专利名称：红细胞功能修饰物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态或R-状态的物质的、调节ATP从红细胞游离的调节剂，以及含有上述物质的医药组合物。
背景技术：
在疾病的治疗及临床检查中，为了将药物有效且选择性地输送至目标组织，希望研究向特定组织输送药物的方法，即给药系统。确立给药系统的重要因素之一是药物的运输体。到目前为止，对发挥药物运输体功能的物质进行了很多研究，其中开发了将红细胞用作运输体的技术(日本特表2003-522140号公报、日本特表2001-512480号公报)。上述公报中记载了红细胞在其内部或表面结合药物或氧，发挥作为用于运输的载体的功能。
但是，人们仅认识到红细胞是向目标组织运输药物或氧的运输体，还没有人为地控制红细胞本身所具有的生理功能并将其应用于临床的技术，还未发现使红细胞所具有的氧释放能力、血管扩张作用在目标部位特异性发挥的方法。
另一方面，已知如果给予红细胞以血中氧分压降低、pH降低或机械变形等各种刺激，则会使ATP游离(Sprague，R.S.et al.，Am.J.Physiol.Cell Physiol.，281C1158-C1164，2001)。而且，从红细胞游离的ATP作用于内皮细胞上的特异受体，促进一氧化氮(NO)和前列环素在血管内皮上的合成和游离。两者与血管扩张反应具有紧密联系。
但是，还不明确ATP从红细胞游离的详细分子机理和其氧浓度依存性的详细情况，因此，仍然不明确具体地应该如何将ATP游离现象应用在病症的控制上。
发明内容
本发明的目的在于提供游离ATP的红细胞、含有使ATP游离的药物的红细胞以及含有游离ATP的红细胞的医药组合物。进而，本发明的目的还在于提供使用红细胞定量测定氧浓度依存性ATP游离量的方法。
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现通过将血红蛋白的结构稳定在T-状态或R-状态，能够与氧分压无关地或者以所需氧浓度控制ATP的游离，进而完成了本发明。
即，本发明如下所述(1)一种促进ATP从红细胞游离的促进剂，其含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质。
作为使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质，可以举出例如选自苯扎贝特、一氧化氮、二氧化碳和腺苷中的至少一个。上述ATP的游离可在100mmHg或以下的氧分压下进行。
(2)一种医药组合物，其含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质。
使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质以及使ATP游离的氧分压与(1)所示相同。本发明的医药组合物可以作为血管扩张药或血流改善药使用。
(3)一种使ATP从红细胞中游离的方法，其特征在于使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态。
ATP的游离可在氧分压100mmHg或以下进行。
(4)一种抑制ATP从红细胞游离的抑制剂，其含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质。
作为使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质，可以举出一氧化碳或磺酰脲。抑制ATP的游离可在100mmHg或以下的氧分压下进行。
(5)一种医药组合物，其含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质。
使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质以及抑制ATP游离的氧分压与上述(4)所示相同。此时，本发明的医药组合物可作为例如血管收缩药、血流控制药或血管扩张抑制剂使用。
(6)一种抑制ATP从红细胞中游离的方法，其特征在于使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态。
ATP游离的抑制可在100mmHg或以下的氧分压下进行。
(7)血红蛋白结构稳定在T-状态的红细胞。
此时，本发明的红细胞可以举出用选自苯扎贝特、一氧化氮、二氧化碳、腺苷和氢离子中至少一种的物质处理过的红细胞。另外，ATP的游离可在100mmHg或以下的氧分压下进行。
(8)血红蛋白结构稳定在R-状态的红细胞。
此时，本发明的红细胞可以举出用一氧化碳或磺酰脲处理过的红细胞。
ATP游离的抑制可在100mmHg或以下的氧分压下进行。
(9)一种医药组合物，其含有上述(7)所述的红细胞。
此时，本发明的医药组合物可以用于治疗缺血性疾病(例如选自出血性休克、心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、脑出血、闭塞性动脉疾病、糖尿病导致的血管病、冠状动脉狭窄症、四肢缺血性疾病、闭塞性动脉硬化症及缺血性溃疡？坏死中的至少一种)或酸中毒。上述缺血性疾病可以是缺血再灌注综合症(由例如休克后复苏、器官冷藏后灌注、外科手术后血流再开通以及闭塞血管的重建的至少一个原因引起的)。
(10)一种医药组合物，其含有上述(8)所述的红细胞。
此时，本发明的医药组合物可以用于治疗血管扩张性疾病(例如败血症休克或过敏性休克)。
(11)一种ATP的测定方法，其特征在于氧浓度依存性地定量从红细胞游离的ATP量。
(12)一种增强ATP从红细胞游离的方法，其特征在于，向红细胞悬浮液中添加腺苷，将所得悬浮液暴露在无氧或低氧分压条件下。
无氧或低氧分压条件为例如0mmHg～150mmHg的条件，腺苷的浓度为例如0.1μmol/L～10μmol/L。
