能够结合转化生长因子β1(TGF－β1)的肽的制作方法

专利名称：能够结合转化生长因子β1(TGF－β1)的肽的制作方法
技术领域：
总体上，本发明涉及一些具有结合转化生长因子β1(TGF-β1)能力的肽及其应用。特别是，因为所述的肽直接结合到TGF-β1上，因此本发明涉及一些抑制TGF-β1的生物活性的肽，及其在与TGF-β1的过度或失调表达相关的疾病或病理变化的治疗中的应用。
背景技术：
TGF-β1是属于在结构上相关的调节蛋白(细胞因子)超家族的糖蛋白，其是哺乳动物体内所描述的三种异构体(TGF-β1，2和3)之一。最丰富的异构体是TGF-β1，它是由25kDa同型二聚体组成，该同型二聚体是由二硫键结合的两个亚基组成。人的TGF-β1的氨基酸序列已经由一些作者公开，例如Derynck K等人“在正常细胞和变异细胞中人的转化生长因子-beta互补DNA序列和表达”Nature.316(6030)，701-705(1985)。
TGF-β1是在进化过程中具有高度保护序列的分子。虽然它最初通过其诱发粘附的能力来定义，该粘附不依赖于大鼠的纤维原细胞的增殖和形态学改变，但是后来的研究显示TGF-β1是广泛的细胞类型增殖的普遍抑制剂。该分子可在细胞分化的全部阶段中，由不同组织的各种类型的细胞生成。它具有一系列的生物效应，能产生与发育、生理和免疫应答有关的有效的和通常为相反的效应。关于TGF-β1在肝再生和分化以及肝纤维化中的作用的信息，以及该分子对细胞外基质的作用的信息可参见西班牙专利申请第ES 2146552 A1号。
为了研究TGF-β1的作用机理，已报导某些十种蛋白质(膜受体和细胞外基质蛋白)与该细胞因子相互作用。
另一方面，因为许多疾病或病理改变与TGF-β1的过度或失调表达相关，例如，与组织或器官的功能丧失相关的纤维化、或者外科的或美学上的并发症，因此引起了对寻找能抑制TGF-β1生物活性的产物的关注，因为该产物有可能应用到人或动物的治疗中，阻断因TGF-β1过度或失调表达引起的病理结果。
一些方法已用于抑制TGF-β1的生物活性中，包括下列应用(i)特异的中和抗体；(ii)编码TGF-β1基因的反义寡核苷酸序列，它阻断TGF-β1表达；或(iii)TGF-β1的可溶性受体，它以与抗体相似的方式作用。所述抗体的应用能够全部和特异的阻断该细胞因子(TGF-β1)，虽然血液中存在外源性免疫球蛋白和来源于TGF-β1全身阻断作用的两方面加强了其某些副作用。另外，免疫球蛋白随时间的稳定性不允许短时间内控制该细胞因子的活性阻断。反义寡核苷酸序列在基因表达水平上产生抑制TGF-β1-事实是产生了重要的所述细胞因子参与的所有生物过程的失调。
最近已开发另一个策略，该策略基于能抑制TGF-β1的生物活性的肽的应用。以此方式，西班牙专利公开第ES214652号公开了一些源于TGF-β1及其受体的、或者源于能结合TGF-β1的蛋白质的合成肽，该合成肽可作为TGF-β1生物活性的抑制剂使用。

发明内容
总体上，本发明解决了寻找能抑制TGF-β1生物活性的新化合物的问题。
本发明提供的技术方案是基于一个事实发明者鉴别一系列不仅能结合TGF-β1而且通过直接结合TGF-β1能抑制TGF-β1生物活性的肽。这些肽中的一部分通过应用噬菌体展示多肽库相关技术来鉴别，该文库允许识别具有6-15个氨基酸的典型大小、能以高度的亲和性结合TGF-β1的肽，并随后通过体外和体内试验分析它们抑制TGF-β1生物活性的能力来定量。其它的肽通过先前应用与噬菌体库相关的技术识别的肽的平截获得。
能结合TGF-β1的肽、以及特别是那些通过直接结合到TGF-β1上能抑制TGF-β1生物活性的肽，能够潜在用于对治疗与TGF-β1的过度或失调表达相关的疾病和病理改变。类似地，能结合TGF-β1的肽提供了研究TGF-β1生物学作用的工具(在不同生物过程调节的许多领域中，TGF-β1的生物学作用仍然有待阐明)。
因此，本发明的一方面涉及能结合TGF-β1的肽。在具体和优选的实施方案中，这些肽也能抑制TGF-β1的生物活性。
另一方面，本发明涉及包含至少一种所述的肽的药物组合物。
另一方面，本发明涉及所述的肽在药物组合物制备中的应用，该药物组合物用于治疗与TGF-β1过度或失调表达相关的疾病和病理改变。与TGF-β1过度或失调表达相关的这类疾病或病理改变的代表性例子包括与组织或器官的功能丧失相关的纤维化，以及外科的和/美学上的并发症。
另一方面，本发明涉及编码所述肽的DNA序列。
另一方面，本发明涉及包括编码本发明所提供肽的DNA序列的DNA构建。
另一方面，本发明涉及包括所述DNA序列或DNA构建的载体。
另一方面，本发明涉及宿主细胞，例如转化的宿主细胞，该宿主细胞包括所述DNA构建或载体。
另一方面，本发明涉及产生本发明提供的肽的方法，包括在允许所述肽表达的条件下培养所述宿主细胞，并且，如果需要，回收所获得的肽。
另一方面，本发明涉及DNA序列和DNA构建在载体和细胞的制备中的应用，该载体和细胞通过基因治疗技术治疗与TGF-β1过度或失调表达相关的疾病和病理改变。
附图简要说明

图1示意性地显示所述的15-氨基酸(aa)肽在丝状噬菌体M13表面的位置，该15-氨基酸(aa)肽遗传学地融合于蛋白pIII。
图2示意性地显示所述的插入片段在M13噬菌体的基因组的基因位置，该插入片段编码15-aa肽，以及在蛋白pIII的序列中所述的肽的位置。
图3示意性地显示根据所述的“生物淘选”技术选择所述的肽。生物素酰化的TGF-β1固化在含有链霉抗生物素的平板上(通过生物素-链亲和素键联)。根据在TGF-β1与噬菌体展示的肽之间的相互作用，从所述的噬菌体库中选择噬菌体。通过洗涤排除对TGF-β1具有低亲和性的噬菌体。通过降低所述的pH值洗脱留在所述的平板中的噬菌体。三个周期的强化对TGF-β1具有高度亲和性的噬菌体后，分离和测序所述噬菌体(见实施例1)[对图3的说明“a”展现15-aa肽的噬菌体库；“b”在E.coli(K91Kan)(扩增)中感染；“c”所述噬菌体的纯化；“d”减少TGF-β1浓度的所述噬菌体的孵育；“e”洗涤；“f”所述的结合噬菌体的洗脱(↓pH)；“g”在E.coli菌株中感染；“h”感染的菌落(四环素)的选择；“i”所选择的噬菌体的扩增；和“j”在三次“生物淘选”周期后测定DNA序列(对应所述的肽)]。
图4表示通过噬菌体展示多肽库识别的所述15-aa肽序列类推树。
图5所示为TGF-β1浓度对Mv-1-Lu细胞株生长作用的图解说明，按照每分钟计数(c.p.m.)的氚标记的胸苷的摄取量表示。
图6所示为所述急性肝损伤诱导方案的图解说明(见实施例3)。
本发明的详细说明一方面，本发明涉及肽，下文指本发明所述的肽，该肽的氨基酸序列包括的3-15个连续氨基酸残基的氨基酸序列选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ IDNO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22，及其药物可接受的盐。
