筛检卷曲相关蛋白激动剂或拮抗剂的方法

专利名称：筛检卷曲相关蛋白激动剂或拮抗剂的方法
技术领域：
本发明涉及筛检卷曲相关蛋白激动剂或拮抗剂的方法。
2.背景技术青光眼青光眼是一组眼病，其特征在于视神经变性。它是导致世界范围内失明的首要原因。发生青光眼的一个主要危险因素是家族史。业已阐释了几种不同的青光眼遗传方式。
原发性先天性青光眼或婴儿青光眼是一种遗传性疾病，其特征在于眼内房水回流系统发育异常，导致眼内压增高，glove或角膜增大(即眼积水)，视神经损伤，最终导致视觉损害。
原发性开角型青光眼(POAG)是一种常见疾病，其特征在于视神经萎缩，导致视野缺损，最终失明。根据发病年龄和临床表现的不同，POAG又主要被分为两组。青年发病的POAG通常在较大儿童或青年期发病，进展迅速，病情严重，伴随较高的眼内压。该型POAG对医学治疗反应较差，通常需要进行眼科手术治疗。成年或晚发型POAG是青光眼中最常见的类型。其症状较青年发病的POAG为轻，发展也更加缓慢，发病年龄不定，通常在40岁以后。该型POAG的眼内压轻度或中度升高，对于常规监测的医学治疗反应满意。不幸的是，由于该病的进展比较缓慢而且没有痛感，因此通常都是在视神经已经发生不可逆性损伤后才被发现。
两种类型的POAG通常都与眼内压升高有关，而眼内压升高是由于房水通过小梁网回流时受到抑制导致的。POAG中人小梁网(HTM)的病理生理学特征在于细胞外基质组分增加，而小梁网细胞数量减少。因此，有可能是由于HTM细胞在结构、功能或数量上的缺陷影响了POAG的发病机理。POAG的病理生理学还涉及人巩膜筛板(HLC)细胞，业已显示该细胞拥有的蛋白表达模式与HTM类似(Steely et al.(2000)Exp.Eye Res 7017-30)。因此，POAG的常见起因可能在于对神经视网膜损伤最具作用的两种组织。因此，为了了解POAG的分子发病机理并制定独特治疗方式，确定并了解HTM和HLC的分子控制机制至关重要。
业已显示，培养的HTM细胞表达多种生长因子受体mRNA，而且，业已显示，这些表达的受体具有功能，因为应用外源性生长因子可以引起生理反应(Wordinger et al.(1998)Invest Ophthalmol Vis Sci 391575-89)。在体内，这些受体可能通过房水中存在的生长因子(aquecrine/旁分泌)或小梁网细胞本身合成或局部释放的生长因子(自分泌)来激活。实际上，业已显示，多种TGF-b同工型可以显著抑制EGF刺激的小梁网细胞增殖，而FGF-1，TGF-a，EGF，IL-1a，IL-1b，HGF，TNF-a，PDGF-AA和IGF-1可以显著刺激细胞外酸化(ibid)。通过高亲和力受体作用的特定生长因子可能涉及HTM正常微环境的维持，也可能涉及POAG的发病机理。
对分子病理学的一种深入探讨源于这样的观察结果，即可以在人和动物中诱导眼内高压的糖皮质激素能够改变培养HTM细胞的细胞骨架结构(Wilson et al.(1993)Current Eye Res 12783-93)。这些细胞骨架改变包括肌动蛋白微丝重组形成交联的肌动蛋白网络(CLANs)，而这种结构改变可能是导致眼内高压的最终生理学改变(Clark et al.(1993)JGlaucoma 4183-88)。实际上，降压类固醇四氢可的松业已显示可以降低由糖皮质激素诱导的眼内高压的眼内压(IOP)，而且还可以抑制这些糖皮质激素介导的HTM细胞骨架方面的改变(Clark et al.(1996)InvOphthal & Vis Sci 37805-813)。
美国专利5,925,748,5,916,778和5,885,776披露了与GLC1A基因突变相关的青光眼诊断方法，以及鉴定青光眼治疗的实验方法，所述青光眼治疗方法调节GLC1A基因编码的MYOC蛋白活性。
Wnt信号通路Wnt基因家族编码在分化和发育过程中起关键作用的分泌型配体蛋白。该家族包括至少15种脊椎动物和无脊椎动物基因，包括果蝇体节极性基因wingless以及一种脊椎动物同系物integrated，Wnt的名字就是从上述两种基因衍生的。Wnt蛋白似乎可以使很多发育和平衡过程变得容易。例如，脊椎动物Wnt1似乎在体节诱导肌节和建立中脑边界的过程中表现积极(见McMahon and Bradley(1990)Cell 621073；Ku and Melton(1993)Development 1191161；Stern et al.(1995)Development 1213675)。在脊椎动物原肠胚形成过程中，Wnt3a，Wnt5a和Wnt5b在原条中的表达是独立而又有所重叠的。在原条区域，Wnt3a是唯一一种能够产生背部(体节)中胚层的Wnt蛋白，而Wnt3a无效等位基因的纯合小鼠没有形成前肢的尾部体节。在脊椎动物肢体建立极性方面，Wnt基因也非常重要，正如业已显示的非脊椎动物同系物wingless，在昆虫肢体发育过程中可以建立极性。在两种情况下，还与刺猬蛋白(Hedgehog)家族成员有相互作用。
Wnt信号通路包括多种涉及Wnt/无翅蛋白信号传导的蛋白质，并与刺猬蛋白发育通路紧密相联。在果蝇中的无翅-刺猬蛋白(wingless-hedgehog)通路中，分泌型无翅蛋白通过卷曲蛋白受体与邻近细胞结合，介导细胞间的相互作用。然后卷曲蛋白受体激活Dishelveled蛋白，阻断Zeste-white-3激酶对Armadillo蛋白(一种β-连环蛋白)的抑制作用。活化的Armadillo蛋白可以与高迁移率组(HMG)蛋白LEF/TCF(淋巴增强因子/T细胞因子)作用，促进细胞核表达刺猬蛋白(hh)基因。刺猬蛋白是一种分泌型蛋白质，可以通过另一个受体——Patched蛋白与邻近Wnt/无翅蛋白活化细胞的细胞结合。刺猬蛋白与Patched受体的结合，激活细胞核表达无翅蛋白，然后该蛋白分泌，进一步加强与邻近刺猬蛋白分泌细胞的相互信号作用。因此，Wnt/无翅蛋白-刺猬蛋白相互信号系统在脊椎动物和非脊椎动物发育过程中，使两种邻近细胞的分化决定更加容易。这导致了分化界线的稳定，其中一边组织分泌刺猬蛋白，而另一边组织则产生无翅蛋白。实际上，细胞表面通过影响一个细胞与另一个细胞以及细胞外基质的差异粘附，在发育和平衡过程中起到至关重要的作用。而且，一旦细胞差异粘附发生，Wnt/无翅蛋白-刺猬蛋白的过程作用就会使邻近细胞层之间的后续信号更加容易。
这种Wnt/无翅蛋白分界对于果蝇体节和附器的产生以及哺乳动物脑和肢体的细分非常重要(Ingham(1994)Curr Biol 41；Niswander et al.(1994)Nature 371609；Wilder and Perrimon(1995)Development 121477)。在非洲爪蟾(Xenopus)中，眼原基和耳泡的原肠胚形成后，卷曲蛋白-2受体(xfz2)高度表达，在鸡中，Wnt基因家族中的一个特别成员Wnt13，业已显示在晶状体和睫状边缘的色素和非色素层增殖上皮中表达(Jasoni et al.(1999)Dev Dyn 215215)。相互作用的Wnt/无翅蛋白-刺猬蛋白通路在正常分化的体节组织的维持方面具有作用。例如，在人类中，体节组织patched基因的散发失能突变可以导致人类肿瘤中最常见类型的基底细胞癌。而且，patched基因的可遗传突变还可导致基底细胞痣综合征，该综合征是一种常染色体显性遗传病，特征在于发育异常，包括肋骨和颅面部改变以及恶性肿瘤(Hahn et al.(1996)Cell 85841；Johnson et al.(1996)Science 2721668)。
最近，业已显示，与哺乳动物Wnt受体卷曲蛋白同源的被称为分泌型或可溶性卷曲蛋白相关蛋白5(SFRP5)的蛋白质优先由脊椎动物视网膜色素上皮细胞(RPE)表达(Chang et al.(1999)Hum Mol Genet 8575)。而且，另一种SFRP，SFRP2业已显示，由内核层细胞特异性表达。结果是视网膜的感光细胞暴露于两种相反梯度的SFRP分子下。由于卷曲蛋白相关蛋白不含跨膜区，它们被认为是一种分泌型、可溶性受体，通过正常七次跨膜卷曲蛋白受体与Wnt信号系统发生作用。实际上，在血管内皮细胞和多种上皮细胞中高度表达的一种sFRP——FrzA可以与Wnt-1蛋白特异性结合，从而通过卷曲蛋白受体阻断Wnt-1信号(Dennis et al.(1999)J Cell Sci 1123815)。
3.发明内容一方面，本发明提供了确定某个研究对象是否倾向于发生青光眼的新方法和试剂盒。在一个实施方案中，所述方法基于测定下述物质的相对水平或活性，所述物质包括卷曲蛋白相关蛋白(FRP)、无翅蛋白(Wnt)信号通路组分、Wnt信号激活基因或Wnt信号激活基因的基因产物。在优选实施方案中，应用源于研究对象的小梁网细胞进行实验。该方法包括在适宜细胞中测定基因损伤的存在或缺如，所述基因损伤的特征在于具有至少下述特征之一(i)编码卷曲蛋白相关蛋白(FRP-1)的基因、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因发生突变；(ii)FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因错误表达；(iii)FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因的调节启动子存在错误或突变，所述错误或突变导致异常表达。
在特别优选实施方案中，诊断方法包括确定至少下述一种现象的存在(a)野生型FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因中存在一个或多个核苷酸的缺失；(b)野生型FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因中存在一个或多个核苷酸的添加；(c)野生型FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因中存在一个或多个核苷酸的取代；(d)野生型FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因中存在染色体整体重排；(e)FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因的转录信使RNA(mRNA)水平发生变化；(f)FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因的转录mRNA中存在非野生型剪接模式；(g)FRP、Wnt信号蛋白或由Wnt信号激活表达的基因的水平或活性异常。
例如，可以通过下述方法检测基因损伤(i)提供含寡核苷酸的探针和引物，所述寡核苷酸可以与以下核酸的正义或反义序列杂交，所述核酸为FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因(野生型或突变型)，或其片段，或者与FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因的天然相关5’或3’侧翼序列；(ii)将探针或引物与含有源于研究对象生物学样本的适宜核酸混合；以及(iii)通过探针或引物与核酸杂交，测定基因损伤的存在或缺如。在一个优选实施方案中，诊断方法和/或试剂盒应用一套引物扩增(如通过PCR或LCR)可能包括突变的FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因的至少一个区域，然后分析扩增产物与正常野生型编码序列之间存在的不同突变或基因表达水平。在另一个优选实施方案中，诊断方法和/或试剂盒应用探针，在适宜严格的条件下，测定其与生物学样本中互补核酸序列的杂交能力，其中，含有野生型FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因的探针没有与样本核酸进行杂交的能力，提示在样本核酸中存在突变；或者含有突变型FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因的探针具有与样本核酸进行杂交的能力，提示在样本核酸中存在突变。在另一个优选实施方案中，可以应用多种方法，包括免疫探测和生化实验，测定FRP、Wnt信号组分或由Wnt信号激活表达的基因编码的蛋白质的水平或活性。
应用本文描述的实验方法和试剂盒获得的信息(单独或结合其他与青光眼发生相关的基因缺陷信息或环境因素)在确定一个无症状个体是否已经或者容易发生青光眼时非常重要。此外，这些信息还提供了更加个性化的预防或治疗该病的方法。
另一方面，本发明还提供了为青光眼防治确定治疗方法的体外或体内试验筛查测试化合物。在一个特殊优选实施方案中，该治疗方法促进Wnt信号。在一个实施方案中，该方法是一个结合试验，主要包括以下步骤(a)形成反应混合物，包括(i)FRP或Wnt信号多肽，(ii)FRP或Wnt信号多肽的结合配体，以及(iii)测试化合物；以及(b)测定FRP或Wnt信号多肽与结合蛋白的相互作用。在有化合物存在的情况下，FRP或Wnt信号多肽与结合蛋白的相关作用存在具有统计学意义的改变(增强或抑制)，提示为Wnt信号的潜在激动剂(拟态剂或增强剂)或拮抗剂(抑制剂)。反应混合物可以是无细胞蛋白制剂如重建蛋白混合物或细胞裂解物、培养的细胞系统、或者含有表达结合配体的异种核酸的重组细胞。
另一个示例实施方案提供了一种筛检测试化合物的试验方法，可以用来鉴定能够促进或增强Wnt信号和/或基因表达的试剂，所述基因由小梁网细胞的Wnt信号调节。在一个实施方案中，筛检试验方法包括将转染了报告基因的细胞与测试化合物混合，然后测定报告基因的表达水平，其中，所述报告基因与启动子操作相连，并由高迁移率组(HMG)蛋白调节(如淋巴增强因子/T细胞因子)。报告基因可以编码，例如产生可检测信号的基因产物，所述可检测信号如颜色、荧光、发光、细胞活性、减少细胞对营养物质的需求、细胞生长和耐药。例如，报告基因编码的基因产物可以选自氯霉素乙酰转移酶，荧光素酶，β半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。
另一方面，本发明描述了治疗青光眼的方法，包括将适宜的细胞(如小梁网细胞)与有效剂量的化合物混合，所述化合物可以促进小梁网基因的表达，所述基因涉及Wnt信号，或由Wnt信号调节。优选化合物是小分子的核酸(包括反义或三体分子以及核酶)，蛋白，肽或拟肽。特别优选的化合物是卷曲蛋白相关蛋白(FRP)拮抗剂。特别优选的拮抗剂是抑制或降低细胞内FRP表达水平的反义、核酶或三体分子。其他优选FRP拮抗剂是抗体，它可以减少或抑制FRP与Wnt的结合。
本发明的其他特征和优势在下面的发明详述和权利要求中将变得更加清晰。
4.


