专利名称：西拉美新在癌症治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及西拉美新在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
背景技术：
肿瘤细胞对传统治疗模式如传统的由半胱天冬酶介导的细胞程序死亡经常获得耐药性。因此，仍有很大的对癌症治疗用的新型有效药物的未能使人满足的需要。
众所周知，在代表许多不同类型癌症的细胞中，σ2受体被上调(Bem等人，1991，Cancer Res.51，6558；Vilner等人，1995，Cancer Res.55，408)，此外，σ2受体配体可抑制细胞增殖并诱导肿瘤细胞中的细胞程序死亡(Brent & Pang，1995，Eur.J.Pharmacol.278，151；Crawford &Bowen，2002，Cancer Res.62，313)。另外，已经表明σ2配体可能强化抗肿瘤药的活性(Crawford & Bowen，2002，Cancer Res.62，313)。
国际专利公开WO 92/22554描述了被认为可用于治疗多种精神和神经障碍的一系列σ受体配体。这些化合物的构效关系已经由Perregaard，J.等人在J.Med.Chem.，1995，38，11，1998-2008页作了进一步研究。
在众多的其它化合物中，WO 92/22554公开了化合物1′-[4-[1-(4-氟苯基)-1H-吲哚-3-基]-1-丁基]-螺[异苯并呋喃-1(3H)4′-哌啶](西拉美新)，其新的应用为本发明的主题。
现在我们意外地发现西拉美新的抗癌活性比所述参考σ2配体更显著有效。
发明内容
本发明提供用于治疗癌症的药物。
已知σ2受体配体诱导不同来源的癌细胞中的细胞程序死亡。我们现在意外地发现，当单独使用时，本发明的西拉美新比σ2活性参考化合物如氟哌啶醇在癌细胞中更有效地诱导细胞程序死亡。此外，当西拉美新与已知的化疗化合物如依托泊苷、多柔比星、星形孢菌素、长春新碱和他莫昔芬联合使用时，我们观察到显著的协同作用。因此，本发明证明西拉美新可用于生产用于治疗癌症的药物组合物，并且这种组合物可与其它的癌症化疗药物联合，和/或与放疗联合。当西拉美新与抗癌化疗药物联合使用时，药物可同时或顺序地给药。
在一个实施方案中，本发明涉及协同有效剂量的西拉美新或其可药用盐、连同化疗药物在制备上述药物组合物中的应用，所述药物组合物适于活性成分的同时给药。特别地，所述药物组合物可在同一单元剂型(如在同一片剂或胶囊)内包含活性成分。这种单元剂型可包含均一混合物形式的活性成分、或在单元剂型的分别的室中包含活性成分。
在另一个实施方案中，本发明涉及协同有效剂量的西拉美新或其可药用盐、连同化疗药物在制备上述药物组合物或药包中的应用，所述药物组合物或药包适于活性成分的顺序给药。特别地，所述药物组合物可包含离散单元剂型形式的活性成分，如包含活性成分中的任一种的离散片剂或胶囊。这些离散单元剂型可包含在相同的容器或包装中，如泡罩包装。
如本文中使用的，术语药包是指包含活性成分中每一种的药物组合物，但是为离散单元剂型形式的组合物。如本文中使用的，术语“协同有效剂量”是指当联合使用时，西拉美新和化疗剂的剂量提供协同作用，优选提供可得到的最大协同作用。
如上所述，本发明的药物组合物或药包可适于活性成分的同时给药或活性成分的顺序给药。
更具体地，本发明涉及具有以下通式的西拉美新或其可药用盐在制备用于治疗癌症的药物中的新用途
此外，本发明涉及治疗癌症的方法，包括对有需要的个体给药可药用量的西拉美新或其可药用盐。
本发明的另一个方面涉及治疗癌症的方法，包括对要用化疗剂治疗或正经历化疗剂治疗的个体给药西拉美新或其可药用盐。
根据本发明，化合物1′-[4-[1-(4-氟苯基)-1H-吲哚-3-基]-1-丁基]-螺[异苯并呋喃-1(3H)，4′-哌啶](西拉美新)的使用形式可以为化合物的碱形式、或其可药用酸加成盐的形式、或所述盐的无水物或水合物形式。用于本发明的化合物的盐为与无毒性的有机酸或无机酸形成的盐。示例性的这种有机盐为与马来酸、富马酸、苯甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、草酸、双-亚甲基水杨酸、甲磺酸、乙二磺酸、乙酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、肉桂酸、柠康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、衣康酸、羟基乙酸、对氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸和茶碱乙酸，以及8-卤代茶碱如8-溴茶碱形成的那些盐。示例性的所述无机盐为与盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、和硝酸形成的那些盐。优选地，化合物作为富马酸盐或盐酸盐使用。
