减轻内毒素的效应的制作方法

专利名称：减轻内毒素的效应的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于减轻病原体感染导致的肠毒素的效应的营养方法。
背景技术：
人和动物的胃肠道处于产生多种病症的危险之中，所述病症包括衰老、病毒、细菌和/或它们的毒素引起的病症，或者其它物理或化学物质滥用引起的病症。
有几种因素或者疗法能够减轻多种胃肠道病症的症状。其中土著菌群(称作小型生物群)在调节肠道环境方面发挥着重要的作用。这些定居在肠道的非病原性微生物(称作益生菌)与从所述微生物释放或作为食物成分摄取的益生分子一起提供了预防或治疗胃肠病症(包括艰难梭菌(C.difficile)感染)的可能的方法。
已经证实，人的肠道细菌调节肠道中艰难梭菌毒素A的产生，并且比起常规小鼠，毒素A更容易结合从无菌小鼠分离的肠膜，这表明土著微生物在艰难梭菌的发病中起重要作用。用于检测由艰难梭菌引起的大肠炎和腹泻的营养方法的临床研究表明乳杆菌(Lactobacillus GG)改善了入院的成人和婴儿的大肠炎的症状。类似地，非病原性酵母(Saccharomycesboulardii)也在防止或治疗成人和婴儿中艰难梭菌引起的大肠炎和腹泻中起积极作用。另外，RU 2168915公开了一种肉制品作为针对儿童和虚弱人们中胃肠病症的治疗性或预防性食品的用途，该肉制品包含预定比例的牛肉、猪肉、漂白的牛肝、南瓜，和奶油。所有以上的观察都表明，针对艰难梭菌感染的营养介入的领域仍然是开放的。
发明概述本发明是涉及包含蛋白胨和/或肉膏的口服组合物用于治疗病原体感染导致的肠毒素效应的用途。此类效应包括由于肌动蛋白丝分解引起的肠上皮完整性的破坏和所引起的紧密连接的破坏，以及毒素诱导的肠液分泌导致的腹泻，和环加氧酶诱导作用介导的其它过程。
发明详述在本发明中，“口服组合物”旨在表示任何可摄取的组合物，并且可以是营养组合物、营养补充物，或者药物。例如，它也可以是药物治疗的佐剂。该口服组合物旨在应用于遭受病原体感染产生的肠毒素效应的人，包括婴儿或早产婴儿到老年人。它也可以用于遭受病原体感染产生的肠毒素效应的动物，如猫、狗、鱼、兔、鼠、仓鼠等等，以及更加一般地人类饲养的任意动物，如马、奶牛、家禽、绵羊等。
术语“肉膏”旨在包括任何肉类的提取物，例如牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉和/或火鸡肉等等的提取物。它也可以来自上面提到的肉类的混合物。无论如何，它都将至少提供氮、氨基酸和碳。用于本发明的适宜的、通过商业途径可获得的肉膏的实例是由Becton Dickinson and Company提供的BD Bacto Beef Extract。
术语“酵母提取物”可以包括自溶酵母的水溶性部分，并优选地含有维生素B复合物。它还覆盖包含自溶的面包酵母的可溶性和不溶性部分，并且在这种情况下，它优选还包含核黄素和泛酸。然而，在本发明的优选实施方案中，“酵母提取物”并包含该微生物并且不包含该微生物产生的酶。酵母提取物可能是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)提取物。用于本发明的适宜的、通过商业途径可获得的酵母提取物的实例是Becton Dickinsonand Company公司提供的BD Bacto Yeast Extract。
术语“蛋白胨”意思是蛋白质物质的部分酶促或酸水解产物的任何可溶性混合物。蛋白质起始材料的选择并不关键，但是优选酪蛋白、乳清蛋白和肉类蛋白质。优选地，蛋白胨的分子量小于3kDa。用于本发明的适宜的、通过商业途径可获得的蛋白胨的实例是Becton Dickinson and Company公司提供的BD Bacto Peptone。