本发明所述的肽能结合TGF-β1。这些肽的一些能在体外和/或体内抑制TGF-β1的生物活性。
通过任何能测定两分子间结合的适当的方法评价本发明所述的肽结合TGF-β1的能力，例如，通过亲和分析方法，该分析方法包括在使所述的肽结合到TGF-β1的条件下将TGF-β1与所测试的肽相接触；并且评价所述的肽和TGF-β1间的结合。在具体的实施方案中，通过用放射性标记的TGF-β1完成该亲和分析，例如，在专利申请ES 2146552 A1中公开的人125I-TGF-β1。可选择地，所测试的肽可以是标记的组分。一般而言，这种亲和分析包括将TGF-β1与欲测定其亲和性的肽相接触(例如，固定在用链霉抗生物素封闭的平板上)，孵育适当的孵育期后，分析所述的肽与TGF-β1的结合。通过洗涤排除对TGF-β1具有低亲和性的所述的肽，而具有高亲和性的肽仍结合到TGF-β1上，并且通过破坏所述的两分子之间的分子相互作用(例如，通过降低pH值)游离。通过测试所述的肽对不同浓度的TGF-β1的结合，或者反之亦然，可以获得所测试的肽对TGF-β1的亲和性的概念。可以评价本发明所述的肽在体外抑制TGF-β1的生物活性的能力，并且如果需要，通过Mv-1-Lu细胞株生长抑制实验定量化，该细胞株来源于貂的肺上皮细胞并且该细胞株的增殖被TGF-β1抑制(见实施例2)。
可被评价本发明所述的肽在体内抑制TGF-β1生物活性的能力，并且如果需要，通过急性肝损伤动物模型体内测试定量化，例如通过四氯化碳(CCl4)给药来诱导该急性肝损伤(见实施例3)。已知，急性损伤产生效应和生理反应的级联反应包括TGF-β1水平的增长，其因此引起I型胶原基因表达(在其它作用之中)。
本发明的范围包括本发明所述肽的药物可接受的盐。术语“药物可接受的盐”包括惯于形成金属盐或酸加成盐的那些盐。只要所述的盐是药物可接受的，则该盐的性质不是关键性考虑因素。本发明所述肽的药物可接受的盐可根据本领域的技术人员公知的常规方法，从酸或碱(有机的或无机的)中获得。
在具体的实施方案中，本发明提供了包含氨基酸序列的3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续氨基酸残基的肽，所述氨基酸的序列选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22及其药物可接受的盐。
在其它具体的实施方案中，本发明提供了肽，该肽选自下列序列号的肽SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22及其药物可接受的盐。
在其它具体的实施方案中，本发明提供了肽，该肽选自下列序列号的肽SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35和SEQ IDNO36及其药物可接受的盐。这些肽包括序列号为SEQ ID NO17的所述肽的9-14个氨基酸序列的连续氨基酸残基，并且通过所述的肽的平截获得(实施例4)。
在其它具体的实施方案中，本发明提供了肽，该肽选自下列序列号的肽SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQID NO11，SEQ ID NO14，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO33和SEQ ID NO34及其药物可接受的盐。序列号为SEQ ID NO4，SEQID NO6，SEQ ID NO11，SEQ ID NO14和SEQ ID NO17的肽显示了在体外和体内抑制TGF-β1生物活性的能力；序列号为SEQ ID NO2的肽显示只在体内抑制TGF-β1生物活性的活性；而序列号为SEQ IDNO3和SEQ ID NO18的肽显示只在体外抑制TGF-β1生物活性的活性。序列号为SEQ ID NO33和SEQ ID NO34的肽显示在体外抑制TGF-β1的生物活性的活性。
为了初步识别具有结合TGF-β1的能力的肽，应用涉及噬菌体展示多肽库技术，该多肽库能够测定对TGF-β1具有高亲和性的肽，并且随后在体外和在体内定量化它们抑制TGF-β1生物活性的能力。结合TGF-β1并在体外或体内抑制TGF-β1生物活性的所述肽的序列可以在各种“生物淘选”周期(通常为3次)后从相应的DNA序列中导出。识别某些产物的抑制剂的噬菌体展示多肽库的用途已经由下列作者公开，例如，Chirinos-Rojas C.L.等人.，Immunology，1999，Jan.96(1)109-113；McConnell S.J.，等人.，Gene，1994，Dec.30，151(1-2)115-118；或SmithG.P.，Sciences，1985，Jun.14，228(4705)1315-1317。
因此，本发明提供了用于识别能结合TGF-β1的肽的方法，其包括(i)应用包含多个丝状噬菌体的噬菌体展示的多肽库，每一个噬菌体的基因组包含编码不同肽的核苷酸序列，该不同肽的核苷酸序列连接编码噬菌体包膜蛋白的基因(因此每一个噬菌体包含遗传学融合噬菌体包膜蛋白的不同的肽)；(ii)通过亲和分析筛选噬菌体，该噬菌体包含以增强的亲和性结合TGF-β1的肽；并且(iii)根据相应的DNA序列，测定结合TGF-β1的所述肽的序列，该DNA序列插入到在步骤(ii)中筛选的所述噬菌体并且编码结合TGF-β1的所述肽。
在具体的实施方案中，为了获得15-aa肽，该15-aa肽能以高亲和性结合TGF-β1并且对所述的细胞因子的生物活性也具有最终的抑制活性，应用包含多个丝状噬菌体(M13)的噬菌体展示的多肽库，每一个噬菌体包含遗传学融合到该噬菌体包膜蛋白的不同的15-aa肽，此时15-aa肽结合到所述包膜蛋白pIII的N-末端。这样所述的噬菌体展现了具有在5个表面蛋白分子的每个中的15-aa肽的表面，而编码所述肽序列的DNA包含在所述噬菌体内。在所述噬菌体库中，编码所述肽的序列来源于含20个天然氨基酸的15个位点的每一个中被兼并的序列，因此在不同的噬菌体中允许存在15氨基酸的1.1×1012个可能的序列。在所述的肽序列和在所述的噬菌体内编码肽序列的DNA之间物理比例为1∶1，这允许(从广泛的变体中)选择特异地结合TGF-β1的那些序列。该方法通过亲和分析完成。