1′-[4-[1-(4-氟苯基)-1H-吲哚-3-基]-1-丁基]-螺[异苯并呋喃-1(3H)，4′-哌啶]的富马酸盐可根据Perregaard，J.等人的J.Med.Chem.，1995，38，11，1998-2008(化合物14f)所述制备，可通过标准方法由其制备碱和其它可药用盐。
因此，本发明的酸加成盐可通过如下获得通过在惰性溶剂中用酸处理1′-[4-[1-(4-氟苯基)-1H-吲哚-3-基]-1-丁基]-螺[异苯并呋喃-1(3H)，4′-哌啶]，随后通过已知方法进行沉淀、分离并任选进行重结晶，并且如果需要，通过湿法或干法研磨或另外适当的方法将结晶产物微粉化，或从溶剂-乳化方法制备粒子。
优选盐的沉淀在惰性溶剂中进行，如惰性极性溶剂如醇(如乙醇、2-丙醇和正丙醇)。
根据本发明，1′-[4-[1-(4-氟苯基)-1H-吲哚-3-基]-1-丁基]-螺[异苯并呋喃-1(3H)，4′-哌啶]或其可药用盐可以任何适当的方式给药，如口服或非肠道给药，并且其可作为用于所述给药的任何适当的形式存在，如为片剂、胶囊、粉末、糖浆剂、或注射用溶液或分散液的形式。优选地，根据本发明的目的，本发明的化合物以固体药物实体的形式(以片剂或胶囊为宜)给药，或以注射用悬浮液、溶液、或分散液的形式给药。
制备固体药物制剂的方法为本领域公知的。因此，可通过将活性成分与普通的助剂和/或稀释剂混合，并且随后在适宜的压片机中压缩混合物而制备片剂。助剂或稀释剂的例子包括玉米淀粉、乳糖、滑石、硬脂酸镁、明胶、乳糖、树胶等等。也可使用任何其它的助剂或添加剂如着色剂、芳香剂、防腐剂等，条件是它们与活性成分相容。
如本文中使用的，术语“组合物”是指包括含特定量的特定成分的产品，以及直接或间接得自特定量的特定成分的组合的任何产品。
包含活性成分的药物组合物可为适于口服使用的形式，例如为片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、可分散性粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。口服用组合物可根据本领域中已知用于生产药物组合物的任何方法制备，并且这种组合物可包含一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂，以提供药学上美观、可口的制剂。片剂包含与适于生产片剂的无毒性可药用赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可为例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，如微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、玉米淀粉或海藻酸；粘结剂，如淀粉、明胶、聚乙烯-吡咯烷酮或阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
本发明的组合物可用于治疗哺乳动物的癌症，优选治疗人的癌症。
本发明使用的西拉美新或其盐最方便地以单元剂型如片剂或胶囊的形式口服给药，所述单元剂型包含约0.01μg/kg体重/天到100mg/kg体重/天，优选0.01μg/kg体重/天到30mg/kg体重/天，最优选为0.5mg/天/kg体重到7.0mg/天/kg体重的活性成分(以游离形式计算)。
当西拉美新与其它化合物联合以便获得增加的疗效、或为了使用低于正常剂量的其它化合物以使副作用最小化时，则可以使用低于正常剂量的西拉美新和/或其它化合物用于治疗。对患者特定剂量的计算为本领域技术人员的常规实践。