肠毒素是对肠粘膜起作用的细菌外毒素。它们可以由致病性细菌在肠内产生。细菌肠毒素是有效的粘膜免疫原，其激活粘膜和系统免疫反应，从而导致多种疾病，包括食物中毒、普通腹泻、大肠炎、慢性炎症和痢疾。肠毒素也导致严重的粘膜溃疡、出血性炎性渗出或者血性腹泻。毒素诱导的疾病通常伴有腹部绞痛和直肠痛。肠毒素为液体分泌和肠炎的主要刺激物。它们在上皮细胞表面的结合导致丝状肌动蛋白的解聚和紧密连接渗透性的增加，以及激活胞内途径并随后合成和释放液体分泌活化剂。毒素还诱导严重的炎症，通常特征为通过感觉肠神经的激活以及感觉神经肽的释放在粘膜内嗜中性粒细胞的迁移以及肠细胞坏死，并伴有细胞因子的释放和上皮细胞破坏。
致病性细菌可以是共生的微生物系统的一部分，即它们可以无害地存在于肠道，除非或者直到这个微生物系统的平衡遭到扰乱，例如，在用抗生素，尤其广谱抗生素治疗期间就可以发生所述扰乱。在此类情况下，这些“机会病原体”可以迅速生长，占据肠道微生物系统并产生引起肠炎的毒素。此类细菌的例子包括艰难梭菌和产气英膜梭菌(clostridiumperfringens)，并且本发明的组合物特别适于治疗此类细菌产生的毒素效应。应当理解本发明尤其适用于治疗医院感染。
其它产生肠毒素的细菌的例子包括大肠杆菌(E.coli)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、志贺氏菌(Shingellae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、或者产肠毒素的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)(ETBF)。
艰难梭菌感染是入院患者大肠炎和腹泻的主要原因，由于抗生素摄入，这些患者的肠道小型生物群改变。艰难梭菌通过释放两种毒素毒素A和毒素B而引起肠炎。两种毒素在人体都有强烈的细胞毒性作用，但是毒素A是液体分泌(从而导致腹泻)和肠炎症的主要刺激物。毒素A结合于上皮细胞表面，并通过有被小窝内化到细胞质。内化导致肌动蛋白张力丝的解聚、肌动蛋白结合的黏着斑的破坏、紧密连接的打开、细胞的脱离和液体分泌增加。这些效应已经在体外在培养的人上皮细胞系(例如T84结肠细胞系)中得到证明，其中在单细胞层上加入毒素A减小了跨上皮阻力并增加了单细胞层的通透性。艰难梭菌肠毒素在体内显示出诱导严重炎症，其特征是当豚鼠、兔或大鼠回肠暴露于毒素A时，粘膜中嗜中性粒细胞迁移和肠细胞。导致该急性炎症反应的机制似乎是感觉肠神经的激活和感觉神经肽的释放。最近的研究还提出毒素A上调肠内COX-2的表达。
胃肠病原体引起的损伤的最常见的后果之一是腹泻。腹泻是由致病性细菌(包括产生肠毒素的细菌)、寄生虫或病毒可以引起的肠道内上皮细胞分泌的增加造成的。
COX-2是一种催化由花生四烯酸合成前列腺素的酶。COX-2的其它已知的催化底物包括二高-γ-亚麻酸(20:3n:6)和二十碳五烯酸(EPA，20:5n-3)，分别产生PGE1和PGE3。已经克隆了人COX-2基因，并且已经描述了它的基因表达对不同元件，如cAMP、NF-κB和TGF-β、IL-1或TNF-α的应答。
COX-2与多种炎症相关，所述炎症包括过敏反应和肠炎症。在其中涉及COX-2活性的肠炎症肠病症中，有胃炎、炎性肠病、过敏性肠综合征或肠癌。
