专利名称：利用鉴定纤维样变性治疗中使用的化合物的ctgf和trka受体的筛选方法
该要求保护的发明涉及鉴定和/或制备用于减少和/或防止纤维变性的化合物的方法。本发明还涉及用于降低和/或防止纤维变性的化合物和该化合物的用途。
当生物学组织损伤时，损伤和相关的炎症反应都可引起细胞死亡。当细胞死亡发生时，合成新组织代替死亡的或垂死的细胞。新组织的合成可分成两种类型，特化细胞的再生和结缔组织的增加。在一些病理情况下，结缔组织的增加在愈合过程中占优势，导致形成纤维变性组织。在纤维变性中，新组织修复组织中的任何结构缺损，但是由结缔组织和结缔组织生产细胞取代特化细胞损害了其自身的功能。
纤维变性是否发生，或者实际纤维变性的程度，受到各种因素的影响，包括待愈合的损伤的性质，严重性和位置。纤维变性最常见的是皮肤表面的瘢痕，除了大面积的瘢痕形成外，它是相对不令人讨厌的。然而，纤维变性也可在诸如肝脏，肺和肾的内部器官的组织中发生。在大多数情况下，最严重的是在这些区域的纤维变性，因为该器官的特化活性受到损害。在最极端的情况中，由于该损害可出现器官衰竭或死亡。
纤维变性在疾病状态中的重要性的一个例子可通过在糖尿病，即在全世界现在达到流行比例的一种疾病中出现的肾纤维变性(糖尿病性肾病)来证实。
糖尿病的发病率在最近几年经历了一个全球性的增长。特别是它归功于2型糖尿病(晚期发作(late-onset)的糖尿病)的显著增长(Silink M(2002)，Horm.Res.57(Suppl 1)第1-5页)。糖尿病与许多继发型并发症，特别是微血管相关性并发症密切联系。这些并发症，包括纤维变性情况的肾病，通常在糖尿病开始后的许多年形成。
糖尿病性肾病的特征在于细胞外基质蛋白质在肾小球膜和肾小球基底膜中和在小管间质中细胞外基质蛋白的过多沉积。
在确定糖尿病性肾病(DN)易感性中认为遗传背景是重要的(Quinn M等，(1996)Diabetologica 39第940-945页)，但是据信关键性起动因素是组织暴露于慢性高血糖中(UKPDS Group，(1998)Lancet352，第837-853页)。肾病的流行随地理位置，糖尿病类型，和诊断后时间的长度而变化。尽管有影响因素，但是预期糖尿病性肾病的流行在前十年中会增长(Bagust A等，(2002)Diabetes Med19(Suppl4)第1-5页)。糖尿病性肾病是末期肾病的主要原因，且需要新的治疗方法来限制其发展。
糖尿病性肾病的病理学在1和2型糖尿病中相似。两种类型的糖尿病都与肾小球中存在的相似超微结构改变相关联(Osterby R，(1992)Diabetologica 35第803-812页)。肾小球基膜厚度增加，且肾小球膜细胞外基质扩张。
据认为是糖尿病性肾病中肾功能下降的主要原因是肾小球膜扩张(Steffes M等(1989)Diabetes 38第1077-1081页)。由于肾小球膜基质扩张，影响肾小球毛细血管，减少了可用于过滤的表面并变窄或阻塞管腔。除了肾小球硬化症外，小管间质纤维变性也在糖尿病性肾病中发生。肾功能的进行性丧失与其它肾病中出现的进行性间质纤维变性相关联(Risdon R等，(1968)Lancet2 7564第363-366页)。
纤维变性疾病通常与生长因子和激素的不平衡相关联，后者又接着影响蛋白质表达的产量。异常蛋白质表达接着又导致纤维变性形成。例如，纤维变性通常受到纤维变性组织中存在的转化生长因子-β的增加的影响。
纤维变性是无有效疗法的最大疾病群体之一，部分原因是这些疾病的机制受到各种因素的影响且准确的细胞机制未被阐明。因此，对纤维变性或其可提供的靶的分子靶特性缺乏了解，而围绕该靶可作为抗纤维变性疗法的基础。
对于糖尿病性肾病，研究表明葡萄糖可至少部分通过转化生长因子-β(TGF-β)的作用诱导基质合成(Ziyadeh F等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA97第8015-8020页)。
然而，TGF-β具有许多生理学作用，包括涉及免疫和上皮增生(McCartney-Francis N等，(1998)Int.Rev.Immunol.16第553-580页)。这些变化的生理学作用意味着TGF-β不可能是临床上有利的靶。抑制TGF-β的作用可能对生物体具有多种影响，引起不需要的和潜在的严重副作用。
转化生长因子-β通过直接诱导胶原蛋白和基质合成引起纤维变性。另外，TGF-β也能诱导参与和/或影响该途径的其它分子的表达引起纤维变性。一个该蛋白是结缔组织生长因子(CTGF)，它诱导增生，胶原蛋白合成和间充质细胞的趋化性(Moussad E等，(2000)Molec Genet Metab.71第276-292页)。CTGF(CCN2)是具有多个结构域的38kDa的分泌蛋白质，它由立即早期基因编码且是CCN蛋白质家族的一个成员(Bork等，(1993)Febs Lett.327第125-130页；Perbal等，(2001)Mol.Pathol.54第57-79页)。然而，其发挥功能的分子机制尚未充分阐明。CTGF中存在多个结构域表明它与多个其它因子相互作用。已表明CTGF通过其von Willebrand型C结构域直接结合BMP4和TGF-β，导致抑制BMP和增强TGF-β信号传导(Abreu等，(2002)Nat.Cell.Biol.4第599-604页)。
已表明CTGF结合整联蛋白(Babic等，(1999)Mol.Cell Biol.19第3811-3815页)且有可能该相互作用在介导CTGF诱导的一些细胞现象中是重要的。
CTGF在包括糖尿病性肾病的各种纤维变性疾病中过量表达(Wahab N等，(2001)Biochem J 359第77-87页)。事实上，已表明CTGF表达水平增加与糖尿病性肾病的严重性和进行速度增加相关联(Ito Y等，(1998)KidneyInt.53第853-886页)。
因此，CTGF可以是潜在有用的纤维变性反应的分子指标。尚未证实CTGF直接诱导体内肾纤维变性，但是，当与TGF-β一起皮下注射时，在大鼠中诱导持续皮肤纤维化(Mori T等(1999)J.Cell.Physiol.181第153-159页)。
在本发明的形成过程中，本发明人证实了CTGF与细胞受体，即TrkA受体相互作用，以诱导与纤维变性形成相关的细胞内信号传导级联。
有三种Trk受体酪氨酸激酶基因(TrkA，TrkB和TrkC)。与其配体结合时，Trk受体二聚化并自身磷酸化，导致包括Ras，Rap-1，和Cdc 42-Rac-Rho家族的一些小G蛋白，以及受MAP激酶，PI3-激酶，和磷脂酶C-γ(PLCγ)调节的途径活化(Segal，2003)。活化的Trk受体也可与各种细胞质衔接(adaptor)蛋白直接或间接相互作用以产生许多生物学反应，包括，细胞增殖和存活；轴突和树突生长，和改型；细胞骨架的装配和改型；膜运输和融合；和突触的形成，功能，和可塑性(Huang E和Reichardt L，(2003)Annu.Rev.Biochem.72第609-642页)。
在实施例中描述的本发明人的工作证实了Trk酪氨酸激酶活性是涉及纤维变性的细胞内信号分子的CTGF-依赖型诱导所必需的。该工作导致形成了鉴定和制备可与CTGF受体和/或CTGF受体激动剂(agonist)相互作用以减少或防止纤维变性的化合物的方法。