本发明提供的药物组合物和方法特别地被认为可用于癌症的治疗，癌症包括实体瘤如皮肤癌、乳癌、脑癌、宫颈癌、睾丸癌、等等。更具体地，可通过本发明的化合物、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于心脏肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺的支气管原性癌(鳞状上皮细胞癌、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌、腺癌)、肺泡(支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠道食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(胰管腺癌、胰岛瘤、胰升血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、纤维神经瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道肾(腺癌、韦母氏瘤[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝脏肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞性腺瘤、血管瘤；骨骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生性骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统颅(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、变形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性恶性胶质瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、成视网膜细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓纤维神经瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科子宫(子宫内膜癌)、宫颈(宫颈癌、肿瘤前子宫颈非典型增生)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌]、粒膜-鞘细胞瘤、塞-莱二氏细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄样肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)；血液学血液(骨髓性白血病[急性和慢性]、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良综合征)、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、胎块发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣；和肾上腺成神经细胞瘤。
因此，本文中提供的术语“癌细胞”包括受以上所指状况中任一种折磨的细胞，术语“癌症”包括但不限于以上所指状况中的任一种。任何上述状况被认为是单一的实施方案，因此，当使用术语癌症时，用于治疗每种状况的组合物被单独要求保护并被包括在要求保护的组中。
当与西拉美新、药物组合物、药包、治疗方法的用途有关而提及上述癌症适应症中的任一种时，其被认为是单独的实施方案。因此，上述特别说明的每种适应症可各自地与所述西拉美新的用途、药物组合物、药包、治疗方法和鉴定可用于治疗应用的化合物的方法一起要求保护。
实验程序细胞培养鼠纤维肉瘤细胞WEHI-S、Wn902、Wn912、和WEHI-R4分别为正常细胞、媒介物对照细胞、Hsp70过度表达细胞、和hTNF耐受细胞。试验的其它细胞型包括人乳癌细胞型MCF7-S1和MDA-MB-468、和非致瘤性永生化乳房上皮细胞HBL100。MCF7casp3.1和-3.3以及neo2为表达半胱天冬酶3和媒介物的单细胞克隆。MCF7pCEP、-Bcl2WT、-Bcl2 NT、-Bcl2 Acta、和-Bcl2 Cb5为表达媒介物、野生型Bcl2、胞质定位型Bcl2、线粒体定位型Bcl2、和ER定位型Bcl2的单细胞克隆(Maria Hyer Hansen，Apoptosis Laboratory，Danish Cancer Society)。