图1显示了人卷曲蛋白相关蛋白(FRP-1)的cDNA序列(序列1)。
图2显示了人FRP-1的氨基酸序列。
图3图示了Wnt信号传导通路。图3(a)显示了基于FRP与Wnt的结合导致的基因表达抑制。图3(b)显示了Wnt刺激基因表达。Wnt与卷曲蛋白(Fz)的结合可以激活disheveled蛋白(Dsh)，该蛋白反过来防止糖原合酶激酶3(GSK3)与蛋白激酶C(APC)的结合，导致β-连环蛋白的积聚，而β-连环蛋白的积聚反过来可以使与转录因子、T细胞因子(TCF)的相互作用变得更加容易，促进基因表达。
5.具体实施方式
5.1.概述总的来说，本发明基于以下发现，即卷曲蛋白相关蛋白-1(FRP-1)在青光眼患者的小梁网(TM)中上调。尽管不希望受到限制，但据认为，Wnt信号通路如图3(b)所示在TM中发挥作用，调节小梁网细胞重要的功能，而FRP-1可以如图3(a)所示拮抗正常的Wnt信号，因此干扰TM细胞功能。
5.2.定义为方便起见，下面给出了本说明书、实施例和后附权利要求中采用的某些术语和短语的含义。
本文所用术语“异常”是指基因产物水平或生物活性的改变，这种改变只存在于青光眼组织或细胞中，但不存在于非青光眼组织或细胞中。例如，异常高水平的卷曲蛋白相关蛋白基因产物与青光眼患者青光眼性小梁网细胞的相关性高于与正常患者非青光眼性小梁网细胞的相关性。而且，Wnt通路组分生物活性的异常低下与正常患者小梁网细胞相关。
如用于多肽如FRP的活性的术语“异常活性”是指与野生型或天然多肽活性不同的活性，或者与健康个体中多肽活性不同的活性。多肽活性的异常可以是因为它较天然对应物活性更强。此外，活性异常还可以因为它较天然对应物活性更弱，或其活性与天然对应物活性无关。活性异常还可以是活性的改变。例如，一种异常肽可以与不同的靶肽发生相互作用。具有异常FRP活性的细胞可以是因为编码FRP的基因过量表达或表达不足。
本文所用术语“激动剂”是指这样一种制剂，它可以直接或间接增强、补充或加强Wnt启动的基因表达，或者由Wnt调控基因编码的蛋白的活性或水平，或者Wnt信号通路中的基因或蛋白。
术语“等位基因”，在本文还可与“等位基因变异体”互换使用，是指一个基因或其部分的另一种形式。等位基因占据同源染色体的相同位点或位置。当一个个体携带某基因的两个完全相同的等位基因时，该个体被称为该基因或等位基因的纯合子。当一个个体携带某基因的两个不同等位基因时，该个体被称为该基因的杂合子。特定基因的等位基因间的差异可以是一个核苷酸或几个核苷酸，还可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。某基因的等位基因还可以是含有突变的基因形式。
本文所用术语“拮抗剂”是指这样一种制剂，它可以直接或间接防止、最小化或抑制Wnt启动的基因表达，或者由Wnt调控基因编码的蛋白的活性或水平，或者Wnt信号通路中的基因或蛋白。
本文所用术语“结合配体”是指一种能与特定基因产物通过非共价力相互作用的物质组合物。例如，卷曲蛋白相关蛋白基因产物的“结合配体”包括能与卷曲蛋白相关蛋白基因mRNAs如FRP-1反义多核苷酸发生相互作用的物质组合物，以及能与卷曲蛋白相关蛋白多肽如Wnt多肽发生相互作用的组合物。
本文所用术语“多肽的生物活性片段”是指一个全长多肽的片段，其中该片段可以特异性模拟或拮抗相对应的全长野生型多肽的活性。
“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”是可以在本文中交互使用的术语。应该理解，这些术语不仅指特定的个体细胞，而且指这样一种细胞的后代或潜在后代。因为在传代过程中，由于突变或环境影响会发生某些修饰，使后代细胞实际上可能与亲本细胞不完全相同，但这些细胞仍属于本文所用术语范畴。
“嵌合多肽”或“融合多肽”是编码例如一种个体FRP多肽的第一种氨基酸序列与定义一个功能区(如多肽部分)的第二种氨基酸序列的融合，所述功能区与FRP多肽的任意一个功能区都不同或基本不同源。一种嵌合多肽可能存在一种异源功能区，该功能区可能存在于也表达第一种多肽的生物体内(虽然属于不同的多肽)，也可能是不同种类的生物体表达的“种间”“基因间”等融合多肽结构。总的说来，融合多肽可以用通式X-FRP-Y来表示，其中FRP代表FRP衍生多肽的一部分，X和Y可以独立缺如或代表在生物体内与FRP序列不相关的氨基酸序列，包括天然发生的突变。
“导入复合体”应该代表一种靶向工具(如可以导致与一种基因、蛋白、多肽或肽以高亲和力与靶细胞表面结合，和/或被靶细胞的细胞或胞核增强摄取的分子)。靶向工具的示例包括固醇(如胆固醇)，脂质(如阳离子脂质，病毒体或脂质体)，病毒(如腺病毒，腺相关病毒和逆转录病毒)或靶细胞特异性结合剂(如被靶细胞特异性受体识别的配体)。优选的复合体在体内非常稳定，防止在靶细胞内化作用前，发生显著的解构。但是，在适宜的条件下，该复合体可以在细胞内裂解，使基因、蛋白、多肽或肽以功能活性的形式释放。
众所周知，基因可以以单拷贝或多拷贝的形式存在于个体基因组内。这些基因副本可以完全相同，也可以存在某些修饰，包括核苷酸取代、添加、倒位或缺失，但这些基因副本仍编码几乎具有相同活性的多肽。因此，术语“编码FRP多肽的DNA序列”是指某个个体中一个或多个基因。而且，核苷酸序列可以在不同生物个体间存在某些差异，这些存在差异的核苷酸序列被称为等位基因。这些等位基因差异可能或不会导致编码多肽的氨基酸序列差异，但编码的多肽仍具有相同的生物活性。
“卷曲蛋白相关蛋白(FRP)”可以是与卷曲蛋白细胞外配体结合功能区相似的分泌型蛋白家族中的任意一员。FRP也指分泌型或可溶性卷曲蛋白相关蛋白(sFRP)，因为它们不含跨膜功能区，因此似乎可以作为Wnt蛋白的主要阴性受体发挥作用。有很多不同的脊椎动物基因编码FRP，这些基因包括人分泌型卷曲蛋白相关蛋白编码基因Frz-l(GenBank存取号AF056087)；人分泌型卷曲蛋白相关蛋白编码基因SFRP5(GenBank存取号AF117758)；人Frz-B基因(GenBank存取号U24163)；以及非洲爪蟾FrzA基因(GenBank存取号AF049908)。
本文所用术语“青光眼”是指一组眼病，其特征在于视神经变性和视野缺损，其原因通常是由于房水回流通道受阻导致的眼内压升高(慢性或开角型青光眼)，或由于虹膜与晶状体之间的压力导致的(急性或闭角型青光眼)。
“同源”或“相同”或“相似”是指在两种肽或两种核酸分子之间序列的相似性。同源性可以通过比较每一序列同一位置得到确定，为了比较的目的，可以进行序列比对。当对比序列的某一位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在该位置相同。核酸序列间同源或相似或相同的程度可以通过核酸序列中相同或匹配核苷酸位置的数量函数来计算。氨基酸序列间的相同程度可以通过氨基酸序列中相同氨基酸的数量函数来计算。氨基酸序列间的同源或相似程度可以通过氨基酸序列中氨基酸即结构相关氨基酸的位置的数量函数来计算。两个核酸或多肽序列中的同源百分比可以应用本领域众所周知的几种数学运算方法之一进行确定(如通过BLAST序列同源软件，该软件可以在下述网址获得http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。“不相关”或“不同源”序列与本发明一种FRP序列的相同程度低于40％，尽管优选相同程度低于25％。
本文所用术语“相互作用”包括在分子间可以检测到的相互作用，如可以应用例如酵母双杂交试验来检测。术语相互作用还包括分子间的“结合”相互作用。相互作用可以，例如是天然存在的蛋白-蛋白或蛋白-核酸或核酸-核酸。
本文所用术语“分离的”如果指核酸，如DNA或RNA，是指分别从其他DNA或RNA中分离的分子，以天然来源的大分子形式存在。例如，编码一个FRP多肽的分离核酸优选包括不超过10千碱基(kb)的基因组DNA FRP天然紧邻侧翼核酸序列，更优选这种天然侧翼序列不超过5kb，最优选这种天然侧翼序列不超过1.5kb。本文所用术语分离的还指基本不含细胞物质、病毒物质的核酸或肽，或在通过重组DNA技术制备时基本不含培养基、以及在化学合成时基本不含化学前体或其他化学物质的核酸或肽。而且，“分离的核酸”还意味着包括非天然核酸片段以及在自然状况下不存在的核酸片段。本文所用术语“分离的”还指从其他细胞蛋白中分离的多肽，并意味着包括纯化重组多肽。
本文所用术语“调制”是指上调(即激活或刺激(如通过激动作用或加强作用))和下调(即抑制或压制(如通过拮抗作用，减弱作用或抑制作用))。
术语“突变基因”是指一个基因的等位基因形式，该突变基因可以使携带突变基因的个体的表型相对于不携带该突变基因的个体发生改变。如果一个个体必须是该突变的纯合子才能发生表型改变，那么该突变被称为隐性。如果单拷贝的突变基因就足以使个体发生表型改变，那么该突变被称为显性。如果携带单拷贝突变基因的个体表型位于(该基因)纯合子和杂合子之间，那么该突变被称为共显性。
本发明的“非人动物”包括哺乳动物，如啮齿类动物、非人灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖类动物、爬行动物、兔等。优选的非人动物选自啮齿类家族，包括大鼠和小鼠，最优选小鼠，尽管在理解和确定可以影响例如胚胎发生和组织形成的制剂时，转基因两栖类动物如非洲爪蟾属成员以及转基因鸡也可以作为很重要的研究工具。本文所用术语“嵌合动物”是指体内存在重组基因表达的动物，或者重组基因在动物的某些细胞但非全部细胞表达的动物。术语“组织特异性嵌合动物”提示，重组基因之一在某些组织而非其他组织中存在和/或表达或受到干扰。
本文所用术语“核酸”是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)，以及在适宜情况下的核糖核酸(RNA)。应该理解，作为等价物，术语还包括从核苷酸类似物中制备的RNA或DNA类似物，并如下述实施方案所用，单链(正义或反义)和双链多核苷酸。
术语“与序列x公布的核苷酸序列互补的核苷酸序列”是指序列x的核酸链的互补链核苷酸序列。本文所用术语“互补链”可以与术语“互补”互换使用。核酸互补链可以是编码链的互补链，也可以是非编码链的互补链。当所指为双链核酸时，序列x的核酸的互补链是指具有序列x核酸序列链的互补链，或者具有序列x互补链的核苷酸序列的任意核酸。当所指具有序列x核苷酸序列的核酸是单链时，该核酸的互补链是具有与序列x核苷酸序列互补序列的核酸。核苷酸序列及其互补序列总是以5’到3’的顺序给出。
术语“多态性”是指一个基因或其部分(如等位基因变异体)有超过一种的形式共同存在。一个基因的某部分，存在至少两种不同的形式，即两种不同的核苷酸序列，就被称为“基因的多态区”。多态区可以是一个核苷酸，该核苷酸在不同的等位基因中表现不同。多肽区的长度也可以是几个核苷酸。
“多态性基因”是指具有至少一个多态区的基因。
本文所用术语“启动子”是指一个DNA序列，可以调节与启动子操作性连接的所选DNA序列的表达，从而影响细胞中所选DNA序列的表达。该术语包括“组织特异性”启动子，即只在特定细胞中(如特定组织的细胞)影响所选DNA序列表达的启动子。该术语还包括所谓的“泻露型”启动子，该启动子不仅调节所选DNA主要在一种组织中的表达，而且可以导致该DNA也在其他组织表达。该术语还包括非组织特异性启动子和构建表达启动子、诱导启动子(即表达水平可以控制)。
在本文中，当指含氨基酸的基因产物时，“蛋白”、“多肽”和“肽”是可以互换使用的。
术语“重组蛋白”是指本发明应用重组DNA技术制备的多肽，通常情况下，编码FRP多肽的DNA被插入到适宜的表达载体中，然后再应用该载体转化宿主细胞，产生异源蛋白。而且，在用于重组FRP基因时，短语“衍生于”是指包括在“重组蛋白”含义之内，那些蛋白具有天然FRP多肽的氨基酸序列，或者与通过突变产生的多肽相似的氨基酸序列，所述突变包括天然形式多肽的取代或缺失(包括截短)。
本文所用术语“小分子”是指一种组合物，其分子量小于大约5kD，优选小于大约4kD。小分子可以是核酸，肽，多肽，拟肽，碳水化合物，脂质或其他有机(含碳)或无机分子。很多制药公司都拥有广泛的化学和/或生物学混合物文库，通常是真菌、细菌或藻类提取物，可以应用本发明任意一种试验方法进行筛选，鉴定可以调制FRP或Wnt信号生物活性的化合物。
本文所用术语“特异性杂交”或“特异性检测”是指本发明核酸分子与脊椎动物优选FRP基因的至少大约6，12，20，30，50，100，150，200，300，350，400或425个连续核苷酸杂交的能力。
在本说明书中所用的遗传学术语“转录调控序列”是指DNA序列，如起始信号、增强子和启动子，可以诱导或调控与其操作性连接的蛋白编码序列的转录。
本文所用术语“转染”是指如通过表达载体，通过核酸介导的基因转移将核酸导入受体细胞。本文所用术语“转化”是指一个过程，在该过程中，细胞的基因型由于细胞摄取外源性DNA或RNA而发生改变，并且，例如，转化细胞表达重组形式的FRP多肽，或者，在反义表达转移基因的情况下，天然形式的FRP多肽的表达受到破坏。
本文所用术语“转基因”是指业已导入到细胞中的核酸序列(编码，如FRP多肽之一，或反义转录物)。转基因可以与其导入的转基因动物或细胞部分或完全异源，即不同，或者与其导入的转基因动物或细胞的内源性基因同源，但是该基因应该被设计成插入或被插入到动物基因组中，插入方式应该可以改变其插入细胞的基因组(如，它可以在某位点插入，使之与天然基因不同，或者它的插入可以导致基因敲除)。转基因还可以游离基因的形式存在于细胞中。转基因还可以包括一个或多个转录调控细胞和其他核酸，如内含子，它们对于所选核酸的最优化表达可能是必需的。