因此，在本发明的一个方面提供了一种鉴定和/或制备用于减少和/或防止纤维变性的化合物的方法，包括步骤(a)提供CTGF受体(b)提供试验样品(c)提供CTGF受体激动剂(d)将CTGF受体与试验样品接触(e)随后或同时将CTGF受体与CTGF受体激动剂接触(f)检测和/或测量CTGF受体的活化量(g)比较存在试验样品时CTGF受体活化量与不存在试验样品时检测和/或测量的CTGF受体活化量(h)根据其不导致CTGF受体活化增加或减少来确定化合物是否降低和/或防止纤维变性。
对于“CTGF受体激动剂”，我们是指作用于CTGF受体以产生和CTGF与该受体相互作用产生的效果基本上相同的效果的化合物。我们还包含能够产生和CTGF与CTGF受体的相互作用基本上相同的效果的CTGF受体激动剂的衍生物，类似物和片断。非CTGF本身的CTGF受体激动剂使用实施例1提供的方法通过测量和/或检测CTGF受体自身磷酸化，受体诱导的蛋白质磷酸化和TIEG表达可容易地鉴定。
对于“衍生物”，我们是指还具有对一个或多个其氨基酸侧链基团，α-碳原子，末端氨基，或末端羧酸基团的至少一种化学修饰的CTGF受体激动剂化合物。化学修饰包括添加化学基团，产生新键，和去掉化学基团。在氨基酸侧链基团上的修饰包括赖氨酸e-氨基的酰化，精氨酸，组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺。末端氨基的修饰包括脱氨基，N-低级烷基，N-双低级烷基，和N-酰基修饰。末端羧基的修饰包括酰胺，低级烷基酰胺，二烷基酰胺，和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4的烷基。另外，通过蛋白质化学领域的普通技术人员已知的保护基团可保护一个或多个侧链基团，或末端基团。氨基酸的α-碳可以被单或双甲基化。
对于“类似物”，我们是指具有包括一个或多个氨基酸取代，缺失，倒置，或添加的修饰且能够产生与CTGF与受体相互作用产生的效果基本上相同的效果的CTGF受体激动剂。
对于“片断”，我们是指能够产生与CTGF与受体相互作用产生的效果基本上相同的效果的CTGF受体激动剂的一部分。
任选该方法还包含分离能够减少和/或防止纤维变性的化合物的步骤。然后该分离的化合物任选可配制成还包含药用上可接受的载体，赋形剂和/或稀释剂的组合物。
优选的是，通过检测和/或测量至少一种下列活性来检测和/或测量CTGF受体活化CTGF受体自身磷酸化，CTGF受体诱导的蛋白质磷酸化或CTGF诱导的TIEG表达。测量这些活性的典型方法在实施例1和2中提供。
优选的是CTGF受体激动剂是CTGF。
优选的是CTGF受体是TrkA受体。
合适的是该化合物直接影响CTGF受体与其激动剂之间的相互作用。换句话说，该化合物与CTGF受体或其激动剂直接相互作用以减少CTGF受体的活化。
另外，该化合物可间接影响CTGF受体与其激动剂之间的相互作用。换句话说，该化合物通过至少一种其它化合物与CTGF受体或其激动剂间接相互作用以减少CTGF受体的活化。
合适的是，通过上述方法鉴定和/或制备的化合物是酪氨酸激酶的拮抗剂。
对于“拮抗剂”，我们是指作用于CTGF受体以抑制和/或防止CTGF或CTGF受体激动剂与该受体相互作用产生的作用的化合物。我们还包括能够防止和/或抑制CTGF和/或CTGF受体激动剂与CTGF受体相互作用产生的作用的CTGF受体拮抗剂的衍生物，类似物和片断。使用实施例1提供的方法通过测量和/或检测CTGF受体自身磷酸化，受体诱导的蛋白质磷酸化和TIEG表达可容易地鉴定CTGF受体拮抗剂。
在本发明的第二个方面，提供了一种用于减少和/或防止纤维变性的化合物，其特征在于它抑制和/或防止CTGF受体活化；且更优选的是抑制和/或防止至少一种下列活性CTGF受体自身磷酸化；CTGF受体诱导的蛋白质磷酸化；和/或TIEG的诱导。
优选的是通过本发明第一个方面的方法鉴定和/或制备该化合物。
合适的是，该化合物是选自多肽，抗体分子和反义核苷酸的至少一种。优选的是，该化合物是抗体分子。
术语“抗体分子”用于指任何一种抗体，抗体片断，或抗体衍生物。它打算包含野生型抗体，合成抗体，重组抗体或抗体杂合体，例如，但不限于，免疫球蛋白轻链和/或重链可变和/或恒定区的噬菌体展示产生的单链修饰的抗体分子，或在本领域的技术人员已知的免疫测定方式中能够与抗原结合的其它免疫活性分子。
术语“抗体衍生物”是指在本领域的技术人员已知的免疫测定方式中能够与抗原结合的任何修饰的抗体分子，例如抗体的片断(例如Fab或Fv片断)，或者通过添加一个或多个氨基酸或其它分子以帮助将抗体偶连到另一肽或多肽，大型载体蛋白或固相支持物上(例如，氨基酸酪氨酸，赖氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸及其衍生物，NH2-乙酰基团或COOH-末端氨基基团，等等)进行修饰的修饰抗体分子。
对于“反义寡核苷酸”，我们是指能够与互补核酸序列特异性结合的单链核酸。通过与合适的靶序列结合，形成RNA-RNA，DNA-DNA，或RNA-DNA双链。这些核酸通常称为“反义”，因为它们与该基因的有义或编码链互补。最近，证实了寡核苷酸与DNA双链结合时形成三螺旋是可能的。发现了寡核苷酸可识别DNA双螺旋大沟中的序列。从而形成三螺旋。这表明可以合成通过识别大沟氢结合位点特异性结合双链DNA的序列特异性分子。
通过与靶核酸结合，上述寡核苷酸可抑制靶核酸的功能。这可能是例如，抑制转录，加工，poly(A)添加，复制，翻译，或者促进细胞的抑制机制，例如促进RNA降解的结果。
反义寡核苷酸可在实验室制备，然后通过例如，显微注射或从细胞培养基吸收进细胞中导入细胞，或者可用携带反义基因的质粒或逆转录病毒或其它载体转染后在细胞中表达它们。
或者，该化合物是酪氨酸激酶受体抑制剂。优选的是，该酪氨酸激酶抑制剂选自BSF-466895，AP-23451，AP-23464，AP-23485，AZD-0530，AP-22408，RG-13022，RG-13291，RG-14620，RP53801，CEP-075，CEP-2563，二氢氯化物，CHIR-200131，CHIR-258，c-jun激酶，KST-638，KF-250706，MNAC-13，抗-EphA2Mabs，MLN-608，AG-957，薰草菌素A类似物，NSC-330507，NSC-680410，苯丙氨酸衍生物，SH2抑制剂，AG-1295，EGF-染料木黄酮，制表菌素，染料木黄酮，neuT Mab，PP1，TT-232，CGP-52411，CGP-53716，CGP-57148，imatinib，NVP-AAK980-NX，NV-50，phenoxodiol，FAK抑制剂，IGF-1，Met受体抑制剂，TIE-2抑制剂，CP-564959，PN-355，CP-127374，FCE-26806，FGFR-3抑制剂，Met RTK拮抗剂，PD-171026，PD-173956，PD-180970，Src非-RTK拮抗剂，kahalalide F，CCX2，南蛇藤醇，TAK-165，TG-100-13，TG-100-96，desmal，U3-1566和SKI-606。
优选的化合物是CTGF受体拮抗剂。
在本发明的第三个方面，提供了本发明第二个方面的化合物在治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病中的用途。
