专利名称：疮疱丙酸杆菌的抗菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的抗菌剂。更详细地说，涉及含有后述式[I]所示的肽作为有效成分的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂。
背景技术：
疮疱丙酸杆菌(P.acnes；痤疮杆菌)是厌氧性的革兰氏阳性无孢子杆菌，存在于皮肤、肠道上。尽管其本来被认为是对人体致病性低的细菌，但通过最近的研究发现其对慢性疾病的发病、进展起着重要的作用。疮疱丙酸杆菌强烈地活化免疫系统，如1)活化补体、2)产生嗜中性白细胞趋化因子、3)诱导嗜中性白细胞释放酶等。作为由疮疱丙酸杆菌引发、促进的疾病有痤疮、肉样瘤病、葡萄膜炎、结膜炎、角膜炎、角膜水疱、心内膜炎、脊椎关节炎等。
因此，要求开发对疮疱丙酸杆菌具有优异抗菌作用的药物。
其中，痤疮是一种毛囊皮脂腺被侵入的慢性炎症性疾病，皮疹多发于面部、颈部、胸背部。常见粉刺、红色丘疹、脓疱、硬结、小结、囊肿、疤痕等多种皮疹以各种程度共存。通常，痤疮从微小粉刺形成闭合性粉刺，然后向开放性粉刺或者炎症性粉刺红色丘疹、脓疱转移，严重的时候会留下痤疮疤痕等后遗症。并且，痤疮对于年轻人等也是精神痛苦的原因，因此需求适当的治疗。
痤疮中，在毛囊中存在的疮疱丙酸杆菌产生脂肪酶，将皮脂成分中的甘油三酯分解成游离脂肪酸。游离脂肪酸刺激毛囊漏斗部上皮，引起过度角化症，诱导粉刺的形成。并且，疮疱丙酸杆菌产生嗜中性白细胞趋化因子、补体活化因子、蛋白酶、透明质酸酶等，诱导嗜中性白细胞到病变部位，破坏毛囊上皮。其结果，在病变部位产生脓肿(参照池田重雄监修、《标准皮肤科学(第6版)》、第270页～第272页、医学书院出版、2001年)。
因此，作为痤疮的治疗剂，除了需要对疮疱丙酸杆菌的抗菌作用，还希望同时具有角化过度抑制作用、对由嗜中性白细胞诱导的炎症的抑制作用。
但是，作为以往的痤疮治疗方法，如1)涂布抗生素外用剂、合成抗菌外用剂、视黄酸类，2)口服四环素类抗生素、大环内酯类抗菌剂，3)涂布具有脱脂作用的硫磺樟脑洗剂，等，但具有副作用问题，在效果方面也有限，对于重症痤疮无效。因此，也将几种治疗方法组合，但具有药物间相互作用导致副作用、就整体而言价格过高等问题。
肉样瘤病是以非干酪样坏死性上皮样细胞肉芽肿为特征的全身性疾病，肺是最容易受影响的器官，但眼睛、皮肤、淋巴腺、骨和关节、心脏、神经组织、其他内脏也有病灶。作为肉样瘤病的全身病变的一部分，表现为葡萄膜炎。肉样瘤病是一种IV型变应性疾病，其如下形成由于某种原因导致T细胞被活化，由此活化T细胞产生的细胞因子导致单核细胞在局部聚集，并分化成巨嗜细胞，最终形成类上皮样细胞肉芽肿。尽管长期以来肉样瘤病的原因一直不明，但近年来疮疱丙酸杆菌作为原因被人们所关注。已经明确从疮疱丙酸杆菌病变部位淋巴结可高效率、大量地收集疮疱丙酸杆菌细菌，并且疮疱丙酸杆菌的细菌成分大量聚集于类上皮样细胞肉芽肿内。肉样瘤病的有效治疗方法还没有确立，是种难治性疾病。肉样瘤病患者中的70％左右无奈地被追踪现察，将甾类激素作为第一选择药使用，但具有副作用等问题(参照Atarashii Ganka、第17卷(临时增刊号)、第87页～第89页、2000年)。
另一方面，在WO96/12732号小册子等公开了下式[I]所示的肽。
在WO96/12732号小册子中公开了由式[I]所示肽(以下称为肽[I])形成的抗生素、抗肿瘤物质、抗炎症物质以及创伤愈合物质。另外，公开了由肽[I]形成的抗菌剂、抗肿瘤剂、抗炎症剂、创伤愈合剂、抗溃疡剂。并且，公开了肽[I]的抗菌作用，特别是对于好氧性的革兰式阳性菌的抗菌作用、对变应性和非变应性炎症的抑制作用。
在日本特开平10-067677号公报中公开了感染性皮肤疾病治疗剂，其特征在于含有肽[I]和感染性皮肤疾病治疗剂。
在日本特开平10-120575号公报中公开了由油脂性基质和白糖构成的创伤愈合剂，其特征在于还含有肽[I]。
在日本特开平10-120590号公报中公开了寄生性皮肤疾病治疗用外用剂，其特征在于含有寄生性皮肤疾病治疗药以及肽[I]。
在日本特开平10-259141号公报中公开了皮肤疾病治疗用外用剂，其特征在于含有肾上腺皮质激素、肽[I]、维生素E和角鲨烷。
鉴于上述事实，本发明以提供疮疱丙酸杆菌的优异抗菌剂为目的。并且，本发明的目的还在于提供疮疱丙酸杆菌引起的疾病，如痤疮、肉样瘤病等的预防或治疗剂。另外，本发明的目的在于提供痤疮的预防或治疗剂，其兼具对疮疱丙酸杆菌的抗菌作用、过度角化抑制作用、对由嗜中性白细胞诱导的炎症的抑制作用。