(13)一种增强ATP从红细胞游离的方法，其特征在于，向红细胞悬浮液中添加腺苷，将所得悬浮液暴露在60mmHg～80mmHg的二氧化碳分压条件下。
腺苷的浓度为例如0.1μmol/L～10μmol/L。
(14)一种控制ATP从红细胞游离的方法，其特征在于，向添加了腺苷的红细胞悬浮液中添加抑制带III蛋白阴离子透过功能的物质(例如磺酰脲)。
作为磺酰脲，可以举出例如4，4’-二异硫氰酸酯-均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸(DIDS)。
(15)一种控制ATP从红细胞游离的控制剂，其含有抑制带III蛋白阴离子透过功能的物质(例如DIDS等磺酰脲)。
本发明的控制剂可用于例如抑制ATP的游离。
图1为显示氧分压和ATP游离的关系以及饱和CO和苯扎贝特的红细胞游离作用的图。
图2为显示氧分压和ATP游离的关系以及饱和CO和αNO-Hb的红细胞游离作用的图。
图3为将40％大鼠全身血液体积的血液放出后，恢复到T-状态稳定化红细胞60分钟后的肝脏微循环的有效循环窦状隙密度(FSD)、碱过剩及胆汁分泌恢复的图。
图4显示测定向细胞外液中添加腺苷时ATP释放量的结果。
图5为显示腺苷浓度依存性地释放ATP的作用的图。
图6为显示在R-状态下ATP游离的图。
图7为显示DIDS对ATP从一氧化碳处理红细胞游离的抑制效果的图。
图8为显示DIDS对ATP游离的用量依存性效果的图。
图9为显示各氧分压下DIDS的ATP游离抑制效果的图。
图10为显示二氧化碳分压依存性地增加ATP游离的图。
具体实施例方式
以下详细说明本发明。
如组织为低氧状态，则三磷酸腺苷(ATP)会从红细胞中释放出来，释放的ATP通过在血管内皮细胞表面上表达的特异性受体使钙浓度上升，从而促进一氧化氮(NO)及前列环素的合成和游离。这意味着通过该NO和前列环素产生血管扩张作用。
另一方面，释放到血浆中的ATP分解为二磷酸腺苷(ADP)，活化血小板凝集和粘附。这意味着发生止血。
如上所述，ATP从红细胞游离对于生物体内的生理功能非常重要。然而，到目前为止还不清楚其氧浓度依存性和生理功能机理的关系。另外，在分子水平上还没有证明红细胞到达低氧分压部位时，具有释放作为血管扩张物质的ATP到达病灶的能力的研究。
因此，本发明人着眼于在低氧分压下ATP从红细胞的游离是如何发生的，并对此进行了深入的研究。
1.ATP游离和血红蛋白变构性的关系以与氧分压的关系描绘，ATP从红细胞游离的模式为与氧解离曲线相同的S型曲线。这里，氧解离曲线是指显示与氧结合的血红蛋白的比例相对于氧分压的曲线。该ATP游离模式依存于红细胞中的血红蛋白(Hb)变构性，ATP的游离模式与Hb的S型曲线模式类似。因此，本发明人认为红细胞ATP释放反应的氧依存性是由于血红蛋白感知氧浓度而引起该现象的。于是，将血红蛋白的构造稳定在T型或R型结构，测定了ATP从红细胞的游离。结果为R型抑制ATP释放，T型活化ATP的释放，证明了上述研究。
血红蛋白是作为氧的运输体而发挥作用的分子量为64,500的蛋白质。血红蛋白与氧的结合亲和性与血红蛋白的结构有关。也就是说，血红蛋白在低氧分压下为T型结构(称为“T-状态”)，在高氧分压下为R型结构(称为“R-结构”)。这里“T-状态”是指血红素5配位，对氧为低亲和性(在末梢氧易离去)的结构。“R-结构”是指血红素6配位，对氧为高亲和性(氧在末梢难以离去)的结构。
已经发现了几个将血红蛋白稳定在T-或R-状态的药物。因此，为了使用这些药物研究将血红蛋白变构性稳定在T-状态或R-状态时的ATP游离模式，使用已知将血红蛋白稳定在T-状态的NO衍生物进行了研究(Yonetani，T.et al.，J.Biol.Chem.，273(32)，20323-20333(1998))。
在氧不存在的条件下将该NO衍生物添加到血红蛋白中时，则红细胞与氧分压无关，释放一定的ATP。另外，使用已知将血红蛋白稳定在R-状态的一氧化碳(CO)进行同样测定时，则红细胞与氧分压无关，几乎不游离ATP。由此可知，如果将血红蛋白结构稳定在T-状态或R-状态，则可与氧分压无关地调节ATP游离。这意味着由于血中氧分压降低血红蛋白结构转变为T-状态时、或者将血红蛋白结构稳定在T-状态时，能够有效地使具有血管扩张作用的ATP从红细胞游离。另外，由于血中氧分压增加而使血红蛋白的结构转变为R-状态时、或者将血红蛋白结构稳定在R-状态时，则能够抑制ATP从红细胞游离。
如图1所示，在氧分压降低时人红细胞会将ATP释放到细胞外。该能力显示将氧分压50～70mmHg作为临界(拐点)的S型曲线，因此本发明人假定血红蛋白感知氧浓度。而且，如果红细胞被将血红蛋白结构稳定在所谓R-状态(血红素6配位)的CO饱和，则该能力完全消失。而将血红蛋白的结构稳定在所谓T-状态(血红素5配位)的苯扎贝特(100μmol/L处理30分钟)则使其变为即使是正常氧浓度也能释放大量ATP的红细胞。
如图2所示，如在氧不存在的条件下，以血红蛋白0.5当量添加使红细胞稳定在T-状态的NO，则红细胞与氧浓度无关地释放一定的ATP(“αNO-Hb”的图)。
因此认为，血红蛋白稳定在T-状态的红细胞显示减轻缺血·再氧化损伤的效果。作为会产生缺血·再灌注的脏器或组织，可以举出例如心脏、肝脏、脑、肺、肾脏、血管、骨骼肌、胰脏、胃、小肠、大肠等，但并不限定于这些。特别是在肝脏的缺血·再灌注损伤中，红细胞戏剧性地发挥改善胆汁分泌恢复的效果。该事实通过研究将大鼠全身血液体积的40％的血放出，15分钟后，用红细胞或T-状态稳定化红细胞恢复到等量血红蛋白时肝脏微循环动态得到证明(后述)。即，用T-状态稳定化红细胞恢复时所得到的效果与使用正常红细胞得到的效果比较，在有效循环窦状隙密度(functional simusoidal density(FSD))、酸中毒的改善、胆汁分泌的恢复率方面更优异(图3)。
