非腺嘌呤在制备促进伤口愈合的药中的应用的制作方法

专利名称：非腺嘌呤在制备促进伤口愈合的药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及非腺嘌呤的用途，具体地说是非腺嘌呤在制备促进伤口愈合的药中的应用。
背景技术：
我们知道，伤口愈合是受伤组织恢复到正常组织结构的基本过程。虽然大部分伤口愈合很快，但是组织损伤或恢复缓慢仍是临床所面临的主要挑战。伤口无法愈合大多同人体受到的某些损害有关，例如糖尿病、感染或免疫抑止。糖尿病患者极易引发下肢慢性溃疡，严重时可导致死亡。伤口愈合是一种复杂的生物学过程，其特点是分为几个连续的阶段受伤、血液凝固、发炎、组织形成和组织重建。皮肤受伤经常伴随出血，从而导致血小板聚集，形成血液凝块，这样伤口愈合的过程就开始了。随后，免疫细胞移往伤口周围，修复开始，这便进入发炎阶段。在到达伤口附近的免疫细胞中，除了巨噬细胞外，中性粒细胞是最主要的免疫细胞。发炎过程是组织修复的开始，而白细胞有序的聚集则是保证发炎过程顺利进行所必需的。随着发炎的继续，通过纤维增生和血管生成，组织和细胞外基质开始形成。所有这些环节都必须协调推进，而且各种细胞因子、生长因子和其他活性分子缺一不可。在这个有条不紊的过程中，任何一个环节的缺失都会造成伤口无法愈合。
鸟苷是一种天然健康产品，鸟苷是一种含有鸟嘌呤和D-核糖成分的核苷，它带有轻微的盐味，常常存在于胰腺、三叶草、咖啡植被和松树花粉中。人们已经发现鸟苷天然存在于一些植物中并可以从中进行分离，例如冬虫夏草属、松树根茎和苜蓿属植物分泌物或者紫花苜蓿植被。其化学结构如图6所示。
鸟苷在营养学方面的影响，尤其是对慢性脊柱损伤的运动功能改善和髓鞘再生的改善，其动物实验研究是我们对人类机体进行临床试验的基础。基于2003年Jiang等人的研究成果，对创伤性脊髓损伤35天的大鼠连续7天应用鸟苷(经腹腔注射，8毫克/千克/天)，可以发现脊髓的功能恢复和髓鞘再生。
对小鼠经口腔或经腹腔应用鸟苷可以防止由于谷氨酸盐产生的兴奋性中毒所引起的癫痫和死亡，而这种兴奋性中毒在临床上与癫痫、中风和神经变性等疾病的治疗存在一定的关联性。其他的研究结果同样证明了鸟苷的抗惊厥作用，另外，也有研究发现鸟苷在小鼠中的促遗忘作用和抗焦虑作用，这是由于鸟苷在调节谷氨酸盐兴奋系统作用中的功能相似的原因。
鸟苷可促进星形胶质细胞的增殖，从而在阻止星形胶质细胞的编程性细胞死亡的过程中起到一定作用。鸟苷还可以促进损伤后神经营养因子的释放，促进中枢神经系统中更多的嘌呤释放。在机体对损伤的反应中，鸟苷还可对小神经胶质细胞和毛细管内皮细胞发生作用。
鸟苷是在多种营养学效应中所包含的一种嘌呤核苷。人体损伤后，鸟苷和其他的嘌呤、腺苷从神经元和神经胶质细胞中释放出来，并且处于正常水平。尽管对P1和P2腺苷受体进行了大量广泛的研究，但是鸟苷发生作用的部位仍然是目前研究的热点。最近的一项对大鼠大脑鸟苷结合部位的研究显示存在G-偶联鸟苷受体。G-蛋白依赖性信号标志途径，包括MAP激酶途径和PI3-Kinase/AKT/PKB途径(可抑制能引起编程性细胞死亡的胱门蛋白酶)可以调节鸟苷的多种营养学作用，例如防止星形胶质细胞编程性细胞死亡的保护作用。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供非腺嘌呤比如鸟苷、鸟嘌呤和肌苷等作为制备治疗和促进伤口愈合的药中的应用。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是非腺嘌呤比如鸟苷、鸟嘌呤和肌苷等，用其中的一种即可，能用来治疗和促进伤口愈合。特别是能增进健康小白鼠和患先天性糖尿病的小白鼠损伤皮肤的伤口愈合。同时也证实了伤口愈合过程中，非腺嘌呤通过激活细胞内的生物酶(如纳豆激酶)起作用。