“转基因动物”是指任何动物，优选非人哺乳动物、鸟类或两栖类动物，在这些动物中，动物的一个或多个细胞含有通过人为干预导入的异源核酸，如通过本领域众所周知的转基因技术。将核酸导入细胞，通过周密的基因操作直接或间接导入前体细胞，如通过微注射或注射重组病毒。术语基因操作不包括经典杂交，或体外受精，而是主要指重组DNA分子的导入。该分子可以整合到染色体中，也可以是染色体外的可复制DNA。
本文所用术语“治疗”意欲包括病况或疾病的至少一个症状的治愈或改善。
术语“载体”是指能够将与之连接的另一核酸进行转移的核酸分子。优选载体的一种类型是游离基因，即能够在染色体外进行复制的核酸。优选的载体是那些能够使与它们连接的核酸进行自主复制并表达的核酸。能够指导与它们操作性连接的基因表达的载体在本文被称为“表达载体”。总的说来，在重组DNA技术中应用的表达载体的常用形式是“质粒”，所述质粒通常指环状双链DNA环，以载体的形式不会与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以交互使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明意欲包括其他形式的表达载体，这些载体可以发挥同等功效，并在本领域众所周知。
术语“野生型等位基因”是指一个基因的等位基因，当该基因以双拷贝形式存在于个体时，导致野生型表型。一个特定基因可以有几种不同的野生型等位基因，因为基因中某些核苷酸的改变不会影响一个个体的表型，所述个体携带两个拷贝的核苷酸发生变化的基因。
“Wnt信号通路组分”是指涉及Wnt信号通路的蛋白或蛋白编码基因。这些蛋白的示例包括Wnt，卷曲蛋白(Fz)，disheveled(Dsh)，糖原合酶激酶3(GSK3)，蛋白激酶C(APC)，β-连环蛋白以及高迁移率组(HMG)蛋白(如LEF/TCF(淋巴增强因子/T细胞因子))。
“Wnt蛋白”是指由一大组哺乳动物基因包括Wnt3a，Wnt5a和Wnt5b编码的蛋白。
5.3.青光眼的预后和诊断基于本文公开的发现，即某些青光眼患者FRP水平升高，可以发展出多种青光眼诊断方法。某些诊断方法可以检测核酸序列中存在的突变，这些突变可以导致不恰当的高水平FRP。这些诊断方法可以基于已知的人FRP cDNA核酸序列或编码的氨基酸序列进行开发，所述核酸序列如图1所示，所述氨基酸序列如图2所示。其他诊断方法可以基于人FRP的基因组序列或调控FRP表达的基因序列进行开发。另外一些诊断方法可以基于在mRNA水平的FRP基因表达水平的变化进行开发。含有人FRP基因组序列的质粒可以从NIH-MGC-95文库中获得，其克隆编号为NM-003012。
其他诊断方法还可检测Wnt信号蛋白或编码Wnt信号蛋白的基因的活性和水平。例如，诊断方法可以这样开发，即检测不适宜的低水平Wnt信号活性，包括例如，导致Wnt信号组分功能发生异常的突变，所述Wnt信号组分包括卷曲蛋白(Fz)，disheveled(Dsh)，糖原合酶激酶3(GSK3)，蛋白激酶C(APC)，β-连环蛋白，高迁移率组(HMG)蛋白(如LEF/TCF(淋巴增强因子/T细胞因子))以及刺猬蛋白(Hh)。此外，还可应用基于非核酸的技术，检测任何Wnt信号蛋白量或特异性活性的改变。
目前可以应用多种方法检测基因和基因产物的异常水平或活性。例如，有很多方法可以用来检测人多态性位点的特异性等位基因。检测特异性多态性等位基因的优选方法部分有赖于该多态性的分子特征。例如，多态性位点的多种等位基因形式可能只是DNA中单个碱基对的差异。这些单核苷酸多态性(或SNPs)是遗传变异的主要贡献者，包括所有已知多态性的大约80％，它们在人类基因组中的密度预计平均为1/1000碱基对。SNPs是最常见的二等位基因——仅以两种不同的形式存在(尽管在理论上可能在一个SNP中存在高达4种不同的形式，对应于DNA中存在的4种不同的核苷酸碱基)。但是，SNPs是比其他多态性更稳定的突变，使它们适于在标记物和未知变异体间存在连锁不平衡时进行相关研究，所述未知变异体可以用来绘制致病突变图谱。此外，由于典型的SNPs仅有两个等位基因，可以应用简单的增/减试验方法(plus/minus assay)而不是长度测定法进行基因型分析，使它们更容易进行自动分析。
有多种方法可以用来检测个体中存在的特定单核苷酸多态性。该领域的进步业已提供了准确、简便而且便宜的大规模SNP基因型分析技术。最近，例如，业已披露了几种新技术，包括动态等位基因特异性杂交(DASH)，微板试验诊断凝胶电泳(MADGE)，焦磷酸的荧光检测，寡核苷酸特异性结合，TaqMan系统以及多种DNA“芯片”技术，如Affymetrix SNP芯片。这些方法需要扩增靶基因区，典型的通过PCR进行扩增。其他新开发的方法基于通过侵入性裂解产生小信号分子，然后进行质谱分析或固定挂锁探针和滚环扩增，可能会逐渐消除对PCR的需求。下面将简要介绍几种本领域已知的检测特异性单核苷酸多态性的方法。应该理解，本发明的方法包括所有这些可用方法。
业已发展出几种方法，使单核苷酸多态性的分析变得容易。在一个实施方案中，可以应用专门的耐核酸外切酶的核苷酸检测单碱基多态性，所述耐核酸外切酶的核苷酸如Mundy，C.R.(美国专利号4,656,127)所披露。根据该方法，将与紧邻多态性位点3’端的等位基因序列互补的引物与源于特定动物或人的靶分子进行杂交。如果靶分子上的多态性位点含有与耐特定核酸外切酶的核苷酸衍生物互补的核苷酸，那么该衍生物就会整合到杂交引物的末端。这种整合使引物也耐核酸外切酶，并因此可以进行检测。因为样本中耐外切酶的衍生物特点已知，因此发现引物变得耐核酸外切酶就提示，靶分子多态性位点中存在的核苷酸与反应中应用的核苷酸衍生物互补。该方法的优点在于它不需要测定大量无关序列数据。
在本发明另一个实施方案中，应用基于解决方案的方法来检测多态性位点核苷酸的特点。Cohen，D.et al(法国专利2,650,840；PCT申请号WO91/02087)。如Mundy在美国专利号4,656,127中披露的方法，应用的引物与紧邻多态性位点3’端的等位基因序列互补。该方法应用标记的二脱氧核苷酸衍生物测定该位点的核苷酸特点，如果该二脱氧核苷酸衍生物与多态性位点的核苷酸互补，它就会整合到引物末端。
Goelet，P.et al.(PCT申请号92/15712)描述了另一种被称为GeneticBit Analysis或GBATM的方法。Goelet，P.et al.的方法应用标记终止子和引物的混合物，所述引物与多态性位点的3’端序列互补。因此，可以通过预测靶分子多态性位点中存在的核苷酸测定整合的标记终止子，所述核苷酸与标记终止子互补。与Cohen et al(法国专利2,650,840；PCT申请号WO91/02087)所述方法不同，Goelet，P.et al.的方法优选异相试验，在试验中，引物或靶分子被固定在固相基质上。
最近，业已描述了几种在DNA中检测多态性位点的引物指导性核苷酸整合法(Komher，J.S.et al.，Nucl.Acids.Res.177779-7784(1989)；Sokolov.B.P.，Nucl.Acids.Res.183671(1990)；Syvanen，A.-C.，et al.，Genomics 8684-692(1990)；Kuppuswamy，M.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.SA.)881143-1147(1991)；Prezant，T.R.et al.，Hum.Mutat.1159-164(1992)；Ugozzoli，L.et al.，GATA 9107-112(1992)；Nyren，P.et al.，Anal.Biochem.208171-175(1993))。这些方法与GBATM不同的地方在于，它们全都有赖于标记脱氧核苷酸整合到多态性位点碱基存在差异的部位。在这种形式下，因为信号的强弱与整合脱氧核苷酸的数量成正比，因此，发生于相同核苷酸runs的多态性导致的信号与run长度成正比(Syvanen，A.-C.，et al.，Amet.J.Hum.Genet.5246-59(1993))。
对于导致蛋白翻译永久性终止的突变，蛋白截短试验(PTT)提供了一种有效的诊断方法(Roest，et al.，(1993)Hum.Mol.Genet.21719-21；van der Luijt，et al.，(1994)Genomics 201-4)。对于PTT，首先从可用组织中分离RNA，然后进行逆转录，并通过PCR扩增感兴趣片段。然后将逆转录PCR的产物作为模板，进行巢式PCR扩增，所用引物含有RNA多聚酶启动子和启动真核细胞翻译的序列。感兴趣区域扩增后，整合到引物中的独特功能区可以进行随后的体外转录和PCR产物翻译。翻译产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，出现截短的肽信号提示存在导致蛋白永久性终止的突变。在该技术的改良方案中，当感兴趣靶区域源于单一外显子时，可以应用DNA(而非RNA)作为PCR模板。
可以应用任何类型的细胞或组织获得核酸样本，用于本文描述的诊断方法。在一个优选实施方案中，DNA样本可以获取自体液，例如应用已知技术(如静脉穿刺抽血)获取自血液，或唾液。此外，核酸试验还可在干燥样本(如毛发或皮肤)中进行。
诊断方法还可以直接在组织切片(固定和/或冰冻)上原位进行，所述组织切片源于活检或切除术获得的患者组织，这样就不需要进行核酸纯化了。在这些原位方法中，核酸制剂可以用作探针和/或引物(见例如，Nuovo，G.J.，1992，PCR in situ hybridizationprotocols and applications，Raven Press，NY)。
除了这些主要集中于一种核酸序列检测的方法外，在这些检测方案中还可评价某些特征。例如，可以应用差异显示方法、Northern分析和/或RT-PCR产生指纹特征。
一种优选检测方法是等位基因特异性杂交法，所用探针与Wnt信号组分的至少一个等位基因区域重叠，并在突变或多态性区域周围存在大约5，10，20，25或30个核苷酸，所述Wnt信号组分可以提示青光眼。在本发明一个优选实施方案中，将几种能够与涉及青光眼的等位基因变异体特异性杂交的探针粘附于固相支持物上，如“芯片”(能够支持高达大约250,000个寡核苷酸)。可以通过多种方法使寡核苷酸与固体支持物结合，包括平版印刷术。应用含有寡核苷酸的这些芯片进行突变检测分析的方法，又被称为“DNA探针检测”，如Cronin et al.(1996)HumanMutation 7244所述。在一个实施方案中，芯片含有一个基因至少一个多态性区域的所有等位基因变异体。然后将固相支持物与测试核酸混合，检测与特异性探针的杂交。因此，在一个简单的杂交试验中，可以鉴定一个或多个基因的很多等位基因变异体的身份。
这些技术在分析前还包括核酸扩增步骤。扩增技术对于本领域技术人员来说众所周知，包括但不限于克隆，多聚酶链反应(PCR)，特异性等位基因多聚酶链反应(ASA)，连接酶链反应(LCR)，巢式多聚酶链反应，自主序列复制系统(Guatelli，J.C.et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，转录扩增系统(Kwoh，D.Y.et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，以及Q-β复制酶(Lizardi，P.M.et al.，1988，Bio/Technology 61197)。
扩增产物可以多种方式进行试验分析，包括大小分析，大小分析后的限制性酶切分析，在反应产物中探测特异性标记寡核苷酸引物，等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交，等位基因特异性5’外切酶检测，测序，杂交等。
基于PCR的检测方法包括同时多重扩增多种标记物。例如，本领域众所周知，可以选择PCR引物产生PCR产物，这些产物在大小上互不重叠，可以同时进行分析。此外，还可以应用不同标记的引物扩增不同的标记物，使每一种产物可以区别检测。当然，基于杂交的检测方法使样本中的多种PCR产物可以进行区别检测。其他技术也是本领域已知的，允许对多种标记物进行多重分析。
在一个仅为举例说明的实施方案中，方法包括以下步骤(i)从患者中收集细胞样本，(ii)从样本细胞中分离核酸(例如基因组，mRNA或两者的混合物)，(iii)将核酸样本与一种或多种引物混合，在能够发生杂交和等位基因扩增的条件下，所述引物能与提示青光眼的Wnt信号组分的至少一个等位基因的5’和3’杂交，以及(iv)检测扩增产物。这些检测方案对于分子数量非常低的核酸分子的检测尤为重要。
在研究试验的优选实施方案中，通过限制性酶切图谱的变化可以鉴定提示青光眼的Wnt信号组分的异常水平或活性。例如，分离、扩增(任选)样本和对照DNA，然后应用一种或多种限制性内切酶消化，通过凝胶电泳测定片段长度。
在另一个实施方案中，可以应用本领域已知的多种测序反应直接进行等位基因测序。测序反应示例包括那些基于由Maxim and Gilbert((1977)Proc.Natl Acad Sci USA 74560)或Sanger(Sanger et al.(1977)Proc.Natl Acad Sci USA 745463)开发的技术。还应该考虑，在进行研究试验时(见，例如Biotechniques(1995)19448)，可以应用多种自动测序方法，包括质谱测序(见例如PCT公开内容WO94/16101；Cohen et al.(1996)Adv Chromatogr 36127-162；and Griffin et al.(1993)Appl BiochemBiotechnol 38147-159)。很明显，本领域技术人员应该知晓，在某些实施方案中，测序反应只需检测一个、两个或三个核酸碱基的发生。例如，可以进行A-Track等，例如在只检测一个核酸时。