优选的是，本发明第二个方面的化合物用于制备治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病的药物。
合适的是，该纤维变性疾病是选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾纤维变性，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化(systemic sclerosis)，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成(keloid scar formation)和癌症相关性纤维变性中的一种。
优选的是，该疾病是糖尿病性肾病。
在本发明的第四个方面，提供了一种治疗和/或预防纤维变性疾病的方法，包含施用治疗上或预防上有效剂量，或多个剂量的根据本发明第一个方面的方法鉴定和/或制备的化合物。
合适的是，该纤维变性疾病是选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾纤维变性，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌症相关性纤维变性中的一种。
优选的是，该疾病是糖尿病性肾病。
在本发明的第五个方面，提供了能够结合CTGF受体激动剂的试剂在治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病中的用途。
在本发明的第六个方面，提供了能够结合CTGF受体激动剂的试剂在制备用于治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病的药物中的用途。
优选的是，该纤维变性疾病选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾纤维变性，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射诱导的纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌症相关性纤维变性中的一种或多种。
在本发明的第七个方面，提供了能够结合CTGF受体激动剂的试剂在减少和/或防止CTGF受体激动剂与CTGF受体的体内或体外结合的方法中的用途。
对于“能够结合CTGF受体激动剂的试剂”，我们包括能够与CTGF受体激动剂自然缔合的化合物，核酸，多肽或抗体。该试剂与CTGF受体激动剂之间的结合可通过离子，静电和/或共价相互作用发生。优选的是，试剂与CTGF受体激动剂的结合会减少和/或防止CTGF受体激动剂结合和/或缔合和/或活化CTGF受体的能力。
优选的是，在本发明的第七个方面，能够结合CTGF受体激动剂的试剂是CTGF受体。作为选择，能够结合CTGF受体激动剂的试剂是与免疫球蛋白Fc-区连接的CTGF受体。
对于“Fc-区”，我们包括抗体的“片断可结晶”区。对于“免疫球蛋白”，我们包括含有一个或多个免疫球蛋白互补决定区(CDR)的多肽，例如抗体，B细胞受体或T细胞受体，或其片断。优选的是，免疫球蛋白是抗体。更优选的是，免疫球蛋白是IgG。
优选的是，在本发明的第七个方面，提供了一种用途，其中CTGF受体是TrkA受体。作为选择，CTGF受体是TrkA受体的可溶形式。
应明白术语“可溶形式”包括与细胞膜不结合或不插入其中且可存在于溶液中不聚集的多肽形式。
优选的是，在本发明的第五，六和七方面中，CTGF激动剂是CTGF。
在本发明的第八个方面，提供了编码与免疫球蛋白Fc-区连接的TrkA受体的核酸。
在本发明的第九个方面，提供了含有根据本发明第八方面的核酸的载体。
在本发明的第十个方面，提供了含有与免疫球蛋白Fc-区连接的TrkA受体的多肽。
在本发明的第十一个方面，提供了含有根据本发明的第八方面的核酸和/或根据本发明的第九方面的载体和/或根据本发明的第十方面的多肽的细胞。
在本发明的第十二个方面，提供了含有根据本发明的第八方面的核酸和/或根据本发明的第九方面的载体和/或根据本发明的第十方面的多肽和/或根据本发明的第十一方面的细胞，和药用上可接受的载体或赋形剂的药用组合物，该核酸和/或载体和/或多肽和/或细胞以治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病有效的量存在。
对于“有效量”，我们包括足以治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病的量。使用本领域的技术人员已知的方法可测定有效量。
实施本发明的某些优选方面的例子现在将参照下面附图进行描述，其中-
图1-CTGF活化细胞内信号途径血清饥饿的人肾小球膜细胞(HMC)在CTGF/V5融合蛋白存在的条件下培养所示的时间。对等量的细胞裂解物蛋白进行SDS-PAGE并使用抗(A)MAPK途径，(B)JNK，和(C)PKB和CamKII的组成型蛋白的磷酸-特异性抗体通过Western印迹分析。β-肌动蛋白显示为等量蛋白上样的标记。D)细胞在盖玻片上生长并血清饥饿48小时，之后在不存在，(a)和(c)，或存在40ng/ml CTGF-融合蛋白，(b)和(d)的条件下在培养基中培养30分钟。固定细胞，透化处理，用抗-磷酸PKCδ(a)和(b)和PKCα(c)和(d)第一抗体，且然后用荧光素偶连的第二抗体进行探测。结果代表了三个不同的实验。
图2-CTGF诱导不同蛋白的酪氨酸磷酸化血清饥饿的HMC在40ng/ml CTGF/V5融合蛋白存在的条件下培养所示的时间期限。对等量的细胞溶胞产物蛋白进行SDS-PAGE并使用抗磷酸酪氨酸抗体通过Western印迹进行分析。结果代表了三个不同实验。
图3-CTGF与HMC表面蛋白相互作用允许CTGF/V5融合蛋白与细胞表面结合，然后用BS3与其配体化学交联，然后从该细胞制备膜富集成份。使用兔抗-CTGF抗体免疫沉淀交联的CTGF复合物，以SDS-PAGE鉴别，使用鸡抗-CTGF抗体通过Western印迹进行分析(泳道2)。对于一些培养物省去了交联步骤(泳道1)。结果代表了三个不同的实验。
图4-CTGF与TrkA和p75NTR在HMC中相互作用(A)在没有(泳道1)或存在(泳道2)CTGF/V5融合蛋白(40ng/ml)的条件下培养血清饥饿的HMC15分钟，之后在RIPA缓冲液中制备细胞溶胞产物。等量的溶胞产物蛋白使用抗磷酸酪氨酸珠免疫沉淀。结合的蛋白质通过SDS-PAGE分辨并使用抗TrkA抗体通过Western印迹进行分析。
(B)HMC在没有(泳道1)或存在(泳道2)组氨酸标记的-CTGF/V5融合蛋白(200ng/ml)的条件下4℃温育2小时以允许结合细胞表面受体，之后与该蛋白质用DTSSP化学交联。制备膜富集成份并溶解。等量的溶解蛋白与金属亲和珠温育。结合的蛋白在还原条件下进行SDS-PAGE，并使用抗TrkA抗体进行Western印迹。
(C)HMC与200ng/ml rCTGF(FibroGen Inc.)在4℃下温育2小时。结合的CTGF按上述交联，制备膜富集成份并溶解。在溶解成份中的交联的CTGF-复合物捕捉到抗-C-末端-CTGF抗体亲和珠上(泳道1)，或用对照IgG亲和珠温育该成份(泳道2)。使用抗-TrkA抗体通过Western印迹分析结合的蛋白质。