在具体的实施方案中，所提到的亲和分析包括称为“生物淘选”的离体筛选方案。简而言之，该技术包括，在用链霉抗生物素封闭的并加入生物素酰化的TGF-β1的平板中，孵育一组在实践中代表所有15-aa肽变体(在此情况下)的噬菌体。因此通过生物素-链亲和素结合将生物素酰化TGF-β1锚定在所述的平板中，由此正确地显示TGF-β1与所述噬菌体携带的肽之间的相互作用。孵育后，通过洗涤去除非结合的噬菌体，然后通过降低pH值特异地洗脱所述特别结合的噬菌体，该降低pH值是破坏TGF-β1与所述噬菌体展示肽之间的分子相互作用的操作。被洗脱的噬菌体然后通过在菌株中感染被放大。该操作重复3个周期，因此完成了所述噬菌体的含量的富集，该噬菌体以高亲和性特异地结合TGF-β1。用于封闭所述平板的生物素酰化TGF-β1的浓度在每一次周期中逐渐地减少，例如从2.5到0.01，并且最终到0.001μg/ml。因此，在此过程结束后，通过引物来测序根据对TGF-β1的亲和性而筛选出噬菌体。这允许获得所述噬菌体展现的肽序列。
实施例1显示通过噬菌体库筛选结合TGF-β1的肽，“生物淘选”筛选，以及序列测定以高度的亲和性结合TGF-β1的肽。
本发明也提供了用于识别能结合TGF-β1的肽的技术，该技术包括能结合TGF-β1的肽的平截，随后测试这些截短的肽结合TGF-β1的能力。该截短的肽可通过任何常规方法获得，例如在N-末端或C-末端处截短的肽形式的化学合成法(考虑到它们的大小)。可应用表现两分子之间结合特征的任何恰当的方法来测定这些截短的肽结合TGF-β1的能力，例如，亲和分析，该方法包括在允许所述肽结合TGF-β1的条件下将TGF-β1与所测试的肽相接触，并且评价所述肽对TGF-β1的结合，这已在上文中提及。同样，这些截短的肽在体外和/或在体内抑制TGF-β1生物活性的能力通过本说明书所述任何方法测试。
由于TGF-β1在许多生物过程中发挥作用，本发明所述的肽抑制TGF-β1活性导致了治疗与过度的或失调的TGF-β1表达相关的疾病和病理改变的药物的潜在开发，因为这样的肽能阻断被该细胞因子过度或失调表达诱导的损害。
因此本发明所述的肽能用于治疗与过度的或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理改变，例如(i)与器官或组织功能丧失相关的纤维化，例如，肺纤维化、肝纤维化(肝硬化)、肾纤维化、角膜纤维变性等等；以及(ii)外科的和/或美学上的并发症，例如，与皮肤和腹膜外科手术相关的纤维化、与烧伤相关的纤维化、骨关节纤维化、瘢痕瘤等等。
因此，在另一方面，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的本发明的肽和至少一个药物可接受的赋形剂。本发明提供的该药物组合物包含一个或多个本发明的肽，任选地与一个或多个可选择的抑制TGF-β1的化合物结合。该药物组合物用于对人体或动物体的给药和/或应用(在前者中是优选的)。
替代抗体或反义寡核苷酸序列，诸如本发明的那些肽的肽应用具有许多优点，因为它们是具有较高扩散电势和较短半衰期的小分子。虽然它们比抗体较快地降解，所述的肽对TGF-β1显示高的亲和性，然而，副作用可通过剂量来控制。与其它类型的化合物相比，所述的肽也较容易地运输到靶器官和组织。
本发明所述的肽可通过任何方法给药来治疗与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病和病理改变，所述方法将本发明所述的肽与该肽在人体内或动物体内的作用位点或靶相接触。存在于本发明所提供的药物组合物中的肽、衍生物或药物可接受的盐的量可以在相当大的范围内改变。
应用本发明所述的肽和/或药物组合物治疗与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理改变的剂量，依赖于很多因素-包括患者的年龄、状态、背景病症或病理学改变的严重性，以及本发明包括的肽的给药途径和频率。
包含本发明所述的肽的药物组合物可以组方成任何给药形式，例如，固体或液体，并且通过任何适当的途径给药，例如，口服、非肠道、直肠的或局部给药。为了此效应，必须包括合适的给药形式的制剂所需要的可接受的药物赋形剂，例如药膏(油脂凝胶、水凝胶等)、滴眼剂、喷雾气溶胶、可注射的溶液、渗透泵系统等等。关于该效应所需要的不同药物剂型的综述和所述赋形剂的综述可参见下列文件例如，“Tratado de Farmacia Galénica”，C.Faulíi Trillo，1993，Luzán 5，S.A.Ediciones，Madrid.出版物。
本发明所述的肽在所述的药物组合物的制造中的应用构成本发明的另外部分。因此，在另一方面，本发明涉及了本发明所述的肽在药物组合物的制造中的应用，该药物组合物用于治疗与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理改变，例如与器官或组织功能丧失相关的纤维化，例如，肺纤维化、肝纤维化(肝硬化)、肾纤维化、角膜纤维变性等等；和外科的和/或美学上的并发症，例如，与皮肤和腹膜外科手术相关的纤维化、与烧伤相关的纤维化、骨关节纤维化、瘢痕瘤等等。
本发明所述的肽可通过常规方法获得，例如通过固相化学合成，用高效液相色谱法(HPLC)纯化，以及如果需要，通过常规技术分析，例如序列测定和质谱分析法、氨基酸分析、核磁共振技术等等。
可选择地，本发明所述的肽可通过重组DNA技术获得。因此，在另一方面，本发明产生编码本发明所述的肽的DNA序列。所述的DNA序列可容易地从所述的肽的氨基酸序列中导出。
所述的DNA序列可以包含在DNA构建中。因此，本发明产生包含DNA序列的DNA构建，该DNA序列编码本发明所述的肽。为了表达编码本发明所述的肽的DNA序列，该DNA构建可操作性地加入调节序列。控制序列是控制和调节本发明所述的肽的转录和(可应用地)翻译的序列；它们包括启动子和终止子序列等，该序列在转化宿主细胞中是有功能的并且包括所述的DNA序列或DNA构建。在具体的实施方案中，所述的控制表达序列在细菌中是有功能的。有利的是该DNA构建也包括标记或编码Motif(功能片段)或表型的基因，该Motif或表型使得能够筛选该DNA构建转化的宿主细胞。本发明提供的DNA构建可通过本领域公知的方法获得[Sambrook等人，“分子克隆，实验室手册”，第二版，美国冷泉港实验室杂志，纽约，1989年卷1-3]([Sambrook etal.，“Molecular cloning，a Laboratory Manual”，2nded.，Cold Spring HarborLaboratory Press，N.Y，1989 Vol.1-3])。
本发明提供的DNA序列或DNA构建可插入在适当的载体中。因此，在另一方面，本发明涉及包含所述的DNA序列或DNA构建的载体，例如表达载体。载体的选择将依赖于它随后要插入的宿主细胞。例如，所述的DNA序列所插入的载体可以是紧接着插入到所述细胞中的质粒或者是载体，其可以或可以不整合到所述的细胞的基因组。所述的载体可通过技术人员已知的常规方法获得。[Sambrok等人，1989，引用上文]。