在另一个实施方案中，可以应用裂解制剂保护剂(如核酶，羟胺或四氧化锇联合哌啶)来检测RNA/RNA或RNA/DNA或DNA/DNA杂合双链中的错配碱基(Myers，et al.(1985)Science 2301242)。通常说来，“错配裂解”领域的技术始于杂合双链的提供，所述杂合双链由含有野生型等位基因和样本的杂交(标记)RNA或DNA形成。然后应用能够裂解双体分子中单链区域的制剂处理该双链双体分子，在对照和样本链之间由于碱基错配会有这样的单链区域存在。例如，RNA/DNA杂交分子可以应用RNase来处理，而DNA/DNA杂交分子则可应用S1核酶处理，消化错配区域。在其他实施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA双体分子可以应用羟胺或四氧化锇联合哌啶来处理，消化错配区域。消化错配区域后，在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过分子大小分离消化获得的物质，确定突变位点。见，例如Cotton et al(1988)Proc.Natl Acad Sci USA 854397；and Saleeba et al(1992)Methods Enzymol.217286-295。在一个优选实施方案中，对照DNA或RNA经标记，便于检测。
在另一个实施方案中，应用能够在双链DNA中识别错配碱基的一种或多种蛋白(即所谓的“DNA错配修复”酶)用于错配裂解反应。例如，大肠杆菌的mutY酶可以裂解G/A错配中的A，而源于Hela细胞的胸苷DNA糖基化酶可以裂解G/T错配中的T(Hsu et al.(1994)Carcinogenesis151657-1662)。根据一个示例实施方案，一种适宜探针可以与源于测试细胞的cDNA或其他DNA杂交。然后应用DNA错配修复酶处理该双体分子，应用电泳等策略检测如果可能有的裂解产物。见，例如美国专利号5,459,039。
在另一个实施方案中，可以应用电泳迁移率的变化鉴定可以提示青光眼的Wnt信号组分的异常水平或活性。例如，可以应用单链构象多态性(SSCP)在突变和野生型核酸之间检测电泳迁移率的差异(Orita et al.(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA 862766，还见Cotton(1993)Mutat Res285125-144；and Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 973-79)。样本和对照位点等位基因的单链DNA片段变性再复性。单链核酸的二级结构会根据序列而有所变化，导致的电泳迁移率的改变可以检测甚至单个碱基的变化。DNA片段可以标记，也可以应用标记探针进行检测。方法的敏感性可以通过应用RNA(而非DNA)得到加强，在RNA中，二级结构对序列变化更敏感。在一个优选实施方案中，研究方法根据电泳迁移率的变化，应用杂合双体分析来分离双链杂合双体分子(Keen et al.(1991)Trends Genet 75)。
在另一个实施方案中，应用变性梯度凝胶电泳法(DGGE)在含有梯度变性聚丙烯酰胺凝胶上检测等位基因的迁移(Myers et al.(1985)Nature313495)。当应用DGGE作为分析方法时，DNA应经修饰，以确保它没有完全变性，例如通过PCR添加一个大约40bp的高熔富GC的GC发夹。在另一个实施方案中，在变性制剂梯度中应用温度梯度，鉴定对照和样本DNA的迁移率差异(Rosenbaum and Reissner(1987)BiophysChem 26512753)。
检测等位基因的其他示例技术包括但不限于选择性寡核苷酸杂交，选择性扩增或选择性引物延伸。例如，制备寡核苷酸引物，该引物中含有的已知突变或核苷酸变异(如等位基因变异体)被置于引物中央，然后在只允许完全匹配杂交发生的条件下将引物与靶DNA进行杂交(Saikiet al.(1986)Nature 324163；Saiki et al(1989)Pro.Natl Acad.Sci USA 866230)。这些等位基因特异性寡核苷酸杂交技术可以在下述情况下用来检测一个突变或多态性区域，所述情况包括当寡核苷酸附着于杂交膜并与标记靶DNA进行杂交时，寡核苷酸与经PCR扩增的靶DNA或很多不同突变或多态性区域进行杂交。
此外，有赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可以与本发明联合使用。作为特异性扩增引物的寡核苷酸可以在分子的中心部分或引物的3’端尽头携带感兴趣突变或多态性区域(这样扩增就有赖于区别杂交)(Gibbs et al(1989)Nucleic Acids Res.172437-2448)，在适宜的条件下，可以防止错配的发生，或者降低多聚酶延伸反应(Prossner(1993)Tibtech 11238)。此外，还需要在突变区域引入新的限制性酶切位点，建立基于裂解的检测方法(Gasparini et al.(1992)Mol.Cell Probes61)。可以预见，在某些实施方案中，可以应用Taq连接酶进行扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88189)。在这些情况下，连接只在下述条件下发生，即5’序列的3’端完全匹配，这样在特定位点检测已知突变是否存在就可以通过检测扩增的存在或缺如来进行。
在另一个实施方案中，等位基因变异体的鉴定通过应用寡核苷酸连接试验(OLA)来进行，如下述文献所述，如美国专利号4,998,617，以及Landegren，U.et al.(1988)Science 2411077-1080。在OLA方法中，应用两个设计能够与靶单链邻接序列杂交的寡核苷酸。其中一个寡核苷酸与分隔标记连接，如，生物素化分隔标记，另一个进行可检测标记。如果在靶分子中存在完全互补序列，寡核苷酸将会杂交，这样他们的末端临近并形成连接底物。连接允许应用亲和素或其他生物素配体使标记的寡核苷酸恢复。Nickerson，D.A.et al.描述了一种结合PCR和OLA的核酸检测试验方法(Nickerson，D.A.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA878923-27)。在该方法中，应用PCR获得靶DNA的指数级扩增，然后应用OLA检测扩增产物。
业已开发出几种基于这种OLA的技术，可以用来检测提示青光眼的Wnt信号组分的异常水平或活性。例如，美国专利号5,593,826披露了一种OLA方法，应用具有3’氨基的寡核苷酸和5’磷酸化寡核苷酸形成一个含有氨基磷酸酯连接的结合物。在Tobe et al((1996)Nucleic Acids Res 243728)描述的另一种OLA变异方法中，OLA与PCR的结合可以在单一微升孔中测定两种等位基因类型。通过将每种等位基因特异性引物标记一个独特的半抗原，即地高辛和荧光素，然后应用半抗原特异性抗体检测每个OLA反应，所述抗体应用不同的报道酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记。该系统可以通过产生两种不同颜色，以高产量形式检测两种等位基因。
本发明的另一个实施方案针对可以检测青光眼易感性的试剂盒。该试剂盒含有一种或多种寡核苷酸，包括能够与至少一个Wnt信号组分的5’和3’杂交的5’和3’寡核苷酸。为了便于随后的分析，产生的PCR产物应该大小适宜，PCR扩增寡核苷酸应该能够与25-2500个分离碱基对杂交，优选大约l00-500个分离碱基。
为了用于试剂盒，寡核苷酸可以是多种天然和/或合成组合物的任意一种，如合成寡核苷酸，限制性片段，cDNA，合成肽核酸(PNAs)等。试验试剂盒还可应用标记寡核苷酸，使试验中的鉴别工作变得更加容易。可以采用的标记示例包括放射性标记，酶，荧光化合物，链霉亲和素，亲和素，生物素，磁性等分，金属结合等分，抗原或抗体等分等。
试剂盒还可以任选包括DNA取样方法。DNA取样方法在本领域技术人员中众所周知，包括但不限于底物，如滤纸等；DNA纯化试剂如NucleonTM试剂盒，裂解缓冲液，蛋白酶溶液等；PCR试剂如10x反应缓冲液，热稳定多聚酶，dNTPs等；以及等位基因检测方法如限制性酶，等位基因特异性寡核苷酸，来自干燥血液用于巢式PCR的变性寡核苷酸引物。
5.4.青光眼治疗药物的筛检试验本发明还提供了鉴定青光眼治疗药物的筛检方法。青光眼的治疗药物可以是任何类型的化合物，包括蛋白、肽、拟肽、小分子和核酸。核酸可以是，例如基因、反义核酸、核酶或三体分子。本发明的青光眼治疗药物可以是Wnt信号组分活性的激动剂，或者是FRP或Wnt信号拮抗活性的拮抗剂。优选的激动剂包括Wnt信号组分或者表达由Wnt信号调控的基因和蛋白。
本发明还提供了鉴定青光眼治疗药物的筛检方法，所述治疗药物能够与FRP蛋白结合，进而干扰其对Wnt信号的阻断，或者治疗药物能够与Wnt信号组分结合，进而激动Wnt信号组分的活性。
根据化合物类型和所需化合物活性，可以应用多种试验方法鉴定本发明化合物。下面披露的是可以用来鉴定青光眼治疗药物的至少一些方法。根据基于小梁网基因活性的Wnt信号，本领域技术人员可以设计其他鉴定青光眼治疗药物的试验方法。
5.4.1.无细胞试验方法可以应用无细胞试验方法鉴定能够与FRP，Wnt信号组分或其配体发生相互作用的化合物。这样的化合物能够，例如修饰FRP，Wnt信号组分或其配体的结构，进而影响其活性。无细胞试验方法还可用来鉴定能够调节FRP或Wnt信号组分与结合配体相互作用的化合物。在一个优选实施方案中，鉴定这些化合物的无细胞试验方法主要包括反应混合物，该反应混合物在有或没有结合配体存在的情况下，含有FRP或Wnt信号组分以及测试化合物或测试化合物库。测试化合物可以是，例如结合配体衍生物，如生物灭活靶肽，或小分子。
因此，本发明的一个示例筛检试验方法包括以下步骤，将FRP、Wnt信号组分或其功能片段、或者结合配体与测试化合物或测试化合物库混和，然后检测复合物的形成。为了便于检测，可以将分子用一种特异性标记物进行标记，将测试化合物或测试化合物库用另一种不同的标记物进行标记。测试化合物与FRP、Wnt信号组分或其功能片段、或其结合配体的相互作用可以在孵育步骤和清洗步骤后，通过测定两种标记的水平进行检测。在清洗步骤后，存在两种标记提示有相互作用。
分子间相互作用还可应用实时BIA(生物分子相互作用分析，Pharmacia Biosensor AB)进行鉴定，该方法检测表面胞质团共振(SPR)，这是一种光学现象。检测有赖于大分子在生物特异性界面上质量浓度的变化，不需要对反应物进行标记。在一个实施方案中，测试化合物库可以固定在传感器表面上，例如，形成一个流动细胞墙。然后，含有FRP、Wnt信号组分、其功能片段、或其结合配体的溶液持续流过传感器表面。在信号记录仪上显示的共振角变化就会提示相互作用的发生。该技术在例如Pharmacia编写的BIAtechnology用户手册中有进一步详细阐述。
本发明的另一个示例筛检试验方法包括以下步骤(a)形成反应混合物，包括(i)FRP或Wnt信号多肽，(ii)其结合配体，以及(iii)测试化合物；以及(b)测定FRP或Wnt信号多肽与结合蛋白的相互作用。如本文所述，FRP或Wnt信号组分与结合配体可以重组制备，从来源中纯化，如血浆，或者化学合成。在有测试化合物存在的情况下，相对于没有测试化合物存在的情况，FRP或Wnt信号组分与结合蛋白的相关作用存在具有统计学意义的改变(增强或抑制)，提示该测试化合物为FRP或Wnt信号生物活性的潜在激动剂(拟态剂或增强剂)或拮抗剂(抑制剂)。这种试验方法的化合物可以同时混和。此外，FRP或Wnt信号组分可以首先与测试化合物混和一段适宜时间，然后将结合配体加入反应混合物。化合物的效果可以通过产生的剂量反应曲线来评价，该剂量反应曲线数据通过应用不同浓度的测试化合物获得。而且，还应进行对照试验，提供用于对比的基线值。在对照试验中，将分离或纯化的FRP或Wnt信号组分加入含有FRP结合配体或Wnt信号组分结合配体的组合物中，然后在没有测试化合物的条件下，定量检测复合物的形成。
可以通过多种技术检测FRP蛋白与FRP结合配体的复合物形成。复合物形成的调制可以应用，例如可检测标记蛋白，如放射标记、荧光标记或酶标记的FRP、Wnt信号组分或结合配体，通过免疫试验或者色谱法进行定量检测。
典型地，需要固定FRP、Wnt信号组分或其结合配体，这样可以使复合物与一种或两种未结合蛋白的分离变得更加容易，还可使试验可以自动进行。FRP或Wnt信号组分与结合配体的结合可以在任何适宜装载反应试剂的容器中进行。示例包括微量滴定板，试管和微量离心管。在一个实施方案中，提供的融合蛋白增加了一个功能区，使蛋白可以结合到基质上。例如，谷光甘肽-S-转移酶融合蛋白可以吸附到谷光甘肽sepharose珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷光甘肽衍生性微量滴定板上，然后再与结合配体例如35S标记的结合配体，以及测试化合物结合，并在能够形成复合物的条件下孵育混合物，例如，在生理状态的盐和pH的条件下，尽管可能需要稍微更严格一些的条件。孵育后，清洗珠子，去除任何未结合标记，基质固定，直接进行放射标记的测定(如将珠子置于闪烁剂中)，或者在随后将复合物分离后，在上清中测定放射标记。此外，从基质中分离复合物，SDS-PAGE分离，然后应用标准电泳技术如下述实施例所述，从凝胶中定量珠子部分存在的FRP或Wnt信号组分或结合配体的水平。