优选地，蛋白胨以口服组合物的形式给药，所述组合物按体积计包含0.3％到7％蛋白胨。蛋白胨的合适来源包括乳清蛋白和充分水解的乳清蛋白，虽然也可以使用水解程度在15％到20％的乳清蛋白，但优选平均肽大小不超过5个氨基酸的乳清蛋白。肉类蛋白质是蛋白胨的备选来源，并且在肉类蛋白质中优选牛肉蛋白质。可以加入肉膏，优选按体积计0.3％到7.0％的量。在优选的实施方案中，口服组合物包含(按体积计)1％肉膏和1％蛋白胨。另外，该组合物可以包括酵母提取物，优选按体积计0.01％到5％的浓度。
本发明的口服组合物可以采取多种不同的食品形式。例如，当目标群体是婴儿群体，它可以是婴儿配方粉剂。它也可以是脱水的食品，例如汤。它还可以是肠组合物或者补充配方。当遭受肠病症的个体是宠物时，该口服组合物可以是湿的或干的宠物食品。
当根据本发明的组合物掺入到药物中时，它可以与任何合适的赋形剂掺和成任意药用形式。
我们已经发现，对于遭受病原体感染(如通过肠道病症，肠上皮完整性的破坏和腹泻证明)的个体摄取肉膏同时摄取或不摄取蛋白胨，或者仅摄取蛋白胨时，与那些患有同样疾病但是饮食中没有添加肉膏或者蛋白胨的个体相比，有正常化的液体分泌，较小的细胞结构破坏，和减轻的炎症。
在本发明的构架中，肉膏和/或蛋白胨也可以与酵母提取物结合从而对于遭受肠紊乱、损伤和应激的患者的肠完整性取得提高的效果。
实施例下面的实施例用来阐明本发明范围内的一些产品和生产这些产品的方法。不认为它们以任何方式限制本发明。可以对本发明进行修改和修饰。也就是说，技术人员将认识到这些实施例中许多变通方案用以覆盖宽范围的配方、成分、加工和混合物用以对于多种应用合理地调节本发明化合物的天然发生的水平。
实施例1-组合物对紧密连接和肌动蛋白丝的作用材料和方法人结肠细胞系T84(ATCC，CCL-248)在DMEM∶F12 1∶1的培养基中培养，该培养基补充有20％FBS(胎牛血清)，2mM谷氨酰胺以及100U/ml青霉素-链霉素。人原代皮肤成纤维细胞在DMEM中培养，该培养基补充有10％FBS以及100U/ml青霉素-链霉素。
T84单细胞层以0.5×106个细胞/内眼板接种于六孔内眼板内并培养3周。测量TEER(跨上皮电阻)的基线值，然后将培养基换成含有20％deMan-Rogosa-Sharpe溶液的生长培养基(在PBS中含有1％牛肉膏，1％肉蛋白胨和0.5％酵母提取物的溶液，以后将其称为“MRS”)。37℃1小时后，在单细胞层的顶面加入艰难梭菌毒素A，其终浓度为100ng/ml，接着在37℃下1、2、4、6和24小时后测量TEER。对照单细胞层只暴露于培养基。对于每一种情况使用一式三份的内眼板。在每个时间点，收集1ml顶面和1ml底外侧培养基，并根据厂家说明书利用Cytotoxicity Detection Kit测量LDH释放来评价细胞生活力。
将T84细胞或人原代成纤维细胞(2×105/室)接种在4室载玻片上，按照前述方法培养，与20％的MRS溶液孵育1小时后加入终浓度为500ng/ml的毒素A。6小时后，用PBS洗涤细胞，用3.7％的多聚甲醛固定，用PBS洗涤两次，在-20℃用丙酮渗透5分钟，以PBS-1％BSA(牛血清白蛋白)处理用来降低非特异标记。在用200U/ml的罗丹明标记的毒蕈肽标记细胞后，通过荧光显微术评估肌动蛋白解聚和细胞变圆。
结果毒素A影响上皮细胞的紧密连接，该作用通过上皮单细胞层的跨上皮电阻(TEER)的降低来测量。为了评估MRS是否可以中和毒素A的毒性，在所述组合物存在或不存在的情况下，将T84单细胞层暴露于毒素A，并测量TEER。向T84单细胞层加入100ng/ml毒素A并孵育6小时后导致TEER减小到TEER对照值的1/3(309±8vs.985±49Ωcm2)。加入20％的MRS溶液以及毒素A防止了TEER减小(1403+95vs.309±8Ωcm2)，但是并不改变T84细胞的基线TEER值(1217±277Ωcm2vs.985±49Ωcm2)。没有观察到细胞生活力的变化，表明毒素A在6小时期限内没有诱导细胞死亡。以上结果表明蛋白胨、肉膏和酵母提取物的混合物能够中和毒素A并保护T84单细胞层免于毒素A诱导的TEER减小。