发明内容
本发明人为了达到上述目的进行了深入地研究，结果发现肽[I]对疮疱丙酸杆菌具有优异的抗菌作用，并且发现肽[I]具有对表皮角化细胞增殖的抑制作用以及对伴随有嗜中性白细胞浸润的炎症的抑制作用，即确认了其对痤疮的预防或治疗有用，进而完成本发明。
即，本发明涉及下述内容(1)疮疱丙酸杆菌的抗菌剂，其含有下式[I]所示的肽或其可药用盐作为有效成分。
(2)由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂，其含有下式[I]所示的肽或其可药用盐作为有效成分。
(3)如上述(2)所述的预防或治疗剂，其中由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病为选自痤疮、肉样瘤病、葡萄膜炎、结膜炎、角膜炎、角膜水疱(corneal phlycten)、心内膜炎以及脊椎关节炎的疾病。
(4)如上述(3)所述的预防或治疗剂，其中由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病为痤疮。
(5)如上述(4)所述的预防或治疗剂，其中痤疮为寻常痤疮。
(6)如上述(3)所述的预防或治疗剂，其中由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病为肉样瘤病。
(7)如上述(6)所述的预防或治疗剂，其中肉样瘤病为眼肉样瘤病。
(8)如上述(1)～(7)中任意一项所述的预防或治疗剂，其剂型为外用剂。
(9)用于预防或治疗痤疮的化妆品，其含有式[I]所示的肽或其可药用盐作为有效成分。
(10)预防或治疗疮疱丙酸杆菌感染的方法，其中使用式[I]所示的肽或其可药用盐。
(11)预防或治疗由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的方法，其中使用式[I]所示的肽或其可药用盐。
(12)预防或治疗痤疮的方法，其中使用含有式[I]所示的肽或其可药用盐作为有效成分的化妆品。
(13)式[I]所示的肤或其可药用盐用于制备疮疱丙酸杆菌的抗菌剂的用途。
(14)式[I]所示的肽或其可药用盐用于制备由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂的用途。
(15)式[I]所示的肽或其可药用盐用于制备预防或治疗痤疮的化妆品的用途。
(16)一种商业包装，其包括含有式[I]所示的肽或其可药用盐及可药用载体的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂组合物、以及记载有可以将该组合物用于或应该用于预防或治疗疮疱丙酸杆菌感染的记载物。
(17)一种商业包装，其包括含有式[I]所示的肽或其可药用盐及可药用载体的用于预防或治疗由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的药物组合物、以及记载有可以将该组合物用于或应该用于预防或治疗由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的记载物。
(18)一种商业包装，其包括含有式[I]所示的肽或其可药用盐及可药用载体的用于预防或治疗痤疮的化妆品组合物、以及记载有可以将该组合物用于或应该用于预防或治疗痤疮的记载物。
通过本发明，能够得到疮疱丙酸杆菌的优异抗菌剂。并且，能够得到痤疮、肉样瘤病等由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂；痤疮的预防或治疗剂，其兼具对疮疱丙酸杆菌的抗菌作用、对过度角化的抑制作用、对由嗜中性白细胞诱导的炎症的抑制作用；用于预防或治疗痤疮的化妆品。
发明的详细说明本发明的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂、由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂、痤疮的预防或治疗用化妆品，含有肽[I]作为有效成分。
肽[I]可如下得到培养属于链霉菌属的肽[I]产生菌株、如放线菌高贵链霉菌属(Streptomyces nobilis，以下简写为“S.nobilis”)，将通过有机溶剂提取所得培养液或培养液的固形物或者培养菌体的提取物上样于各种柱层析，对含有目标物的柱层析级份进行再结晶处理，由此获得。
生产肽[I]的放线菌高贵链霉菌属可以从公知的保藏机构获得，如可使用理化学研究所的保存菌(JCM4274)(在美国以ATCC19252、在荷兰以CBS198.65保存)等菌。