在另一方面，本发明涉及宿主细胞，例如，包含本发明所述的DNA序列或DNA构建的转化的宿主细胞。
在另一方面，本发明涉及产生本发明所述的肽的方法，该方法包括在允许产生本发明所述的肽的条件下，使具有本发明所述的DNA序列或DNA构建的宿主细胞生长，并且如果需要，恢复本发明所述的肽。关于优化培养所述宿主细胞的条件将依赖于使用的宿主细胞的类型。如果需要，产生本发明所述的产生肽的方法包括所述肽的分离和纯化。
在另一方面，本发明涉及这些DNA序列和DNA构建在载体和细胞的制造中的应用，该载体和细胞通过基因疗法治疗与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病和病理改变。根据本发明的这部分内容，将这些DNA序列或DNA构建与遗传转移载体(例如，病毒或非病毒载体)相接触。为了实施本发明的这部分内容，适当的病毒载体包括但不局限于下列载体腺病毒、与腺相关、逆转录病毒、慢病毒属、α病毒、疱疹病毒属、冠状病毒衍生的载体等等。为了实施本发明这部分内容，恰当的非病毒载体包括但不局限于裸露DNA，脂质体、多胺、树状聚体、阳离子的糖聚合物、脂质体-多聚阳离子复合物、蛋白质、受体介导的遗传输送系统等等。
以下实施例举例说明本发明，不应理解为对本发明的限制。
实施例1应用噬菌体展示的多肽库选择结合TGF-β1的肽。
为了获得能以高度的亲和性结合TGF-β1并且对所述细胞因子的生物活性提供可能的抑制活性的15氨基酸的序列，应用了基于噬菌体展示多肽库技术中开发的离体筛选技术。这些库包含多数丝状噬菌体(M13)，每一个噬菌体包含遗传学融合至所述病毒包膜蛋白的肽-在此情况下该肽结合到包膜蛋白pIII的N-末端(图1)。这样，所述的噬菌体在每个5拷贝的表面蛋白pIII的表面上展示15-aa肽，而编码所述肽的DNA序列包含在所述噬菌体中。在所述的噬菌体库中，在所述噬菌体库中，编码所述肽的序列来源于含20个天然氨基酸的15个位点的每一个中被兼并的序列，所述肽序列和所述的噬菌体内编码肽序列的DNA之间物理比例为1∶1，这允许(从广泛的变体中)选择特异地结合TGF-β1的那些序列。该方法通过被称为“生物淘选”的体外筛选方案完成。
用于本实施例的所述的噬菌体展示库来源于由T.Nishi，H.Tsuri和H.Saya[Exp.Med.(Japan)11，1759(1993)]公开的初级库的第二次扩增，并且通过George P.Smith实验室提供。该技术的其它信息可在以下网站中获得http//www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisDlayWebsite/PhageDisplayWebsiteIndex.html筛选技术(“生物淘选”)该技术包括在用链霉抗生物素封闭的(在0.1M NaHCO3中有10μg/ml的链霉抗生物素，在室温下持续2小时)并加入生物素酰化的TGF-β1的平板中孵育一组(在实际作用)代表所有15-aa变体的噬菌体。所述的生物素酰化的TGF-β1通过生物素-链亲和素相互作用锚定在该平板中，因此它能够正确展示其与所述噬菌体携带的肽间的相互作用。TGF-β1以3×104病毒/ml的浓度接触所述噬菌体携带的肽。在大约孵育12小时后，用PBS/Tween(磷酸盐缓冲液/去水山梨糖醇脂肪酸酯的聚氧化烯衍生物)通过5次洗涤去除非结合的噬菌体。然后通过降低pH(洗脱缓冲液)洗脱结合的噬菌体，降低pH破坏TGF-β1与所述噬菌体展示的肽之间的相互作用。然后通过在菌株(E.coli)中的感染扩增被洗脱的噬菌体。所述方法重复三个周期由此完成噬菌体量的富集，该噬菌体以高亲和性特异地结合TGF-β1(图3)。用于封闭所述平板的生物素酰化的TGF-β1的浓度在每一次周期中逐渐地减少，例如从2.5到0.01，并且最终到0.001μg/ml。因此，在每一周期中筛选的噬菌体展示了对TGF-β1越来越高的亲和性。感染E.coli细胞后，通过四环素抗药性分离遗传学修饰的噬菌体，随后在此方法结束后，随后用引物测序根据TGF-β1的亲和性筛选的噬菌体。这能够获得在所述噬菌体中展示的肽序列，从分离的菌落中获得大量克隆的该噬菌体。在总的测序克隆中，与每一个克隆所携带的15氨基酸的肽相对应的序列复制的倍数是所述的15氨基酸序列对TGF-β1的相对亲和性水平的一个指征。
肽的序列在细菌抗菌素存在下通过筛选所述噬菌体感染的细菌菌落来完成从所述“生物淘选”中获得的克隆的筛选；通过由所述噬菌体基因组编码的四环素抗药性基因获得所述细菌的耐药性。因此，只有用噬菌体感染的那些菌落能生长。这表示每一个菌落包含编码在其表面存在的唯一的一个肽的唯一一个所述噬菌体的基因组。
从“生物淘选”的最后一次筛选周期中获得总数为108的噬菌体感染的细菌菌落。应用序列号为SEQ ID NO23的引物来完成编码存在于所述pIII蛋白中的肽的区域的序列。如表1所示，提供了不同的肽序列。该表也反映了携带所述序列的菌落(克隆)数。
表1.结合TGF-β1的噬菌体中的氨基酸序列

各序列的克隆(菌落)数显示所述的肽对TGF-β1的亲和性程度的近似指征，也就是，越多的菌落表示越高的亲和性。但是，亲和性程度与所述肽阻断TGF-β1生物活性的能力不相关。实际上，最有活性的、序列号为SEQ ID NO17的(见表2和表3)肽由3个克隆表示，然而序列号为SEQ ID NO3的通过41个克隆表示的肽在急性肝损伤分析中具有更差的活性(见表3)。由于没有与任何具体理论相关联，该观察可能通过下列假设阐明最活性的肽可能阻断TGF-β1与其受体间的结合。
肽序列的比较用CLUSTAL W程序(1.81)分析获得的所述序列。该程序根据氨基酸序列类推产生多序列分簇。根据所述的肽序列的类推，肽因而成簇在不同的结构家族中(图4)。根据这些类推，可能暗示较少的TGF-β1结合基序或者结合不同的TGF-β1区域的肽的簇。
实施例2通过应用Mv-1-Lu细胞增殖分析中的肽体外抑制TGF-β1的生物活性细胞株Mv-1-Lu(CCL-64，美国典型细胞培养物，Virginia，USA)来源于貂的肺上皮细胞，作为单细胞层生长，并且通过减少它的增殖来反映TGF-β1的存在(图5)。因此，所述的肽介导的该细胞因子的抑制能恢复细胞生长并且反映不同的肽在体外抑制TGF-β1的生物活性的能力。根据常规操作通过肽合成获得所测试的肽(Merrifield RB.美国化学会杂志1963；852149-2154；Atherton E等人，J Chem Soc Perkin Trans1981；1538-546)。