(D)图4C泳道1所示的样品煮沸更长的时间，然后使用抗-TrkA抗体进行Western印迹。
(E)剥离印迹(D)并使用抗-p75NTR抗体再探测。结果代表了4个不同的实验。
图5-HMC表达Trk受体从HMC提取总RNA并用于RT-PCR。扩增后，10μl各PCR反应产物通过含溴化乙锭(0.5μg/ml)的1.2％(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳。结果代表了3个不同的实验。
图6-CTGF活化HMC中的TrkA在没有(泳道1)或存在(泳道2)CTGF/V5(40ng/ml)的条件下培养血清饥饿的HMC15分钟。对等量的细胞溶胞产物蛋白进行SDS-PAGE并通过Western印迹进行分析。印迹A用抗-TrkA抗体进行探测。印迹B用抗磷酸-TrkA(Tyr490)抗体进行探测，而印迹C用抗磷酸-TrkA(Tyr674/675)进行探测。结果代表了3个不同的实验。
图7-HMC中的CTGF刺激TIEG水平血清饥饿的HMC与rCTGF/V5融合蛋白接触不同的时间期限，之后制备细胞溶胞产物并通过Western印迹分析TIEG和β-肌动蛋白水平。显示了进行的3个独立实验的代表性印迹(每个实验每种条件重复3份培养物)。
图8-TIEG介导Smad7表达水平的CTGF-依赖型下调血清饥饿的HMC接受图中所示的条件。24小时后，制备细胞溶胞产物，通过Western印迹分析TIEG，Smad7，和β-肌动蛋白水平。显示了进行的3个独立实验的代表性印迹(每个实验每种条件重复3份培养物)。
实施例实施例1-CTGF-TrkA相互作用的鉴定材料和方法细胞培养物，抗体和试剂原代正常成人肾小球膜细胞(HMC)(CC-2259，lot 3F1510)(Biowhittaker，Wokingham，Berkshire，U.K.)按以前所述在培养基中维持(Wahab N等，(1996)Biochem J.316，第985-992页)。
汇合长满的指数期后的HMCs培养物(6-8代)在含10％(v/v)胎牛血清和4mM(正常血糖)，11，15或30mM(高血糖)d-葡萄糖的培养基中维持达4周。在每周末，用PBS充分洗涤培养物并用于RNA提取或在无血清时在补充了葡萄糖的培养基中培养24小时。
使用Phospho-Akt抗体(P-Ser 472/473/474)(Pharmingen，San Diego，CA，USA)，Phospho-Akt(P-Thr 308)(Sigma，Gillingham，Dorset，UK)和ERK5抗体(Sigma，Gillingham，Dorset，UK)。
Phospho-ERK1/2途径采样器，phospho-JNK途径采样器，phospho P38MAPK途径采样器，phospho-PKCδ，phospho-PKCα，phospho-TrkA(Tyr674/675)，phospho-TrkA(Tyr490)抗体来自New EnglandBioLabs(Hitchen，Herts.，UK)。Phospho-CaMKII(P-Thr286)抗体来自Promega(Southampton，Hants.，UK)且抗磷酸酪氨酸抗体来自SantaCruz(Autogen Bioclear，Calne，Wilts.，UK)。抗-TrkA 抗体从UpstateBiotechnology(Milton Keynes，UK)获得。抗-TIEG-1抗体由Dr.StevenJohnson(Mayo Foundation，Minnesota，USA)惠赠。K-252a购自Calbiochem(Nottingham，UK)。重组CTGF(CTGF/V5融合蛋白)在转化的HMC中表达且使用Talon金属亲和树脂从培养基中纯化(Wahab N等，(2001)Biochem J.359，第77-87页)。作为选择，r-CTGF(非融合蛋白)在杆状病毒系统中表达且由FibroGen Inc.惠赠(South San Francisco，CA，USA)。兔抗-CTGF(pAb2)和鸡抗-CTGF(pIgY3)也由FibroGen Inc.提供。
交联和膜制品细胞层用冷的结合缓冲液(PBS和0.5％葡萄糖)洗涤两次并在结合缓冲液中用CTGF在4℃下温育2小时。温育后，细胞层用冷结合缓冲液洗涤5次并用1mM 3，3′-二硫基双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)或二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)(Pierce Biotechnology，Tattenhall，Cheshire，UK)在PBS中室温下温育30分钟。通过加入50mM Tris缓冲液pH7.5室温下终止反应15分钟。
细胞层用洗涤缓冲液(10mM Tris缓冲液(pH7.5)，5mM MgCl，150mMNaCl))洗涤，在匀浆缓冲液(10mM Tris缓冲液(pH7.5)，250mM蔗糖，1mM EDTA，5mM MgCl，150mM NaCl，和1x蛋白酶抑制剂混合剂(RocheApplied Science Mannheim，Germany))中刮碎，通过25号针头，并在Dounce匀浆器中以30-40转在冰上匀浆。
匀浆产物在4℃下以2500xg离心10分钟。所得的上清在4℃下以45000xg离心90分钟。膜富集沉淀在溶解缓冲液(10mM Tris缓冲液(pH7.5)，5mM MgCl，150mM NaCl，1％Triton-X100，1x蛋白酶抑制剂混合剂(Roche，见上文))中溶解1小时。在4℃下以45000xg再离心1小时后收集可溶性膜蛋白。
如果使用rCTGF/V5融合蛋白，CTGF-交联蛋白用兔抗CTGF抗体免疫沉淀，或者捕捉到Pull-Down PolyHis柱(Pierce Biotechnology，Tattenhall，Cheshire，UK)上。
如果使用rCTGF，将CTGF-交联蛋白捕捉到山羊抗-CTGF-C末端结构域-琼脂糖免疫亲和柱上，使用IgG-琼脂糖柱作为对照(FibroGen Inc.)。用溶解缓冲液充分洗涤柱后，在还原的SDS-PAGE上样缓冲液中溶解结合的蛋白质，煮沸5分钟并通过SDS-PAGE在4-12％梯度凝胶上分辨。凝胶用考马斯蓝染色，或者用于Western印迹。
RNA提取和RT-PCR分析使用RNAzol B方法(AMS Biotechnology(UK)Ltd.，Oxfordshire，UK)从6×106个肾小球膜细胞提取总RNA。来自各样品的等量总RNA(2μg)使用SuperScript II RNase H+逆转录酶(Gibco BRL，Paisley，Scotland，UK)和随机引物逆转录成cDNAs。
等量(0.5μl)的逆转录反应物(20μl)在含有10μl的10xPCR缓冲液，16μldNTPs(各1.25mM)，2mM MgCl2，5M甜菜碱(Sigma)，0.5μM各特定引物和1.25U Amplitaq DNA聚合酶(Gibco BRL)的100μl体积中进行PCR扩增。在94℃下变性5分钟开始扩增，接着对所有基因进行30个PCR循环。每个循环由94℃下60秒，55℃下60秒和72℃下60秒组成。最后在72℃下延伸10分钟。扩增TrkA，TrkB和TrkC p75NTR，NGF，BDGF的引物序列按Anderson等，(2002)J Clin.Endocrinol.Metab.87，第890-897页所述且在表1中给出(对Anderson等(2002)表1的修改)。