肽[I]还可通过WO96/12732号小册子或者日本特开平10-175996号公报等中记载的方法得到。
做为肽[I]的可药用盐，优选为无毒性、可药用的常用盐，如钠、钾等碱金属盐，钙、镁等碱土类金属盐，铵盐等无机碱的盐，及三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、N，N’-二苄基乙二胺等有机胺盐，以及盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等无机酸盐，甲酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、酒石酸等有机羧酸盐，甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等磺酸加成盐，与精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等碱性或酸性氨基酸的碱或酸加成盐。
肽[I]对疮疱丙酸杆菌具有极优异的抗菌作用，对疮疱丙酸杆菌感染，由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病，如痤疮、肉样瘤病、葡萄膜炎、结膜炎、角膜炎、角膜水疱、心内膜炎以及脊椎关节炎，优选痤疮、肉样瘤病的预防或治疗有效。
上述痤疮包括寻常痤疮、新生儿痤疮、聚会性痤疮、毛囊脂螨性痤疮(demodex acne)、痤疮样疹(acneiform eruption)、由外部化学物质导致的痤疮、坏死性痤疮、夏季痤疮等，优选为寻常痤疮。
上述肉样瘤病包括肺、眼睛、皮肤、淋巴、骨、关节、心脏、神经组织、其他内脏的肉样瘤病，但优选为眼睛的肉样瘤病。
由于痤疮是由疮疱丙酸杆菌引起的，伴随有过度角化、嗜中性白细胞诱导引起的炎症的疾病，因此兼具疮疱丙酸杆菌的抗菌作用、过度角化抑制作用、对由嗜中性白细胞诱导引起的炎症的抑制作用的肽[I]，对于痤疮的预防或者治疗极为有效。
本发明涉及的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂、由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂，能够以以往公知的剂型给包括人在内的哺乳动物施用，如软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、胶乳剂、洗剂、糊剂、搽剂、乳剂、外用液剂、硬膏剂、气雾剂、吸入剂、喷雾剂、栓剂、灌肠剂、药浴剂(dipping agent)、贴剂、膏剂、带剂、滴鼻剂、滴耳剂、滴眼剂、眼软膏剂等外用剂型，注射剂(液剂、混悬液等)、注入剂、静脉滴注剂等非口服剂型，片剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊剂、微胶囊剂、颗粒剂、粉末、散剂、丸剂、饮用液剂、液剂、浸剂、煎剂、浸膏剂、混悬液(如橄榄油)、糖浆剂、柠檬水剂(lemonade)、酏剂、锭剂等口服剂型。
本发明涉及的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂、由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂的剂型，可以在考虑病变部位、效果表现的有效性等的基础上进行适当选择，但优选以外用剂型形式给药。当由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病是痤疮时，在外用剂型中优选为软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、胶乳剂、洗剂、糊剂、搽剂、乳剂、外用液剂、硬膏剂、喷雾剂、药浴剂、贴剂、膏剂、带剂等剂型。当由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病是肉样瘤病时，特别优选滴眼剂或者眼软膏剂等剂型。
本发明涉及的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂、对由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂，在使用时按照适于各种剂型的方法进行给药。如为外用剂型时，将其直接喷雾、贴付或涂布于皮肤或者粘膜等重要部位；为片剂、丸剂、饮用液剂、混悬液、乳剂、颗粒剂和胶囊剂时，口服给药；为注射剂时，给药到静脉内、肌肉内、皮内、皮下、关节腔内或者腹腔内；为栓剂时，给药到直肠内。