所述的Mv-1-Lu细胞在37℃下，在有5％CO2的162cm2瓶(CostarCorporation，CA，USA)中的完全培养基[RPMI-1640，含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠盐、抗生素和10％胎牛血清(FBS)]中培养成为融合单层。胰蛋白酶化后，将细胞以5000细胞/孔的起始密度接种在96孔板中的200μl完全培养液中，37℃，5％CO2培养6小时确保粘附。然后，加入不同浓度的欲测试的肽和加入起始浓度为200μg/ml、随后浓度为200pg/ml的TGF-β1(Roche)。在孵育12小时后，加入25μl干净培养基(RPMI-1640)中的1μCi甲基-3H-胸苷(Amersham生命科学，Buckinghamshire，英国)到每一个孔中。在相同的条件下孵育所述平板12个多小时。最后，收获所述细胞(Filtermate 196 Harvester，Packard)，将在DNA合成过程中掺入的氚标记的胸苷转移到平板(UniFilter-96 GF/C，Perkin Elmer)中。接着加入闪烁液，用闪烁计数器(Top Count，微量培养板闪烁计数器，Packard)定量化放射强度。作为阳性和阴性对照，分别在TGF-β1缺乏和存在的情况下掺入氚化胸腺嘧啶。根据以下公式计算在该实验中TGF-β1活性的抑制

该阴性对照表示在TGF-β1存在但是肽缺乏的情况下氚化胸腺嘧啶的掺入，而该阳性对照表示在TGF-β1和肽都缺乏的情况下氚化胸腺嘧啶的掺入。因此根据所述的肽逆转该细胞因子对Mv-1-Lu细胞株增殖的抑制作用，测量所述的肽对TGF-β1生物活性的抑制百分比(表2)。
表2.通过“生物淘选”筛选获得的肽在体外对TGF-β1生物活性抑制作用，根据Mv-1-Lu细胞株的生长分析计算。

序列号为SEQ ID NO3，11，17和18的肽在体外能够抑制TGF-β1的生物活性，它们的抑制百分比高于20％。
另外，为了评价所述的肽逆转TGF-β1对Mv-1-Lu细胞株的增殖的抑制剂作用的能力，将西班牙专利申请ES 2146552 A1中P144定义的肽的活性与序列号为SEQ ID NO17的肽的活性进行比较。序列号为SEQ ID NO17的肽显示增加的能力。
实施例3应用由CCl4诱导的急性肝损伤模型评价肽在体内对TGF-β1的生物活性的抑制急性肝损伤产生效应和生理反应的级联反应，包括TGF-β1浓度的升高。在其它方面，该升高是形成I型胶原基因表达的关键原因。在急性肝损伤模型中，重25到30克的雌性Balb/C系小鼠口服给药剂量为2μl的CCl4(每克体重)，该2μl的CCl4溶于同等体积的玉米油中(体积比为1∶1)。对照组只给予同等体积的玉米油，并且治疗组(单独口服给药在玉米油中的CCl4后)每24小时给予50μg肽，该50μg肽溶于500μl的含有1％生理盐水溶液的DMSO(二甲基亚砜)中。在72小时后处死所有的动物，并且处理肝脏样品。为了评价mRNA的表达，肝组织在液氮中冷冻并且在-80℃中保存直到进一步使用。其它肝组织样品在OCT或Tissue-Tek(Sakura Finetek B.V.)中保存并且按照与用于mRNA研究的样品的相同的处理方法处理。其它肝样品固定在10％缓冲的福尔马林溶液中，石蜡包埋并且处理成用于对其组织学评价。应用定量聚合酶链反应(PCR)技术对所有组中的编码I型胶原的mRNA的量定量。图6显示在该急性肝损伤分析中诱导、获得样品和定量结果的流程图。通过测量诱导的I型胶原mRNA的水平的评价方法，可以通过实时PCR方法定量所测试的肽阻断该急性损伤的能力。表3显示通过噬菌体衍生的肽对胶原I型mRNA表达的抑制程度。所测试的肽通过常规的固相的肽合成方法获得(Merrifield RB.美国化学会杂志1963；852149-2154；AthertonE等人J Chem Soc Perkin Trans 1981；1538-546)。
表3.通过“生物淘选”筛选获得的肽在体内对TGF-β1生物活性的抑制作用，根据在急性肝损伤模型中I型胶原mRNA诱导作用的抑制计算。

(Neg阴性)序列号为SEQ ID NO2，4，6，11，14和17的肽在体内能够抑制TGF-β1的生物活性，它们的抑制百分比大于35％。
另外，为了评价所述的肽抑制在先前所述的小鼠急性肝损伤模型中I型胶原mRNA诱导作用的能力，对西班牙专利申请ES 2146552 A1中称为P144的肽的活性与序列号为SEQ ID NO17的肽的活性进行比较。在该对比分析中，观察到序列号为SEQ ID NO17的肽比西班牙专利申请ES 2146552 A1中称为P144的肽，以更大的程度抑制I型胶原mRNA的表达，在该分析中西班牙专利申请ES 2146552 A1中称为P144的肽不显示任何活性。比较试验(实施例2和3)获得的结果表明本发明所述的肽中的代表肽(序列号为SEQ ID NO17的肽)比西班牙专利申请ES2146552 A1中代表的肽(称为P144的肽)相比，在所述的Mv-1-Lu细胞的增殖试验中和在急性肝损伤模型中具有更强的活性。
实施例4在Mv-1-Lu细胞的增殖试验中从标记为SEQ ID NO17的肽中截短的肽在体外对TGF-β1生物活性的抑制该实施例显示一些肽的抑制活性，该肽的氨基酸序列包含本发明所述的氨基酸序列之一的3-15个连续氨基酸残基根据逆转TGF-β1对Mv-1-Lu细胞株增殖作用的抑制剂作用的能力，在截短的肽(来源于序列号为SEQ ID NO17的肽序列)与全序列之间进行活性比较。对于该效应并且为了测定序列号为SEQ ID NO17的肽的能在体外抑制TGF-β1的生物活性最小序列，通过在该分子的N-末端、C-末端或两个末端处平截，合成该肽的截短形式。根据常规方法(Merrifield RB.美国化学会杂志1963；852149-2154；Atherton E等人JChem Soc Perkin Trans 1981；1538-546)通过肽合成获得所测试的肽。采用在实施例2中描述的相同方法学，根据所述的Mv-1-Lu细胞株的增殖分析，对截短的肽与序列号为SEQ ID NO17的肽的全序列之间的活性进行定量。
表4.从序列号为SEQ ID NO17的肽中获得的截短的肽在体外对TGF-β1生物活性的抑制作用，根据Mv-1-Lu细胞株生长重建分析计算

如表4所示，在该比较分析中，从N-末端中去除赖氨酸(K)表明序列号为SEQ ID NO17的肽的活性从28.5％降低到9.4％。相反，从C-末端中去除最多达三个氨基酸不影响该肽的活性。并且，芳香族氨基酸酪氨酸(Y)和色氨酸(W)废除了该肽的活性。这使得能够将序列号为SEQID NO17的最初的肽减少到12个氨基酸序列(KRIWFIPRSSWY)[SEQID NO34]而不影响它在体外对TGF-β1的抑制活性。