其他将蛋白质固定于基质上的技术也可用于本研究试验方法。例如，可以利用生物素与链霉亲和素的结合，固定FRP，Wnt信号组分或其同类结合配体。例如，可以应用本领域众所周知的技术(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)中制备生物素化的FRP或Wnt信号组分，然后将之固定于链霉亲和素包被的96孔板中(Pierce Chemical)。此外，能与FRP或Wnt信号组分起反应的抗体也可加入平板孔中，通过抗体结合可以将FRP或Wnt信号组分固定于孔中。如上所述，在有FRP或Wnt信号组分存在的平板中孵育FRP或Wnt信号组分、结合蛋白和测试化合物制剂，定量孔中形成的复合物的量。除了上述检测GST-固定复合物的方法外，检测这些复合物的示例方法还包括免疫检测复合物法和酶联试验，前者应用能与FRP或Wnt信号组分结合配体起反应的抗体，或者能与FRP或Wnt信号组分蛋白起反应而且能与结合配体竞争的抗体；后者有赖于检测与结合配体相关的酶活性，可以是内在活性，也可以是外在活性。在后述情况下，酶可以与结合配体化学结合，也可以与其以融合蛋白的形式出现。为了举例说明，结合配体可以与辣根过氧化物酶化学交联，也可以与其基因融合，复合物中多肽的量可以应用酶的发色底物，如3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐或4-chloro-1-napthol来评价。同样，可以提供含有多肽和谷光甘肽-S-转移酶的融合蛋白，然后应用1-氯-2，4-二硝基苯检测GST活性来定量形成的复合物。
对于有赖于免疫检测法的复合物中一种蛋白的定量过程，可以应用抗该蛋白的抗体。此外，复合物中待检测的蛋白质还可能以融合蛋白的形式成为“抗原决定簇标记”，所述融合蛋白除了FRP或Wnt信号组分序列外，还包括第二种多肽，其抗体可以容易地获得(例如通过商业途径)。例如，应用针对GST等分的抗体，上述GST融合蛋白就可以用来定量结合。其他有用的抗原决定簇标记包括myc抗原决定簇(如见Ellisonet al.(1991)J Biol Chem 26621150-21157)，以及pFLAG系统(International Biotechnologies，Inc.)或pEZZ蛋白A系统(Pharmacia，NJ)，所述myc该抗原决定簇包括源于c-myc的10个残基的序列。
无细胞试验方法还可用来鉴定能够与FRP或Wnt信号组分发生相互作用以及能够调制其活性的化合物。因此，在一个实施方案中，将FRP或Wnt信号组分与测试化合物混和，然后监测FRP或Wnt信号组分的催化活性。在一个实施方案中，根据本领域已知方法，检测FRP或Wnt信号组分与靶肽结合的能力。
5.4.2.基于细胞的试验方法除了如上所述的无细胞试验方法，本发明提供的FRP蛋白还使基于细胞的试验方法的产生变得容易，如鉴定小分子激动剂或拮抗剂。在一个实施方案中，将细胞膜外表面表达FRP蛋白的细胞与测试化合物单独孵育，或者与测试化合物以及已知能够与FRP发生相互作用的分子共同孵育，然后应用例如微生理仪检测FRP与测试化合物之间的相互作用(McConnell et al.(1992)Science 2571906)。FRP与测试化合物之间的相互作用可以通过微生理仪检测培养基中酸度的变化来进行。在优选实施方案中，本发明基于细胞的试验方法应用的人类细胞源于正常或青光眼患者的眼组织小梁网。
人类小梁网细胞的培养增殖允许在可重复实验条件下进行该类独特细胞的结构和功能特性研究。人类小梁网细胞可以从小梁网组织粉碎的外植体中有效生长，而且培养细胞可以在体外通过多种途径维持未培养小梁网细胞独特的超微结构特征。小梁网细胞拥有广泛的生化和结构特征，这些特征对于维持房水回流通路非常重要。这些特征包括小梁网细胞生长成为内皮细胞单层，细胞表面呈非血栓性，产生血浆酶原激活因子，活跃的吞噬作用，以及合成粘多糖、胶原、纤连蛋白和其他结缔组织元素的能力。透明质酸酶和其他溶酶体酶的存在强调，人小梁网细胞能够代谢透明质酸和其他细胞外物质。体外小梁网细胞损伤的潜在机制可以通过下述手段进行检验，包括评价例如通路延长、过氧化物暴露和细胞形态激光处理的影响。
基于小梁网细胞或其他类型细胞的试验方法还可用来鉴定化合物，这些化合物可以调制FRP基因的表达，调制FRP mRNA的翻译，或者调制FRP mRNA或蛋白的稳定性。因此，在一个实施方案中，能够产生FRP的细胞，如小梁网细胞与测试化合物共同孵育，检测细胞培养基中产生的FRP的量，并与没有与测试化合物共同孵育的小梁网细胞产生的量进行比较。化合物对FRP的特异性可以通过多种对照分析进行确证，如检测一种或多种对照基因的表达。
测试化合物包括小分子，蛋白和核酸。特别是，该方法可以用来测定FRP反义分子或核酶的功效。
在另一个实施方案中，应用与FRP基因启动子至少一个部位操作性连接的报道基因，通过转染实验，测试化合物对FRP基因转录的作用。基因的启动子区域可以应用本领域已知方法从例如基因组文库中分离。报道基因可以是编码易于定量的蛋白质的任何基因，如荧光素酶或CAT基因，这些基因本领域众所周知。
在一个优选实施方案中，报道基因是能够被Wnt信号转录激活的天然或合成基因。例如，在Wnt诱导下，锯齿蛋白(engrailed)基因被激活。而且，锯齿蛋白表达的增加导致刺猬蛋白基因的诱导转录，使刺猬蛋白基因在Wnt的作用下也被激活。最后，能够由核LEF(tcf)/β-连环蛋白激活的合成报道基因也可以成为衡量Wnt诱导的敏感报道基因。
如本文所述，本发明还涉及通过上述筛检试验鉴定的新制剂及其治疗应用。
5.5.治疗疾病的方法“青光眼治疗药物”可以是拮抗剂，也可以是激动剂，可以是上述任何适宜制剂，包括应用本文提供的药物筛检方法鉴定的分离的多肽，基因治疗构建物，反义分子，拟肽，小分子，非核酸，非肽或制剂。
本发明提供了预防或治疗某个体的方法，所述个体业已罹患或可能罹患与FRP或Wnt通路组分表达或活性异常相关的疾病，如青光眼。
5.5.1.预防方法一方面，本发明提供了一种在个体中预防疾病或病况的方法，该方法包括给该个体应用一种能够调制FRP或Wnt通路组分表达或至少一个FRP或Wnt通路组分活性的制剂，所述疾病或病况与异常的FRP或Wnt通路组分表达或活性相关。具有罹患该疾病风险的个体可以通过如本文所述的诊断或预后方法进行鉴定。预防制剂可以在出现FRP或Wnt通路组分异常的表现症状特征之前应用，这样，疾病或病况就得到预防，或者其进展得到延缓。根据异常FRP或Wnt通路组分的类型，例如，可以应用FRP或Wnt通路组分激动剂或FRP或Wnt通路组分拮抗剂制剂来预防性处理个体。预防方法与本发明的治疗方法类似，将在下面的部分给予进一步阐述。
5.5.2.治疗方法通常说来，本发明提供了一种治疗疾病或病况的方法，该方法包括给个体应用有效剂量的能够调制FRP或Wnt通路组分活性的化合物，所述疾病或病况由异常的FRP或Wnt通路组分活性所致。能够用来减轻涉及FRP或Wnt通路组分活性异常的疾病症状的方法包括，例如如上所述的反义，核酶，和三螺旋分子或小的有机物。适宜化合物的示例包括拮抗剂，激动剂或本文详述物质的同系物。
5.5.3.有效剂量可以在细胞培养或实验动物中应用标准药理学方法检测这些化合物的毒性和疗效，如测定LD50(使群体中50％死亡的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗效果的剂量比率是治疗指数，可以表示为LD50/ED50。优选治疗指数大的化合物。尽管可以应用有毒副作用的化合物，但在设计给药系统时应该注意，将这些化合物定向导入到受累组织部位，使其对未受累细胞的潜在危害最小化，进而减少副作用。
在细胞培养试验和动物研究中获得的数据可以用来制定用于人类的剂量范围。这些化合物的剂量优选位于这样的循环浓度范围内，所述循环浓度包括的浓度x，其ED50的毒性作用很小或没有毒性。剂量可以在该范围内根据所用剂型和给药方式而有所变化。对于本发明方法中应用的任何化合物，开始时其治疗有效剂量都可以从细胞培养试验中估计。在动物模型中可以制定一个剂量，使循环血浆浓度范围包括IC50，包括在细胞培养试验中测定的浓度x的IC50(即测试化合物的浓度可以使症状得到一半抑制)。这些信息可以用来更精确地确定人类应用剂量。例如可以应用高效液相层析测定血浆水平。
5.5.4.在临床试验中监测FRP/Wnt治疗药物的效果根据FRP或Wnt通路组分或疾病遗传学特征，确定预期可以显示最好临床效果的人群的能力使下述方面成为可能1)对已经上市但市场反应不好的药物进行重新定位；2)援救备选药物，其临床开发由于安全性或疗效的限制而不能继续，这种限制是部分患者特异性的；以及3)加速备选药物的开发过程，并使备选药物开发的成本降低，药物标记更加理想(例如，应用FRP或Wnt通路组分作为标记，可以用来使有效剂量最优化)。
治疗FRP或Wnt通路组分的个体，应用通过检测FRP或Wnt通路组分特征对治疗进行监测，所述特征如FRP或Wnt通路组分蛋白水平或活性，FRP或Wnt通路组分mRNA水平，和/或FRP或Wnt通路组分基因转录水平。这些检测指标可以提示治疗是否有效，或者是否应该对治疗进行调制或优化。因此，可以应用FRP或Wnt通路组分作为临床试验期间药物疗效的标记。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种监测某制剂(如激动剂，拮抗剂，拟肽，蛋白，肽，核酸，小分子或其他应用本文所述筛检方法鉴定的备选药物)治疗受试者有效性的方法，该方法包括以下步骤(i)在应用制剂前，获得受试者治疗前样本；(ii)检测治疗前样本中FRP或Wnt通路组分蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平；(iii)获得一个或多个受试者治疗后样本；(iv)检测治疗后样本FRP或Wnt通路组分蛋白、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平；(v)将治疗前样本FRP或Wnt通路组分蛋白、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平与治疗后一个或多个样本的FRP或Wnt通路组分蛋白、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平进行比较；以及(vi)根据结果修正受试者制剂的应用。例如，如果需要将FRP或Wnt通路组分的表达或活性提高到高于检测水平，可以增量使用制剂，即增加制剂的效果。此外，如果需要将FRP或Wnt通路组分的表达或活性降低到低于检测水平，可以减量使用制剂，即降低制剂的效果。
还可以在应用FRP或Wnt通路组分治疗药物前后获取受试者细胞，检测FRP或Wnt通路组分之外的其他基因的表达水平，确认FRP或Wnt通路组分治疗药物不会产生有害的基因表达的增加或降低。可以应用，例如转录profiling来达成这一点。因此，可以应用体内暴露于FRP或Wnt通路组分治疗药物的细胞mRNA以及未暴露于FRP或Wnt通路组分治疗药物的细胞mRNA进行逆转录，然后与含有多种基因DNA的芯片进行杂交，进而比较经过或未经FRP或Wnt通路组分治疗药物处理的细胞的基因表达。如果，例如，FRP或Wnt通路组分治疗药物使个体的原癌基因表达开放，那么这种特定FRP或Wnt通路组分治疗药物可能是不受欢迎的。
5.5.5.配方和应用根据本发明所用的药物组合物可以应用一种或多种生理可接受载体或赋形剂以传统方式制备。因此，化合物及其生理可接受盐类、溶剂可以制备成用于，例如注射、吸入或吹入(通过口腔或鼻腔)或局部外用、口服、口腔、非肠道或直肠的制剂。
对于这样的治疗，本发明化合物可以制备成多种给药方式，包括系统给药，外用或局部给药。所用技术和制剂通常可以参考Remmington’sPharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.Easton，PA。注射通常不是系统给药的优选方式，而口服剂型则是。本发明的局部眼用组合物可以与一种或多种药用赋形剂配伍，如缓冲剂，防腐剂(包括防腐佐剂)，张力调节剂，表面活性剂，助溶剂，稳定剂，舒适感增强剂，缓和剂，pH调节剂和润滑剂。眼部外用组合物的pH通常制备成4.5-8，渗透压为26-320mOSm/kg。对于系统给药，优选注射，包括肌内注射，静脉内注射，腹腔注射和皮下注射。对于注射制剂，本发明化合物可以制成溶液形式，优选溶于生理可兼容缓冲液，如Hank’s液或Ringer’s液。此外，化合物还可制备成固体形式，在用前溶解或再悬。还包括冻干形式。
对于口服给药，药物组合物可以采用例如通过传统方式与药用赋形剂制备的片剂或胶囊的形式，所述药用赋形剂如结合剂(如pregelatinised玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)，填充剂(如乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)，润滑剂(如硬脂酸镁，云母或硅土)，分散剂(如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)，或湿润剂(如硫酸月桂酸钠)。片剂可以应用本领域众所周知的方法进行包衣。口服液体制剂可以采用例如溶液、糖浆或悬液的形式，或者也可以以干品形式呈现，然后在使用前用水或其他适宜载体进行沟兑。这些液体制剂可以通过传统方法与药物添加剂共同制备，所述药用添加剂如悬浮剂(如山梨醇糖浆，纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)，乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯树胶)，非水性载体(如，ationd oil，油脂，酒精或分馏植物油)，以及防腐剂(如甲基或丙基-p-羟安息香酸或山梨酸)。制剂还可以包括适宜的缓冲盐，调味剂，色素和增甜剂。