这些药物组合物中，可使用如可可脂、白凡士林、聚乙二醇、丙二醇、液体石蜡、蜂蜡、橄榄油、可可油、芝麻油、大豆油、山茶油、花生油、牛油、猪油、羊毛脂、对羟基苯甲酸甲酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、胶态烃(如plastibase、poloid等)、鲸蜡醇、硬脂醇等基质；如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂；如纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉、羧甲基淀粉、藻酸钠、糊精、聚乙烯醇、硬脂酸等粘合剂；如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等崩解剂；如硬脂酸镁、Aerosil、滑石、月桂基硫酸钠等润滑剂；如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橙子粉末等矫味剂；如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等剂；如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等稳定剂；如甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、硬脂酸铝等助悬剂；羟丙基甲基纤维素等分散剂；纯净水、生理盐水、乙醇、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)等稀释剂；如黄著胶等增稠剂等制剂中惯用的可药用的各种有机或无机载体，通过公知的方法制成制剂。
另外，根据需要，还可以使用高岭土、膨润土、氧化锌等填充剂；甘油、丙二醇等保湿剂；载体；粘合剂；辅助剂；着色剂；香料；pH调节剂；增量剂；增溶剂；缓冲剂；润湿剂(付質剤)；表面活性剂；抗氧剂；抛射剂；溶剂；助溶剂等。另外，通过选用适当的溶剂，肽[I]也可以直接以液体制剂的形式使用。
本发明涉及的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂、对由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂，以软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、胶乳剂、洗剂、糊剂、搽剂、乳剂、外用液剂、硬膏剂、喷雾剂、贴剂、膏剂、带剂等皮肤外用剂使用时，通过含有至少一种选自N-酰基肌氨酸或其盐、作为碳原子数10～18的高级脂肪酸与碳原子数1～20的醇的反应产物的高级脂肪酸酯、碳原子数2～10的二元羧酸或其盐、作为碳原子数3～6的羟基羧酸与碳原子数1～20的醇的反应产物的羟基羧酸酯、以及脂肪酸乙醇酰胺中的经皮吸收促进剂，能够使药效成分容易地被皮肤吸收、进一步提高治疗效果。
上述N-酰基肌氨酸可以举出N-月桂酰基肌氨酸、N-油酰基肌氨酸、N-棕榈酰基肌氨酸、椰子油脂肪酸肌氨酸等，其盐可以举出上述N-酰基肌氨酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐等。
上述高级脂肪酸酯为碳原子数10～18的高级脂肪酸和碳原子数1～20的醇的反应产物。如果上述高级脂肪酸的碳原子数过少，则产物高级脂肪酸酯易挥发；而过多时，则经皮吸收效果降低。上述醇的碳原子数过多时，经皮吸收效果降低。
作为上述碳原子数为10～18的高级脂肪酸，可以举出癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸等饱和脂肪族一元羧酸；棕榈油酸、油酸、异油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪族一元羧酸；癸二酸等饱和脂肪族二元羧酸等。
作为上述碳原子数1～20的醇，可以举出甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇(octyl alcohol)、辛醇(capryl alcohol)、壬醇、癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、棕榈醇、硬脂醇等脂肪族饱和醇等。