序列表<110>医药申请研究基金会(FIMA)<120>能够结合转换生长因子β1(TGF-β1)的肽<130>FIMA02007<150>ES 200302020<151>2003-08-22<160>36<170>PatentIn version 3.1<210>SEQ ID NO1<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>1Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Leu Arg Ser Ala Pro Gly Ala1 5 10 15<210>SEQ ID NO2<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>2Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Asn Arg Ser Ala Pro Gly Ala1 5 10 15<210>SEQ ID NO3<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>3Arg Phe Phe Thr Arg Phe Pro Trp His Tyr His Ala Ser Arg Leu1 5 10 15<210>SEQ ID NO4<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>4Arg Leu Ala His Ser His Arg His Arg Ser His Val Ala Leu Thr1 5 10 15
<210>SEQ ID NO5<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>5Arg Arg Trp Val Arg Tyr Pro Val His Leu His Ser Pro Ile Val1 5 10 15<210>SEQ ID NO6<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>6Pro Pro Tyr His Arg Phe Trp Arg Gly His Arg His Ala Val Gln1 5 10 15<210>SEQ ID NO7<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>7His Arg Ile Ser His Phe Ala His Arg Tyr Leu Ala Arg Leu His1 5 10 15<210>SEQ ID NO8<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>8Trp His Trp Arg His Arg Ile Pro Leu Gln Leu Ala Ala Gly Arg1 5 10 15<210>SEQ ID NO9<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>9Gly Trp His Ser Leu Leu His Ser Arg Tyr His Arg Ile Ala Ala1 5 10 15
<210>SEQ ID NO10<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>10Phe Val Trp Val Arg Phe His Arg Leu Pro Arg Gln Ile Tyr Thr1 5 10 15<210>SEQ ID NO11<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>11Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser Val Arg Thr Arg1 5 10 15<210>SEQ ID NO12<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>12Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser Val Gly Leu Gly1 5 10 15<210>SEQ ID NO13<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>13Arg Lys Trp Phe Leu Gln His Arg Arg Met Pro Val Ser Val Leu1 5 10 15<210>SEQ ID NO14<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>14Ser Gly Arg Arg His Leu His Arg His His Ile Phe Ser Leu Pro1 5 10 15<210>SEQ ID NO15<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>15
Gly Trp Ile Thr Phe His Arg Arg His His Asp Arg Val Leu Ser1 5 10 15<210>SEQ ID NO16<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>16Arg Leu His Gly His Arg Ser His Arg Phe Thr His Val Ala Gln1 5 10 15<210>SEQ ID NO17<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>17Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10 15<210>SEQ ID NO18<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>18Met Pro Leu Ser Arg Tyr Trp Trp Leu Phe Ser His Arg Pro Arg1 5 10 15<210>SEQ ID NO19<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>19Arg Hig Leu Ser His Phe Lys Trp Leu Arg Ser His Gly Leu Asp1 5 10 15<210>SEQ ID NO20<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>20Arg Arg Phe His Phe His Ser Arg Met Val Ala Val Asp Asn Ser1 5 10 15<210>SEQ ID NO21<211>15