另外，献血血液通常在4℃下保存，仅在这种低温保存下血红蛋白成为R-状态。而且，如果在低温保存时使其成为一氧化碳血红蛋白(COHb)，则能够抑制ATP的释放，保存红细胞的能量。如向这种处于R-状态的红细胞添加T-状态稳定化剂，则活化ATP的释放。即，对处于R状态的红细胞或一氧化碳饱和红细胞也有ATP释放恢复效果。另外，在上述肝脏的缺血再灌注损伤中，通过一氧化饱和红细胞，有效循环窦状隙密度恢复到休克前的90％(图3)。这意味着可以将红细胞用作将CO运输到末梢组织的载体。
由上可知，调节血红蛋白的T-R转变的药物不仅激发了红细胞的氧释放能力，而且具有相应于在生物体的阻力血管处可发生的氧分压降低而释放ATP的能力。因此，能够使T-R转变的所有药物以及经这些药物处理的红细胞，作为能够活化ATP释放的具有附加价值的血液包含在本发明中，可以用在“附加价值输血”中。
ATP在生物体内作用于血管内皮细胞，增加NO从而使血流增加。另外，在肝脏中ATP作用于肝细胞膜，活化毛细胆管的节律收缩，从而活化胆汁分泌。另外，由于T-状态稳定化剂具有红细胞到达低氧环境时发挥的生物作用，即具有增强氧释放和血管扩张、改善休克的生物作用，因此可以作为末梢循环改善药使用。
2.T-状态或R-状态稳定化(1)稳定化物质本发明中，作为具有将血红蛋白稳定在T-状态、使ATP从红细胞游离作用的物质(称为“T-状态稳定化物质”)，可以举出例如苯扎贝特、NO、NO衍生物、二氧化碳、腺苷、氢离子等，可将这些物质的至少1种单独使用，或适当组合使用。但是，T-状态稳定化物质并不限定于上述示例的物质。
T-状态稳定化物质只要具有将ATP从红细胞游离的作用即可，也可以是上述列举的药物的部分变体或衍生物。
将血红蛋白稳定在T-状态的方法是公知的(Kilmartin JV，Rossi-Bernardi L，Interaction of hemoglobin with hydrogen ions，carbondioxide，and organic phosphates.Physiological Review，vol.53，836-890(1973))、可以通过使用二氧化碳、ATP、肌醇六磷酸酯(Inositolhexakisphosphate)、氢离子(H+)、氯离子等(Cl-)处理来进行。
另外，作为具有将血红蛋白稳定在R-状态、抑制ATP从红细胞游离作用的物质(称为“R-状态稳定化物质”)，可以举出例如一氧化碳(CO)、磺酰脲。但是，R-状态稳定化物质并不限定于上述示例的物质。
(2)ATP的游离或其抑制如上所述，稳定在T-状态的红细胞具有游离ATP的功能。
“游离ATP”是指ATP的释放曲线不是以与氧分压的关系描绘时的对血红蛋白通常观察到的S型曲线，而是在至少高于拐点的氧分压(例如100mmHg PO2)下，较上述通常的S型曲线所显示的ATP释放量释放更多的ATP(例如图1的“苯扎贝特”曲线)。因此，只要为这种ATP释放曲线，在上述通常S型曲线的拐点以下的氧分压的情况下，可以与该S型曲线所示ATP释放量相等，也可比其多，也可以比其少。但是，就本发明而言，ATP释放的促进在氧分压100mmHg以下、优选在40～80mmHg下进行。
稳定在R-状态的红细胞具有抑制ATP游离的功能。“抑制ATP的游离”是指ATP的释放曲线不采用以与氧分压的关系描绘时对血红蛋白通常观察到的S型曲线，所释放的ATP量至少在通常的S型曲线拐点以下的氧分压下少于S型曲线所显示的ATP释放量(例如图1的“CO-Hb”曲线)。因此，只要为这种ATP释放曲线，在高于拐点的氧分压下，可以与上述通常S型曲线所示ATP释放量相等，也可比其少，也可以比其多。但是，就本发明而言，ATP释放的抑制在氧分压100mmHg以下、优选在40～80mmHg下进行。应说明的是，小动脉的氧分压为上述的40～80mmHg。
3.腺苷的添加与ATP释放的关系(1)与氧分压的关系腺苷是碱基部分含有嘌呤衍生物腺嘌呤的核苷酸的一种，是ATP的原料。
由于腺苷是通过连通细胞内外的转运系统被摄取到细胞内的，因此本发明人考虑到向红细胞悬浮液中添加腺苷。
结果发现，如果向细胞外液中添加腺苷，则在无氧或低氧条件下ATP游离(释放)增强。特别是，如向细胞外液中添加1μmol/L的腺苷处理5分钟，并在低氧或无氧条件下暴露1分钟，则ATP释放量增强约2倍。
这说明如果在例如输血用血液中预先添加腺苷，则能够得到ATP游离能力高的保存血液，腺甘添加血液能够有效地用作急救医疗或手术时的输血制品，这一点非常有用。
本发明中向红细胞悬浮液中添加的腺苷为0.1～10μmol/L，优选为1～5μmol/L。
这里，“无氧条件”是指氧分压为0mmHg，“低氧分压”是指大于0mmHg、小于等于正常氧条件(150mmHg、空气中)的条件。
通过在上述氧分压下处理血液悬浮液10～60分钟，能够增强ATP释放。
(2)与二氧化碳分压的关系已知二氧化碳(CO2)具有被称为“高碳酸血保护(hypercapnicprotection)”的作用，即如果在机械呼吸时人为地减少换气使CO2分压上升，则具有改善ARDS(成人呼吸窘迫综合症、Adult respiratorydistress syndrome)预后的作用，但其机理还不明确。
本发明中，证实通过在通常氧分压(常氧Normoxia)下改变CO2分压，能够增强ATP释放。CO2分压优选为60～80mmHg。
(3)与阴离子交换剂(Anion exchanger)的关系在红细胞的膜上存在被称为“Band III”(带3)的膜贯通糖蛋白质(每个红细胞约106个)。该蛋白质分为N末端一侧的亲水性结构域和C末端一侧结构域的2个功能结构域。N末端一侧的亲水性结构域通过锚蛋白连接于细胞骨架体系，与红细胞的形态维持有关。C末端一侧的结构域是穿膜14次的膜内区域，凭借阴离子透过功能、即Cl-和HCO3-的交换反应，担任CO2气体的运输和排出功能。担任该功能的膜蛋白质称为“阴离子交换剂”。
本发明人由于发现ATP向细胞外的释放是通过上述阴离子交换剂进行的，因此考虑到可通过提高上述阴离子交换剂的阻力、抑制其功能(阴离子透过功能)来控制ATP的释放量。
