专利名称：人14－3－3ε蛋白促进神经细胞的分化的制作方法
技术领域：
本发明为利用哺乳动物细胞转染技术发现人14-3-3ε蛋白在大鼠神经干细胞中过表达促进神经细胞的分化，利用酵母双杂交及共转化、细胞免疫荧光等技术发现并证实了人14-3-3ε蛋白可以与Math2蛋白相互作用，并且这种相互作用促进了Math2的核定位，通过双荧光素酶转录活性实验揭示了人14-3-3ε蛋白与Math2蛋白的相互作用增强了Math2蛋白介GAP-43转录激活作用，上调GAP-43的表达，从而揭示了人14-3-3ε蛋白促进神经细胞分化的分子机理，为开发治疗神经退行性病变药物提供可能的分子靶标。
本发明涉及生物医学高技术中新方法、新基因、新蛋白的开发与应用领域。
背景技术：
基因组被称为是“生命的蓝图”。我们人体中的每一个细胞都有这本蓝图，然而我们的细胞却是在功能和形态上千差万别的。造成这一现象的原因是，蓝图的实现在于基因的表达，而每一个基因的表达都受到了严密、精确的调控。基因的表达调控是一个多层次的非常复杂的过程，对于一个具体的基因来说，转录水平的调控是其中一个很重要的环节。
以人脑为代表的中枢神经系统极为复杂，其所表达的基因数目就反映了这一点。人脑表达了人基因组中已知基因的50％以上，所以，人脑的细胞受到了极为复杂的转录调控。
一个具体基因的开启或关闭，以及表达量的多少，是由转录因子和转录调节因子以及这些因子的应答元件决定的。在这一过程中，既有因子和元件的相互作用，也有因子与因子间的相互作用。这些相互作用是在转录水平精密调控基因表达的基础。近年来，人们在研究中发现了很多转录因子蛋白家族，如bHLH蛋白超家族，HOX蛋白家族，Myc蛋白家族，STAT蛋白家族，kelch蛋白超家族，等等，它们都通过与其他的蛋白相互作用来完成精密的转录调节过程。
近年来，含bHLH结构域的蛋白在转录调控中的作用以及在神经发育中的作用正受到越来越多的关注。
含bHLH结构域的转录因子是一个大的家族，在基因转录调控方面起重要的作用。其中一类是在神经系统中特异表达，在神经的发育与神经细胞的分化中起关键的作用。这类bHLH转录因子分两个亚家族一个亚家族是决定因子，即决定细胞的命运，包括Math1、Mash1、Neruogenin-1和Neruogenin-2；另一亚家族是NeuroD亚家族，包括Math2、NeuroD和NeuroD2，它们促进神经细胞的分化。
Math2能够通过bHLH结构域而结合靶基因GAP-43启动子特定的DNA序列，其一致序列为CANNTG，称为E-box或E元件；Math2蛋白结合GAP-43启动子的E-box以后，激活GAP-43启动子的的转录，上调GAP-43的表达，促进神经细胞的分化。
我们对于Math2的关注是在我们研究另外一个基因功能的过程中开始的。这个基因称为14-3-3ε，它编码一个具有255个氨基酸的蛋白。14-3-3蛋白是一个高度保守的、在各种真核细胞中都表达的蛋白家族。14-3-3蛋白家族在哺乳动物细胞中有7个成员，分别为β/α，γ，ε，ζ/δ，η，τ和σ。在线虫、果蝇和植物中也都有两个以上的成员。
迄今为止，14-3-3蛋白结合的靶蛋白有150余种，包括蛋白质激酶，如PKC，Raf；受体蛋白，如GpIb-Ix；酶，如PTPH1，tyrosine phosphatase；结构和骨架蛋白，如Tau，Kif1C；G-Protein及其调节蛋白，如p190RhoGEF；参与细胞周期调控的蛋白，如Chk1，p53；参与基因表达转录调控的蛋白，如TAZ，YAP；参与细胞凋亡调控的蛋白，如BAD，NADE，从而在细胞信号传导、细胞周期调控、基因表达转录调控、细胞凋亡以及神经递质的合成等方面起重要的作用。
关于14-3-3蛋白在神经细胞分化方面的作用，目前报道还不多。在RA诱导的小鼠胚胎瘤细胞F9细胞分化过程中，14-3-3β、ξ、ε、η和τ的表达水平升高，可能与促有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)活性增强有关。14-3-3β在F9细胞的过表达虽然增强了MAPK级联系统的信号，却不足以引起细胞的分化。我们将14-3-3ε在大鼠神经干细胞中过表达，促进神经干细胞的分化。