表1
Western印迹细胞在还原SDS-PAGE上样缓冲液中裂解且立即从平板上刮下。细胞溶胞产物超声处理10秒以剪切DNA。然后样品煮沸5分钟并通过SDS-PAGE在4-12％梯度凝胶上分辨。使用BioRad转移装置将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯滤膜(Immobilin-P，Millipore，Bedford，UK)上。印迹在含有1xTBS，0.1％Tween-20且含5％(w/v)脱脂奶粉的封闭缓冲液中温育1小时。
通过在抗体稀释缓冲液(1xTBS，0.1％Tween-20且含5％BSA)中适当稀释的第一抗体中4℃下温育印迹过夜进行免疫检测。然后用洗涤缓冲液(1xTBS，0.1％Tween-20)洗涤印迹3次并用第二辣根过氧化物酶(HRP)-偶连的抗体室温下温育1小时。
结合的抗体使用增强的化学发光试剂Luminol(Autogen Bioclear UKLtd，Wiltshire，UK)显色。预染的分子量标准(Amersham International PLC，Amersham，UK)用于监测蛋白质迁移。
免疫荧光染色细胞用3.7％低聚甲醛固定并用含0.5％Triton X-100的PBS室温下透化处理10分钟。然后用与产生第二抗体相同物种的血清(5％溶于PBS)4℃下温育盖玻片过夜。第一次温育后，用第一抗体(在含3％BSA的PBS中最佳稀释)在37℃下温育盖玻片1小时。
然后洗涤盖玻片并用荧光素偶连的第二抗体(Sigma Aldrich，Dorset，UK)在黑暗中温育1小时。染色后，用抗退色封固介质(Vector Labs，Peterborough，U.K.)将盖玻片封固在玻璃片上并使用荧光显微镜检查。
结果CTGF活化一些细胞内信号途径使用纯化的rCTGF-V5融合蛋白鉴定与HMC中的生长因子反应活化的细胞内信号途径。发现CTGF迅速触发传统MAPK(ERK1/2)和JNK途径(图1A和B)的活化但不能活化p38MAPK。图1显示了CTGF刺激15分钟后这些激酶的最大活化。
CTGF刺激还导致Akt，也称为蛋白激酶B(PKB)在两个已知的磷酸化位点Thr-308和Ser-473的活化(图1C)。Thr-308的活化与ser-473的活化相比似乎更迅速且持久。
Thr-308的活化受到磷酸肌醇依赖型激酶1，或PDK1的影响，PDK1的活性严格依赖于3-磷酸化肌醇脂类(Downward J(1998)Curr.Opin.CellBiol.10第262-267页)。Ser-473的磷酸化通过整联蛋白连接的激酶(ILK)进行(Attwell等，(2000)Oncogene 19第3811-3815页)，且似乎在15分钟时瞬时具有最大水平，且在接触CTGF30分钟内返回到接近基础的水平。
CTGF刺激还导致Cam KII的瞬时活化(图1C)。与CTGF反应活化的其它激酶是PKCδ和PKCα(图1D)。
CTGF与受体的相互作用图1证实了CTGF通过活化上述激酶的受体给下游信号蛋白提供信号。这些激酶正常情况下由受体酪氨酸激酶(RTK)活化。
通过将HMC与CTGF接触不同的时间检测CTGF通过受体酪氨酸激酶(RTK)起作用的可能性。从HMC细胞制备细胞溶胞产物并使用抗磷酸酪氨酸抗体进行Western印迹分析。
结果表明CTGF融合蛋白(40ng/ml)在10分钟内刺激HMC中至少两种表观分子量为大约75-80和140-150kDa的主要蛋白的酪氨酸磷酸化(图2)。
在对照细胞溶胞产物中检测到另一磷酸酪氨酸蛋白质(MW45 kDa)但是响应CTGF处理而减少。
CTGF与人肾小球膜细胞(HMC)表面蛋白相互作用通过允许CTGF结合到该细胞表面来考察CTGF与HMC表面蛋白的相互作用。接着进行交联操作并从细胞分离膜富集成份。溶解后用兔抗-CTGF抗体免疫沉淀该成份。然后通过PAGE和用鸡抗-CTGF抗体进行Western印迹来分析共价交联的CTGF复合物。
在图3中，CTGF似乎与膜蛋白交联形成表观分子量为85kDa，180kDa和＞220kDa的复合物，后者是大型扩散带(泳道2)。当删除交联步骤时这些复合物没有从膜富集成份中免疫沉淀(泳道1)。
为了确定CTGF是否活化RTK，将血清饥饿的HMC在存在和没有CTGF的条件下培养15分钟。将细胞裂解并免疫沉淀磷酸酪氨酸蛋白。使用抗多种已知酪氨酸激酶受体的抗体通过Western印迹分析免疫沉淀的蛋白质。
图4A显示了交叉反应的抗-TrkA抗体(大约140kDa的带)。当用CTGF培养细胞时该带的强度更强(泳道2)，表明通过CTGF活化。
通过不同的实验证实CTGF与TrkA受体的相互作用，其中允许His-标记的CTGF/V5融合蛋白，或在杆状病毒系统中表达的rCTGF结合到细胞表面，然后使用可逆交联剂DTSSP与其配体交联。后者随后通过还原试剂裂解。
随后，制备膜成份并将任何交联的CTGF复合物捕捉到亲和金属珠，或抗-C末端CTGF抗体亲和珠上。捕捉的复合物在还原条件下进行SDS-PAGE并通过Western印迹进行分析。
图4B，4C，和4D证实了CTGF与TrkA受体相互作用。
以前已经证实了Trk受体与泛(pan)神经营养蛋白受体p75NTR相互作用。因此，剥离印迹并使用抗-p75NTR抗体再探测。图4E显示了该抗体与具有P75NTR的正确分子量的蛋白质交叉反应。
因此该结果证实了CTGF与TrkA和p75NTR受体相互作用。
HMC表达Trk受体通过从HMC提取总RNA对其进行RT-PCR分析来考察HMC的Trk受体表达。图5显示了HMC表达Trk受体家族的所有三个成员TrkA，TrkB，和TrkC，以及泛受体p75NTR。
CTGF活化HMC中的TrkATrkA与其配体结合时自身磷酸化一些酪氨酸残基，导致缔合和活化多种效应物分子。Tyr490的磷酸化是Shc缔合和活化Ras-MAP激酶级联所必需的。Tyr674/675的磷酸化位于催化域内且反映了Trk激酶活性。因此我们试验了用CTGF刺激细胞是否会导致TrkA在这些残基上磷酸化。图6中的结果清楚地表明CTGF诱导该受体在这些残基上磷酸化。
K252a抑制CTGF-诱导的信号传导K252a是已知选择性抑制酪氨酸激酶的生物碱样激酶抑制剂。在CTGF刺激的HMC细胞中K252a抑制ERK1/2，JNK和ERK5的蛋白质磷酸化。这表明这些激酶的磷酸化可通过酪氨酸激酶受体trkA诱导，且酪氨酸激酶抑制剂能够抑制CTGF介导的信号传导。
CTGF诱导TIEG的表达图7显示了CTGF接触引起TIEG表达水平的迅速增加。
通过用TIEG反义和对照寡核苷酸处理细胞来考察TIEG直接介导Smad7水平的CTGF-依赖型下调的能力。图8显示HMC中TIEG和Smad7蛋白的组成型水平低(泳道1)。
用CTGF培养细胞24小时显著增加TIEG水平而将Smad7降低到几乎不能检测的水平(泳道2)。在TIEG反义寡核苷酸存在的条件下该影响被完全消除(泳道5)，但是对照寡核苷酸不能(泳道6)。