以下将描述相关的图表图表1为不同浓度鸟苷促进Balb/c小鼠伤口愈合效果图。
图表2为不同浓度鸟嘌呤促进小鼠伤口愈合效果图。
图表3为250um肌苷促进小鼠伤口愈合效果图及6-硫代鸟嘌呤抑制肌苷促进伤口愈合效果图。
图表4为25ug/ml抗-NGF抑制250um鸟苷促进伤口愈合效果图。
图表5为250um鸟苷促进先天性糖尿病小鼠的皮肤伤口愈合。
图表6为鸟苷化学结构图。
名词中英文对照非腺嘌呤non-adenine based purines鸟苷guanosine鸟嘌呤 guanine肌苷inosine神经生长因子NGF6-硫代鸟嘌呤6-TG具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面将用鸟苷、鸟嘌呤和肌苷等的试验及结果说明其在制备促进伤口愈合的药中的应用。本发明的其他特征和优点、效果在以下的详细描述中越发明显。涉及本发明的最优方案时对于详尽的描述和具体的例子，我们只作注解，有了详尽的描述，在不改变本发明的宗旨和发明领域的前提下，对其略做修改和变化是轻而易举的事情。
本发明已经证实了非腺嘌呤鸟苷、鸟嘌呤和肌苷能通过激活纳豆激酶在促进伤口愈合时起到有效作用。
因此，本发明还提供了一种通过对生物体使用有效剂量的纳豆激酶激动剂促进伤口愈合的方法。
“有效数量”一词在此意指为达到理想的效果，在必需的时间内所使用的有效的剂量。
“生物体”一词在此意指所有的动物，包括人在内，但被治疗的最好是人。
“纳豆激酶激动剂”一词在此指任何通过激活纳豆激酶促进伤口愈合的分子或化合物。不论一种分子或化合物是否通过纳豆激酶起到作用，都能够通过检测纳豆激酶抑制剂(比如6一硫代鸟嘌呤)对该分子或化合物活动的影响来检测。不论一种分子或化合物是否能够促进伤口愈合，都能通过各种体外或体内模型检测出来，包括本文描述的模型。具体说来，纳豆激酶激动剂指鸟苷、鸟嘌呤或肌苷。
本发明的整体研究方案及过程如下本发明首先选择的动物是Balb/c雌鼠，6-8周大，有先天性糖尿病。
手术伤口的形成整个手术过程都严格遵循了AREB 102条款，高度警惕。在CAF的外科手术室进行手术，给小鼠吸入异氟烷(3-5％)和氧气(1L/min)，使其麻醉。用夹子夹起小鼠背部的毛，这是对皮肤最后的准备工作，然后用浓度为70％的酒精消毒。用镊子和剪刀在被麻醉的Balb/c小鼠背部留下两个全层皮切割伤口(直径1cm)，然后消毒，伤口至少间隔1cm完好的皮肤。
处理方法把1.5％(w/v)的羧甲基化纤维素(CMC)(sigma)0.15g融解在10ml PBS中，然后将溶液通过一个0.2μmHT Tuffryn膜片过滤，将最后的溶液等分装入盖塑胶小试管，保存于-20℃低温下备用。
治疗首先将1.41mg鸟苷融解于0.5ml的1M氢氧化钠中，然后加入4.5mlddH2O；再加入同等量的3％CMC贮备溶液，混和溶液，然后将溶液通过一个0.2μmHT Tuffryn膜片过滤，将溶液保存于-20℃低温备用。