作为上述高级脂肪酸酯可以举出十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、月桂酸异丙酯、硬脂酸异丙酯等。
上述二元羧酸或其盐，碳原子数为2～10。碳原子数过少或者过多，经皮吸收效果都会下降。作为上述碳原子数为2～10的二元羧酸，可以举出草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸等饱和脂肪酸二元羧酸；富马酸、马来酸等不饱和脂肪族二元羧酸；邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸等芳香族二元羧酸等。其盐可以举出上述二元羧酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐等。
上述羟基羧酸酯为碳原子数3～6的羟基羧酸和碳原子数为1～20的醇的反应产物。上述羟基羧酸的碳原子数过少，则产物羟基羧酸酯易挥发；过多，则经皮吸收效果下降。上述醇的碳原子数过多，则经皮吸收效果降低。
作为上述碳原子数为3～6的羟基羧酸，可以举出乳酸、甘油酸等一元羧酸；苹果酸、酒石酸等二元羧酸等。作为上述碳原子数为1～20的醇，可以举出与用于上述高级脂肪酸酯反应中的醇相同的醇。作为上述羟基羧酸酯，可以举出乳酸十四酯、乳酸十六酯等。
作为上述脂肪酸乙醇酰胺，可以举出脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸二乙醇酰胺；它们的环氧烷物加成物等。作为上述脂肪酸乙醇酰胺，可以举出月桂酸单乙醇酰胺、月桂酸二乙醇酰胺、月桂酰单乙醇酰胺、棕榈酸单乙醇酰胺、棕榈酸二乙醇酰胺、肉豆蔻酸单乙醇酰胺、肉豆蔻酸二乙醇酰胺、月桂酸·肉豆蔻酸单乙醇酰胺、椰子油脂肪酸单乙醇酰胺、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、聚氧乙烯加成月桂酰单乙醇酰胺、聚氧乙烯加成椰子油脂肪酸单乙醇酰胺等。
作为在本发明涉及的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂、由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂中可含有的上述经皮吸收促进剂，特别优选为N-月桂酰基肌氨酸、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、富马酸、马来酸、乳酸十四酯、乳酸十六酯、月桂酸二乙醇酰胺。上述经皮吸收促进剂优选为上述物质，但并不限于它们，可以使用以往公知的物质。
在本发明涉及的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂、由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂中含有的肽[I]的量，没有特别限定，可以在考虑剂型、给药途径等的基础上在宽范围内进行适当选择，优选肽[I]为10-10～20重量％的范围，更优选为10-7～10重量％的范围。特别是作为外用剂进行使用时，肽[I]为0.01～20重量％、优选为0.1～5重量％的范围。
本发明涉及的疮疱丙酸杆菌的抗菌剂、由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂的给药量，没有特别限定，可以在考虑患者的体重、年龄、剂型、给药途径、症状、患病部位大小等因素的基础上在宽范围内进行适当选择，但通常为每日按照肽[I]计，以10pg/kg～100mg/kg左右的范围、优选0.1mg/kg～10mg/kg左右的范围分1～4次给药。
另外本发明还涉及含有肽[I]或其可药用盐作为有效成分的痤疮预防或治疗用化妆品。
作为化妆品，可以举出化妆水、雪花膏、乳液、面膜等各种组合物形式的皮肤化妆品。将含有肽[I]的组合物制成化妆品时，除了添加在将肽[I]制成药品组合物时可以添加的上述添加物之外，还可以在不影响本发明组合物的有利特性的范围内，添加化妆品活性剂、防腐剂、香料、填充剂、颜料、防紫外剂、臭氧吸收剂、染料、保湿剂(甘油等)等通常在化妆品领域中使用的添加物。如化妆水可如下制得在精制水中溶解甘油等保湿剂、皮肤营养剂等，在醇中溶解防腐剂、香料等，将两者混合在室温下使其溶解，在醇部分中加入肽[I]或其可药用盐，从而得到。
本发明涉及的用于预防或治疗痤疮的化妆品，通常通过在皮肤等需要部位直接喷雾或者贴付、涂布有效量的上述化妆品进行使用(给药)。