单独用TGF-b培养细胞相同的时间导致TIEG和Smad7都适度增加(泳道3)。然而，在CTGF反义寡核苷酸存在的条件下用TGF-b培养细胞完全消除TIEG的适度诱导并导致Smad7的诱导增加(泳道7)。在对照反义寡核苷酸存在的条件下没有观察到该结果(泳道8)且与导致观察到TIEG表达水平适度增加的TGF-b-诱导的CTGF一致。
通过用TIEG反义和对照反义寡核苷酸处理细胞也获得了相似的结果(泳道9和10)。用TGF-b和CTGF培养细胞(泳道4)显著增加TIEG的表达水平而减少Smad7的表达水平。这些结果清楚地表明TIEG介导Smad7表达的CTGF-依赖型下调。
实施例2-用于鉴定抑制CTGF诱导的纤维变性的化合物的筛选方法通过在用CTGF处理的HMC中试验各化合物抑制，例如，TIEG诱导的能力实施筛选具有依赖于CTGF-CTGF受体相互作用的纤维变性抑制特性的化合物。
使用含有或不含潜在抑制剂预培养30分钟的人肾小球膜细胞(HMC)实施该筛选方法。然后在存在或没有潜在抑制剂的条件下用CTGF-V5融合蛋白(40ng/ml)刺激这些细胞2小时。用冷PBS洗涤细胞层后，在RIPA缓冲液中裂解细胞并通过ELISA测定溶胞产物的TIEG。
对于ELISA试验(Voller A等，(1976)，in Manual of Clinical Immunology(Rose，N和Fishman H，编)第506-512页，American Society of Microbiology，Washington，DC.)，用溶胞产物或提供标准曲线的r-TIEG标准稀释液在4℃下覆盖NUNC微量滴定板过夜。
去掉覆盖溶液并用PBS简单洗涤孔后，通过用含1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS在37℃下温育孔1小时封闭非特异性蛋白。然后用最佳稀释的抗-TIEG抗体温育孔60分钟，接着用过氧化物酶偶连的第二抗体在37℃下温育60分钟。用PBS洗涤孔3次后，用底物2，2′-连氮-双-3-乙基苯并噻唑啉6-磺酸(2，2′-azinobis-3-ethylbenzthazoline 6-sulphonic acid)检测结合的抗体并读取405nm下的吸光度。
通过克隆进PcDNA 3.1/V5-His Topo载体(InVitrogen)从全长TIEGcDNA产生重组TIEG蛋白。该载体可转染进哺乳动物细胞系以表达TIEG-融合蛋白。
使用预结合的镍螯合树脂从细胞溶胞产物纯化TIEG融合蛋白。抗-TIEG抗体可从Dr.Steven Johnson(Mayo Foundation，Minnesota，USA)获得或者可使用常规方法在兔中针对TIEG融合蛋白产生。
实施例3-通过抑制(blocking)CTGF激动剂(agonist)接近细胞表面受体减少糖尿病小鼠中糖尿病性肾病的形成通过抑制CTGF激动剂接近细胞表面受体，可预防和/或减少糖尿病小鼠中糖尿病性肾病的形成。通过使用能够结合CTGF受体激动剂的试剂，从而防止该激动剂与细胞表面受体的结合可做到这点。例如，可使用可溶性小鼠TrkA受体(sTrkA)。
代表CTGF受体细胞外区域的cDNA序列可使用从小鼠肾提取的总RNA和特别设计的寡核苷酸引物通过RT-PCR产生。将该PCR产物克隆进设计成有效分泌表达蛋白的pSecTag2哺乳动物表达载体(Invitrogen)阅读框中。已经表明免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的融合延缓了其它可溶性受体的体内清除(Zhou A，Ueno H，Shimomura M，Tanaka R，Shirakawa T，NakamuraH，Matsuo M，Iijima K.Kidney Int.2003，6492-101)，因此可通过RT-PCR扩增小鼠IgG的Fc部分的cDNA并与CTGF 3′端(with the 3′-end of CTGF)克隆进阅读框中。
小鼠Fc的反义引物含有防止其与存在于pSecTag2载体中的myc表位融合的终止密码子。这些构建体可用于按照标准技术，通过使用存在于pSecTag2载体中用于选择的Zeocin抗性基因产生稳定转染的小鼠成纤维细胞系。
有效表达和分泌该受体的细胞系可按常规大规模培养(T150瓶)。使用FPLC Mono S(Pharmacia)可从培养基中纯化表达的重组蛋白质，通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE检查纯化的蛋白质并用磷酸盐缓冲液(PBS)透析。透析的蛋白质可通过Detox-igel柱(Pierce)，通过使用鲎阿米巴样细胞试验(Sigma)检查内毒素，并过滤灭菌(0.2μm)。
为了进行体内试验，设置4组小鼠(a)，(b)和(c)db/db小鼠(每组n＝10)，和(d)db/m小鼠(n＝10)。对于这些实验，我们使用糖尿病型db/db和非糖尿病型db/m小鼠(Jackson Laboratory)。db/db小鼠是遗传改造的小鼠模型，代表2型糖尿病且在出生后几周形成与肥胖和胰岛素抗性相关的高血糖。我们选择该模型是因为它在16周大之前表现出肾小球膜扩张(Chen H，Charlat O，Tartaglia LA，Woolf EA，Weng X，Ellis SJ，Lakey ND，Culpepper J，MooreKJ，Breitbart RE，Duyk GM，Tepper RI，Morgenstern JP.Cell.1996，84491-5；Like AA，Lavine RL，Poffenbarger PL，Chick WL.Am J Pathol.1972，66193-224.)。
在糖尿病发作后立即对(a)组每天接受50μg sTrkA的皮下注射。我们根据其它研究人员同样设计的成功实验选择该剂量(Park L，Raman KG，LeeKJ，Lu Y，Ferran LJ Jr，Chow WS，Stem D，Schmidt AM.Nat Med.1998，41025-31；Wendt TM，Tanji N，Guo J，Kislinger TR，Qu W，Lu Y，Bucciarelli LG，Rong LL，Moser B，Markowitz GS，Stein G，Bierhaus A，Liliensiek B，Arnold B，Nawroth PP，Stern DM，D′Agati VD，Schmidt AM.Am J Pathol.2003，1621123-37；Holash J，Davis S，Papadopoulos N，Croll SD，Ho L，Russell M，Boland P，Leidich R，Hylton D，Burova E，Ioffe E，Huang T，Radziejewski C，Bailey K，Fandl JP，Daly T，Wiegand SJ，Yancopoulos GD，Rudge JS.Proc NatlAcad Sci U S A.2002，9911393-8.)。
皮下注射的VEGF的s-受体-Fc捕捉剂(decoy)具有大约2天的血清半寿期(t1/2)。(b)组接受等体积的载体。(c)和(d)组不接受治疗。在20周大时处死小鼠以评估糖尿病性肾病的形成。