口服制剂还可以通过适宜制备，控制活性化合物的释放。对于口腔用药，组合物可以采用以传统方式制备的片剂或锭剂的形式。对于吸入给药，本发明应用的化合物可以应用适宜的推进剂通过加压装置或喷雾器以气雾剂的形式方便地给药，所述推进剂如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他适宜气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门来确定，这样可以给予一定数量的药物。例如用于吸入器或吹入器的白明胶胶囊和cartridge，可以制备成含有化合物和适宜粉基的粉剂混合物，所述粉基如乳糖或淀粉。
化合物还可以制备用于通过注射的非肠道给药，如弹丸注射或连续输注。注射制剂可以以单位剂量的形式存在，如在安瓿中或在多剂量容器中，并添加防腐剂。组合物可以采用如下形式，如悬液，溶液或溶于油性或水性载体的乳剂，并可含有如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的制剂。此外，活性成分还可以是粉剂，在使用前用适宜的载体进行沟兑，如无病原体消毒水。
化合物还可制备成直肠用组合物，如栓剂或保留灌肠剂，如含有传统栓剂基质，如可可油或其他甘油酯。
除了前述制剂，化合物还可制备成长效制剂。这些长效制剂可以局部应用，通过植入(如皮下或肌内)或肌内注射。因此，例如，化合物可以与适宜的多聚物或疏水物质(如在适宜的油类中的乳剂)或离子交换树脂一起制备，或者制备成sparingly可溶性衍生物，如sparingly可溶性盐。其他适宜的给药系统包括微球系统，该系统可以在一段较长的时间内，将药物无损性局部导入。该技术应用的微球为前毛细血管大小，可以通过冠脉导管注射到任何所需部分，如心脏或其他器官，而不导致炎症或缺血。应用的治疗药物可以从这些微球中缓慢释放，并通过周围的组织细胞(如上皮细胞)摄取。
系统给药还可以通过经粘膜或经皮途径进行。对于经粘膜或经皮给药，制剂中可以应用能够渗透屏障的适宜渗透剂。这些渗透剂在本领域通常已知，包括，例如经粘膜给药的胆盐和梭链孢酸衍生物。此外，还可应用去污剂使渗透变得更加容易。经粘膜给药可以通过鼻腔喷雾或应用栓剂。对于外用给药，本发明的寡聚体可以制备成本领域通常已知的药膏、油膏、凝胶或霜剂。还可以局部应用洗液治疗损伤或炎症，加速愈合。
在临床工作中，可以通过本领域熟悉的多种方法，将治疗性FRP或Wnt通路组分基因的基因导入系统引入患者中。例如，基因导入系统的药用制剂可以通过眼内注射或系统给药如静脉注射引入，蛋白质在靶细胞中的特异性转导可以主要通过基因导入载体的特异性转染实现，细胞型或组织型表达是由于转录调控序列控制报道基因的表达，或者两者结合。在另一个实施方案中，重组基因的起始导入限制更多，需要定位导入到动物体内。例如，基因导入载体可以通过导管(见美国专利5,328,470)或定位注射(如Chen et al.(1994)PNAS 913054-3057)的方式导入。FRP或Wnt通路组分基因可以以基因治疗构建物的形式通过例如Dev et al.(1994)Cancer Treat Rev 20105-115所述的电击转化技术或transcleral iontophoresis技术导入。
基因治疗构建物的药物制剂或本发明化合物可以主要包括适宜稀释的基因导入系统，或者包括缓释基质，该基质中埋入基因导入载体或化合物。此外，当完整的基因导入系统可以从重组细胞中完全制备时，如逆转录病毒载体，药物制剂可以包括一种或多种制备该基因导入系统的细胞。
如果需要，组合物还可以包装或dispenser装置的形式存在，包装或装置中可以包括含有活性成分的一个或多个剂型单位。例如，包装可以含有金属或塑料衬托，如真空成形泡壳包装。包装或dispenser装置中还可以包括使用说明书。
5.6.试剂盒本发明还提供了用于诊断或预后方法或者用于治疗疾病或病况的试剂盒，所述疾病或病况与异常的FRP或Wnt通路组分蛋白相关。本发明还提供了确定给某受试者应用哪种FRP或Wnt通路组分治疗药物的试剂盒。本发明包括的试剂盒可以检测生物样本中FRP或Wnt通路组分mRNA或蛋白的存在，还可以检测FRP或Wnt通路组分中存在的突变，或者鉴定FRP或Wnt通路组分中的多态性区域。例如，试剂盒可以包括能够检测生物样本中FRP或Wnt通路组分蛋白或mRNA的标记化合物或制剂；检测样本中FRP或Wnt通路组分量的工具；以及将样本中FRP或Wnt通路组分的量与标准进行比较的工具。化合物或制剂可以包装在适宜的容器中。试剂盒还可包括应用试剂盒检测FRP或Wnt通路组分mRNA或蛋白的使用说明书。
在一个实施方案中，试剂盒包括含有有效剂量FRP或Wnt通路组分拮抗剂治疗药物的药物组合物和治疗或预防高血压的使用说明书。在另一个实施方案中，试剂盒包括含有有效剂量FRP或Wnt通路组分拮抗剂治疗药物的药物组合物和治疗眼病如青光眼的使用说明书。通常说来，试剂盒包括含有有效剂量FRP或Wnt通路组分激动剂或拮抗剂治疗药物的药物组合物和作为青光眼治疗药物的使用说明书。例如，试剂盒可以包括含有有效剂量FRP或Wnt通路组分激动剂治疗药物的药物组合物和用作止痛剂的使用说明书。
还有其他试剂盒可以用来确定一个个体是否已经发病或倾向于发病，所述疾病与异常的FRP或Wnt通路组分活性相关。这样的试剂盒可以包括，例如一种或多种核酸探针，所述探针可以与FRP或Wnt通路组分基因或其等位基因变异体或其变异形式的至少一个部分进行特异性杂交。
5.7.FRP或Wnt通路蛋白和核酸的其他应用本发明FRP或Wnt通路组分核酸还可用于以下试验。在一个实施方案中，具有序列1或其部分的人类FRP或Wnt通路组分核酸或者能够与之杂交的核酸，可以用来确定FRP或Wnt通路组分基因的染色体位置。将FRP或Wnt通路组分基因的染色体位置与业已显示与某特定疾病或病况相关的染色体区域位置进行比较，例如通过连锁分析(物理位置临近基因的共同遗传)，可以提示FRP或Wnt通路组分可能具有一定作用的疾病或病况。业已与特定疾病连锁的染色体区域列表可以在，例如McKusick，Mendelian Inheritance in Man(可以通过约翰霍普金斯大学Welch医学图书馆在线获得)和http://www3.ncbi.nih.gov/Omim(OnlineMendelian Inheritance in Man)中获得。而且，FRP或Wnt通路组分基因还可作为染色体标记物用于基因连锁研究，所述研究涉及的基因不是FRP或Wnt通路组分。
基因的染色体定位可以通过本领域众所周知的几种方法进行。例如，应用Southern印迹杂交或杂交体细胞PCR绘图技术可以确定某特定基因位于哪条染色体或染色体片段上。可以将一个基因定位于染色体或染色体区域的其他绘图策略包括原位杂交，标记流式分类染色体预筛检，以及通过与染色体特异性cDNA文库构建物杂交进行预选。
而且，核酸与中期染色体荧光原位杂交(FISH)，是一种将核酸准确定位到染色体上的一步式方法，所述核酸如FRP或Wnt通路组分核酸。该技术应用的核酸可以短至500或600碱基；但是，大于2000bp的克隆与特异性染色体位置结合的可能性更高，所述特异性染色体位置具有简单检测所需要的足够的信号强度。这些技术在如Verma et al.，Human Chromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，NewYork(1988)中有述。应用这些技术，一个基因可以定位于含有大约50-500个基因的染色体区域。
如果显示，FRP或Wnt通路组分基因位于的染色体区域与某种特异性疾病共分离，即相关，那么就需要测定受累个体与未受累个体间cDNA或基因组序列的差异。在突变存在于一些或所有受累个体而非正常个体，提示突变可能是疾病的致病原因。
5.8.药物基因组学单独运用导致个体FRP或Wnt通路组分基因或蛋白缺陷或缺乏的特定改变的知识(FRP或Wnt通路组分基因的遗传特征)，或者结合导致该疾病的其他遗传学缺陷信息，可以针对个体的基因特征，为其定制特定疾病的治疗方法，这就是“药物基因组学”的目标。例如，携带FRP或Wnt通路组分基因某特异性等位基因的个体，可能出现也可能不出现某种特定疾病的症状，或者有发生某种特定疾病症状的倾向。而且，如果这些个体是有症状的，他们对某种药物的治疗也可能有反应，也可能没有反应，但也可能对另一种药物的治疗有反应，所述药物如特异性FRP或Wnt通路组分治疗药物。因此，从一个群体中产生FRP或Wnt通路组分的遗传特征(FRP或Wnt通路组分的群体遗传特征)(如与发生某种疾病相关的FRP或Wnt通路组分基因改变分类)，所述群体具有某疾病或病况的症状，所述疾病或病况由FRP或Wnt通路组分基因和/或蛋白的缺陷和/或缺乏所致，并将某个体的FRP或Wnt通路组分基因特征与群体基因特征相比较，使我们可以筛选或设计预期对某特定患者或患者群(即具有相同遗传改变的患者)安全有效的药物。
例如，FRP或Wnt通路组分的群体遗传特征可以通过在罹患某一疾病的群体中测定FRP或Wnt通路组分的遗传特征达成，如测定FRP或Wnt通路组分基因的同一性，所述疾病由FRP或Wnt通路组分基因的缺陷或缺乏所致。任选地，FRP或Wnt通路组分群体遗传特征还可以包括该群体对FRP或Wnt通路组分治疗药物反应的相关信息，该信息可以通过应用多种方法获得，包括，监测1)FRP或Wnt通路组分相关疾病相关症状的严重性，2)FRP或Wnt通路组分基因的表达水平，3)FRP或Wnt通路组分的mRNA水平，和/或4)FRP或Wnt通路组分的蛋白水平。以及(iii)根据FRP或Wnt通路组分基因中存在的特定基因改变，或者FRP或Wnt通路组分基因，将群体分开或分类。FRP或Wnt通路组分的群体遗传特征还可以任选提示，某些特定改变的患者可能对某种特定治疗方法有反应或没有反应。根据个体FRP或Wnt通路组分遗传特征，应用这种信息或群体特征应该可以预言哪个个体将对特定药物治疗有反应。
在一个优选实施方案中，FRP或Wnt通路组分遗传特征是转录或表达水平特征，以及步骤(i)包括单独确定FRP或Wnt通路组分蛋白的表达水平，或者联合确定已知对该疾病有关的其他基因的表达水平。FRP或Wnt通路组分遗传特征可以在很多患者的疾病不同阶段给予检测。
还可以应用转基因动物进行药物基因组学研究。例如，如本文所述，可以制备转基因小鼠，该小鼠含有FRP或Wnt通路组分基因的特定等位基因变异体。这些小鼠可以通过下述方法创建，例如通过应用人FRP或Wnt通路组分基因等位基因取代小鼠的野生型FRP或Wnt通路组分基因。然后测定这些小鼠对FRP或Wnt通路组分治疗药物的反应情况。
5.9.转基因动物本发明还提供了转基因动物，这些动物可以用于多种目的，如鉴定青光眼治疗药物。本发明转基因动物包括核酸序列中含有突变的非人动物，所述核酸序列可以导致不适宜高水平的FRP(如可以调控FRP表达的转录因子的编码基因发生突变)。此外，转基因动物还可以包括Wnt信号组分的突变，包括卷曲蛋白(Fz)，Disheveled(Dsh)，糖原合酶激酶3(GSK3)，蛋白激酶C(APC)，β-连环蛋白和高迁移率组(HMG)蛋白(如LEF/TCF(淋巴增强因子/T细胞因子))。这些动物可以用来，例如检测通过干扰小梁网细胞基因表达对表型的影响，所述基因的表达受Wnt信号调控。
转基因动物还可以是含有转基因的动物，所述转基因如报道基因，受FRP启动子或其片段的控制。这些动物对于，例如鉴定调制FRP产生的药物非常有用，例如，这些药物可以调制FRP的基因表达。例如，可以根据本领域已知方法，应用FRP cDNA片段筛检基因组文库，分离FRP基因启动子，并对其进行特征鉴定。
在本发明范畴内的其他非人动物还包括(这样的动物)，(该动物中)编码Wnt信号组分的内源性基因的表达发生突变或被“敲除”。这些动物可以用来检测某一Wnt信号组分的缺失是否可以导致某一特定表型。获得转基因和基因敲除非人动物的方法在本领域众所周知，并将在这里给予探讨。
在一个优选实施方案中，本发明提供了用于开展青光眼诊断和治疗的转基因非人动物。例如，在某些优选实施方案中，本发明转基因动物包括异源FRP表达基因，该基因导致眼部组织中FRP基因表达水平增加。在优选实施方案中，眼部组织是小梁网，FRP过度表达细胞是小梁网细胞。在其他更优选实施方案中，小梁网细胞FRP表达水平增加的转基因非人动物至少具有一个青光眼特征性症状，如眼内压(IOP)增高。在某些优选实施方案中，本发明转基因动物提供了体内筛检青光眼治疗化合物和开展青光眼诊断的试验系统。
5.9.1.基于动物的系统本发明的另一方面涉及转基因动物，该转基因动物包括含有本发明转基因的(该动物)细胞，优选(虽然任选)在动物的一个或多个细胞中表达外源性FRP蛋白。FRP转基因可以编码野生型蛋白，也可以编码其同系物，包括激动剂和拮抗剂，以及反义构建物。在优选实施方案中，可以应用，例如能够控制所需表达模式的cis-作用序列，将转基因的表达限制于某些特定类型的细胞、组织或发育阶段。在本发明中，这种嵌合表达的FRP蛋白对于多种形式的连锁分析都很重要，而且提供了另外一种方法，评价例如FRP表达缺乏的效果，在其他部分正常的胚胎中，FRP表达缺乏可能会完全改变组织某一部分的发育情况。为了达到这一目的，可以应用组织特异性调控序列和条件调控序列控制转基因以某一特定空间模式表达。而且，表达的暂时模式可以通过，例如条件重组系统或原核转录调控序列达到。
能够通过位点特异性基因调控在体内使转基因得到表达的基因技术是本领域技术人员众所周知的。例如，现在已有能够使重组酶得到调控表达的基因系统，所述重组酶可以催化靶序列的基因重组。本文所用短语“靶序列”是指能够通过重组酶基因重组的核苷酸序列。靶序列的侧翼序列是重组酶的识别序列，在表达重组酶活性的细胞中通常是切除的或者是反转的。可以设计重组酶催化的重组事件，这样靶序列的重组可以导致FRP蛋白之一的表达激活或抑制。例如，可以设计将能够干扰重组FRP基因表达的一个靶序列切除，如编码拮抗同系物或反义转录物的序列，这样可以激活该基因的表达。这种干扰蛋白表达的过程可以由多种机制产生，如将FRP基因从启动子元件或内部终止子中空间分离。而且，转基因还可以这样制备，其中基因的编码序列由重组酶识别序列侧翼包绕，并在起始时以相对于启动子元件3’到5’的方向转化细胞。在这种情况下，靶序列的反转使研究基因进行了重新定向，即通过将编码序列的5’端以相对于启动子元件的方向定位，这样启动子可以驱动转录的激活。