本发明所用的其他浓度的鸟苷，也都是通过这种方法制成的。根据想要制成的浓度，每次实验所要融解的鸟苷剂量根据浓度的不同而变化。最终的药剂由鸟苷、CMC和PBS的贮备溶液混和而成。
在实验中所用的肌苷、鸟嘌呤和6-硫代鸟嘌呤的准备方法同鸟苷相同。制作贮备溶液时，先将每种化合物溶于蒸馏水，最后在其贮备溶液中加入3％CMC和PBS贮备溶液。
0.5％透明质酸处理方法将250mg透明质酸溶于25ml消毒过的PBS，然后加入相同量的浓度为3％CMC的储备溶液，混合溶液，然后将溶液储存在-20℃低温备用。
NBTI(500μm)处理方法将4.19mg NBTI和2.5ml二甲基压砜(BDH)制成4000μm NBTI(Sigma)的贮备溶液。将其与3％CMC和PBS贮备溶液混合做溶体处理，再将最后的溶液通过HT Tuffryn膜片过滤并储存在-20℃低温备用。
神经生长因子(NGF)和抗NGF抗体处理方法按照2μg/μl的比例使用2.5S NGF，按照25μg/ml的比例使用抗NGF。
所有的药剂在使用之前都需要加热到37℃，然后用移液管把药剂局部施用到每个伤口表面，用移液管的边缘使药剂扩散到整个伤口。
手术伤口闭合的测量将小鼠随机分到不同的治疗小组，每组有4-7只，整个观察过程中，研究人员也无法分辨。手术后连续7天，每天用20μl药剂局部处理伤口。到第4，5，6，7天，伤口边缘形成和伤口试剂取得后，就可以去掉夹子了。手术后第二天和以后每隔一天都要将伤口情况记录到透明的塑料纸上，然后通过使用IPLab(Scanalytics Inc.，8550 Lee Highway，Suite 400 3.5版)把伤口面积量化。所有的实验都需要重复2-3次，以确保实验结果的稳定性，因为在伤口愈合率方面，不同组的小鼠之间存在差别，每个实验都有其溶剂对照组。
数据分析伤口愈合面积通过测量每只小鼠每个伤口的相对闭合伤口和原始伤口面积得出，平均伤口愈合闭合面积就是同一个治疗小组的小鼠每天伤口闭合面积的平均值。这样，每个小组的小鼠每天的平均伤口愈合面积就可绘成图表，并且可以同其他治疗小组进行对比。每天平均结果的标准误差也可以计算出来。
组织学研究第1，2，3，4，5天，受伤的小鼠被二氧化碳麻醉后，将切割下的身体侧面皮肤组织，包括整个受伤区域及其下层的肌肉，放入10％的福尔马林磷酸盐缓冲液固定1个周。把每个标本做最大维度的切割，用于组织学观察；酒精和二甲苯的浓度不断升高，组织脱水；用石蜡包埋；将切片置于玻璃片之上；再用苏木精、伊红染色，做成5mm厚的切片。
将所有切片放到暗视野显微镜下观察，并将所有显著变化拍照。
伤口愈合结果为验证活体内局部施用嘌呤在可以促进伤口愈合的假说，我们对其在健康的Balb/c幼鼠(6-8周大)和先天性糖尿病的小鼠所起到的促进作用进行了研究，受伤后没有被治疗的小鼠会自疗这一结果得到了确认。因此，这些实验研究了同溶剂对照组进行对比，局部施用药物后对伤口闭合的促进作用。因为在动物身上进行的伤口愈合会有偏差，所以每个实验都有溶剂对照组。
实施例1局部施用鸟苷促进小鼠皮肤伤口愈合从图表1中可以看出，Balb/c小鼠的手术伤口每天都用鸟苷浓度为50μm-5000μm的羧甲基化纤维素进行治疗。我们的实验证实了同溶剂对照组(图表1，p＜0.001，n＝8)相比每天一次局部施用250μm鸟苷能够增强伤口愈合，更高浓度的鸟苷(1000μm-5000μm)对动物的伤口愈合不会产生更强的促进作用。图表1同时表明，鸟苷治疗组50％的伤口闭合需要1.6天，而溶剂对照组(p＜0.001，n＝10)需要3天。