人成神经细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞(ATCC，USA)。另外，试验了人宫颈癌细胞系HeLa(由Dr.J.Lukas，Danish Cancer Society友情提供的)和ME180。还试验了HEK293-A前列腺癌细胞系PC3、和非致瘤性永生化前列腺上皮细胞系PNT1A。非转化NIH3T3鼠成纤维细胞由C.Holmberg(University of Copenhagen，Denmark)友情提供。将成纤维细胞如(Fehrenbacher等人，2004)所述用pBabe-puro mock、-SV40LT、-v-Ha-ras、-c-src转导。将细胞在37℃下在具有5％CO2的湿润空气气氛中，在补充有10％热灭活的小牛血清(Biological Industries，BeitHaemek，Israel)、0,1mM非必需氨基酸(Invitrogen)、和抗生素的DMEM(Invitrogen，Paisly，UK)中繁殖、或在补充有6％热灭活的小牛血清和抗生素的RPMI-1640(Invitrogen)中繁殖。对细胞重复进行试验并通过hoecsht染色(H-33342，Molecular Probes，Eugene，OR)发现支原体为阴性的。
西拉美新与细胞膜或组织膜的结合使用现有技术的Sby，K.等人在Neuropharmacol.，2002，43，95-100中所述的[3H]Lu 28-179(西拉美新)结合试验，证明从如上所述的细胞系制备的组织或啮齿动物或人组织上的西拉美新敏感性结合位点的存在。简单地说，将细胞如所述方式培养，使用细胞刮器(cell scraber)在用磷酸盐缓冲的盐水中收获并离心(1000xg，10min)。将得到的小球用于Sby等人在2002中所述[3H]Lu 28-179结合试验。
细胞程序死亡刺激物试验了以下细胞程序死亡刺激物西拉美新(Lu-28-179)、西拉美新类似物28131M、28134M、29288O、32160F、32124C、和32168F、及氟哌啶醇(H.Lundbeck A/S，Copenhagen，Denmark)，人TNF-α(Strathmann Biotech Gmbh，Germany)、毒胡萝卜素(thapsigargin)、依托泊苷、多柔比星、星形孢菌素、长春新碱、他莫昔芬(SIGMA-Aldrich，St Louis，MO)、concanamycin A(Alexis Biochemicals，San Diego，CA)。
药理学抑制剂和药物使用了以下蛋白酶抑制剂zVAD-fmk、DEVD-fmk(BachemBubendorf，Switzerland)、DEVD-CHO(Neosystems，Strasbourg，France)、LEHD-CHO、zFA-fmk(Enzyme System Products，Livermore，CA)、CA-074-Me(Peptides International，Louisville，KY)、APC11138(Celera Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)、胃酶抑素A、PD150606、和钙蛋白酶抑制剂I(CI)(Calbiochem，La Jolla，CA)、TPCK(Boehringer Mannheim)、pefabloc(AEBSF)(Roche Diagnostics，DK)。
使用了以下抗氧化剂丁基化羟基茴香醚(BHA)、α-生育酚、γ-生育酚、谷胱甘肽乙酯(GSH)、N-乙酰基-半胱氨酸(NAC)(SIGMA-Aldrich，St Louis，MO)。将细胞与抑制剂和抗氧化剂在药物之前预培养1小时。
另外，试验了以下药物对西拉美新细胞毒性的影响σ2受体拮抗剂BD1047(Tocris)和AC927(由W.Bowen赠送，Brown University，USA)、3-甲基腺嘌呤、放线菌素D、环己酰胺和胆固醇。