为了确定MRS针对毒素A诱导的TEER减小的保护作用是否与导致细胞变圆的细胞骨架改变有关，单独用毒素A或者联合20％的MRS溶液处理T84细胞，并通过免疫细胞化学分析细胞骨架肌动蛋白。加入500ng/ml毒素A诱导T84细胞变圆，其通过单细胞层的蜂窝外观可以证明，该外观是由于肌动蛋白解聚和包装。组合加入20％的MRS溶液和毒素A部分地防止了由毒素A引起的肌动蛋白解聚和随后的细胞变圆，但是单独加入毒素A时不影响细胞的细胞骨架。由于T84单细胞层的空间结构，这些效应不容易被观察到。为了更容易解释，使用原代人皮肤成纤维细胞重复实验，该细胞形成平面单细胞层。在毒素A存在下6小时后，所有成纤维细胞都呈现出圆的外观，表明细胞骨架的完全破坏。组合加入20％的MRS溶液和毒素A部分防止了肌动蛋白解聚和细胞变圆。用毒素A和20％组合物处理过的成纤维细胞的形状与对照成纤维细胞或者仅用所述组合处理的成纤维细胞的形状相当但是不相同。因此MRS可以中和毒素A，部分防止由于肌动蛋白解聚引起的细胞骨架改变及随后的细胞变圆。
用下列溶液代替20％MRS溶液重复这些实验1％牛肉胨溶液的20％溶液1％牛肉膏溶液的20％溶液0.5％酵母提取物溶液的20％溶液含有充分水解的乳清肽(平均肽大小小于约5个氨基酸)的1％溶液含有充分水解的乳清肽(平均肽大小不大于5个氨基酸)的10％溶液得到与20％MRS溶液相似的结果。
讨论这里观察到的保护作用的机制并没有清楚地阐明并且可能是不同的。毒素A诱导肌动蛋白丝聚合，导致细胞骨架肌动蛋白解聚。肌动蛋白破坏是体外观察到的细胞变圆以及紧密连接通透性增加的原因。毒素A对肌动蛋白的作用是由于它对Rho家族蛋白质的葡糖转移酶的活性。毒素A能够酶促转移UDP葡萄糖的葡萄糖残基至Rho、Rac和Cdc-42的苏氨酸37，导致肌动蛋白张力丝解聚、肌动蛋白结合的黏着斑的破坏、紧密连接的开放、细胞脱离以及增加的液体分泌。这些作用已经在体外用T84细胞得到证明，其中在单细胞层上加入毒素A减小了跨上皮阻力并增加了单细胞层的通透性，这是由于上皮细胞中Rho蛋白质的修饰。因此我们认为蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏干扰了Rho蛋白质的信号通路，从而抑制了毒素A的作用。不希望被理论束缚，该干扰可以在葡萄糖残基转移至Rho蛋白质的上游或下游。
实施例2-组合物对产肠毒素的胃肠病原体引起的损伤的作用材料和方法将六周龄的雄性小鼠无限制地用60mg/L庆大霉素、250mg/L万古霉素、300mg/L阿莫西林和10mg/L两性霉素处理一周以便消灭肠道小型生物群。将这些小鼠分成3组1)对照组；2)无限制地接受饮用水中20％MRS溶液一周的实验组；3)用管饲法每两天给予500μl组合物两次的实验组。在处理结束后，用30mg/kg体重的戊巴比妥钠将动物麻醉并放在温暖的毯子(37℃)上，整个手术持续时间期间都在0.8-3％的异氟醚(isofluoran)麻醉下进行。通过正中线切口开腹，暴露远端空肠。将两段5厘米长的空肠段用手术线进行两端双结扎，从而形成间隔2cm的两个肠袢。在其中一个内注射600μl PBS作为对照，另一个注射600μl含有20μg毒素A的PBS。然后，将肠袢返回腹腔，缝合切口。让小鼠恢复并对它们连续追踪。4小时后，安乐处死动物，分离肠袢，并记录它们的重量与长度的比率(mg/cm)，用来评估液体分泌。接着用冰预冷的PBS洗涤肠袢两次，浸入RNAlaterTM中，在液氮中迅速冷冻后保存于-80℃。