本发明所有转基因动物都在它们的多种细胞中包括一个本发明转基因，该转基因可以通过调控细胞功能、细胞生长、死亡和/或分化改变“宿主细胞”的表型。因为应用本文描述的一个或多个转基因构建物可以产生本发明转基因生物体，所以将给出通过参考外源性遗传物质制备转基因生物体的一般性论述。为了应用下述方法和材料将特异性转基因序列整合到生物体中，本领域技术人员可以对该一般性论述进行调整。
在一个示例实施方案中，可以应用噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统(Lakso et al.(1992)PNAS 896232-6236；Orban et al.(1992)PNAS 896861-6865)或者酿酒酵母的FLP重组酶系统(O’Gorman et al.(1991)Science 2511351-1355；PCT公开WO92/15694)产生体内位点特异性基因重组系统。Cre重组酶可以催化位于loxP序列之间的干预靶序列的位点特异性重组。loxP序列是34个碱基对的核苷酸重复序列，可以与Cre重组酶结合，而且是Cre重组酶介导的基因重组的必需序列。在Cre重组酶存在的情况下，loxP序列的方向性决定了干预靶序列是切除的还是反转的(Abremski et al.(1984)J.Biol.Chem.2591509-1514)；当loxP序列序列是顺行重复序列时，催化靶序列的切除，当loxP序列是反转重复序列是，催化靶序列的倒位。
因此，靶序列的基因重组有赖于Cre重组酶的表达。重组酶的表达可以通过启动子元件进行调控，所述启动子元件也受调控，如通过外部添加制剂，启动子元件可以是组织特异性的，发育阶段特异性的，可诱导的或可抑制的。这种调控可以使靶序列的基因重组只发生在启动子元件介导的重组酶表达的细胞中。因此，重组FRP蛋白的表达激活可以通过控制重组酶表达得到调控。
应用cre/loxP重组酶系统调控重组FRP蛋白的表达需要构建一个转基因动物，该动物包括编码Cre重组酶和研究蛋白的转基因。通过构建“双”转基因动物可以得到含有Cre重组酶和重组FRP基因的动物。得到这种动物的一种方便方法是将两种转基因动物杂交，这两种转基因动物中，每一种都含有一个转基因，如FRP基因和重组酶基因。
开始构建转基因动物获得的一个优势源于这样的可能性，即研究蛋白的表达对于转基因动物可能有害，所述研究蛋白可以是激动剂，也可以是拮抗剂，所述转基因动物含有重组酶介导的可表达形式的FRP蛋白。在这种情况下，可以繁殖并维持研究转基因在所有组织中都保持静默状态的初始群。该初始群中的个体可以与表达重组酶的动物进行杂交，所述重组酶在动物的例如一个或多个组织和/或以所需时间模式表达。因此，创建一个初始群，例如，初始群中FRP拮抗转基因是静默的，可以进行该初始群后代的研究，在这些后代中，特定组织或特定发育阶段的FRP介导的诱导发生障碍，导致，例如致死性表型的出现。
相似的条件转基因还可应用原核启动子序列进行提供，为了使FRP转基因的表达更加容易，该原核启动子序列需要与原核蛋白同时表达。示例的启动子和相应的转激活原核蛋白可以参考美国专利号4,833,080。
而且，条件转基因的表达还可以通过类似基因治疗的方法进行诱导，其中，编码转激活蛋白，如重组酶或原核蛋白的基因被导入到组织中，并以，例如细胞类型特异性的方式表达。通过该方法，FRP转基因可以一直保持静默状态到成年，除非由转激活子诱导“打开”。
在一个示例实施方案中，本发明“转基因非人动物”可以通过将转基因导入非人动物生殖细胞系来制备。可以应用不同发育阶段的胚胎靶细胞导入转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段，可以应用不同的方法。选择用于实践本发明的任何动物特定细胞系，这些细胞系健康，胚胎生长良好，胚胎生殖核能见度良好，复制适应性良好。此外，单模标本也是一个显著因素。例如，在制备转基因小鼠时，通常应用如C57BL/6的品种或FVB品系(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。优选品种为携带H-2b，H-2d或H-2q单模标本的品种，如C57BL/6或DBA/1。用来实践本发明的品系可以是转基因品系本身，和/或敲除品系(即源于一个或多个基因部分或完全受到抑制的动物)。
在一个实施方案中，转基因构建物被导入到单细胞阶段的胚胎。合子是最佳的显微注射靶目标。在小鼠中，雄性生殖核的直径可以达到大约20微米，这样可以进行再生性注射DNA溶液1-2pl。应用合子作为基因转移的靶目标的一个主要优势在于，在绝大多数情况下，注射的DNA可以在第一次分裂前整合到宿主基因中(Brinster et al.(1985)PNAS 824438-4442)。结果是，转基因动物的所有细胞都携带整合的转基因。这通常在转基因有效传播到初始群后代方面也有所反映，因为50％的生殖细胞将含有转基因。
正常情况下，在适宜的培养基中孵育受精胚，直至出现生殖核。如下所述，大约在这个时候，将含有转基因的核苷酸序列导入雌性或雄性生殖核中。在一些品种如小鼠中，优选雄性生殖核。最优选的是，在雄性合子被卵子核或合子的雌性生殖核处理之前，将外源性遗传物质添加到雄性合子的DNA互补链中。据信卵子核或雌性生殖核可以释放能够影响雄性DNA互补链的分子，可能是通过将雄性DNA的精蛋白置换为组蛋白，从而使雌性和雄性DNA互补链能够更加容易地结合，形成二倍体合子。
因此，优选在雄性DNA互补链受到雌性生殖核影响之前，将外源性遗传物质添加到雄性DNA互补链或其他任何DNA互补链中。例如，外源性遗传物质可以在雄性生殖核刚刚形成后，就添加到早期雄性生殖核中，这个时候，雄性和雌性生殖核相互分离，两个生殖核都紧邻细胞膜。此外，还可在精子经诱导进行decondensation后，将外源性遗传物质添加到精子核中。然后将含有外源性遗传物质的精子添加到卵子中，或者将decondensed精子添加到卵子中，然后立即添加转基因构建物。
可以应用本领域已知的任意方法将转基因核苷酸序列导入到胚胎中，例如，显微注射，电击转化或微脂粒感染技术。转基因核苷酸序列导入胚胎后，可以在体外孵育胚胎，孵育时间不限，也可以将胚胎直接再植入代理宿主，或者在体外孵育一段时间后，再植入宿主。体外孵育至成熟也属于本发明范畴。一种常见方法是在体外孵育胚胎大约1-7天后，将它们再植入代理宿主，具体孵育时间要根据种系来确定。
为本发明起见，合子实际上是二倍体细胞的形成，该细胞能够发育成为一个完整的生物体。通常，合子包括一个含有核的卵，核可以是天然形成的，也可以是人工形成的，所述卵是通过两个来自接合体的单倍体核融合形成的。因此，结合体核必须是天然兼容的核，即这个核可以导致健康合子的形成，合子能够进行分化，并发育成为具有功能的生物体。通常，优选整倍体合子。如果获得了整倍体合子，那么染色体数量的变化相对于接合体来源生物体的整倍体数量就不应该超过1。
除了相似的生物学考虑外，物理学特征也控制着外源性遗传物质的量(如体积)，所述外源性遗传物质可以添加到合子核中，或者添加到构成合子核一部分的遗传物质中。如果没有去除遗传物质，那么外源性遗传物质可以添加的量就会受到在不破坏物理特性的情况下的吸收量的限制。通常，插入的外源性遗传物质的体积不超过大约10皮升。添加的物理学效应必需不能破坏合子的存活能力。DNA序列数量和变异的生物学限制根据特定合子和外源性遗传物质的功能而有所差异，这对于本领域技术人员来说是显而易见的，因为产生合子的遗传物质，包括外源性遗传物质，必须在生物学上能够启动并维持合子的分化和发育，使之成为一个具有功能的生物体。
添加到合子中的转基因构建物的拷贝数量有赖于添加的外源性遗传物质的总量，而且该拷贝数量将是能够使基因转化发生的数量。理论上只需要一个拷贝，但是通常情况下，需要应用多拷贝，例如，为了保证一个拷贝具有功能，需要应用1,000-2,000拷贝的转基因构建物。对于本发明，为了增强外源性DNA序列的表型表达，使每个插入的外源性DNA序列有超过一个的功能拷贝通常是具有优势的。
可以应用任何能够将外源性遗传物质添加到核遗传物质中的技术，只要这种技术不破坏细胞、核膜或其他现存的细胞结构或基因结构。优选通过显微注射技术将外源性遗传物质插入到核遗传物质中。显微注射的细胞和细胞结构已知，并在本领域得到应用。
应用标准方法可以完成再植。通常情况下，代理宿主是麻醉的，胚胎被植入到输卵管中。植入特定宿主的胚胎数量根据品种的不同而有差异，但通常与该品种自然生产的后代数量相匹配。
可以应用任何适宜方法筛检代理宿主转基因后代转基因的存在和/或表达情况。筛检通常可以通过PCR，Southern印迹或Northern印迹分析完成，分析中应用与转基因至少一个部分互补的探针。可以采用Western印迹分析作为筛检转基因产物存在的替代或其他方法，分析应用抗转基因编码蛋白的抗体。典型地，从尾部组织中制备DNA，然后应用Southern印迹或PCR法分析转基因。此外，尽管任何组织或细胞类型都可用于该分析，但可以应用据信表达转基因水平最高的组织或细胞进行转基因存在和表达的测试，所述测试可以应用Southern分析或PCR法。
评价转基因存在的其他替代方法包括但不限于适宜的生物化学方法，如酶和/或免疫学方法，特定标记物或酶活性的组织学染色，流式细胞仪分析等。血液分析还可用来检测血液中转基因产物的存在，并评价转基因对多种类型血细胞和其他血液组分水平的影响。
可以通过将转基因动物与适宜的配体进行交配获得转基因动物后代，也可以通过将转基因动物的卵子和/或精子体外受精获得转基因动物后代。在与配体进行交配的时候，该配体可以是也可以不是转基因动物和/或基因敲除动物；当该配体是转基因动物时，它可以包括同一或不同的转基因，也可以同时包括同一和不同的转基因。此外，配体可以是亲本系。当采用体外受精时，受精胚胎可以植入到代理宿主体内，也可以体外孵育，或者在体外孵育后植入代理宿主体内。无论应用哪一种方法，都应该应用上述方法或其他适宜方法评价后代转基因的存在情况。
根据本发明制备的转基因动物包括外源性遗传物质。如上所述，在某些实施方案中，外源性遗传物质是导致FRP蛋白(激活剂或拮抗剂)产生的DNA序列，反义转录产物或FRP突变体。而且，在这些实施方案中，该序列还与转录调控元件相连接，如启动子，该启动子优选能够使转基因产物在某一特定类型的细胞中得到表达。
还可应用逆转录病毒感染将转基因导入到非人动物中。发育的非人胚胎可以体外培养到胚泡期。在此期间，分裂球可以作为逆转录病毒感染的靶细胞(Jaenich，R.(1976)PNAS 731260-1264)。分裂球的有效感染可以通过酶处理去除透明带获得(Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986))。所用导入转基因的典型病毒载体系统是携带转基因的复制缺陷型逆转录病毒(Jahner et al.(1985)PNAS 826927-6931；Van der Putten etal.(1985)PNAS 826148-6152)。可以通过在单层产病毒细胞上培养分裂球获得有效而容易的转染(Van der Putten et al.，supra；Stewart et al.(1987)EMBO J.6383-388)。此外，还在更晚一些的阶段进行感染。可以将病毒或产病毒细胞注射到分裂腔内(Jahnet et al.(1982)Nature 298623-628)。绝大多数初始群将成为转基因嵌合体，因为整合只发生在一部分细胞中，形成转基因非人动物。而且，初始群还可以含有在基因组不同位点上插入的多种逆转录病毒转基因，在后代中通常会分离。此外，还可以通过逆转录病毒宫内感染妊娠中期胚胎，将转基因导入到生殖细胞系(Jahner et al.(1982)，supra)。
转基因导入的第三类靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞可以从体外培养的植入前胚胎中获得，并与胚胎融合(Evans et al.(1981)Nature292154-156；Bradley et al.(1984)Nature 309255-258；Gossler et al.(1986)PNAS 839065-9069；and Robertson et al.(1986)Nature 322445-448)。可以通过DNA转染或逆转录病毒介导的转导有效地将转基因导入ES细胞。然后，可以将这些转化的ES细胞与来自非人动物的胚泡结合。这样，ES细胞可以定殖在胚胎中，形成能够产生嵌合动物的生殖细胞系。综述见Jaenisch，R.(1988)Science 2401468-1474。
在一个实施方案中，应用基因打靶技术将变化引入培养的胚胎干细胞中，所述基因打靶技术是一种应用同源重组修饰动物基因组的方法。通过靶定ES细胞内感兴趣FRP基因，这些变化可以导入动物的生殖细胞系，产生嵌合体。基因打靶过程可以通过将DNA靶构建物引入组织培养细胞完成，所述DNA靶构建物包括与靶FRP位点同源的片段，还包括对FRP基因组序列进行修饰的所需序列(如插入，缺失，点突变)。然后筛检准确打靶的处理细胞，鉴定并分离那些业已适当打靶的细胞。
胚胎干细胞基因打靶技术实际上是本发明考虑的一种方案，是通过应用打靶转基因构建物破坏FRP基因功能的一种方法，所述打靶转基因构建物被设计成能够与一个或多个FRP基因组序列进行同源重组。可以安排打靶构建物，在与FRP基因某一元件重组的基础上，将阳性筛选标记物插入(或置换)基因的编码序列。插入的序列不仅干扰破坏了FRP基因的功能，而且提供了一种阳性筛选性状。FRP的示例打靶构建物将在下面给予更加详细的描述。