细胞死亡的检测细胞存活率使用MTT还原试验测量细胞存活率。使用Versamax微量板读出器(Molecular Devices)通过在570nm的吸收进行分光光度法分析，评价四唑盐3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四钠溴化物(MTT，SIGMA-Aldrich)到显蓝色的甲产物的转化。存活率测定为未经处理的细胞或用抑制剂处理的细胞的百分比将细胞接种在包含200μL介质的96-孔板上，在第二天用药物处理。在加入药物之后的24-60小时，通过除去100μL介质并加入25μL MTT溶液(1mg/mL，在PBS中，经过无菌过滤)评价对细胞存活率的影响。在37℃中在暗处培养3小时之后，将细胞用100μL的增溶缓冲剂(20％SDS，在50％二甲基甲酰胺溶液中)进行浸透处理并在第二天在分光光度计上进行分析。
细胞死亡和细胞毒性使用乳酸脱氢酶(LDH)释放试验(Roche，Mannheim，Germany)评价细胞死亡和细胞毒性。质膜破裂(将胞质中的LDH释放到培养介质中)是测量细胞毒性或细胞溶解的方法。通过四唑盐(黄色)到甲盐(红色)的转化，用分光光度法测量LDH引起从乳酸盐氧化为丙酮酸盐和从NAD+还原为NADH+H+的酶促活性。将细胞接种并如MTT法中所述进行处理。在分析时，取出50μL介质并将其与50μL反应缓冲液混合。除去剩余的介质并将细胞在37℃下在1％Triton X-100中进行细胞溶解20分钟。又测量了细胞溶胞产物中的LDH含量，并如下计算LDH释放％的估计值细胞毒性(LDH释放％)＝LDH介质中/(LDH介质中+LDH溶胞产物中)×100％核凝聚通过核凝聚类型评价、并通过对经药物处理的细胞进行hoechst染色(细胞可渗透型Hoechst 33342，SIGMA-Aldrich)进行细胞死亡模式。使用细胞不可渗透型Sytox Green(Molecular Probes)分析膜完整性的丧失并与用Hoechst时所观察到的核形态学变化相比较。将细胞与25mg/mL hoechst的10.000x稀释物和/或5mM sytox green的10.000x稀释物在37℃下培养5分钟，然后使用倒置Olympus显微镜IX-70分析核凝聚的类型和可能的共同染色。
凝胶电泳检测DNA梯(DNA laddering)收获细胞并将其在120μL溶胞缓冲液(100mM NaCl、100mMTris-HCl(pH 8.0)、25mM EDTA、0,5％SDS和100μg/mL蛋白酶K)中在50℃下培养过夜。将样品用6M NaCl沉淀并在4℃下以13,000rpm离心5分钟。随后通过2.5体积的96％乙醇从上清液沉淀基因组DNA。在4℃下以20.000rpm离心10分钟并用70％乙醇漂洗之后，将小球溶解于包含1μg/mL核糖核酸酶A的10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mMEDTA中。将样品在37℃下培养1.5小时并从在260nm处的吸光度(A)估算DNA浓度。将DNA(5μg/泳道)在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳并通过溴化乙锭染色进行直观分析。
半胱天冬酶和组织蛋白酶活性为了测量胞质半胱氨酸组织蛋白酶的酶活性，将接种在24-孔板中的近汇合(subconfluent)的细胞在冰上用包含20μg/mL洋地黄皂苷的提取缓冲液(250mM蔗糖、20mM HEPES、10mM KCI、1,5mMMgCl2、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM pefablock；pH7,5))处理12-15分钟。为了测量总的细胞半胱氨酸组织蛋白酶酶活性，将细胞在冰上用包含200μg/mL洋地黄皂苷的上述提取缓冲液处理12-15分钟。为了分析半胱天冬酶3/7样活性，将近汇合的细胞在冰上用半胱天冬酶提取缓冲液(0,5％Triton X-100、25mM HEPES、5mM Mg2Cl、1mMEGTA、1mM pefablock、pH7,5)处理20分钟。通过分别加入一体积的在半胱天冬酶反应缓冲液(100mM HEPES、20％甘油、0,5mMEDTA、0,1％CHAPS、5mM DTT、1mM pefablock、pH7,5)中的20μM Ac-DEVD-AFC(Biomol)、或在组织蛋白酶反应缓冲液(50mM乙酸钠、4mM EDTA、8mM DTT、1mM pefablock、pH6.0)中的20μMzFR-AFC(Enzyme System Products)，估算半胱天冬酶3/7样活性和半胱氨酸组织蛋白酶活性。在20分钟内使用Spectramax Gemini荧光计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在30℃分析AFC的释出Vmax(激发波长400nm，发射波长489nm)。