我们以人14-3-3ε为诱饵蛋白，进行酵母双杂交筛选人三月胎脑cDNA文库，得到了一个克隆，其cDNA序列编码的蛋白为Math2。我们的实验即是以这两者相互作用的发现为线索，探索两者在转录调节中的分子机理，以及两者在神经细胞分化方面的功能。我们的实验，可能为揭示神经细胞分化以及损伤神经再生的机理提供一些线索。
发明内容
Math2是一个具有bHLH结构域的神经转录因子，它激活神经分化相关基因的转录，促进神经细胞的分化。
我们发现1人4-3-3ε和Math2的相互作用，通过这种相互作用增强了Math2的核定位，从而上调靶基因GAP-43的转录激活作用，最终促进神经细胞的分化。
由于人14-3-3ε和Math2的相互作用以及对基因的转录调节是正常人脑中的生命过程，则其因基因突变或非正常表达则可能引起神经方面的疾病。我们的结果揭示了14-3-3ε的过表达促进神经细胞分化的分子机理，从而为开发治疗神经退行性病变药物提供可能的分子靶标。
1.我们首先在大鼠神经干细胞过表达pEGFP-14-3-3ε，同时以pEGFP空载体为对照。结果发现，过表达pEGFP的神经干细胞仍然保持紧密成团的状态，形成神经干细胞球，形态没有发生变化，而过表达pGFP-14-3-3ε的神经干细胞形态发生了显著的分化，不仅细胞迁移，而且有明显的神经突起的生长。结果说明，14-3-3ε能够促进神经干细胞的分化。
2.为了确定人14-3-3ε促进神经细胞分化的分子机制以及参与神经细胞分化的信号通路，我们以14-3-3ε为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库，筛查到与14-3-3ε发生相互作用的蛋白Math2。随后，我们利用蛋白质体外结合技术(Pull-down assay)进一步验证了14-3-3ε与Math2的相互作用是特异的。
3.细胞免疫荧光实验表明，14-3-3ε蛋白与Math2之间的相互作用改变了Math2的亚细胞定位——促进了Math2的入核运输，增强了Math2的核定位，而14-3-3ε蛋白自身的亚细胞定位不发生变化。Math2是一个促进神经细胞分化的转录因子，其自身的亚细胞定位发生变化将对其靶基因的转录调控产生重要的影响。
4.荧光素酶报告基因检测结果表明，14-3-3ε蛋白与Math2之间的相互作用进一步增强了Math2介导的GAP-43启动子的转录激活作用。此外，Western blot结果显示，14-3-3ε在P19细胞中的过表达上调了内源GAP-43的表达水平。
因此，人14-3-3ε通过与Math2的相互作用，增强Math2的核定位，上调GAP-43的表达，从而促进神经细胞的分化。
以上所述及的实验内容和结果也即本发明的技术指标。
图1.人14-3-3ε的过表达促进大鼠神经干细胞的分化a为过表达pEGFP空载体的大鼠神经干细胞；b是过表达pEGFP-14-3-3ε的大鼠神经干细胞。
图2酵母双杂交中His+Y190菌落的LacZ活性检测图3人14-3-3ε的原核表达与纯化1蛋白质分子量标准；2诱导前；3诱导后；4沉淀；5上清；6纯化的融合蛋白。
图4.人14-3-3ε与Math2的体外结合实验(Pull-down assay)1，细胞裂解液；2，GST对照；3，GST-14-3-3ε。
图5.人14-3-3ε蛋白与Math2之间的相互作用促进Math2的核定位a，pEGFP-Math2单独转染Hela细胞；b，pEGFP-Math2与pcDNA4/Myc-14-3-3ε共转染Hela细胞；c，d分别是图a、b用DAPI染核的结果。
图6.人14-3-3ε自身的亚细胞定位不发生变化b，a，pcDNA4/Myc-14-3-3ε单独转染Hela细胞；b，pcDNA4/Myc-14-3-3ε与pEGFP-Math2共转染Hela细胞；c，d分别是图a、b用DAPI染核的结果。
图7人GAP-43基因启动子区E-box分布图8.GAP-43启动子近端簇(E1-E2 E-box)足以能够使得Math2蛋白对GAP-43启动子产生转录激活作用。
图9.人14-3-3ε蛋白与Math2的相互作用增强了进一步增强了Math2介导的GAP-43启动子的转录激活作用图10.人14-3-3ε的过表达促进内源GAP-43的表达水平
1，对照细胞样品；2，14-3-3ε过表达12小时；3，14-3-3ε过表达24小时。
实施例1，试验所需引物