<212>PRT<213>人工肽序列<400>21His Val Arg Leu His His Tyr Leu Arg His Arg Ser Leu Pro Asn1 5 10 15<210>SEQ ID NO22<211>15<212>PRT<213>人工肽序列<400>22Val Pro Met Ala Leu Asn His Gly Val Tyr Val Met Val Ser Ser1 5 10 15<210>SEQ ID NO23<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>起始寡核苷酸fdtet15-mer<400>23TGAATTTTCT GTATGAGG18<210>SEQ ID NO24<211>14<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>24Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10<210>SEQ ID NO25<211>13<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>25Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg1 5 10<210>SEQ ID NO26<211>13<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>26Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10
<210>SEQ ID NO27<211>11<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>27Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu1 5 10<210>SEQ ID NO28<211>9<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>28Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr1 5<210>SEQ ID NO29<211>12<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>29Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10<210>SEQ ID NO30<211>11<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>30Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10<210>SEQ ID NO31<211>10<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>31Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10<210>SEQ ID NO32<211>9<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>32Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala
1 5<210>SEQ ID NO33<211>14<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>33Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg1 5 10<210>SEQ ID NO34<211>12<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>34Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr1 5 10<210>SEQ ID NO35<211>10<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>35Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser1 5 10<210>SEQ ID NO36<211>9<212>PRT<213>由肽SEQ ID NO17平截获得的人工肽序列<400>36Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser1 5
权利要求书(按照条约第19条的修改)根据PCT条约第19(1)条作出的声明国际专利申请PCT/ES04、000320申请人医药申请研究基金会修改权利要求1，并加入权利要求3的特征；因多余而删除权利要求2；因其特征已包括在权利要求1中，因此删除权利要求3，并由此删除多余的权利要求4；新权利要求2、3对应原权利要求5、6；权利要求4的依据是说明书(国际公开)第11页第29-第12页第7行；权利要求5-7对应原权利要求9-11；权利要求8和9对应原权利要求7和8；权利要求10-15对应原权利要求12-17；权利要求16是依据权利要求4作出的修改，因此也得到本发明说明书第11页第29-第12页第7行的支持；权利要求17对应原权利要求18。
修改的权利要求[国际局于2004年12月22日(22.12.04)收到；用修改的权利要求1-17替换权利要求1-18]1.具有结合TGF-β1能力的肽，其氨基酸序列选自下列中的任何一个SEQ ID NO1-SEQ ID NO6，SEQ ID NO9-SEQ ID NO22和SEQ ID NO24-SEQ ID NO36，或者包含3-15个氨基酸的所述肽的片段，以及它们的药物可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的肽，其特征是所述肽还具有体外和/或体内抑制TGF-β1的生物活性的能力。
3.根据权利要求1或2所述的肽，所述肽选自下列序列号的肽及其药物可接受的盐SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6，SEQ ID NO11，SEQ ID NO14，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34。
4.肽在能够抑制TGF-β1的生物活性的药物组合物的制造中的应用，所述肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO22，SEQ IDNO24到SEQ ID NO36、或包含3到15个氨基酸的所述肽的片段，以及它们的药物可接受的盐中的任何一个序列。