对于上述ATP释放的控制，只要是结合于Band III的细胞外结构域、抑制阴离子透过功能的物质(药物、低分子化合物)即可，没有特别限制。
作为结合于Band III细胞外结构域的药物，可以举出例如用于糖尿病治疗的磺酰脲DIDS(4，4’-二异硫氰酸酯-均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸，4，4’-diisothiocyanate-stilbene-2，2’-disulfonic acid)等，优选DIDS。通过向红细胞悬浮液中添加与上述Band III的细胞外结构域结合的物质，能够控制ATP的释放量。
例如向红细胞中添加DIDS的量优选为1×10-6～1×10-4mol/L。
上述(1)和(2)中所述的反应通过结合于Band III细胞外结构域的物质控制。因此，本领域技术人员可以考虑氧分压和二氧化碳分压适当控制ATP释放量。
4.医药组合物本发明中，使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质由于促进ATP从红细胞游离，因此可以用作血管扩张药或血流改善药等医药组合物。
另外，使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质由于抑制ATP从红细胞游离，因此可以用作血管收缩药、血流控制药或血管扩张抑制剂。
上述稳定在T-状态的物质和稳定在R-状态的物质在本发明中称作“T-R转换调节药”。
本发明还提供用上述T-R转换调节药处理过的红细胞。该红细胞由于被调节为T-状态或R-状态，能够促进或抑制ATP的游离，因此可作为医药组合物使用。
作为本发明医药组合物来源的红细胞优选为献血保存血、自身血输血用血液，但并不限定于此。
(1)T-R转换调节药作为将本发明的调节T-R转换的药物用作ATP游离促进剂或ATP游离抑制剂时的给药方式，可以是通常的静脉内或动脉内等的全身给药，或者通过从手术后的重建血管的局部给药。
因此，可以采用组合了导管技术、外科手术等的给药方式。
稳定在T-状态的物质对血管扩张或血流改善具有作用。因此，作为施与稳定在T-状态的物质的对象的疾病，例如为缺血性疾病和循环系统疾病，例子可举出出血性休克、心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、脑出血、闭塞性动脉疾病、糖尿病导致的血管病、冠状动脉狭窄症、四肢缺血性疾病、闭塞性动脉硬化症、缺血性溃疡？坏死、缺血再灌注综合症(休克后复苏、脏器冷藏后灌注、外科手术后血流再开通和闭塞血管的重建等)、缺血性心脏病、消化道出血、DIC(播散性血管内凝血)、外伤性休克、多脏器衰竭等。除此之外，还可以用于治疗、改善酸中毒或休克。
使稳定在R-状态的物质有助于血管收缩或血流抑制。因此，作为施与稳定在R-状态的物质的对象的疾病为血管扩张性疾病，例如可以举出败血症、过敏性休克、内毒素休克。
上述药剂的给药量随年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型的不同而不同，例如出血性休克时的给药量为调制为10g/dl时每日每次800ml，给药1次或多次。多次给药时可以分为每日3～4次。
本发明的T-R转换调节剂可以添加在献血用的流出到体外的血液中，此时，每200ml血液Hb浓度为10g/dl的血液中加入5～10ml。
(2)用调节T-R转换的药物处理得到的红细胞制剂(2-1)血红蛋白变构性对于急救中必需的氧输液的研究开发，目前主要是开发从过期剩余献血血液中纯化血红蛋白，并用生物体适合性材料进行修饰或密封得到的制剂近年的研究显示，红细胞感知血管内的氧浓度，将NO等低分子气体或有机氧活跃地释放或回收，其中一部分可能与血管扩张或血小板活化的调控有关。这说明红细胞不仅与氧的运输、酸碱平衡的调节有关，还有可能积极地发挥微循环血流维持作用。换而言之，这意味着由目前的纯化血红蛋白修饰体制成的人工氧运输体不能完全补充红细胞本来保持的这种附加价值功能。了解作为这种血管活性物质的存储库的红细胞参与血管功能调控的分子机理，在考虑到将其应用于休克的急救方面是特别重要的，在维持细胞膜功能的同时赋予高的氧运输能和微循环血流保持功能的新型红细胞制剂开发是必不可少的。
本发明通过利用了膜透过性高的低分子气体(例如NO，CO)的蛋白质功能修饰技术的红细胞保存技术的提高和附加价值添加技术，开展了对所得献血血液的有效利用。具体而言，本发明的目的在于，分别开发利用α-NOHb(使用NO固定的血红蛋白)或者CO-Hb(用CO固定的血红蛋白)，以少量的血红蛋白即可运输与多量血红蛋白所具有的氧量等量的氧的红细胞制剂的实用制造法或者新型红细胞保存法，并着重于这些成果的实用化。
本发明也具有减轻施与了血液制剂的个体的血红素解毒负担的优点。与正常个体不同，外科手术后或休克状态中由于细胞因子血症、低氧应激诱导了作为血红素解毒酶的血红素加氧酶，血红素向胆红素的分解异常亢进(Kyokane T，Norimizu S，Taniai H，Yamaguchi T，Takeoka S，Tsuchida E，Naito M，Nimura Y，Ishimura Y，SuematsuM.Gastroenterology.120，1227-1240(2001))，因此降低单位氧运输量的血红素绝对量不仅节约血液资源，而且可减轻施与个体的高胆红素症风险。
另外，NO-Hb可用作移植用移植物的氧化冲洗液，这是新的应用。通常，低温(4℃)状态下血红蛋白血红素与分子态氧的亲和性增加，因此α-NOHb适于提高再灌注时的氧运输。另外，为了减轻再灌注时产生的氧反常损伤，反而可使用CO-Hb。并且，非自由基分子的CO可作为温和的血管舒张剂应用，在组织中存在较Hb一氧化碳亲和性更高的血红素蛋白的肌肉和脑中，可期待Hb-CO的血管扩张效果。通过本发明的实验性评价，这种可能性也可以与剩余红细胞的新需求的创新联系起来。本发明提出的αNO-RBC、CO-RB的有效利用在提高急救质量的同时，在考虑靠国民的热心公益获得的宝贵血液资源的有效利用方面也是极为重要的。