2.人14-3-3ε的过表达促进神经细胞的分化我们用GFP-epsilon FX和GFP-epsilon RE这对引物扩增人14-3-3εcDNA重组质粒，将PCR产物进行EcoR I和Xho I双酶切，同时将pEGFP质粒进行双酶切，将载体和片断重组连接，随后转化DH5α。重组质粒经XhoI/EcoR I酶切鉴定为阳性质粒，测序结果表明14-3-3ε编码区的插入方向及阅读框都正确。
我们用Fugene 6将pEGFP、pEGFP-14-3-3ε分别转染培养的大鼠神经干细胞，48小时后观察神经干细胞形态的变化。结果如图1所示，过表达pEGFP的神经干细胞的形态没有发生变化(图1a)，神经干细胞仍然保持成团状态，形成神经干细胞球。而过表达pGFP-14-3-3ε的神经干细胞形态发生了显著的变化(图1b)，不仅细胞迁移，而且有明显的神经突起的生长。结果进一步说明，14-3-3ε具有促进神经细胞分化的功能。
3.酵母双杂交筛选14-3-3ε的相互作用蛋白我们用EpsilonASFE和EpsilonASRB这对引物对人14-3-3ε的cDNA重组质粒用pfu酶进行PCR扩增，将PCR产物进行EcoR I和Xho I双酶切，同时将pAS2-1质粒进行双酶切，将载体和片断重组连接，随后转化DH5α。从转化的菌落中挑选单菌落，提取重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定以及测序验证。结果表明人14-3-3ε基因的读码框被正确的插入到载体之中。该重组载体在本研究中称为pAS2-1-14-3-3ε。我们将pAS2-1-14-3-3ε转入酵母后分别铺于SD/Trp-和含有不同浓度3-AT的SD/Trp-His-培养基上，观察其生长情况。结果表明，含有pAS2-1-14-3-3ε的酵母Y190转化子不能在SD/Trp-His-+20mM 3-AT培养基生长，LacZ检测呈阴性。说明pAS2-1-14-3-3ε转入Y190后没有自激活现象，可以进行下一步的文库筛选。
我们采用顺序转染法，将clontech公司的4月三人胎脑文库转入含有pAS2-1-14-3-3ε质粒的Y190酵母中，转化子全部铺于SD/Trp-Leu-His-+5mM 3-AT培养基上进行His+克隆的筛选。30℃倒置培养一周后，选择培养皿上直径＞2mm的阳性克隆点种于划格的新鲜SD/Trp-Leu-His-+5mM 3-AT平皿上继续培养，得到45个克隆。经72小时培养后进行β-半乳糖苷酶活性检测。结果His+克隆中共有26个菌落呈现蓝色，即为His+LacZ+克隆(Fig 19)。
将筛选到的酵母克隆中的质粒分别与pAS2-1-14-3-3ε和pAS2-1空载体共转染酵母SFY526菌株，以确定筛选到的蛋白是否能够产生自激活现象以及是否能够与BEX1蛋白在更为严谨的条件下相互作用。
通过双转验证实验，我们在197个His+LacZ+酵母克隆中筛选到了26个非自激活LacZ+克隆。经过测序和对上述筛选到的克隆进行测序，并对测序结果进行NCBI数据库的信息查询，发现图2中所示的第45号克隆编码的蛋白为Math2。
4，重组蛋白质表达和Pull-down试验为了扩增人14-3-3ε基因的编码区，我们用6p-lepsilonFB和6p-lepsilonRX这一对引物，对14-3-3ε的编码区进行PCR扩增，在这一对引物中上游引物使用了14-3-3ε基因读码框和其下游的20个碱基，5’端引入了BamH I酶切位点和保护碱基。下游引物使用了该基因自身的终止密码子，并引入XhoI酶切位点及保护碱基。
将上述引物所扩增的PCR产物用BamH I和XhoI双酶进行末端切割后，和用同样的酶处理的pGEX-6p-1载体进行连接，之后转化DH5α，并对克隆进行PCR鉴定和酶切鉴定，所获的阳性克隆进一步做了测序验证。将构建好的重组质粒pGEX-6p-1-14-3-3ε转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基，培养过夜。过夜培养的菌按1∶100的接种量转接入500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6-0.8，加入IPTG至终浓度达0.2mmol/L，诱导3小时后收集菌体，进行SDS-PAGE鉴定。与对照组相比，pGEX-6p-1-14-3-3ε/BL21(DE3)经诱导后在约56kDa处出现一明显表达条带(Fig 3)。
该融合蛋白通过大量诱导表达后，经sephrose4B纯化，可以得到较为纯净的纯化融合蛋白。