本发明涉及的痤疮预防或治疗用化妆品中所含有的肽[I]的量，可以根据化妆品组合物的形态等在宽范围内进行适当选择，优选按[I]计，为0.001～20重量％，更优选为0.01～5重量％的范围。
本发明涉及的痤疮预防或治疗用化妆品的用量，没有特别限定，可以在考虑组合物的形态、使用部位等因素的基础上在宽范围内进行适当选择，但通常每次使用的化妆品为0.01g～10g左右的范围，每日分1～4次使用。
以下通过实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不受下述实施例的限定。
(实施例1)用6株在1991年由日本国内的教育医院分离、鉴定、保存的疮疱丙酸杆菌作为试验菌。在GAM琼脂培养基(日水制药公司生产)中、35℃下厌氧培养48小时，将繁殖的菌落接种到GAM broth(日水制药公司生产)，35℃下厌氧培养18～20小时。将其用含有明胶的缓冲生理盐水(在1000 mL无菌水中溶解有BSG；NaCl8.5、KH2PO40.3g、Na2HPO40.6g、明胶0.1g的溶液)稀释100倍，制成接种菌液。使用二甲基亚砜(DMSO)溶解肽[I]，用DMSO进行2倍的梯度稀释。将其分注到灭菌培养皿中使得DMSO的终浓度为1％，向其中添加9.9mL灭过菌的脑心浸液琼脂(BBL)，按照肽[I]的终浓度为128μg/mL～0.0039μg/mL，制作2倍稀释系列的琼脂平板。通过影印法将接种菌液接种于琼脂平板，35℃下厌氧培养48小时。根据NCCLS(M11-A4)进行MIC的判定。结果示于表1。
表1
(结果)由表1可知，肽[I]对试验中使用的6个疮疱丙酸杆菌菌株都具有很强的抗菌活性。
(实施例2)使用正常人表皮角质化细胞生长培养基(KGMz)将正常人表皮角质化细胞(购自三光纯药株式会社)调整到2×104个细胞/mL的细胞浓度后，在96孔板中以每孔100μL进行接种(2×103个细胞/孔)。在37℃二氧化碳培养箱中培养2～3小时后，以100μL/孔添加溶解于0.02％甲醇-KGM2中的肽[I]。甲醇终浓度为0.01％。将细胞培养3天后，更换培养基继续培养3天。培养后以20μL/孔添加细胞计数试剂盒试剂(和光纯药(株)公司生产)，在二氧化碳培养箱中进行显色反应。一边观察显色状态，将反应时间定为1～4小时。反应后，使用读板器在450nm测定吸光度，作为细胞增殖指标。实验平行反复进行了3次，与未添加肽[I]的组比较吸光度，通过Dunnet多重比较检验法进行检验。结果示于表2。
表2
**P＜0.01(Dunnet多重比较检验)(结果)如表2可知，肽[I]对正常人表皮角质化细胞增殖显示了很强的抑制作用。
(实施例3)
在BDF1系雌性小鼠(7周龄)的右耳廓两面上涂布50μg/mL的溶解于1％DMSO-丙酮溶液的TPA，每面20μL(2μg/耳)，诱发皮肤炎症。将肽[I]溶解在丙酮/甲醇(1∶1)中后使用，分别在TPA刺激的24小时前和1小时前，涂布于右耳廓两面，每面20μL。在TPA刺激的6小时和24小时后，使用Peacock dial thickness gauge测定右耳的厚度，作为浮肿的指标。在TPA刺激的24小时后，采集右耳，测定MPO活性，作为嗜中性白细胞浸润的指标。每组各测定5只。耳的厚度、MPO活性分别通过下式作为抑制率(％)求出。
抑制率(％)＝[(未给予肽[I]的组的平均值-肽[I]给药组的平均值)/(未给予肽[I]的组的平均值-未涂布TPA组的平均值)]×100结果由Dunnet多重比较检验法进行检验。结果示于表3。
表3
*P＜0.05、**P＜0.01(Dunnet多重比较检验)(结果)由表3可知，肽[I]对TPA诱发的小鼠皮肤炎症中的浮肿、嗜中性白细胞浸润具有很强的抑制作用。该结果表明本发明的肽[I]对由嗜中性白细胞浸润引发的炎症具有抑制作用。
(实施例4)在BALB/c系雌性小鼠(5周龄)的右耳廓两面上涂布1mg/mL的溶解于10％DMSO-丙酮溶液的钙离子载体(A23187)，每面10μL(20μg/耳)，诱发皮肤炎症。将肽[I]溶解在丙酮/甲醇(1∶1)中后使用，分别在A23187刺激的24小时前和1小时前，涂布于右耳廓两面，每面20μL。在A23187刺激的6小时和24小时后，使用Peacockdial thickness gauge测定右耳的厚度，作为浮肿的指标。在A23187刺激的24小时后，采集右耳，测定MPO活性，作为嗜中性白细胞浸润的指标。每组各测定5只。耳的厚度、MPO活性分别通过下式作为抑制率(％)求出。