溶酶体稳定性分析，细胞培养物将细胞暴露于在酸性室中聚集的亲溶酶体(lysomotropic)弱碱和异染性荧光染料吖啶橙(AO，Molecular Probes)下。当在酸性溶酶体中高度浓缩时，AO表现出红色荧光，但是在胞质中再定位时表现出绿色荧光。为了监视溶酶体的完整性，使近汇合的用药物处理的细胞接触37℃的0.1-0.5μg/mL的AO，持续3小时。细胞使用倒置的Olympus显微镜IX-70评价或将细胞与基质分开并用具有488nm输出波长的氩离子激光器和CELLQuest分析软件的FACSort(Becton Dickinson，SanJose，CA)通过流式细胞计进行分析。
溶酶体稳定性体外试验对接种在14cm板中的MCF-7细胞加载铁-右旋糖苷(Fe-dextran)，持续9小时，随后进行培养介质中的16小时清除。随后，将细胞在PBS中洗涤并与基质分开。将细胞小球再悬浮在SCA缓冲液(20mM Hepes KOH、10mM KCl、1.5mM Mg2Cl、1mM EDTA、1mMEGTA、250mM蔗糖、pH 7.5)中并在冰上平衡20分钟。通过使用Teflon研杵的150-200个冲程将细胞小球均质化。以750g离心5分钟之后，分离上清液并重复离心步骤。将剩余的上清液转移到包含在磁场中的柱中。将溶酶体级分洗涤两次并从柱上洗脱。随后如用于组织蛋白酶活性测量中所述的，在黑色costar 96孔板中的25μL溶酶体溶液中测量溶酶体组织蛋白酶的释放。在37℃反应1.5小时之后，在30℃使用Spectramax Gemini荧光计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在20分钟内分析AFC释出的Vmax。
免疫印迹分析和免疫荧光使用的一级抗体包括小鼠单克隆抗体，其针对组织蛋白酶B(Oncogene Research Products，Boston，MA)、组织蛋白酶L(Transduction Laboratories，Lexington，KY)、细胞色素c(BDPharmingen)、和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，Biogenesis，Poole，UK)、Hsp70(2H9；由Boris Margulis友情提供，St.Petersbrug，Russia)和兔多克隆组织蛋白酶D(DAKO corporation，CA)、和AIF(apoptosislab，Danish Cancer Research)。对于免疫印迹分析，通过6-12％SDS-PAGE分离蛋白质并转移到硝化纤维素膜。在室温下1小时或4℃下过夜的一级抗体培养之后，将印迹在室温下与二级辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠或抗兔IgG抗体培养1小时。使用ECL或ECLplus(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，England)进行随后的蛋白质检测。
为了使组织蛋白酶、AIF、和cyt C直观化，将细胞固定并在25℃下用-20℃的甲醇渗透处理10分钟。在用5％的山羊血清(在PBS中的1％BSA、0,3％Triton X-100中)预封闭20分钟之后，如所述将细胞与一级抗体(在PBS中的0,25％BSA、0,1％Triton X-100中)培养1.5小时。在与二级抗体Alexa Fluor-488或-546-偶联的抗小鼠IgG或抗兔IgG(Molecular Probes)培养1小时之后，将细胞在PBS中的0,05％Tween20中洗涤三次并使用ProLong Antifade Kit(Molecular Probes)固定。用LSM 510软件，使用Zeiss Axiovert 100M显微镜进行共焦分析。