本实施例所指的鸟苷局部施用在Balb/c小鼠的皮肤伤口上。如该方法所述，每天为每一只小鼠测量伤口闭合面积并且表示为第二天的面积于前一天面积之比。同溶剂对照组的小鼠相比，每天一次施用250μm鸟苷对伤口闭合非常有效(p＜0.0001，n＝8)。
对伤口的组织学观察证实了这些发现。
鸟苷通过细胞内机制增进伤口愈合为了进一步证实转运鸟苷到细胞内是细胞作用机理所必需的，我们同时使用NBTI(转运到细胞内的一种嘌呤)和鸟嘌呤，结果发现500umNBTI抑制了鸟苷促进伤口愈合。
鸟苷通过释放NGF增进伤口愈合NGF能促进小鼠的伤口愈合，所以我们想知道鸟苷是否通过释放NGF来促进伤口愈合。结果表明同时使用250um鸟苷和2ug/20ul的2.5S NGF同单独使用250um鸟苷对伤口愈合的程度起近似的促进作用，而且25ug/ml抗NGF抗体抑制了250um鸟苷促进伤口愈合，如图表4所示。这就表明鸟苷通过释放NGF促进伤口愈合。
实施例2鸟苷能促进糖尿病小鼠的伤口愈合临床证据表明糖尿病患者伤口代谢紊乱经常会导致伤口难以修复。为了证实鸟苷是否能够促进糖尿病小鼠的伤口愈合，我们研究了对先天性糖尿病小鼠的皮肤伤口局部施用250um鸟苷后的效果，用试验小鼠模拟了II型糖尿病人。糖尿病小鼠的伤口比正常小鼠(Balb/c)愈合的慢。我们发现同溶剂对照组相比，每天一次局部施用250um鸟苷能加快伤口愈合，在第二天就能见效，如图表5所示。
实施例3鸟嘌呤促进小鼠的伤口闭合证实了鸟苷能够促进小鼠的伤口愈合后，我们还想证明其他非腺嘌呤，比如鸟嘌呤、肌苷在我们的实验中是否也能增进皮肤伤口愈合。实验结果表明，如图表2所示，同溶剂对照组(p＜0.001，n＝8)相比，使用250μm和1000μm鸟嘌呤也可以有效的促进伤口愈合。鸟嘌呤使50％的伤口愈合时间减少，250μm治疗组需要1.6天，1000μm组需要3.1天。
鸟嘌呤有促进伤口愈合的作用表明在活体内伤口愈合不需要核糖分子。
实施例4肌苷促进小鼠的伤口闭合同样的，和溶剂对照组相比，用250μm肌苷治疗小鼠，也能够非常有效地增进伤口愈合。用肌苷治疗的50％的伤口愈合需要1.2天，而溶剂对照组需要2.8天。而同时使用1000um6-硫代鸟嘌呤和250um肌苷的小鼠则需要2天。如图表3所示。
6-硫代鸟嘌呤抑制鸟苷、肌苷、鸟嘌呤的作用肌苷、鸟苷可以促进金鱼视网膜神经节细胞及细胞内机制的生成，但是作为一种纳豆激酶抑制剂，高浓度的6-硫代鸟嘌呤(6-TG)会抑制这种作用。因此我们想知道鸟苷和肌苷在促进伤口愈合的同时，是否也对细胞内机制(纳豆激酶)的生成有促进作用。所以我们研究了6-TG的作用，在用鸟苷和肌苷促进小鼠的伤口愈合时，它是一种纳豆激酶抑制剂。我们用浓度50um--1000um的6-TG同250um鸟苷、250um肌苷做了一系列试验，试验结果表明，低浓度的6-TG不足以抑制250um非腺嘌呤促进伤口愈合，但高浓度的6-TG(1000um)就会抑制肌苷、鸟苷、鸟嘌呤促进伤口愈合。如图表3所示。
对上述实施例的讨论以上提到的结果说明，对健康幼鼠和糖尿病小鼠局部施用250μm鸟苷能够明显提高伤口治愈率。而且，使用其他非腺嘌呤(肌苷、鸟嘌呤)也能够促进正常小鼠的伤口愈合。