我们将上述的GST-14-3-3ε在BL21中大量表达，应用GST纯化技术，将14-3-3ε结合在Sephrose-4B上。我们用pcDNA6/V5/FLAG-Math2转染细胞后，收集了大约5×106个细胞的裂解物，按照分子克隆原版第三版的标准步骤进行了Pull-down实验，结果如图4说明，14-3-3ε与Math2的相互作用是特异的。
附GST Pull-Down实验步骤1)在两个平行装有50μl Glutathione Sepharose 4B的柱中，分别加入GST-14-3-3ε(1.1nmol)和GST(1.3nmol)，并以10倍柱体积的PBS冲洗。
2)在两个柱中各加入500μl细胞提取液，孵育1h后，以50倍柱体积PBS-T(138mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4，0.05％Tween 20)冲洗。
3)以100μl GST Elution Buffer(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L Glutathione)洗脱。
4)洗脱液进行SDS-PAGE，并以相应抗体进行Western印迹分析。
5.细胞免疫荧光定位我们首先将人Math2的编码区序列构建到pEGFP-N1中。GFP是绿色荧光蛋白，人Math2基因的编码区构建到载体中后，即可以人Math2-GFP融合蛋白的方式获得表达。我们用引物GFPmath2FX和GFPmath2FXRB对酵母双杂交文库筛选得到的第45号克隆进行PCR扩增，扩增出的片段与BamHI和Xho I双酶切的pEGFP-N1载体进行连接，连接产物转化DH5α以获取重组载体，经过酶切鉴定和DNA测序验证，表明Math2基因的读码框已经正确插入载体中，该重组载体命名为pEGFP-N1-Math2。同时，我们设计引物Myc-epsilon FE和Myc-epsilon RX，回收产物后与EcoRI和Xho I双酶切的pCDNA4/Myc/HisA载体进行连接，连接产物转化DH5α以获取重组载体，经过酶切鉴定和DNA测序验证，表明14-3-3ε基因的读码框已经正确插入载体中，命名该重组的质粒为pCDNA4/Myc/HisA-14-3-3ε。
用Lipofectamine2000介导的方法，我们将pEGFP-Math2转染Hela细胞。由于GFP是融合在BEX1的C端的，所以，在一定的波长的激光激发下，可以显示Math2在细胞中的定位(图5a)。结果表明，人Math2蛋白主要定位在细胞核，并在细胞质中有部分分布。
我们将pEGFP-N1-Math2和pCDNA4/Myc/HisA-14-3-3ε共转Hela细胞。细胞经固定后，用anti-Myc(Invitrogen)作为一抗，以罗丹明红标记的兔抗小鼠抗体作为二抗，这样，就可以在共转染的细胞中，通过不同波长的激光激发，看到两个蛋白在同一个细胞中的定位情况。在显微镜下，人Math2-GFP为绿色，全部定位于核(图5b)，在细胞质中无绿色分布。这说明，14-3-3ε通过与Math2的相互作用促进了Math2的入核运输，增强了Math2的核定位。而14-3-3ε与Math2共转染前后，其亚细胞定位不发生变化(图6a，b)。
附细胞免疫荧光试剂浓酸浓硝酸∶浓盐酸＝2∶1(V/V)4％多聚甲醛固定液60ml水中加入4g多聚甲醛，60～80℃水浴中滴加1mol/L的NaOH至溶解透明。待溶液冷却至15℃时用HCl将pH调至7.0。最后用PBS补充至100ml。
透化液0.5％Triton/PBS封闭液3％BSA/PBS封片剂以预先配制的2％DABCO/PBS(Triethy lenediamine)制备90％的甘油实验步骤1).盖玻片的处理将盖玻片分次置入浓酸中浸泡2小时，用去离子水洗净后室温干燥。将经酸处理过的盖玻片投入十倍稀释的多聚赖氨酸溶液中，室温放置5min后取出于60℃干燥1hr或室温过夜。用前将盖玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
2).质粒转染按方法18.3进行。
3).细胞免疫荧光染色(1)细胞固定转染后48hrs用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10～15min。