抑制率(％)＝[(未给予肽[I]的组的平均值-肽[I]给药组的平均值)/(未给予肽[I]的组的平均值-未涂布A23187的组的平均值)]×100结果由Dunnet多重比较检验法进行检验。结果示于表4。
表4
**P＜0.01(Dunnet多重比较检验)(结果)由表4可知，肽[I]对A23187诱发的小鼠皮肤炎症中的浮肿、嗜中性白细胞浸润具有很强的抑制作用。该结果表明本发明的肽[I]对由嗜中性白细胞浸润引发的炎症具有抑制作用。
(实施例5)肽[I] 1mgplastibase(大正制药公司生产)1g使用乳钵将1mg肽[I]粉碎成细粉，添加1g plastibase，使用乳钵将它们充分混合，制备软膏剂。
(实施例6)肽[I] 0.2mg甲醇12.5μL
plastibase(大正制药公司生产) 1g在50μL甲醇中溶解0.8mg肽[I]后，在乳钵上将所得含有本发明肽的甲醇中的12.5μL与1g plastibase充分混合，制备软膏剂。
(实施例7)肽[I] 0.5mgDMSO 0.1mL5重量％阿拉伯胶水溶液 1.9mL在0.5mg肽[I]中添加0.1mL DMSO将肽溶解后，一边搅拌一边每次少量地将0.1mL所得含有本发明肽的DMSO溶液加入至1.9mL5重量％阿拉伯胶溶液中，制备均匀混悬的液体制剂。
(实施例8)肽[I] 0.5mg生理盐水 2mL在0.5mg肽[I]中添加少量生理盐水，使用超声波使其成为均匀的混悬液后，继续添加生理盐水使溶液量达到2mL，制备液体制剂。
(实施例9)肽[I] 25mg乙醇 2.5mL聚氧乙烯氢化蓖麻油60 1g生理盐水 96.5mL将25mg肽[I]溶解于2.5mL乙醇中后，加入1g聚氧乙烯氢化蓖麻油60。一边搅拌所得溶液一边将其添加到96.5mL生理盐水中，制备液体制剂。
(实施例10)肽[I] 10mg聚乙二醇(macrogol)400 50mL生理盐水 适量将10mg肽[I]溶解于50mL聚乙二醇400中后，加入生理盐水达到100mL，制备液体制剂。
产业实用性本发明涉及疮疱丙酸杆菌的抗菌剂；痤疮、肉样瘤病等由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂；痤疮用于预防或治疗的化妆品等，在医药产业上有用。
权利要求
1.疮疱丙酸杆菌的抗菌剂，其含有下式[I]所示的肽或其可药用盐作为有效成分，
2.由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂，其含有下式[I]所示的肽或其可药用盐作为有效成分，
3.权利要求2所述的预防或治疗剂，其中由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病为选自痤疮、肉样瘤病、葡萄膜炎、结膜盐、角膜炎、角膜水疱、心内膜炎及脊椎关节炎的疾病。
4.权利要求3所述的预防或治疗剂，其中由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病为痤疮。
5.权利要求4所述的预防或治疗剂，其中痤疮为寻常痤疮。
6.权利要求3所述的预防或治疗剂，其中由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病为肉样瘤病。
7.权利要求6所述的预防或治疗剂，其中肉样瘤病为眼肉样瘤病。
8.权利要求1～7任一项所述的预防或治疗剂，其剂型为外用剂。
9.用于预防或治疗痤疮的化妆品，其含有下式[I]所示的肽或其可药用盐作为有效成分，
10.预防或治疗疮疱丙酸杆菌感染的方法，其中使用下式[I]所示的肽或其可药用盐，
11.预防或治疗由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的方法，其中使用下式[I]的所示肽或其可药用盐，
12.预防或治疗痤疮的方法，其中使用含有下式[I]所示的肽或其可药用盐作为有效成分的化妆品，
13.下式[I]所示的肽或其可药用盐用于制备疮疱丙酸杆菌抗菌剂的用途，
14.下式[I]所示的肽或其可药用盐用于制备由疮疱丙酸杆菌感染引发的疾病的预防或治疗剂的用途，
15.下式[I]所示的肽或其可药用盐在制备用于预防或治疗痤疮的化妆品中的用途，
全文摘要
本发明涉及疮疱丙酸杆菌的抗菌剂，其含有右式[I]所示的肽或其可药用盐作为有效成分。
文档编号A61P27/00GK1852729SQ20048002670
公开日2006年10月25日 申请日期2004年9月15日 优先权日2003年9月16日
发明者波多野和男, 渡边裕二, 佐久间庄三, 横田义宏 申请人:安斯泰来制药有限公司, 积水化学工业株式会社