为了开发利用Hb变构性修饰的附加价值红细胞制剂，以下内容是必要的，(i)验证占据血液体积50％的红细胞不光仅仅作为氧运输体发挥作用，而且作为感知微循环局部的氧分压变化或剪切应力并释放血管扩张物质、吸收血管收缩物质的代谢库发挥作用，特别是氧的结合解离等导致的血红蛋白变构变化控制本功能这一假说的验证及弄清楚其机理；以及(ii)将这一概念导入至人工氧运输体，以实用化为目标。为了证明上述(i)记载的内容，本发明中探讨了αNO-Hb或CO-Hb对出血性休克的复苏效果。另外，为了研究上述(ii)记载的内容，本发明中将修饰了Hb的红细胞用于实验动物。
(i)αNO-Hb、CO-Hb对出血性休克复苏效果的研究按照wigger′s出血性休克规程引起大鼠的40％出血性休克，尝试利用具有αNO-Hb、CO-Hb的红细胞(从同种大鼠分离制备)使其复苏。用肝脏微循环的生物体显微镜学分析系统对恢复效果进行了比较研究。不仅将微循环的氧供给作为指标，还将功能性毛细血管密度、白血球粘附、库弗细胞活化等作为指标进行了比较研究。另外，还根据wigger′s出血性休克规程用大鼠引起40％出血性休克，尝试利用具有αNO-Hb、CO-Hb的红细胞(从人末梢血中分离制备)使其复苏。
很早就已知氧解离曲线由于以2，3-DPG为代表的生物体内分子、合成化合物的存在而向右(或左)偏移。膜透过性优异的结合于Hb的血红素的NO、CO等气态分子也是Hb变构的调节分子。
(ii)修饰了Hb的红细胞在实验动物中的应用按照wigger′s出血性休克规程引起大鼠的40％出血性休克，尝试用αNO-RBC使其复苏，结果表明αNO-RBC具有显著改善毛细血管水平的开放性(patency)，恢复胆汁分泌的效果显著。另外，还表明原本被认为没有氧运输功能的CO饱和红细胞也具有与没有结合CO的普通红细胞相同的改善效果。使用人末梢血的研究中，确认αNO-RBC、CO饱和红细胞及普通的红细胞对全身的酸中毒均显示改善效果。
(2-2)稳定在T-状态的红细胞由上可知，在本发明制备的红细胞中，稳定在T-状态的红细胞可以作为用于血管扩张、血流改善的治疗的医药组合物使用。另外，本发明中制备的红细胞除了缺血性疾病以外，还可以作为用于治疗、改善酸中毒或休克的医药组合物使用。
本发明的红细胞为了获得免疫适合性，可以从治疗目标的接受者个体得到，也可以使用志愿者的献血。本发明中使用的红细胞为哺乳动物红细胞，优选为人红细胞。
含有本发明的红细胞的医药组合物可以将治疗、预防或检验例如以下组织所产生的疾病作为特异目的进行使用。
消化系统口腔、咽喉、食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏等呼吸系统气管、支气管、肺等泌尿系统肾脏、膀胱等心血管系统心脏、动脉、静脉淋巴系统淋巴管、淋巴节、脾脏、胸腺中枢神经系统脑(大脑、间脑、中脑、小脑)、延髓、脊髓肌肉骨骼肌、平滑肌等这些疾病无论是单独、并发还是与上述以外的其他疾病并发，都可作为本发明医药组合物的使用对象。本发明中优选将血管扩张、血流改善或休克改善为目的。
在本发明中，可以将含有使ATP游离的药物的红细胞用作治疗缺血性疾病或循环系统疾病的医药组合物。
作为缺血性疾病和循环系统疾病，例如可以举出出血性休克、心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、脑出血、闭塞性动脉疾病、糖尿病导致的血管病、冠状动脉狭窄症、四肢缺血性疾病、闭塞性动脉硬化症、缺血性溃疡？坏死、缺血再灌注综合症、缺血性心脏病、消化道出血、DIC(播散性血管内凝血)、外伤性休克、多脏器衰竭等。对于上述缺血再灌注综合症，可以举出选自休克后复苏、脏器冷藏后灌注、外科手术后血流再开通和闭塞血管的重建中的至少一个原因引起的。本发明的医药组合物用于治疗这些疾病，具有血流改善药或血管扩张药的作用。
本发明的医药组合物作为酸碱平衡障碍(例如酸中毒)的治疗药或休克改善药用于治疗中。
如上所述，红细胞通过氧浓度变化引起的血红蛋白变构，使ATP游离到细胞外。具体而言，红细胞在低氧状态下易游离ATP，在氧饱和状态下难以游离ATP。
因此，在血流停滞的地方，例如由于血管血栓、血管肥厚、血管狭窄、血管闭塞等导致通过血液容量减少或消失的地方，由于不能供给含有充足氧的新鲜血液，这种血流停滞的地方的血液成为低氧状态。另外，出血休克也会引起低氧状态。在癌细胞的中心部分由于血管系统不发达，因此氧的供给不充足，癌细胞处于低氧状态。因此，在放射治疗中具有不能有效地产生氧自由基，从而不能发挥充分的治疗效果的问题。另外，由于细胞需要很多的氧，因此在氧的供给停止的情况下(例如血液断流时)，往往发生脑梗塞、心肌梗塞等严重的症状。
本发明的红细胞在这种低氧状态下可有效地供给ATP，维持脏器血流。
另外，在利用大肠镜的肠检查和/或治疗中，由于用空气使肠鼓起，在肠上施加了压力血流变差，肠细胞处于低氧状态。因此，通过使所用气体中含有大量二氧化碳，可使本发明的红细胞能够供给ATP，改善肠的低氧状态。
在红细胞内产生的游离ATP作用于血管内皮细胞上的特异性受体，增加NO、前列环素，使血管松弛、扩张。因此，通过松弛、扩张血流停滞的血管，可以改善血流。
另外，游离的ATP在血液内迅速被分解为ADP。通过分解产生的ADP通过存在于血小板上的特异性受体引起血小板凝集。因此，能够通过上述机理有效地对由于出血导致的显示低氧状态的部位进行止血。
本发明的医药组合物的给药量随年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型而不同，在例如肝疾病手术后的出血性休克时，使用血红蛋白为20g/dl的浓包装，给药量为每天每次200～800mL左右，可给药1次或多次。多次给药时可分为每日3～4次。
(2-3)稳定在R-状态的红细胞在本发明制备的红细胞中，被稳定在R-状态的红细胞可用作治疗败血症休克、过敏性休克等全身血管扩张显著的病态(血管扩张性疾病)的医药组合物。