(2)PBS漂洗，3×5min。
(3)细胞透化室温下，0.5％Triton/PBS透化处理10min。
(4)PBS漂洗，3×5min。
(5)细胞封闭以3％BSA/PBS封闭，37℃，30min或4℃过夜。
(6)一抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按一定的稀释度稀释的一抗(如果进行双免疫荧光分析则同时加入两种一抗)，将盖玻片有细胞的一面朝下伏于一抗上，密封于湿盒中，37℃，30min。
(7)PBS漂洗，3×5min。
(8)二抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按1∶50稀释的荧光素标记的二抗(如果进行双免疫荧光分析则同时加入两种二抗)，37℃，30min。
(9)PBS漂洗，3×5min。
(10)去离子水漂洗去盐，2×5min。
(11)封片取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。立刻用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并照相。
6.人14-3-3ε与Math2的相互作用对Math2介导的GAP-43启动子转录激活作用的影响文献表明，人GAP-43启动子区-1至-1511位点含有8个E-box序列，是神经元特异表达的促进神经分化的标志之一。Math2结合GAP-43启动子区的E-box，激活GAP-43启动子的转录。因此，本研究利用荧光素酶报告基因系统，探讨人14-3-3ε与Math2的相互作用对Math2介导的GAP-43启动子转录激活作用的影响。
GAP-43基因启动区全序列如下
-2001 CACTCTTTGTCCTCTTTTATCACTTAAAATCACGGAAGGCTGTTCTGAAAGCGGCTGGGCTCCTTGTAAC-1931 ATTAAAAAATTATTAAACTCAGAAACTAATTCTGTTTTTTAATCATAAATATGAAAACTAGGAAGCAAAC-1861 TGAGAAGAATGAAAGACCAAATCAGCGGATCTGAAGCAGGCCACTCTCAGGAAGACTCCTGAGGAATAAT-1791 TAAGGCTAATTTTAAATATCACCTCCTGGGTATCATCATCACCATCGTTCCCAGGTACCTGTCTGAGATA-1721 GTCCATTTTGAAATAGATATACCTTAAATTATGTTAAAATGTACTAAGCACTTATTGAGCTCAGTGATCC-1651 TGAAATATGCCTAACAATAAGCTGCCTAGTTGCCACTTATTAGCTAGGTTTATGTCTAGGAGGTCTAGGA-1581 GGGACTATGAAGAATATGAGCTGTTTAATTAGGGGTACTTGTCATCACTAATGAACAACAAGAAATAGTT-1511 TGAAAACTTCTTTGAGATATT TCACCCGAATTTCAGAAAAGTACAGTCTCTGGAGTAA-1441 AGCTATTATACACTCAGAGAGACTGTTGTGCTTTGCATGCGTTATATCATTTAGTCCTCAAAACATGTTG-1371 TCAAGATTGGCATTATTATCTCCATTTTAAAGATGAGAAAATTAGGTGCAAAGAGCTTCAGTAACACACT-1301 CAAACTCATTCAACAATAAATAACTAAAAATTGTGCTATACACACTTTAAGAGT TTCCTCCCCC-1231 AAAATTATGAAAGGCCATAGAAGGAATTCAAGAAGTAGGCTTCATGACTTATCGTTTCTTCTCATCT -1161 AATTCACTTTAATCTCTCATGCCCAAATTGTAAAATATCATTTTGATCACCGTCAATATTACACAGA-1091 CCTGTTTGAATGTGCTCAGCTTTTTCAGTAAAATTAGAAGAAACCACAATTTACAAACAGGTATATGTGC-1021 ATTAAGGAAAAAACAAAAAACTAC ATTTTAGATATGGATGCCAATTCTTAAACATTGTTTATTA-951 