体内实验将WEHI-R4细胞(5×106)皮下植入免疫活性雌性BALB/c小鼠的背中。在肿瘤植入前两天开始西拉美新处理。将小鼠分组(5-9只/组)并每周7天经口给药200μL的以下物质1)介质(0,5％甲基纤维素15，在0.9％NaCl溶液中)；2)100mg/kg/天的悬浮液形式的西拉美新(在0.5％甲基纤维素15(在0.9％NaCl溶液中)中)。对于联合给药的体内试验，将50mg/kg西拉美新(每周7天)与最多30mg/kg单剂量的依托泊苷(i.p.，在第一天给药)联合给药。使用卡尺估算肿瘤体积。在处死小鼠前的14-21天内监视药物对肿瘤生长的作用。
结果在经过培养的不同来源的肿瘤细胞系中，包括来源于前列腺、乳房和宫颈的肿瘤的细胞系中，西拉美新以剂量依赖性的方式有效地诱导细胞程序死亡。细胞对西拉美新的敏感性当通过ras或src致癌性转化时增加，表明西拉美新具有癌症药物所需的选择性地作用于癌细胞而发挥其作用而对正常细胞只有有限影响的能力。
此外，当在WEHI-S和MCF7细胞中相对于参考σ配体如氟哌啶醇和喷他佐辛进行试验时，西拉美新为比氟哌啶醇和喷他佐辛显著地更有效的细胞程序死亡诱导物。
基于死亡过程中的核形态学变化、不存在药理学半胱天冬酶抑制剂的保护、和不存在效应器半胱天冬酶活化，由西拉美新诱导的死亡模式与半胱天冬酶无关。相反，在实施死亡过程中似乎涉及溶酶体组织蛋白酶向胞质中的释放。这个发现基于溶酶体组织蛋白酶B和L的免疫组织化学染色，以及在组织蛋白酶从经过纯化的溶酶体的体外释放。此外，使用组织蛋白酶的药理学抑制剂可以削弱由西拉美新诱导的死亡。
通过Bcl-2的异位表达被保护从而对抗大多数其它抗癌药物的肿瘤细胞被西拉美新有效地杀死。
尽管一些化疗活化p53依赖性死亡途径，但是西拉美新不活化p53。这表明，该死亡途径显著不同于由DNA损伤剂(例如依托泊苷)诱导的死亡途径，这个结果支持了西拉美新表现出广泛的癌症适应症范围的数据，因为在癌症中p53依赖性死亡途径经常受到危害。这进一步得到了上述的由西拉美新诱导的肿瘤细胞死亡没有被Bcl-2抑制的现察结果的支持。
重要地是，西拉美新在体内被很好地耐受，并且在BALB/c小鼠中的同源肿瘤异种移植模型中表现出抗肿瘤发生作用。另外，与分别地用西拉美新和依托泊苷单独处理的组相比，在体内观察到西拉美新和依托泊苷的联合作用。此外，西拉美新与依托泊苷、多柔比星、星形孢菌素、长春新碱和他莫昔芬以协同作用的方式起作用，诱导WEHI-S细胞中的细胞死亡。这些结果表明，西拉美新为新的抗癌药物，其与其它参考σ配体相比特别有效，并且其可单独使用或与常规的化疗剂联合使用，用于治疗癌症。
权利要求
1.西拉美新或其可药用盐在制备用于治疗癌症的药物组合物中的应用。
2.西拉美新或其可药用盐在制备可用于在癌症治疗中增大和/或提供增强的化疗剂作用的药物组合物中的应用。
3.西拉美新或其可药用盐在制备用于在癌症治疗中与化疗剂联合使用的药物组合物中的应用。
4.西拉美新或其可药用盐在制备用于治疗癌症的药物组合物中的应用，其中所述药物组合物进一步包括另一化疗剂。
5.权利要求1-4中任一项的应用，其中癌症选自肺癌、前列腺癌、乳癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、白血病、骨髓癌或皮肤癌。
6.权利要求2-4中任一项的应用，其中化疗化合物选自依托泊苷、多柔比星、星形孢菌素、长春新碱、和他莫昔芬、或其可药用盐。
7.权利要求1-6中任一项的应用，其中所述癌症的治疗与放疗结合。
8.权利要求1-7中任一项的应用，其中西拉美新作为富马酸盐或盐酸盐的形式使用。
9.药物组合物，其包括西拉美新或其可药用盐、和任选的可药用载体或稀释剂。
10.药物组合物，其包括西拉美新或其可药用盐和化疗剂、和任选的可药用载体或稀释剂。
11.药包，其包括西拉美新或其可药用盐和化疗剂、和任选的可药用载体或稀释剂。
12.治疗癌症的方法，其包括对所述患者给药有效量的西拉美新或其可药用盐。
13.权利要求12的方法，其中癌症选自肺癌、前列腺癌、乳癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、白血病、骨髓癌或皮肤癌。
全文摘要
本发明涉及癌症的治疗。本发明特别提供用于治疗癌症的包括西拉美新的药物组合物。本发明进一步提供治疗方法，其包括对患有癌症的患者给药西拉美新。
文档编号A61K31/135GK1893947SQ200480037283
公开日2007年1月10日 申请日期2004年12月17日 优先权日2003年12月19日
发明者C·汤森, M·莱斯特, M·亚特拉, M·S·安德森 申请人:H·隆德贝克有限公司