如上述(2-2)所述，含有稳定在T-状态的红细胞的医药组合物对于治疗出血性休克有效。这说明可以根据休克状态分开使用稳定在R-状态的红细胞或稳定在T-状态的红细胞中的任一种。
本发明的医药组合物的给药量随年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型而不同，例如败血症休克或过敏休克时，使用血红蛋白为20g/dl的浓包装，给药量为每日每次200～800mL左右，可给药一次或多次。多次给药时可分为每日3～4次。
5.血液氧含量的测定方法通过本发明可知，红细胞的氧浓度和ATP释放量的关系为与血红蛋白的氧解离曲线同样的S型曲线。因此，本发明中通过测定低氧性ATP释放量，能够间接地测定红细胞功能储备能力。
本发明的血液氧含量的测定方法在临床检查、治疗上有效。另外，使用本发明的测定方法，能够简便地实施输血血液的含氧量测定或污血检查。
所用血液利用从氧含量测定对象采取的血液。优选摄取后迅速测定ATP。采取量为5～400ml，优选为5～10ml。
血中ATP的测定只要将测定对象血液应用在市售的测定仪器中即可。
预先求出氧含量和血中ATP量的关系式，在所得关系式中代入测定所得的血中ATP量，即可求出试样中的氧含量。
接着举出实施例更加具体地说明本发明。但是，本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1加入肝素采集人末梢血20mL，2000rpm离心7分钟，采集红细胞沉淀，洗涤后利用克雷布斯缓冲液(krebs buffer)制作1×107cell/ml的红细胞悬浮液。将含有1.8mL氧浓度调整为0～150mmHg所需值的克雷布斯缓冲液的密封比色杯在37℃下孵育，用微注射器将200μl的红细胞悬浮液注入到密封比色杯中。5分钟后放在4℃冰中停止反应，在4℃下取样200μl，离心，通过荧光分析定量测定上清中的ATP。正常红细胞为在氧分压(PO2)50～70mmHg附近具有拐点的曲线(图1的S型曲线)。在红细胞中通入100％CO一分钟所制作的CO饱和红细胞在低位，ATP释放稳定(图1“CO-Hb”曲线)；用10-4mol/L(最终浓度)处理的苯扎贝特在高位，ATP释放稳定(图1“苯扎贝特”曲线)。图1中“*”表示相对于正常氧分压(150mmHg、空气中)时的测定值具有显著性差异(P＜0.05)实施例2本实施例中研究了一氧化碳红细胞(CO-Hb)和NO处理红细胞(αNO-Hb)对ATP释放的影响。方法根据上述实施例1。NO作用为，通过通氩气使采取的红细胞完全脱氧后，将NO-谷胱苷肽按照相对于Hb浓度为1∶2的比例添加，离心数分钟后，使用回收的红细胞进行实验。上述红细胞中含有的血红蛋白表示为“αNO-Hb”。
正常-Hb与CO-Hb显示了与实施例1同样的结果(图2)，αNO-Hb比实施例1的苯扎贝特更高位，ATP的释放稳定(图2)。图2中“*”表示相对于正常红细胞(Hb)具有显著性差异(P＜0.05)。
实施例3人洗涤红细胞试样对大鼠40％失血休克引发的肝脏功能障碍的恢复效果对于Wistar系雄性大鼠(250-300g)肌肉注射50mg/kg的戊巴比妥钠，进行麻醉。切开麻醉后的大鼠的气管，在大腿动脉中插管。再在胆管中插管，监测胆汁分泌。在大鼠左颈动脉中也插管作为除血管，以1～2mL/min除血，直至总失血量达到全身血液的40％。除血结束后15分钟休克状态后，将各制剂调整至相当于出血量的Hb量给药，60分钟后根据肝脏微循环、胆汁流量以及动脉血的Hb、重碳酸浓度pH计算碱过剩(图3)。通常碱过剩在正2.5以上为碱中毒(alkalosis)、负2.5以下为酸中毒(acidosis)。图3中，PS为用相当于出血量的量的生理食盐水中复苏(n＝7)、COhRBC为用CO饱和人红细胞复苏(n＝5)、hRBC为用空气饱和人红细胞复苏(n＝5)，以及αNOhRBC为用具有α-亚基被NO饱和的Hb的人红细胞复苏(n＝7)。另外，图3中“*”表示*P＜0.05(与PS组相比有显著性差异)、“#”表示#P＜0.05(与hRBC组相比有显著性差异)。通过已知的视频强化型倒置型生物体显微镜体系统记录肝脏微循环动态。
首先，在施与各红细胞制剂时，确认维持肝脏微循环窦状隙血流的血管密度在施与3种制剂的任一组中均有显著的改善效果(图3上图)。特别是对于被认为不能运输氧的CO饱和红细胞(COhRBC)，肝脏的有效循环窦状隙密度恢复到休克前的约90％。该结果与发明人报告的CO对离体肝脏窦状隙血流维持作用不矛盾(Suematsu M，GodaN，Sano T，Kashiwagi S，Egawa T，Shinoda Y，Ishimura Y.Carbonmonoxidean endogenous modulator of sinusoidal tone in the perfusedrat liver.J Clin Invest.1995 Nov；95(5)2431-2437.)，首次发现可将红细胞作为将CO运输到末梢组织的载体使用。
另一方面，为了研究对于全身酸中毒的改善效果，通过动脉血的Hb以及重碳酸浓度pH求出碱过剩。通常碱过剩在正2.5以上为碱中毒、负2.5以下为酸中毒。3种制剂对碱过剩均有显著的改善效果，αNOhRBC发挥最强的改善效果，与COhRBC、hRBC相比也有显著的改善效果(#P＜0.05)。
除了这些改善效果，对于作为肝脏全体成活力指标的胆汁分泌改善效果，改善效果按照αNOhRBC、hRBC、COhRBC顺序增强，特别是αNOhRBC与休克前相比具有显著的胆汁分泌增强效果。ATP在体外引起毛细胆管节律收缩运动的活化(Kitamura T，Brauneis U，Gatmaitan Z，Arias IM.Extracellular ATP，intracellular calcium andcanalicular contraction in rat hepatocyte doublets.Hepatology.1991Oct；14(4Pt 1)640-647.)，ATP分泌能力高的αNOhRBC显示胆汁分泌活化作用，与该事实不矛盾。无论如何，CO-hRBC的给与作为肝脏窦状隙血流的改善法是有效的，αNOhRBC的投予除了是肝脏的窦状隙血流恢复的有力方法外，还是纠正全身酸碱平衡障碍(例如酸中毒)的有力方法。