结果艰难梭状芽孢杆菌感染可导致腹泻和大肠炎，多数发生于医院和家中的老年人患者，他们因服用抗生素而导致肠道小型生物群改变。为了评估本发明的组合物和其组分是否可以在体内中和毒素A的效应，使用了小鼠模型。为了模拟在人体引发艰难梭状芽孢杆菌感染的条件，将小鼠用抗生素处理一周，目的是改变它们的肠道小型生物群。在抗生素处理结束后1天，对一组小鼠无限制地给予20％的MRS溶液一周。在该期限结束时，形成肠袢并注射PBS或20μg毒素A。4小时的孵育后，对照小鼠的肠袢当注射毒素A时与注射PBS的肠袢相比显示增加的液体分泌(121.9±31.7vs.64.6±13.5mg/cm)。相比，在接受MRS一周的小鼠中，注射毒素A或PBS的肠袢中没有观察到液体分泌的差异(73.6±8.3vs.66.8±10.8mg/cm)。当用管饲法对小鼠施用2剂500μl的20％MRS溶液时，得到相似的结果。这些结果表明，用蛋白胨、肉膏和酵母提取物处理可以防止毒素A在表现出肠道小型生物群受损的受试者中的不利效应。
为了确定该组合物是否通过直接失活毒素A来发挥其保护作用，将20％MRS溶液或作为对照的PBS与毒素A混合1小时后将混合物注射到用抗生素处理一周的小鼠的肠袢中。对照(PBS)与MRS注射的肠袢之间在毒素A诱导的液体分泌水平上没有显著差异。此结果表明，所述组合物不是通过直接结合和失活毒素A来中和毒素A的作用，所述直接结合和失活可以导致毒素切割或者毒素结合表位的掩蔽。
讨论MRS组合物保护小鼠免于毒素A引起的肠液分泌。虽然不希望被理论束缚，但是我们相信蛋白胨、牛肉膏和酵母提取物的保护作用并不是因为切割毒素A的酶活性，有以下两个主要原因1)所用的溶液总是高压灭菌的，它将导致溶液中含有的任何酶(例如蛋白酶)的失活和2)在注射入小鼠的肠袢前与毒素A混合并孵育的该组合物不能抑制肠液分泌。因此，我们相信蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏的保护活性是因为该溶液存在游离分子(例如氨基酸或肽)，这些分子可以结合肠上皮细胞上的毒素A受体并防止毒素A的结合和激活相关的信号通路。
实施例3-组合物对COX-2表达的影响材料和方法用实施例2中描述的相同方法。从小鼠肠袢提取RNA，并通过RT-PCR评价COX-2 mRNA表达。用200U Supercript II酶逆转录总RNA(1μg)。用5’-CACAGTACACTACATCCTG ACC-3’作为正义引物，5’-TCCTCGCTTCTGATTCTGTCTTG-3’作为反义引物，扩增小鼠COX-2的400bp片段。用5’-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’作为正义引物，5’-ATGGATGACGATATCGCT-3’作为反义引物从相同的RT混合物扩增β-肌动蛋白的700bp片段作为内部对照。为了排除DNA污染，直接对RNA样品进行PCR。将PCR产物加入1％琼脂糖凝胶，照相，相片用于带强度的光密度定量。对内部对照β-肌动蛋白的表达进行归一化确定COX-2和对应的β-肌动蛋白mRNA信号的比值，并相对于“未处理样品”(给予水并注射PBS)的比值表达，对未处理样品分配分值1。