TTTCTGAGCT CTTAGAATGTTTAAAATGCAATATATTTATGTGGATTTTTTTCCAGGATATTGG-881 AACATATATAAAATATGCTTGTGCATATCTAAGCTTTGTATTTATTTCAGGTTATATGTATACTGAGAAG-811 AATATATAAACAGTGTATGATATTTACATGTTATTTCATTTTTTGAGGGAAATTAACCTCCACAATTATT-741 AACTATGCATAAAATGTAATGGCAGATATGACTTATATTGTATAGGACTGACTACAATTCCTCTTTAGAA-671 ATAGCTGTTCTTTGCTTTTATAATACTAGGAAAAGAGGAAAAGAGTTCTTAAAGAAATACAAGGATTCCT-601 CAAGCCCCTCTTCCCTAAAACATGCTCTATCATATCTCCTGGATTGACTGGAATATCCTTCTCTGCCCCC-531 ACCCCATCACCCTCTCAATGCAGTGGAAAAGTCGGTGGGTAATTGGGTCCAGATTGGAGGTGTTTAAATA-461 TTCATGAGGCTGGCAGGGGACTGGGAGGGGGCGACTGTCTAGAATGGGGGTAGGGGCTGGGGGAAGTGAT-391 TAGTCACTGAAGGCTAGAGAACAATTCCGAGAAAGAGACGGAGAGAGAGGGAAGAAAAAGACAGATAGAT-321 AGATATTGGGGGGAAGGAGAAAAAAGGAGAAGAGAGGGAAGAGAGGACAGCGGAGAGAGAGCACCAGAGA-251 GAGAGGGAGAGAGAGAGAGAGCGCTAGAGAGAGGGAGCGAG CGATGAGCAATAGCTGTGGACCT-181 TA CTGCTAACTGCCCTGGTGTGTGTGAGGGAGAGAGAGGGAGGGAGGGAGAGAGAGCGCGCTAG-111 CGCGAGAGAGCGAGTGAGCAAGCGAGCAGAAAAGAGGTGGAGAGGGGGGGAATAAGAAAGAGAGAGAAGG-41 AAAGGAGAGAAGGCAGGAAGAAGGCAAGGGACGAGACAACC
人GAP-43启动子序列中的红色字体表示E-box，其中靠近转录起始位点的两个E-box(E1-E2E-box)组成近端簇，位于转录起始位点与上游的-250bp位点之内；其余的6个E-box(E3-E8E-box)组成远端簇，分布于-1511bp与-935bp之间(见图7)。
我们通过PCR分别扩增GAP-43启动子的P1区、P2区和包含8个E-box的区段，将其插入pGL3-basic载体的Kpn I和Xho I之间，构建荧光素酶报告基因重组表达载体GFL，GP1L和GP2L(见图8)。
首先我们研究了人Math2对人GAP-43启动子区不同区段的转录调控作用。我们将pcDNA6/V5-Math2分别与GLC、GP2C、GP1C共转染P19细胞，通过检测荧光素酶报告基因的活性来判断人Math2蛋白是否能激活人GAP-43启动子区不同区段的转录。另外，同时转染的pRL-TK载体能够编码另一种荧光素酶，此酶的活性用作试验的内参照。
结果如图7所示，Math2蛋白能够显著激活GAP-43含全部E-box的启动子区段的转录、GAP-43启动子的核心区E1/E2E-box的转录，而对含E3-E8的启动子区段则没有明显的转录激活作用。结果说明，位于人GAP-43启动子区域近端的E1/E2E-box足以能够使得Math2蛋白对GAP-43启动子产生转录激活作用。
在此基础上，我们又研究了人14-3-3ε与Math2的相互作用对Math2介导的GAP-43启动子转录激活作用的影响。我们将pcDNA4/Myc-14-3-3ε与GP2L、pcDNA6/V5-Math2共转染P19细胞，荧光素酶检测结果表明，14-3-3ε与Math2的相互作用进一步增强了Math2对GAP-43启动子的转录激活作用(图9)。
附荧光素酶报告基因分析的实验步骤和方法样品制备1)将细胞以1×105接种于12孔板，90％汇合时用LIPOFECTAMINE2000进行转染。
