc多肽。
33.药物组合物，包含由权利要求31的方法制备的所述IL-13Rα2.Fc多肽和在制药上可接受的载体。
34.减少在病人中细胞因子水平的方法，包括给所述病人服用治疗有效量的权利要求33的化合物。
35.纯化的可溶IL-13拮抗多肽的制备物，在4℃下连续孵育一周以上，至少40％所述可溶的IL-13拮抗多肽以单体或二聚体的形式存在。
36.根据权利要求35的制备物，在4℃下连续孵育一周以上，至少60％所述可溶的IL-13拮抗多肽以单体或二聚体的形式存在。
37.根据权利要求35的制备物，在4℃下连续孵育一周以上，至少80％所述可溶的IL-13拮抗多肽以单体或二聚体的形式存在。
38.根据权利要求35的制备物，在4℃下连续孵育一周以上，至少90％所述可溶的IL-13拮抗多肽以单体或二聚体的形式存在。
全文摘要
本申请公开了通过细胞因子拮抗多肽与编码细胞因子拮抗多肽的配位多肽的核酸共同表达制备细胞因子拮抗多肽的方法。
文档编号A61K38/20GK1823089SQ200480019915
公开日2006年8月23日 申请日期2004年6月14日 优先权日2003年6月11日
发明者克莱夫·R·伍德, 帕特丽夏·穆萨－里埃尔, 吉恩·W·李, 马克·伦纳德 申请人:韦思公司