通常，用来产生基因敲除动物的胚胎干细胞(ES细胞)与产生的基因敲除动物是同一种系。因此，例如，小鼠胚胎干细胞通常被用来产生基因敲除小鼠。
可以应用技术人员众所周知的方法产生并维持胚胎干细胞，如Doetschman et al.(1985)J.Embryol.Exp.Morphol.8727-45所述的方法。可以应用任何ES细胞系，但是典型情况下，选择的细胞系应该具有这样的能力，细胞可以整合进入发育胚胎中，并成为生殖细胞系的一部分，进而产生敲除构建物的传动生殖细胞系。因此，任何据信具有这种能力的ES细胞系都适用于本发明。一种用来产生ES细胞的典型小鼠品系是129J。另一种ES细胞系是鼠细胞系D3(American Type CultureCollection，分类号CKL 1934)。另一种优选ES细胞系是WW6细胞系(Ioffe et al.(1995)PNAS 927357-7361)。可以应用技术人员众所周知的方法培养细胞，准备敲除构建物的插入，所述方法如Robertson inTeratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson，ed.IRL Press，Washington，D.C.；Bradley et al.(1986)Current Topics in Devel.Biol.20357-371；and Hogan et al.(Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)所披露。
可以应用多种本领域众所周知的方法，将敲除构建物插入到ES细胞中，这些方法包括，例如电击转化，显微注射以及磷酸钙处理。插入的优选方法是电击转化。
每个准备插入到细胞中的敲除构建物必须首先是线形的。因此，如果敲除构建物业已插入到载体中(下述)，可以应用适宜的限制性内切酶消化DNA来获得线性化，选择的限制性内切酶应该只在载体序列内进行酶切，而不在敲除构建物序列内进行酶切。
对于插入，根据所选插入方法，在适宜条件下将敲除构建物添加到ES细胞中，所述适宜条件技术人员已知。当导入ES细胞的构建物超过一个时，可以将这些敲除构建物同时导入，也可以每次导入一个。
如果ES细胞将进行电击转化，应用点击转化仪将ES细胞和敲除构建物DAN暴露于电脉冲，并按照生产厂商的使用说明进行。典型地，电击转化后，在适宜的孵育条件下使ES细胞恢复。然后筛检细胞，检视敲除构建物的存在情况。
可以应用多种方法进行筛检。例如，当标记基因是抗生素耐药基因时，可以在致死浓度抗生素存在的情况下培养ES细胞。推测那些能够存活的ES细胞可能整合了敲除构建物。如果标记基因不是抗生素耐药基因，可以应用Southern印迹法，用设计的只能够与标记序列杂交的DNA序列作为探针，分析ES细胞基因组DNA。此外，还可应用PCR法。最后，如果标记基因是编码酶的基因，所述酶活性可以检测(如b-半乳糖苷酶)，可以在适宜条件下将酶作用底物添加到细胞中，然后分析酶活性。本领域技术人员可能对其他有用的标记物非常熟悉，并熟知在给定细胞中检测这些标记物存在的方法。所有这些标记物都在本发明教义的考虑范畴之内。
敲除构建物可能整合到ES细胞基因组的多个位点，由于随机插入事件的发生，敲除构建物可能在每个ES细胞基因组中整合的位点有所不同。插入的所需位置位于将被敲除DNA序列的互补位点，如FRP编码序列，转录调控序列等。典型地，实际上只有少于大约1-5％摄取了敲除构建物的ES细胞在所需位点整合了敲除构建物。为了鉴定那些适当整合了敲除构建物的ES细胞，应用标准方法从ES细胞中提取总DNA。然后，应用设计的探针对DNA进行Southern印迹分析，所述探针能够以特定形式与应用特定限制性酶消化的基因组DNA杂交。此外，或者另外，还可以应用探针通过PCR扩增基因组DNA，所述探针经特意设计，可以扩增特定大小和序列的DNA片段(即，只有在适宜位置含有敲除构建物的那些细胞才会产生适宜大小的DNA片段)。
鉴定了在适宜位置含有敲除构建物的适宜细胞后，就可以将细胞插入到胚胎中了。插入可以通过技术人员熟知的多种方式进行，但是，优选的方法是显微注射。对于显微注射，在微量加样枪中收集大约10-30个细胞，然后注射到胚胎中，所述胚胎处于适宜的发育阶段，允许含有敲除构建物的异体ES细胞整合到发育胚胎中。例如，如下述实施例所述，转化的ES细胞可以被显微注射到胚球中。
用于插入ES细胞的胚胎适宜发育阶段非常依赖动物品种，但是对于小鼠来说，该阶段大约为3.5天。胚胎是通过灌注雌性妊娠动物子宫获得的。进行该过程的适宜方法是技术人员已知的，如Bradley et al.(supra)所披露。
尽管任何适宜发育阶段的胚胎都适用，优选雄性胚胎。在小鼠中，优选的胚胎还具有编码毛皮颜色的基因，所述基因编码的毛皮颜色与ES细胞基因编码的毛皮颜色不同。按照这种方式，可以通过寻找嵌合毛皮颜色(提示ES细胞整合进入发育胚胎)容易地筛查出敲除构建物的存在。因此，例如，如果ES细胞系携带的基因编码白色皮毛，选择的胚胎携带的基因就应该编码黑色或棕色皮毛。
ES细胞导入胚胎后，可以将胚胎植入假孕抚育母体子宫进行孕育。尽管可以应用任何雌性动物作为抚育母体，典型的抚育母体应按照下述条件进行选择，即具有繁殖和生殖的良好能力，具有照顾下一代的能力。这些抚育母体可以通过与进行了输精管切除术的同种雄性动物交配来制备。假孕抚育母体的阶段对于成功植入是至关重要的，该时间是品种依赖性的。对于小鼠，该阶段大约为假孕2-3天。
在采用了皮毛颜色筛选策略的情况下(如上所述，并见下述实施例)，可以首先通过嵌合皮毛颜色筛检抚育母体生养的后代。此外，或者作为替代，还可应用如上所述的Southern印迹和/或PCR方法，筛检后代尾部组织DNA中敲除构建物的存在。为了产生纯合的敲除动物，可以将显示嵌合性状的后代进行彼此杂交，前提是这些动物据信在其生殖细胞中携带敲除构建物。通过Southern印迹分析同等数量的基因组DNA来鉴定纯合子，所述基因组DNA来自该杂交产生的小鼠，以及已知是杂合子的小鼠和野生型小鼠。
还有其他方法可以用来鉴定和阐明敲除后代的特征。例如，可以应用Northern印迹来分析mRNA中敲除基因、标记基因或者两种基因的编码转录产物的存在或缺如。此外，可以应用Western印迹来评价后代中多种组织敲除的FRP基因的表达水平，可以应用针对特定FRP蛋白的抗体或者针对标记基因产物的抗体进行Western印迹分析，前提是该基因得到表达。最后，可以应用适宜的抗体对后代的多种细胞进行原位分析(如固定细胞，应用抗体标记)和/或FACS分析(荧光激活细胞分类)，寻找敲除构建物基因产物的存在或缺如。
其他制备敲除或破坏转基因动物的方法也众所周知。见，例如Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。还可通过，例如同源重组插入靶序列，产生重组酶依赖性敲除，这样可以通过重组酶序列控制FRP基因的组织特异性和/或时间调控性失活(下述)。
可以通过多种方式，制备含有一个以上敲除构建物和/或一个以上转基因表达构建物的动物。制备的优选方式是产生一系列哺乳动物，每种含有一个所需转基因表型。这些动物通过一系列杂交、回交和筛选进行繁殖，最终产生含有所有所需敲除构建物和/或表达构建物的单一动物，其中，动物除了存在敲除构建物和/或转基因外，是野生型的同源株(异常一致)。
本发明还以下述实施例的形式进行阐释，但这些实施例不应被视为以任何形式对本发明的限制。所有引用参考文献内容(包括本申请全部引用的参考文献，授权的专利，公开的专利申请以及共同未决的专利申请)在此引入，作为参考。除非有特别指示，本发明的实践方法均采用传统细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学技术，这些技术属于本领域常规技术。这些技术在文献中有全面介绍。见，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.by Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor LaboratoryPress1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.美国专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；论著，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
6.1.卷曲相关蛋白1(FRP-1)与青光眼的关系材料与方法通过RNA差异显示鉴定的卷曲相关蛋白cDNA序列AACAGCCTGCCTGTCCCCCCGCACTTTTTACATATATTTGTTTTCATTTCTGCAGATGGAAAGTTGACATGGGTGGGGTGTCCCCATCCAGCGAGAGAGTTTCAAAAGCAAAACATCTCTGCAGTTTTTCCCAAGTACCCTGAGATACTTCCCAAAGCCCTTATGTTTAATCAGCGATGTATATAAGCCAGTTCACTTAGACAACTTTACCCTTCTTGTCCAATGTACAGGAAGTAGTTCT(序列3)6.2.重组FRP或Wnt通路基因在COS细胞中的表达本实施例描述了一种在哺乳动物表达系统中产生全长人类FRP或Wnt通路组分基因的方法。
可以通过下述方法，构建含有编码全长人类FRP或Wnt通路组分蛋白或者可溶性FRP或Wnt通路组分蛋白的核酸表达构建物。应用基于序列1公开的序列信息的PCR引物，通过逆转录(RT-PCR)mRNA获得上述编码全长人类FRP或Wnt通路组分蛋白或者可溶性FRP或Wnt通路组分蛋白的核酸，所述mRNA提取自表达FRP或Wnt通路组分的人细胞，如人小梁网细胞。PCR引物还可以含有适宜的限制性酶切位点，用于引入表达质粒。然后将扩增的核酸插入到真核表达质粒如pcDNAI/Amp(InVitrogen)中，所述质粒含有1)SV40复制起点；2)氨苄青霉素耐药基因；3)大肠杆菌复制起点；4)CMV启动子以及随后的多接头区域，SV40内含子和聚腺苷酸位点。然后将编码全长人类FRP或Wnt通路组分以及在其3’端框架融合的HA或myc标签的DNA片段克隆到多接头区域。如前所述(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，ACherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)，HA标签对应于衍生于流感病毒血凝素蛋白的抗原决定簇。HA标签与FRP或Wnt通路组分的融合使应用能够识别HA抗原决定簇的抗体来检测重组蛋白更加容易。
为了表达重组FRP或Wnt通路组分，可以通过DEAE-DEXTRAN法应用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。应用抗HA抗体，可以通过放射标记和免疫沉淀法(E.Harlow，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1988))检测FRP或Wnt通路组分-HA蛋白的表达。为了检测，转染细胞在转染两天后应用35S半胱氨酸标记。然后收获细胞或者培养基(如，对于可溶性FRP或Wnt通路组分)，使FRP或Wnt通路组分蛋白与HA特异性单克隆抗体进行免疫沉淀反应。或者，也可以通过Western印迹分析检测重组蛋白的表达。为了确定全长FRP或Wnt通路组分是膜蛋白，还是分泌型蛋白，可以应用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5))裂解转染了编码全长FRP或Wnt通路组分蛋白载体的细胞。(Wilson，I.et al.Id.37767(1984))。然后在SDS-PAGE凝胶上分析沉淀蛋白。因此，细胞中存在FRP或Wnt通路组分可以提示全长FRP或Wnt通路组分是膜结合的，而在上清中存在FRP或Wnt通路组分则提示蛋白还以可溶性形式存在，这种可溶性蛋白可能以分泌型蛋白的形式产生，或者通过渗漏的形式从细胞中释放出来。
等价方案本领域技术人员应该理解，或者能够确认，应用常规试验就可以产生很多本文描述的本发明特定实施方案的等价方案。这些等价方案也包括在下述权利要求范围内。
权利要求
1.筛检卷曲相关蛋白激动剂或拮抗剂的方法，包括以下步骤a)令卷曲相关蛋白、多肽、或其生物活性片段在一定条件下与卷曲相关蛋白结合配体以及测试化合物结合，在所述条件下，对于测试化合物，卷曲相关蛋白与卷曲相关蛋白结合配体能够发生相互作用；并且b)检测在测试化合物存在的情况下，卷曲相关蛋白/卷曲相关蛋白结合配体复合物的形成程度，其中，在测试化合物存在的情况下，相对于没有测试化合物存在的情况下，复合物形成的量增加，提示测试化合物是卷曲相关蛋白激动剂，而在测试化合物存在的情况下，相对于没有测试化合物存在的情况下，复合物形成的量减少，提示测试化合物是卷曲相关蛋白拮抗剂。
2.权利要求26的方法，该方法还可包括从测试化合物中制备药物组合物的步骤。
全文摘要
本发明涉及筛检卷曲相关蛋白激动剂或拮抗剂的方法，包括令卷曲相关蛋白、多肽、或其生物活性片段在一定条件下与卷曲相关蛋白结合配体以及测试化合物结合，在所述条件下，对于测试化合物，卷曲相关蛋白与卷曲相关蛋白结合配体能够发生相互作用；并且检测在测试化合物存在的情况下，卷曲相关蛋白/卷曲相关蛋白结合配体复合物的形成程度。
文档编号A61K48/00GK1667416SQ20051000625
公开日2005年9月14日 申请日期2001年2月26日 优先权日2000年2月29日
发明者A·F·克拉克, J·芬格尔特, L·麦克纳特, E·M·斯通, W-H·王 申请人:阿尔康公司, 衣阿华大学研究基金会