2)24-48收集细胞。PBS洗三遍，吸净残余液体，每孔加入150裂解液，室温放置15-20分钟，每隔几分钟晃动一次，使裂解液完全覆盖细胞。
3)收集细胞裂解液，4℃12，000rpm离心2min，收集上清，-70保存备用。
报告基因活性测定使用Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System.基本原理实验所用报告基因载体为pGL3，编码firefly荧光素酶。为了衡量每个孔的转染效率，实验时共转pRL-TK作为内对照，该质粒编码Renilla荧光素酶。这两种酶的底物和反应缓冲液不同，可以用同一样品在同一个试管中测定。firefly荧光素酶反应体系为LAR II，Renilla荧光素酶反应体系为Stop&Glo Reagent，均由试剂盒提供。
1)预热荧光计，设定参数，每次延迟2秒后开始测定，测定时间为十秒。
2)将100μl LAR II加入荧光管，接着加入20μl细胞裂解液，用枪头混匀2-3次，放入荧光计开始读数。
3)记录firefly荧光素酶读数，重复一次。
4)在同一个管中加入100μl Stop&Glo Reagent，混匀，重新放入荧光计开始测定，重复一次。
7.人14-3-3ε的过表达上调细胞内源GAP-43的表达水平我们的研究工作表明，14-3-3ε通过与Math2的相互作用而促进Math2的核定位，从而进一步增强了Math2介导的GAP-43启动子的转录作用。在此基础上，我们将14-3-3ε在P19细胞中过表达，利用抗GAP-43的抗体进行Western blot，检测P19细胞内源GAP-43的表达水平。结果如图10所示，14-3-3ε过表达12小时后，GAP-43表达开始升高，24小时后，GAP-43表达进一步增强。
因此，我们认为，在发育过程中14-3-3ε通过与Math2的相互作用增强Math2的核定位，上调GAP-43的表达而促进神经细胞的分化。
权利要求
1.本发明涉及人14-3-3ε的过表达在神经细胞分化方面的作用、14-3-3ε与Math2之间的相互作用的发现以及二者之间的相互作用对Math2蛋白介导的GAP-43转录激活作用的影响。
2.根据权利要求1所述之人14-3-3ε蛋白，其特征在于，人14-3-3ε的过表达促进神经干细胞的分化。
3.根据权利要求1所述之2个蛋白14-3-3ε与Math2之间的相互作用，其特征在于，14-3-3ε通过与Math2的相互作用促进Math2的入核运输，增强了Math2的核定位。
4.根据权利要求1、3所述及之14-3-3ε与Math2之间的相互作用，其特征在于，通过Luciferase分析，14-3-3ε是通过与Math2之间的相互作用促进Math2的核定位而对Math2介导的GAP43基因启动子转录激活作用进行调节的，14-3-3ε与Math2之间的相互作用可以增强Math2介导的GAP43基因启动子转录激活作用。
5.根据权利要求1、3、4所述之14-3-3ε与Math2之间的相互作用，其特征在于，14-3-3ε在P19细胞中的过表达上调内源GAP-43的表达水平。
6.根据权利要求1、2、3、4、5所述之2蛋白14-3-3ε与Math2，其特征在于14-3-3ε通过与Math2的相互作用，增强了Math2的核定位，上调GAP-43的表达水平而促进神经细胞的分化。
全文摘要
本发明涉及人14－3－3ε蛋白在大鼠神经干细胞中过表达，促进神经细胞的分化。以人14－3－3ε为“诱饵”蛋白，采用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库，获得与之相互作用的一个蛋白Math2。蛋白质体外结合实验证明Math2能够特异地与14－3－3ε相互作用。细胞免疫荧光定位分析、荧光素酶报告基因分析表明，人14－3－3ε通过与Math2的相互作用，增强了Math2的核定位，进一步增强了Math2介导的GAP－43启动子的转录激活作用，上调GAP－43的表达，从而促进神经细胞的分化。结果揭示了人14－3－3ε的过表达促进神经细胞分化的分子机理，从而可能为开发治疗神经退行性病变药物提供分子靶标。
文档编号A61K48/00GK1804042SQ20051000190
公开日2006年7月19日 申请日期2005年1月11日 优先权日2005年1月11日
发明者王来元, 彭小忠, 刘奔, 韩春雨, 强伯勤, 袁建刚 申请人:中国医学科学院基础医学研究所