结果已知COX-2参与毒素A介导的液体分泌，为了确定COX-2是否也参与组合物的保护作用，通过RT-PCR评估COX-2 mRNA表达。由于不同的处理导致COX-2表达的改变相对于β-肌动蛋白表示。在对照小鼠的肠袢内注射20μg毒素A诱导COX-2 mRNA表达增加3.6倍。用该组合物处理小鼠一周导致毒素A引起的COX-2增加减小了一半。在蛋白胨或牛肉膏处理的情况下，毒素A诱导的肠COX-2表达完全正常化到基础水平，而在酵母提取物处理下，毒素A诱导的肠COX-2表达减小到1/2.3。该组合物或其组分都不能显著改变COX-2 mRNA表达的基础水平。当采用管饲法时，该组合物或它的组分也能抵消毒素A诱导的COX-2 mRNA增加。
讨论毒素A结合至上皮细胞后，它表现为引起炎症，包括嗜中性粒细胞迁移和肠细胞坏死以及绒毛的破坏。这些效应是感觉肠神经激活后感觉神经肽(如物质P和降钙素基因相关肽)的释放介导的。除了在NK-1R的肠上皮上表达外，SP的受体在感染艰难梭状芽孢杆菌的动物和人中显著增加。近期的研究还提出艰难梭状芽孢杆菌的毒素A上调肠内COX-2的表达。COX-2是环加氧酶的可诱导的同种型，它介导前列腺素E2(PGE2)(已知增加肠液分泌的物质)的合成，从而导致腹泻。尽管不希望被理论束缚，但是我们相信蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏抑制了这些途径的任一种，从而中和毒素A。我们的结果表明，蛋白胨、酵母提取物或牛肉膏抑制了肠的毒素介导的COX-2诱导。如果我们的溶液抑制或减少毒素与它的肠细胞受体的结合，那么所述抑制可以是由于毒素A介导的信号转导的抑制，其中所述信号转导导致COX-2激活。
权利要求
1.蛋白胨和/或肉膏的用途，用于生产用于治疗产肠毒素的病原体的感染效应的口服组合物。
2.权利要求1的用途，其中所述效应包括肠上皮完整性的破坏、腹泻和其他COX-2介导的效应。
3.权利要求1或2的用途，其中所述病原体是艰难梭菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌、杜氏利什曼原虫、霍乱弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌(Shingellae)、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、和/或产肠毒素的脆弱拟杆菌。
4.前述权利要求任一项的用途，其中所述口服组合物包含按体积计0.3％到7％的蛋白胨或肉膏。
5.前述权利要求任一项的用途，其中所述蛋白胨为乳清蛋白质的水解产物，其平均肽大小不超过5个氨基酸。
6.前述权利要求任一项的用途，其中所述口服组合物包含蛋白胨和肉膏。
7.权利要求6的用途，其中所述口服组合物包含按体积计0.3％到7％的肉膏和按体积计0.3％到7％的蛋白胨。
8.前述权利要求任一项的用途，其中所述口服组合物还包含酵母提取物。
9.权利要求8的用途，其中所述口服组合物包含按体积计0.01％到5％的酵母提取物。
10.前述权利要求任一项的用途，其中所述口服组合物是药物治疗的佐剂。
11.前述权利要求任一项的用途，其中所述口服组合物是婴儿配方或者肠组合物。
全文摘要
本发明涉及包含单独或者组合的肉膏和蛋白胨的口服组合物的用途，用于生产治疗病原细菌(例如艰难梭菌)引起的感染效应的口服组合物。此类效应可以包括肠上皮完整性的破坏、腹泻以及其他COX－2介导的效应。
文档编号A61K35/66GK1886144SQ200480035018
公开日2006年12月27日 申请日期2004年10月12日 优先权日2003年10月13日
发明者I·科尔蒂希杜拉, G·福特保罗斯, G·贝尔贡泽利 申请人:雀巢技术公司