糖尿病性肾病的形成可通过尿白蛋白，血清和尿肌酸酐，肾小球组织学改变和肾小球ECM积聚来评估。小鼠在独立代谢笼中圈养以进行24小时尿收集。可使用鼠微量白蛋白尿(microalbuminuria)试剂盒(Albuwell M；Exocell，Philadelphia)用ELISA测定尿白蛋白浓度。可通过计算肌酸酐清除率(ml/min/100g体重)评估肾功能。血清和尿肌酸酐水平可通过酶法使用苦味酸比色方法测量(Sigma)。
实施例4-药物制剂和给药本发明的化合物正常情况下通过口服或通过任一肠胃外途径以包含活性成份的药物制剂形式，任选以无毒有机，或无机，酸，或碱，加成盐的形式，以药用上可接受的剂型给药。依赖于所治疗的疾病和患者，以及给药途径，该组合物可按各种剂量给药。
在人类治疗中，本发明的化合物可单独给药，但是一般与根据目的给药途径和标准药学实践选定的合适的药用赋形剂，稀释剂或载体混合给药。
例如，本发明的化合物可通过口服，含服或舌下以可含有调味或染色剂的片剂，胶囊，卵状体，酏剂，溶液或悬液的形式给药用于立即-，延迟-或控制-释放应用。本发明的化合物也可通过海绵体内注射给药。
该片剂可含有诸如微晶纤维素，乳糖，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸氢钙和甘氨酸的赋形剂，诸如淀粉(优选玉米，马铃薯或木薯淀粉)，淀粉乙醇酸钠，croscarmellose sodium和某些复合硅酸盐的崩解剂，和诸如聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，蔗糖，明胶和阿拉伯胶的颗粒粘合剂。另外，可包含诸如硬脂酸镁，硬脂酸，榆树酸甘油酯(glyceryl behenate)和滑石的润滑剂。
也可采用相似类型的固体组合物作为明胶胶囊的填充物。在这方面优选的赋形剂包括乳糖，淀粉，纤维素，乳糖或高分子量聚乙二醇。对于水悬液和/或酏剂，本发明的化合物可与各种甜味剂或调味剂，染色物质或染料，与乳化剂和/或悬浮剂和与诸如水，乙醇，丙二醇和甘油，及其组合的稀释剂混合。
本发明的化合物也可通过肠胃外，例如，静脉内，动脉内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内，颅内，肌肉内或皮下给药，或者它们可通过输注技术给药。它们最好以可含有其它物质，例如，足够的盐或葡萄糖使得该溶液与血液等渗的无菌水溶液的形式使用。如果需要，该水溶液应当是适当缓冲的(优选pH从3到9)。在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂可通过本领域的技术人员熟知的标准制药技术容易地完成。
适合于肠胃外给药的制剂包括可含有抗氧化剂，缓冲剂，制菌剂和使得该制剂与目的受体血液等渗的溶质的含水和无水无菌注射液；和可包含悬浮剂和增稠剂的含水和无水无菌悬液。该制剂可存在于单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，且可在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，使用前仅需即时加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬液可从以前描述的无菌粉末，颗粒和片剂类型制备。
对于病人的口服和肠胃外给药，本发明的化合物的日剂量水平通常从1mg/kg到30mg/kg。因此，例如，本发明的化合物的片剂或胶囊可含有一个剂量的活性化合物，如果合适可一次施用单个或两个或多个。在任何情况下医生可确定最适合于任一患者个体的实际剂量且它可随年龄，体重和特定患者的反应而变化。上述剂量是平均情况的举例。当然，存在应接受更高或更低剂量范围的个体情况且它在本发明的范围内。
本发明的化合物也可通过鼻内或通过吸入给药且可方便地以干粉吸入器的形式给药或使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，氟代烷烃，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134A3或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EA3)，二氧化碳或其它合适的气体从加压容器，泵，喷雾器或雾化器提供气溶胶喷雾。对于加压的气溶胶，通过提供阀门给予标定量可测定剂量单位。加压的容器，泵，喷雾器或雾化器可含有活性化合物的溶液或悬液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，它还可含有润滑剂，例如山梨聚糖三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(由例如，明胶制成)可配制成含有本发明化合物的粉末混合物和诸如乳糖或淀粉的合适粉末基质。
优选排列气溶胶或干粉制剂使得每次标定的剂量或“喷出”给予合适剂量的本发明的化合物用于患者的给药。可预料到气溶胶的总日剂量可随患者而变化，且在全天可用单次剂量或者，更常见的是，用分开的剂量给药。
作为选择，本发明的化合物可作为栓剂或阴道栓的形式给药，或者它们可作为洗剂，溶液，乳膏，软膏，扑粉的形式局部应用。本发明的化合物也可经过皮肤给药，例如，通过使用皮肤膏药。它们也可通过眼途径给药，特别是用于治疗眼病。
对于眼科用途，本发明的化合物可在等渗，调节了pH的，无菌盐水中配制成微粉化的悬液，或者，优选的是，作为在等渗，调节了pH的，无菌盐水中的溶液，任选与诸如benzylalkonium chloride的防腐剂混合。作为选择，它们可在诸如凡士林的软膏中配制。
为了局部应用于皮肤，本发明的化合物可配制成含有悬浮于或溶于，例如一种混合物中的活性化合物的合适软膏，该混合物具有一种或多种下列物质矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯化合物，乳化蜡和水。作为选择，它们可配制成悬浮于或溶于，例如，一种混合物中的合适的洗剂或乳膏，该混合物含有一种或多种下列物质矿物油，山梨聚糖单硬脂酸酯，聚乙二醇，液体石蜡，聚山梨醇酯60，鲸蜡基酯蜡，cetearyl alcohol，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。
适合于在口中局部给药的配制品包括在调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中含有活性成份的锭剂；在诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基质中含有活性成份的锭剂；和在合适的液体载体中含有活性成份的漱口水。
一般来说，在人类，本发明化合物的口服或局部给药是优选的途径，因为它最方便。在接受者患有吞咽障碍或口服给药后药物吸收受损的情况下，该药物可通过非肠道，例如，舌下或含服给药。
对于兽医用途，本发明的化合物可根据正常兽医实践以合适的可接受的剂型给药且兽医医生会确定最适合于特定动物的给药方案和给药途径。
权利要求
1.一种鉴定和/或制备用于减少和/或防止纤维样变性的化合物的方法，包括步骤(a)提供CTGF受体；(b)提供试验样品；(c)提供CTGF受体激动剂；(d)将CTGF受体与试验样品接触；(e)随后或同时将CTGF受体与CTGF受体激动剂接触；(f)检测和/或测量CTGF受体的活化量；(g)比较存在试验样品时CTGF受体活化量与不存在试验样品时检测和/或测量的CTGF受体活化量；和(h)根据其引起CTGF受体活化没有增加或减少来确定化合物是否降低和/或防止纤维变性。