实施例4本实施例研究了在含有红细胞(RBC)的悬浮液中，细胞外液(红细胞之外)所含的腺苷如何影响ATP从红细胞的释放。方法根据实施例1如下进行。
向红细胞的外液中添加腺苷5分钟后，将红细胞悬浮液注入到含有氧分压调整为0～150mmHg范围所需值的克雷布斯缓冲液的密封比色杯中，1分钟后终止反应。
结果，如果向细胞外液中添加1μmol/L的腺苷(Adenosine)，正常氧浓度下的ATP释放以及1分钟的低氧下ATP释放都增强了近2倍(图4)。
接着，研究了腺苷对于低氧的ATP释放的浓度依存效果。
结果如图5所示。图5中“缺氧”表示使用在0mmHg的氧分压下(无氧状态、处理1分钟)调制的、“常氧”表示使用在100mmHg氧分压下(肺泡及血中的通常氧分压、处理1分钟)调制的克雷布斯缓冲液测定时的结果。缺氧下，仅添加1μmol/L(10-6mol/L)的腺苷，所释放的ATP量变为约2倍(图5●)。
由图5的结果可认为，通过添加作为ATP原料的腺苷会引起ATP量的增加。而且，这说明如果预先在低温保存的血液(输血血液等)中添加腺苷，则能够实现ATP游离能力高的血液的保存，可以应用在新型的血液保存方法的开发中。
实施例5本实施的目的在于研究与ATP游离相关的膜蛋白质。方法根据实施例1进行。
首先，在一氧化碳处理红细胞(CO(+))中，未确认低氧下ATP游离增加，即使添加1μmol/L的腺苷，低氧下ATP游离增加也甚微(图6“腺苷(+)”、●)。即，如果使用CO将Hb处理为R-状态，则ATP的游离增加促进效果会消失或降低。图6的○为对照(control)。
接着，研究ATP是从红细胞膜上的哪里释放到细胞外的。已知在红细胞膜上存在膜蛋白质Band III(阴离子交换剂-1)。作为从细胞外结合于该Band III的细胞外结构域，塞住该通道蛋白质的孔的药物，有用于糖尿病治疗的被称为DIDS(4，4’-二异硫氰酸酯-均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸，4，4’-diisothiocyanate-stilbene-2，2’-disulfonic acid)的磺酰脲。用该DIDS研究ATP是否通过红细胞膜的Band III游离。首先，在通过CO处理使ATP游离增加促进作用消失的条件下，进行了上述研究。
结果，在腺苷存在/不存在下，即使向CO(+)红细胞添加DIDS，与未添加DIDS情况相比ATP游离量没有差别(图7)。由此可排除DIDS具有促进ATP从R-状态红细胞的游离作用的可能性。
接着，用CO未处理的红细胞，研究DIDS的浓度依存效果。
结果示于表8。表8中“缺氧”表示使用在0mmHg氧分压调制的、“常氧”表示使用在通常氧分压下调制的克雷布斯缓冲液进行测定的情况。结果显示，DIDS浓度依存性地抑制低氧下ATP游离增加(图8)。
另外，研究了在0～140mmHg氧分压下10-4mol/L的DIDS导致的ATP游离增加抑制作用。结果显示DIDS抑制低氧下的ATP游离增加(图9)。
因此说明，由于无氧或低氧氛围气导致的游离增加的ATP通过存在于红细胞膜上的阴离子交换剂Band III游离到细胞外。
并且，通过向细胞外液中添加该DIDS，能够任意地控制ATP从红细胞的游离量。
实施例6已知二氧化碳具有被称为“高碳酸血保护(hypercapnicprotection)”的作用，即如果通过机械呼吸人为地减少换气使二氧化碳浓度上升，则具有改善ARDS(成人呼吸窘迫综合症，Adultrespiratory distress syndrome)预后的作用。因此，本实施例从ATP游离方面研究二氧化碳的高碳酸血(hypercapnic)作用。
对于方法，按照实施例1的方法进行，测定将二氧化碳分压(PCO2)变为0～80mmHg处理5分钟时的ATP释放量。
结果示于图10。缺氧(无氧状态)下ATP的游离不受PCO2的影响。与此相对，在正常氧状态(常氧)下，ATP的游离在上升为60～80mmHg、在80mmHg下，与有无腺苷处理无关地在任何情况都有显著差异，添加腺苷时，ATP的游离显示了协同性的高效果。因此，通过本实施可知，如果增加通常氧分压下红细胞外液中所含有的二氧化碳分压，则ATP的释放能力提高。
产业实用性发明效果本发明提供含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质的促进ATP从红细胞游离的促进剂，以及含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质的抑制ATP从红细胞游离的抑制剂。
如果将血红蛋白的结构稳定在T-状态，则即使在高氧分压状态下也能使ATP从红细胞游离。而如果将血红蛋白的结构稳定在R-状态，则即使在低氧分压状态下也能抑制ATP从红细胞释放。因此，本发明的ATP游离促进剂作为血管扩张药或血流改善药有效，而本发明的ATP游离抑制剂作为血管收缩药、血流控制药、血管扩张抑制药或伴随着血管过度扩张的败血症休克的治疗药有效。
另外，由于血红蛋白的结构稳定在T-状态的红细胞能够游离ATP扩张血管，因此能够增加血流。而血红蛋白的结构稳定在R-状态的红细胞作为在败血症等末梢血管过度扩张的病态下可施与的红细胞制剂有效，并且，由于抑制了ATP的游离，血小板的活化被抑制，因此能够防止血栓。
权利要求
1.一种促进ATP从红细胞游离的促进剂，其含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质。
2.权利要求1所述的促进剂，其中使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质为选自苯扎贝特、一氧化氮、二氧化碳和腺苷中的至少一种。