嘌呤类似物6-硫代鸟嘌呤抑制了鸟苷、肌苷、鸟嘌呤对伤口愈合的促进作用。加入鸟苷或肌苷能够增强PC12细胞中NGF的作用，同时能刺激雏鸡交感神经原的分化。在PC12细胞中，NGF激活了多个信号转导级联反应和具有47-49kda丝氨酸/苏氨酸激酶部分特性的纳豆激酶。嘌呤类似物6-硫代鸟嘌呤(6-TG)选择性地抑制细胞内被NGF激活的47-49kda纳豆激酶。6-TG只对纳豆激酶有特定的作用，对其他信号转导分子(例如蛋白激酶A、蛋白激酶C、Ca2+钙调素或丝裂原活化蛋白激酶)及早期应答基因(例如c-fos基因)的诱导没有影响。在我们的研究中，当6-TG的浓度降低到不能抑制鸟苷促进伤口愈合时，两者之间的竞争尤为明显。但是把6-TG的浓度提高到1000μm，就会抑制鸟苷、肌苷、鸟嘌呤加快伤口愈合的作用。
因此，我们确定在6-TG充当纳豆激酶的抑制剂时，鸟苷和肌苷就作为激动剂起作用。肌苷、鸟苷和6-TG结构相似，它们在细胞内的活动就具有协调性。如果是鸟嘌呤，我们认为它会转化为鸟苷，继而促进伤口愈合。
NBTI是转运到细胞内的一种嘌呤抑制剂，它的使用更进一步证实了鸟苷在细胞内的活动机制。500μm NBTI降低了鸟苷对伤口愈合的促进作用。因此，观察到的小鼠身上嘌呤核苷对伤口愈合的促进作用受细胞内嘌呤敏感激酶的控制。
糖尿病小鼠的伤口愈合患先天性糖尿病(BKS.Cg-m+/+leprdb)的小鼠是临床上可再出现的伤口不可修复的例子。纯合子突变表现为肥胖、不孕、高血糖、抗胰岛素，最终发展成严重的糖尿病。这些动物的症状同成人糖尿病的症状类似，并且伤口愈合明显延迟。正如此，它们曾经被用作模型系统来测试治疗延迟愈合药剂的药效。
我们发现250μm鸟苷能有效地促进患先天性糖尿病小鼠的伤口愈合，这种促进作用最早发生在治疗过程的第二天。我们据此认为出现在最初愈合过程中的巨噬细胞对鸟苷治疗伤口愈合是至关重要的。
其他的机制也对非腺嘌呤促进伤口愈合起作用。细胞外非腺嘌呤能引起多种不同类型的细胞再生，包括脑血管内皮细胞、小神经胶质细胞和星形胶质细胞。因此，嘌呤可以引起巨噬细胞(巨噬细胞和小神经胶质细胞的功能相似)、血管内皮细胞或成纤维细胞的再生，继而引起伤口愈合率的升高。
另外一种在愈合过程起作用的机制就是那些在伤口愈合过程中配合其他生长因子起作用的嘌呤。先前用嘌呤做的实验证实了嘌呤能刺激中枢神经系统营养因子的释放。正因为如此，鸟苷才可以通过配合其他生长因子促进伤口愈合。
我们得出结论像鸟苷、肌苷、鸟嘌呤这些非腺嘌呤能促进普通疗法和基因疗法的小鼠伤口愈合。因此，它们可以成为正常个体或伤口难愈的个体潜在药剂。
本发明参考了许多到目前认为可取的例证，但并不仅仅局限于这些已公开的例证，相反，本发明意在涵盖各种修正和附加声明中所包括的各种修正相应的排列。
权利要求
1.非腺嘌呤在制备促进伤口愈合的药中的应用。
2.非腺嘌呤在制备促进患先天性糖尿病的损伤皮肤的伤口愈合的药中的应用
3.非腺嘌呤是鸟苷或鸟嘌呤或肌苷。
全文摘要
本发明涉及非腺嘌呤在制备促进伤口愈合的药中的应用，非腺嘌呤比如鸟苷、鸟嘌呤和肌苷等，用其中的一种即可，能用来治疗和促进伤口愈合。特别是能增进健康小白鼠和患先天性糖尿病的小白鼠损伤皮肤的伤口愈合。本发明在促进伤口愈合过程中，纳豆激酶抑制剂抑制化合物生效的同时，非鸟嘌呤通过激活细胞内的生物酶(如纳豆激酶)起作用。
文档编号A61P17/02GK1864697SQ20051004359
公开日2006年11月22日 申请日期2005年5月16日 优先权日2005年5月16日
发明者姜淑翠, 罗士博, 王济中, 夏树松 申请人:威海枫叶科技开发有限公司