2.权利要求1的方法，还包含步骤(i)分离能够减少和/或防止纤维变性的化合物。
3.权利要求2的方法，还包含步骤(j)将该分离的化合物配制成还包含药用上可接受的载体，赋形剂和/或稀释剂的组合物。
4.任一上述权利要求的方法，其中通过检测和/或测量至少一种下列活性来测量和/或检测CTGF受体活化CTGF受体自身磷酸化；受体诱导的蛋白质磷酸化；和/或CTGF受体诱导的TIEG表达。
5.任一上述权利要求的方法，其中CTGF受体激动剂是CTGF。
6.任一上述权利要求的方法，其中CTGF受体是TrkA受体。
7.任一上述权利要求的方法，其中该化合物直接影响CTGF受体和其激动剂之间的相互作用。
8.权利要求1至6中任一项的方法，其中该化合物间接影响CTGF受体和其激动剂之间的相互作用。
9.任一上述权利要求的方法，其中该化合物是CTGF受体拮抗剂。
10.用于减少和/或预防和/或诊断纤维变性的化合物，其特征在于它抑制和/或防止CTGF受体活化。
11.以权利要求1至9中任一项的方法鉴定和/或制备的化合物，用于减少和/或预防和/或诊断纤维变性。
12.权利要求10或11要求保护的化合物，它是选自多肽，抗体分子，反义核苷酸的至少一种。
13.权利要求12要求保护的化合物，其中该化合物是抗体分子。
14.权利要求12要求保护的化合物，其中该化合物是CTGF受体拮抗剂。
15.以权利要求1至9中任一项鉴定和/或制备的化合物在治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病中的用途。
16.以权利要求1至9中任一项鉴定和/或制备的化合物在制备用于治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病的药物中的用途。
17.权利要求10或11要求保护的化合物在治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病中的用途。
18.权利要求10或11要求保护的化合物在制备用于治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病的药物中的用途。
19.权利要求15至18中任一项要求保护的用途，其中该纤维变性疾病是选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾纤维变性，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化(systemicsclerosis)，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射诱导的纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌症相关性纤维变性中的一种或多种。
20.权利要求19要求保护的用途，其中该疾病是糖尿病性肾病。
21.一种治疗和/或预防纤维变性疾病的方法，包含施用治疗上或预防上有效剂量，或多个剂量的以权利要求1至9中任一项的方法鉴定和/或制备的化合物。
22.一种治疗和/或预防纤维变性疾病的方法，包含施用治疗上或预防上有效剂量，或多个剂量的在权利要求10至14中任一项要求保护的化合物。
23.权利要求21或22要求保护的方法，其中该纤维变性疾病是选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾纤维变性，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化(systemicsclerosis)，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射诱导的纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌症相关性纤维变性中的一种或多种。
24.权利要求23要求保护的方法，其中该纤维变性疾病是糖尿病性肾病。
25.能够结合CTGF受体激动剂的试剂在治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病中的用途。
26.能够结合CTGF受体激动剂的试剂在制备用于治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病的药物中的用途。
27.权利要求25或26要求保护的用途，其中该纤维变性疾病是选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾纤维变性，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化(systemicsclerosis)，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射诱导的纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌症相关性纤维变性中的一种或多种。
28.能够结合CTGF受体激动剂的试剂在减少和/或防止CTGF受体激动剂与CTGF受体的体内或体外结合的方法中的用途。
29.权利要求26至28中要求保护的用途，其中能够结合CTGF受体激动剂的试剂是CTGF受体。
30.权利要求26至28中要求保护的用途，其中能够结合CTGF受体激动剂的试剂是与免疫球蛋白Fc-区连接的CTGF受体。
31.权利要求29或30要求保护的用途，其中CTGF受体是TrkA受体。
32.权利要求29或30要求保护的用途，其中CTGF受体是TrkA受体的可溶形式。
33.编码与免疫球蛋白Fc-区连接的TrkA受体的核酸。
34.含有根据权利要求33的核酸的载体。
35.含有与免疫球蛋白Fc-区连接的TrkA受体的多肽。
36.含有根据权利要求33的核酸和/或根据权利要求34的载体和/或根据权利要求35的多肽的细胞。
37.一种药用组合物，它含有根据权利要求33的核酸和/或根据权利要求34的载体和/或根据权利要求35的多肽和/或根据权利要求36的细胞，和药用上可接受的载体或赋形剂，该核酸和/或载体和/或多肽和/或细胞以治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病有效的量存在。
全文摘要
本发明提供了鉴定和/或制备用于减少和/或防止纤维变性的化合物的方法，包含步骤提供CTGF受体；提供试验样品；提供CTGF受体激动剂(agonist)；将CTGF受体与试验样品接触；随后或同时将CTGF受体与CTGF受体激动剂接触；检测和/或测量CTGF受体活化量；比较存在试验样品时检测和/或测量的CTGF受体活化量与不存在试验样品时检测和/或测量的CTGF受体活化量；根据其引起CTGF受体活化没有增加或减少来确定化合物是否降低和/或防止纤维变性。
文档编号A61K39/00GK1906491SQ200480040637
公开日2007年1月31日 申请日期2004年11月15日 优先权日2003年11月18日
发明者罗杰·M·马森, 纳迪亚·A·韦哈布 申请人:帝国大学改革有限公司