3.权利要求1或2所述的促进剂，其能够在100mmHg或以下的氧分压下使ATP游离到细胞外。
4.一种医药组合物，其含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质。
5.权利要求4所述的医药组合物，其中使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态的物质为选自苯扎贝特、一氧化氮、二氧化碳和腺苷中的至少一种。
6.权利要求4或5所述的医药组合物，其可以在100mmHg或以下的氧分压下使ATP游离到细胞外。
7.权利要求4～6任意一项所述的医药组合物，其为血管扩张药或血流改善药。
8.一种使ATP从红细胞游离的方法，其特征在于使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T-状态。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于在100mmHg或以下的氧分压下使ATP游离。
10.一种抑制ATP从红细胞游离的抑制剂，其含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质。
11.权利要求10所述的抑制剂，其中使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质为一氧化碳或磺酰脲。
12.权利要求10或11所述的抑制剂，其能够在100mmHg或以下的氧分压下抑制ATP的游离。
13.一种医药组合物，其含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质。
14.权利要求13所述的医药组合物，其中使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态的物质为一氧化碳或磺酰脲。
15.权利要求13或14所述的医药组合物，其可以在100mmHg或以下的氧分压下抑制ATP的游离。
16.权利要求13～15任意一项所述的医药组合物，其为血管收缩药或血流控制药。
17.一种抑制ATP从红细胞游离的方法，其特征在于使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R-状态。
18.权利要求17所述的方法，其特征在于在100mmHg或以下的氧分压下抑制ATP的游离。
19.血红蛋白的结构被稳定在T-状态的红细胞。
20.权利要求19所述的红细胞，其用选自苯扎贝特、一氧化氮、二氧化碳、腺苷及氢离子中的至少一种物质处理。
21.权利要求19或20所述的红细胞，其可在100mmHg或以下的氧分压下游离ATP。
22.血红蛋白结构被稳定在R-状态的红细胞。
23.权利要求22所述的红细胞，其用一氧化碳、磺酰脲处理。
24.权利要求22或23所述的红细胞，其可在100mmHg或以下的氧分压下抑制ATP的游离。
25.含有权利要求19～21任意一项所述的红细胞的医药组合物。
26.权利要求25所述的医药组合物，其用于治疗缺血性疾病。
27.权利要求26所述的医药组合物，其中缺血性疾病为选自出血性休克、心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、脑出血、闭塞性动脉疾病、糖尿病导致的血管病、冠状动脉狭窄症、四肢缺血性疾病、闭塞性动脉硬化症、缺血性溃疡？坏死中的至少一种。
28.权利要求26所述的医药组合物，其中缺血性疾病为缺血再灌注综合症。
29.权利要求28所述的医药组合物，其中缺血再灌注综合症是由选自休克后复苏、脏器冷藏后灌注、外科手术后血流再开通和闭塞血管的重建中的至少一个原因引起的。
30.权利要求25所述的医药组合物，其用于治疗酸中毒。
31.含有权利要求22～24任意一项所述的红细胞的医药组合物。
32.权利要求31所述的医药组合物，其用于治疗血管扩张性疾病。
33.权利要求32所述的医药组合物，其中血管扩张性疾病为败血症休克或过敏性休克。
34.一种ATP的测定方法，其特征在于，氧浓度依存性地定量从红细胞游离的ATP量。
35.一种增强ATP从红细胞游离的方法，其特征在于，向红细胞悬浮液中添加腺苷，将所得悬浮液暴露在无氧或低氧分压条件下。
36.权利要求35所述的方法，其中无氧或低氧分压条件为0mmHg～150mmHg的条件。
37.一种增强ATP从红细胞游离的方法，其特征在于，向红细胞悬浮液中添加腺苷，将所得悬浮液暴露在60mmHg～80mmHg的二氧化碳分压条件下。
38.权利要求35～37任意一项所述的方法，其中腺苷的浓度为0.1μmol/L～10μmol/L。
39.一种控制ATP 红细胞游离的方法，其特征在于，向添加了腺苷的红细胞悬浮液中添加抑制带III蛋白的阴离子透过功能的物质。
40.权利要求39所述的方法，其中抑制带III蛋白质的阴离子透过功能的物质为磺酰脲。
41.一种控制ATP从红细胞游离的控制剂，其含有抑制带III蛋白的阴离子透过功能的物质。
42.权利要求41所述的控制剂，其中抑制带III蛋白的阴离子透过功能的物质为磺酰脲。
43.权利要求41或42所述的控制剂，其用于抑制ATP的游离。
全文摘要
本发明提供含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在T－状态的物质的促进ATP从红细胞游离的促进剂，使用该促进剂使ATP从红细胞游离的方法，含有使红细胞中的血红蛋白结构稳定在R－状态的物质的抑制ATP从红细胞游离的抑制剂、使用该抑制剂抑制ATP从红细胞游离的方法。
文档编号A61K31/195GK1905901SQ200480041040
公开日2007年1月31日 申请日期2004年7月1日 优先权日2004年1月29日
发明者末松诚 申请人:学校法人庆应义塾