5.根据权利要求4所述的肽在药物制造中的应用，该药物用于治疗与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理改变。
6.根据权利要求5所述的肽的应用，其特征在于所述的与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理改变包含与器官或组织功能丧失相关的纤维化，和外科的和/或美学上的并发症。
7.根据权利要求5或6中任一权利要求所述的肽的应用，其特征在于与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理改变选自肺纤维化、肝纤维化(肝硬化)、肾纤维化、角膜纤维变性，与皮肤和腹膜外科手术相关的纤维化、与烧伤相关的纤维化、骨关节纤维化或瘢痕瘤。
8.药物组合物，特征在于其包含治疗有效量的权利要求1-3中任一权利要求所述的肽，和至少一个药物可接受的赋形剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，包含至少一个权利要求1-3中任一权利要求所述的肽和一个或多个与本发明不同的其它TGF-β1抑制物。
10.编码权利要求1-3中任一权利要求所述的肽的DNA序列。
11.包含权利要求10所述的DNA序列的DNA构建。
12.根据权利要求11所述的DNA构建，其包含可操作连接的所述DNA序列表达调节序列。
13.包含权利要求10所述的DNA序列、或者包含权利要求11或12所述的DNA构建的载体。
14.包含权利要求10所述的DNA序列、或者包含权利要求11或12所述的DNA构建、或者包含权利要求13所述的载体的宿主细胞。
15.生产权利要求1-3中任一权利要求所述的肽的方法，其特征在于包括在允许所述的肽产生和回收的条件下使权利要求14所述的宿主细胞生长。
16.权利要求10所述的DNA序列，或权利要求11或12所述的DNA构建通过基因疗法抑制TGF-β1的生物活性的应用。
17.权利要求10所述的DNA序列，或权利要求11或12所述的DNA构建在载体和细胞的制造中的应用，该载体和细胞治疗与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病和病理改变。
权利要求
1.肽，所述肽的氨基酸序列包含的3-15个连续氨基酸残基的氨基酸序列选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22及其药物可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的肽，所述肽的氨基酸序列包含的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续氨基酸残基的氨基酸序列选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22及其药物可接受的盐。
3.根据权利要求1和2中任一权利要求所述的肽，还具有结合转化生长因子β1(TGF-β1)的能力。
4.根据权利要求3所述的肽，所述肽选自下列序列号的肽及其药物可接受的盐SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36。
5.根据权利要求3所述的肽，其还在体外和/或体内具有抑制TGF-β1生物活性的能力。
6.根据权利要求5所述的肽，所述肽选自下列序列号的肽及其药物可接受的盐SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO11，SEQ ID NO14，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO33，SEQ ID NO34。
7.药物组合物，包含药物有效量的权利要求1-6中任一权利要求所述的肽和至少一个药物可接受的赋形剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，所述组合物包含至少一个权利要求1-6中任一权利要求所述的肽、任选地和一个或多个不同的TGF-β1化合物。
9.权利要求1-6中任一权利要求所述的肽在药物组合物的制造中的应用，所述药物组合物用于治疗与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理变化。
1O.根据权利要求9所述的应用，其中所述的与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理变化包括与器官或组织功能丧失相关的纤维化，和外科的和/或美学的并发症。
11.根据权利要求10所述的应用，其中所述的与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理变还包括肺纤维化、肝纤维化(肝硬化)、肾纤维化、角膜纤维变性，与皮肤和腹膜外科手术相关的纤维化、与烧伤相关的纤维化、骨关节纤维化或瘢痕瘤。
12.编码权利要求1-6中任一权利要求所述的肽的DNA序列。
13.包含权利要求12所述的DNA序列的DNA构建。
14.根据权利要求13所述的DNA构建，还包含调节所述DNA序列表达的可操作连接的序列。
15.包含权利要求12所述的DNA序列或者包含权利要求13和14中任一权利要求所述DNA构建的载体。
16.宿主细胞，其包含权利要求12所述的DNA序列，或者包含权利要求13和14中任一权利要求所述DNA构建，或者包含权利要求15所述的载体。
17.产生权利要求1-6中任一权利要求所述的肽的方法，所述方法包括在允许产生所述的肽的条件下使权利要求16所述的宿主细胞生长，并且如果需要，回收所述的肽。
18.权利要求12所述的DNA序列或者权利要求13和14中任一权利要求所述的DNA构建在载体和细胞的制备中的应用，所述载体和细胞通过基因疗法治疗与过度或失调的TGF-β1表达相关的疾病或病理变化。
全文摘要
本发明公开了能够结合转化生长因子TGF－β1(TGF－β1)的肽，其通过直接结合该细胞因子是TGF－β1生物活性的潜在抑制剂。这些肽能够用于治疗与过度或失调的TGF－β1表达相关的疾病或病理改变。
文档编号A61K38/10GK1839149SQ200480024201
公开日2006年9月27日 申请日期2004年7月5日 优先权日2003年8月22日
发明者德 拉斯 埃雷里亚斯 哈维尔·多托尔, 安娜·贝伦·洛佩斯·巴斯克斯, 胡安·何塞·拉萨尔特·萨加斯蒂韦尔萨, 赫苏斯·普列托·巴尔图埃纳, 弗朗西斯科·博拉斯·奎斯塔 申请人:西玛生物医学信息公司